SHAYENNE SCHEFFER HOMRICH

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1 CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS Programa de Pós-Graduação em Nanociências SHAYENNE SCHEFFER HOMRICH NANOCÁPSULAS CONTENDO ÁCIDO ALL-TRANS-RETINOICO: EFEITO ANTITUMORAL VIA DIFERENCIAÇÃO CELULAR E ATIVAÇÃO APOPTÓTICA INTRÍNSECA EM CÉLULAS DE LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA Santa Maria, RS Março, 2017

2 SHAYENNE SCHEFFER HOMRICH NANOCÁPSULAS CONTENDO ÁCIDO ALL-TRANS-RETINOICO: EFEITO ANTITUMORAL VIA DIFERENCIAÇÃO CELULAR E ATIVAÇÃO APOPTÓTICA INTRÍNSECA EM CÉLULAS DE LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Nanociências do Centro Universitário Franciscano de Santa Maria como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Nanociências. Orientador: Prof. Dr. RODRIGO DE ALMEIDA VAUCHER Co-orientador (a): Prof. (a) Dr. (a) MICHELE RORATO SAGRILLO Santa Maria, RS Março, 2017

3 H768n Homrich, Shayenne Scheffer Nanocápsulas contendo ácido all-trans-retinoico: efeito antitumoral via diferenciação celular e ativação apoptótica intrínseca em células de leucemia promielocítica aguda / Shayenne Scheffer Homrich ; orientação Rodrigo de Almeida Vaucher ; coorientação Michele Rorato Sagrillo Santa Maria : Centro Universitário Franciscano, f:il. Dissertação (Mestre em Nanociências) Programa de Pós-Graduação em Nanociências - Centro Universitário Franciscano 1. Leucemias 2. Metabolismo oxidativo 3. Ciclo celular 4. PML/RARa 5. Caspases 6. Nanocarreadores I. Vaucher, Rodrigo de Almeida II. Sagrillo, Michele Rorato III.Título CDU 62 Elaborada pela Bibliotecária Eunice de Olivera CRB 10/1491

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5 Dedico este trabalho ao meu pai, Ronildo À minha mãe, Zélia E ao meu irmão Gibran

6 Agradecimentos À Deus, Pai Maior, minha gratidão pela dádiva da vida e pela sua misericórdia infinita. Aos meus Orixás e aos mentores espirituais, em especial à minha Mãe Iansã, à minha Cigana Clara (entidade de luz), ao Maicon (meu Pai Espiritual, o qual é meu porto seguro e a quem amo com todo o meu ser), ao Seu Caju (uma das pessoas mais sábias que já conheci na minha vida) e a todo Povo de Umbanda minha profunda gratidão e reconhecimento pela luz e amor dispensados a mim, incondicionalmente. Obrigada por me ajudarem a evoluir espiritualmente e me ensinarem a cada dia que o bem que fazemos hoje é o nosso advogado de defesa do amanhã. À minha mãe Zélia, meu amor maior, de joelhos ofereço meu respeito, admiração e gratidão por me amar, amparar e zelar. Mãe, amiga, anjo, confidente, parceira de festas, conselheira e meu melhor colo...sem você a caminhada não seria possível. Te amo infinitamente, com cada átomo do meu corpo, em todas as outras encarnações. Ao meu irmão e pai Gibran, faltam palavras para agradecer pois sem ti nenhum passo poderia seria dado. Obrigada por existir na minha vida, por me ajudar a crescer e principalmente por ser o meu melhor amigo. Te amo muito mano, meu anjo encarnado! Ao Gilmar, meu carinho e sinceros sentimentos de gratidão pelo apoio e por me ajudar sempre que possível. À minha orientadora e amiga Profª. Drª. Michele Rorato Sagrillo, meu profundo respeito e reconhecimento pelo amparo, pelo desprendimento e pelo apoio. Sem VOCÊ esse trabalho não existiria. Muito obrigada minha eterna professora, educadora e amiga, exemplo de competência, responsabilidade e comprometimento incomparáveis. À Profª. Drª. Aline Ourique, minha gratidão pela paciência e carinho em me auxiliar neste trabalho, sempre que precisei. À Profª. Drª. Ivana Beatrice Mânica da Cruz, pela parceria concedida e por abrir as portas do Laboratório de Biogenômica da UFSM. À todo o Grupo de Pesquisa, em especial ao Alencar Machado, à Kátia Nascimento e à Priscila Copetti (meu braço direito), meu carinho e gratidão pela ajuda dispensada e pela amizade incansável. À Isabel Roggia, minha querida amiga, meu profundo carinho e gratidão por me aturar e ajudar sempre. À Profª. Drª. Ivana Zanella, minha admiração e gratidão por me ouvir e ajudar sempre que

7 possível. À Comunidade Franciscana, desde as meninas do serviço geral, incluindo os atendentes da cantina, os funcionários da Portaria e demais cooperadores desta instituição, muito grata por fazerem parte dos meus dias, alegrando, auxiliando e proporcionando aconchego. Ao Centro Universitário Franciscano, ao Programa de Pós-Graduação em Nanociências e à CAPES meu agradecimento eterno pela oportunidade de crescimento profissional. À todos os professores que até aqui me auxiliaram, vos digo que, de um forma ou outra, todos, indistintamente, tem um papel importantíssimo na minha formação profissional e pessoal. À vocês, meu profundo respeito e meu sincero desejo de vitórias infindas. Meus votos cordiais de muita PAZ!!

8 Um pássaro que repousa numa árvore nunca teme que seu galho quebre, pois sua confiança não está no galho, mas sim nas suas próprias asas.

9 RESUMO A Leucemia Promielocítica Aguda (LPA), primeiramente descrita em 1957 é a forma mais maligna de leucemia aguda. Atualmente, o conhecimento dos seus mecanismos fisiopatológicos em nível molecular possibilitou o desenvolvimento de terapias eficazes fazendo com que a LPA seja a forma mais curável de leucemia. Por este motivo a LPA é também utilizada como modelo para os avanços no tratamento do câncer, sendo o tratamento molecular com ácido all-transretinoico (ATRA) o que apresenta alta eficiência no seu controle. Entretanto, inúmeros pacientes adquirem a Síndrome de Diferenciação, como efeito adverso a este medicamento. Diante disto, em comparação com outros fármacos, os antineoplásicos citotóxicos apresentam problemas únicos, como pobre especificidade, elevada toxicidade e susceptibilidade para induzir resistência. Uma estratégia para diminuir a citotoxicidade do ATRA é a incorporação do mesmo em nanocápsulas poliméricas com núcleo oleoso. Neste trabalho nanocápsulas de núcleo lipídico contendo ATRA (NA) foram avaliadas quanto ao seu potencial de inibir o crescimento, induzir a apoptose e interferir com o ciclo celular e na diferenciação de células de LPA, linhagem NB4. Os resultados demonstraram que a NA foi capaz de superar a resistência celular ao tratamento com AL, reduzindo a viabilidade celular, induzindo apoptose, pela expressão dos genes BAX/BCL-2, parada do ciclo celular em G1 e diferenciação celular nas concentrações de 1,5 e 2,0 µm. Adicionalmente, estes sistemas podem contribuir para o aumento da eficácia e redução da toxicidade devido ao potencial para acúmulo das nanopartículas na região tumoral graças à permeabilidade vascular aumentada dos vasos tumorais. A incorporação de ATRA em nanocarreadores lipídicos constitui uma alternativa interessante para viabilizar sua administração intravenosa. Além disso, estes sistemas apresentam potencial para acúmulo do fármaco na região tumoral, por meio de um direcionamento passivo chamado de efeito de permeabilidade e retenção aumentada. Palavras-chave: leucemias, metabolismo oxidativo, ciclo celular, PML/RARa, caspases, nanocarreadores

10 ABSTRACT The Acute Promyelocytic Leukemia (APL), firstly described in 1957, is the most malignant type of acute leukemia. Currently, the knowledge of its pathophysiological mechanism at molecular levels became possible the development of efficient therapies making APL the most curable leukemia type. In this sense, APL is also used as a model on cancer advances, being the molecular treatment performed with all trans-retinoic acid (ATRA) that presents high efficiency at its control. However, several patients develop differentiation syndrome, as a side effect of this drug. In these terms, compared to another drugs, the cytotoxic antineoplastic agents present particular problems, as poor specificity, high toxicity and resistance susceptibility. An alternative strategy to decrease the ATRA cytotoxicity is the incorporation of this drug in polymer nanocapsules with oily core. In this work nanocapsules with lipid core containing ATRA (NA) were evaluated as their potential to inhibit cellular grow, to induce apoptosis, to interfere the cell cycle, and at APL cellular differentiation using NB4 cell line. Results showed that NA was able to overcome the cellular resistance to AL treatment, decreasing cell viability, inducing apoptosis, through BAX/BCL-2 gene expression, cell cycle arresting at G1 phase and cellular differentiation under 1.5 and 2.0 µm. Additionally, theses systems can contribute to increase the efficacy and reduce the toxicity due to the potential accumulation of nanoparticles at the tumor region due to increased vascular permeability of tumor vases. The ATRA incorporation in lipid nanocarriers is a interesting alternative to make possible its intravenous administration. Moreover, these systems present potential to drug accumulation at tumor tissue through a passive targeting called effect of permeability and increased retention. Keywords: leukemias, oxidative metabolism, cell cycle, PML/RARa, caspases, nanocarriers.

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Ilustração da translocação entre os cromossos 15(q22) e 17(q12) Figura 2 - Promielócito hipergranulocítico com inúmeros Faggot cells Figura 3 - Ilustração dos genes PML (cromossomo 15) e RARα (cromossomo 17) antes da translocação Figura 4 - Ativação das caspases por sinal apoptótico externo Figura 5 Cultura e tratamento das células Figura 6 - Gráfico representativo da análise do tamanho de partícula. A. nanocápsulas brancas (NB). B. nanocápsulas com ATRA (NA) Figura 7 - Análise do diâmetro médio e do PDI das NB Figura 8 - Análise do diâmetro médio e do PDI das NA Figura 9 - Análise do potencial zeta das NBs Figura 10 - Análise do potencial zeta das NAs Figura 11 - Representação gráfica da curva média das áreas geradas pelas concentrações Figura 12 - Gráfico representativo da integração dos picos demonstrando a pureza e especificidade do método, onde A é a NA e B é a NB Figura 13 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, figuras 13A e 13B, respectivamente Figura 14 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, respectivamente figura 14C e 14D Figura 15 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, respectivamente figura 15E e 15F Figura 16 - Ensaio da diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 24h de incubação Figura 17 - Ensaio da DCFH-DA com células para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 72h de incubação Figura 18 - Ensaio da DCFH-DA com células do sobrenadante para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 72h de incubação Figura 19 - Análise do Ciclo Celular Figura 20 - A figura 20A representa a expressão do gene BAX e a figura 20B a gene Bcl Figura 21 - Expressão gênica dos genes caspase-1 (A), caspase-3 (B) e caspase-8 (C) Figura 22 - Expressão do gene PML-RARα

12 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Constituintes das formulações de nanocápsulas contendo ATRA e nanocápsulas brancas Tabela 2 - Valores expressos referentes a curva analítica do ATRA Tabela 3 - Sequências de primers utilizados na avaliação molecular Tabela 4 - Características físico-químicas avaliadas nas formulações de nanocápsulas com ATRA (NA). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão Tabela 5 - Resultados das áreas obtidas com relação as concentrações

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos INTERDISCIPLINARIDADE REVISÃO BIBLIOGRÁFICA MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA) AVALIAÇÃO PRÉ-TRATAMENTO TRATAMENTO APOPTOSE: VIAS INTRÍNSECA E EXTRÍNSECA CICLO CELULAR SÍNDROME DA DIFERENCIAÇÃO EM LPA ESTRESSE OXIDATIVO NANOTECNOLOGIA MATERIAIS E MÉTODOS DELINEAMENTO EXPERIMENTAL PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS Composição das nanocápsulas Caracterização físico-química das suspensões contendo nanocápsulas Co-validação do método para desenvolvimento e produção das nanocápsulas Teor de fármaco Avaliação de formação de corona proteica CULTURA CELULAR E TRATAMENTOS ENSAIOS EXPERIMENTAIS Avaliação da citotoxicidade e taxa de proliferação celular Avaliação de indicadores de apoptose e diferenciação celular Análise da modulação de indicadores do metabolismo oxidativo Análise do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo... 41

14 3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS RESULTADOS E DISCUSSÕES PRODUÇÃO DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS AVALIAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES ph Distribuição das partículas Diâmetro médio e índice de polidispersão (PDI) Potencial Zeta CO-VALIDAÇÃO DO MÉTODO PARA DESENVOLVIMENTO E PRODUÇÃO DAS NANOCÁPSULAS Linearidade Especificidade TEOR DO FÁRMACO AVALIAÇÃO DA CORONA PROTEICA ENSAIOS EXPERIMENTAIS Ensaio MTT Avaliação da taxa de produção de radicais livres Análise do Ciclo Celular Análise da expressão gênica CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS... 62

15 14 1 INTRODUÇÃO As leucemias são caracterizadas pelo descontrole do crescimento de células na medula óssea, havendo um bloqueio da maturação hematopoiética normal e uma expansão do clone celular maligno. Na medula óssea, a produção de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas se torna prejudicada devido ao acúmulo de células imaturas, ocasionando diversas complicações orgânicas como anemias, infecções e hemorragias (KOTOWSKI et al., 2007). As leucemias compreendem um espectro de neoplasias, que quando não tratadas evoluem desde as de crescimento rápido e fatal às de crescimento lento. O ponto principal é que ela possui alta prevalência em indivíduos mais idosos, pois há uma multiplicação exagerada e desordenada das células jovens. Os fatores etiológicos têm sido associados com o aumento do risco da doença, desde distúrbios genéticos a fatores extrínsecos (JÁCOMO et al., 2008). A leucemia corresponde a mais de 80% das leucemias agudas em adultos, onde a incidência aumenta com a idade; indivíduos idosos tem mais predisposição, pois parecem ser envolvidos por alterações genéticas afetando o processo de transcrição e os receptores de tiroquinase (BITTENCOURT et al., 2008). Em 2013, nos Estados Unidos (EUA), estimou-se novos casos de Leucemia Mieloide Aguda (LMA). Por ano, a incidência de LMA nos EUA é de aproximadamente 3,5 a cada pessoas, sendo a incidência por idade mais alta nos homens do que nas mulheres, onde a idade mediana por ocasião do diagnóstico é de aproximadamente 67 anos (KASPER et al., 2017). Para o Brasil, os dados de 2016 que são válidos para o ano de 2017 apontam para a ocorrência de novos casos de leucemias em homens e em mulheres. Esses valores correspondem a um risco que estima 5,63 casos novos para cada 100 mil homens e 4,38 para cada 100 mil mulheres (INCA, 2016). A fisiopatogenia da LMA se baseia nas análises citogenéticas e moleculares, pois mostra que esta leucemia juntamente com vários subgrupos apresenta comportamentos fisiológicos distintos (BITTENCOURT et al., 2008). Dentre as LMA, a Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) está associada a uma síndrome hemorrágica que já era conhecida por hematologistas franceses desde Em 1957, Hillestad a descreveu como um subtipo distinto de LMA sendo fenotipicamente caracterizado por um acúmulo de promielócitos anormais na medula óssea e/ou sangue periférico, riscos de complicações trombóticas e hemorrágicas. A prevalência da LPA é de aproximadamente, 10 a 15% dos adultos com diagnóstico de LMA com idade média de 40 anos, que é considerada mais baixa do que a idade média dos pacientes com outros tipos de LMAs (70 anos) (LÖWENBERG

16 15 et al., 2003). Afeta 3 a 10% dos casos de crianças com LMA que apresentam, predominantemente, idade mais avançada, sexo feminino, baixa contagem leucocitária e frequentes problemas de coagulação sanguínea (SAGRILLO et al., 2005). A LPA atinge preferencialmente a faixa etária que compreende dos 20 aos 59 anos de idade, ou seja, ocorre preferencialmente em adultos jovens, quando comparada aos outros subtipos de LMA e não há relatos que comprovem uma maior incidência em algum dos sexos (JÁCOMO et al., 2008). Grande parte das pesquisas realizadas sobre a incidência de LPA, são decorrentes, especificamente, de dados hospitalares, portanto não se sabe o verdadeiro predomínio e a variabilidade deste subtipo de LMA é muito grande. No Brasil, esses dados são bem escassos, e além do mais os subtipos de LMA não são registrados em separado. Em países latinos a prevalência de LPA está entre 20% e 25%, enquanto predominam entre os países desenvolvidos, taxas que variam de 4% a 15% (JÁCOMO et al., 2008). A principal característica diagnóstica da LPA é uma translocação cromossômica aberrante que se justapõe ao gene PML localizado no cromossomo 15 com o gene do receptor do ácido retinoico (RARα) localizado no cromossomo 17 (KAKIZUKA et al.,1991). Portanto, a LPA geneticamente, está associada com alterações cromossômicas estruturais (translocação), envolvendo sempre o lócus gênico para o receptor alfa do ácido retinoico (RARα), localizado no braço longo do cromossomo 17 (17q21) (LOU et al., 2013). Em células saudáveis a proteína produzida pelo gene PML é uma das principais proteínas constituintes dos corpos nucleares estando envolvida em diversas funções biológicas como resposta ao dano do DNA e resistência a microrganismos através da regulação de uma ampla variedade de proteínas (JEANNE et al., 2010). As alterações cromossômicas induzidas pela translocação levam a fusão dos genes PML que também são um fator de transcrição da linhagem mieloide e do gene do receptor de ácido retinoico (RARα), o que resulta em um gene modificado relacionado à síntese de uma oncoproteína quimérica denominada PML/RARα. Essa proteína atua bloqueando a diferenciação mielocítica, ainda que permita a maturação de mielócitos na presença de níveis farmacológicos de ácido retinoico (VILLA et al., 2004; ZHOU et al., 2005; GARCÍA et al., 2006; VITOUX et al., 2007). Como consequência, a maturação da célula é interrompida nesse estágio seguida por uma proliferação descontrolada, possivelmente gerada por outro evento genético ainda desconhecido (GARICOCHEA, 1999). Este subtipo de leucemia possui um fármaco específico para o seu tratamento, o ácido all-trans-retinoico (ATRA). O ATRA é um metabólito natural derivado do retinol, pertence à

17 16 classe dos retinoides e é capaz de atuar na medula óssea, como terapia de diferenciação celular, onde ocorre uma facilitação da pró-apoptose celular e o crescimento das células leucêmicas é inibido. Este tratamento aumenta a sobrevida dos pacientes em 80% e a remissão da doença aumenta em 90% (KOTOWSKI et al., 2007; MORESCO et al., 2011). Apesar da eficácia do tratamento com ATRA, 5% a 20% dos pacientes desenvolvem uma reação grave ao fármaco, conhecida como Síndrome de Diferenciação da LPA, a qual é considerada gravíssima e apresenta consideráveis índices de letalidade (LEAL et al., 2009; MORESCO et al., 2011). Devido a isso, diversos estudos vêm sendo desenvolvidos, com o objetivo de diminuir essas desvantagens e efeitos do ATRA, através de diferentes sistemas de entrega, como por exemplo, as nanocápsulas, as quais, quando em conjunto com o fármaco, melhoram a solubilidade, fotosensibilidade, toxicidade, estabilidade química, a biodisponibilidade e/ou eficácia (FACHINETTO et al., 2008). 1.1 JUSTIFICATIVA Neste contexto, uma questão em aberto, a qual foi objeto de estudo do presente trabalho, é se o ATRA nanoencapsulado poderia reverter os níveis de produção de Espécies Reativas ao Metabolismo do Oxigênio (ERMOs) quando comparado ao ATRA livre, visando um potencial efeito terapêutico desta formulação, como a minimização dos efeitos da Síndrome da Diferenciação, diminuição dos níveis na indução de proliferação celular, indução da diferenciação molecular/celular e aumento da apoptose. 1.2 OBJETIVOS Objetivo Geral Avaliar o efeito de nanocápsulas contendo ácido all-trans-retinoico, através da ação antitumoral por via de diferenciação celular, ativação apoptótica e redução de níveis de ERMOs em cultura de células de leucemia promielocítica aguda Objetivos Específicos - Co-validar método para desenvolvimento e produção das suspensões de nanocápsulas; - Caracterizar as suspensões de nanocápsulas por métodos físico-químicos; Utilizando-se células de LPA, linhagem NB4, buscou-se avaliar: - A capacidade antiproliferativa in vitro da formulação de ATRA nanoencapsulado;

18 17 - A capacidade da nanoformulação de induzir apoptose nestas células e determinar a via de morte celular programada; - A capacidade desta formulação de interferir no ciclo celular e; - A indução ou repressão da transcrição de genes relacionados à ativação ou inibição das rotas apoptóticas, vias de controle do ciclo celular e de diferenciação molecular/celular. 1.3 INTERDISCIPLINARIDADE Cada ciência possui a sua singularidade e essa compreensão se faz necessária para entender que, considerando a inteligência humana e a pluralidade do conhecimento científico, a interdisciplinaridade é uma exigência para o desenvolvimento científico contemporâneo. De acordo com esses conceitos, para o trabalho pretendido se faz necessário a utilização e o conhecimento de várias disciplinas (VEIGA-NETO, 1996). Primeiramente, é preciso entender os conceitos farmacológicos, para a compreensão do comportamento do fármaco em questão. É preciso também, que se tenha conhecimento sobre hematologia e oncologia, tendo em vista os processos e mecanismos das LMAs e seus subtipos, abordados no trabalho. Já o conhecimento das ciências biológicas vem de encontro à necessidade de compreensão acerca do organismo humano e seus sistemas, para que se possa avaliar corretamente os conceitos de saúde e doença e, também, para que se possa entender com maior amplitude a maquinaria biológica das células. Com relação a utilização de nanocápsulas, os conceitos de nanociências e nanotecnologia, indubitavelmente são necessários. 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA) Denominadas células-tronco ou stem cells, estas células indiferenciadas pluripotentes têm por função dar origem aos elementos celulares sanguíneos, os quais chamamos de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. Na medula óssea, as células pluripotentes possuem capacidade de auto-renovação e conseguem se diferenciar, possibilitando originar as séries eritoblástica, granulocítica, megacariocítica e originar também linfócitos B do sangue periférico, as quais estarão presentes no sangue circulante (LORENZI, 2005). Em alguns casos, porém, a interrupção da hematopoese normal, causada por progenitores hematopoiéticos imaturos que se expandem na medula óssea, configura um grupo heterogêneo de doenças, formado pelas leucemias mieloides agudas (LMAs). Dentre essas leucemias, a LPA constitui um subtipo específico, no qual ocorre uma translocação entre os

19 18 cromossomos 15 e 17 t(15;17), ocasionando um acúmulo de células leucêmicas parecidas com promielócitos e a maturação das células de linhagem mieloide é interrompida na medula óssea (JÁCOMO et al., 2008). A Organização Mundial da Saúde (OMS) utiliza critérios clínicos, morfológicos e citogenéticos e/ou moleculares para a identificação dos subtipos de LMA, com base na presença ou ausência de anormalidades genéticas recorrentes específicas. Por exemplo, a presença do rearranjo citogenético t(15;17)(q22;q12) ou o produto de fusão PML-RARα da translocação embasam o diagnóstico de LPA (KASPER et al., 2017), conforme figura 1. Figura 1 - Ilustração da translocação entre os cromossos 15(q22) e 17(q12). Fonte: Jácomo e cols (2008). De um modo geral, toda e qualquer leucemia aguda apresenta quadro clínico semelhante, onde a medula óssea encontra-se infiltrada por células leucêmicas, destacando-se os seguintes sinais e sintomas: cansaço, devido a anemia (diminuição da hemoglobina) normocítica e normocrômica; risco de infecções graves, devido a neutropenia (pequena quantidade de neutrófilos), risco de sangramentos, devido a plaquetopenia significativa (diminuição das plaquetas) e leucocitose acentuada (aumento dos leucócitos) com predomínio de mieloblastos (NAOUM, 2010). Na LPA, ocorre proliferação e acúmulo de muitos promielócitos anômalos na medula óssea, com núcleo fendido e intensa granulação citoplasmática. Usualmente o hemograma neste tipo de LMA revela pancitopenia (diminuição dos elementos figurados do sangue: plaquetas, hemácias, leucócitos) e alguns pacientes podem apresentar leucocitose (aumento do número de leucócitos) (NAOUM, 2010). Em termos citológicos a LPA apresenta morfologia celular característica com promielócitos anormais, núcleo excêntrico e abundantes granulações no citoplasma. Caracteriza-se, também, pela presença de múltiplos bastonetes de Auer no citoplasma,

20 19 formando feixes que conferem a essas células a denominação de Faggot cells (células com maços ou feixes) (SAGRILLO et al., 2005), conforme figura 2. Figura 2 - Promielócito hipergranulocítico com inúmeros Faggot cells. Fonte: Sainty e cols (2000). A principal complicação clínica do paciente com LPA é a coagulação intravascular disseminada (CIVD), a qual se dá devido a liberação de conteúdo pró-coagulante, contido nos grânulos dos promielócitos anômalos. A CIVD se caracteriza por provocar hemorragias graves e alterações laboratoriais como alongamento dos tempos de protrombina e tromboplastina (NAOUM, 2010). 2.2 AVALIAÇÃO PRÉ-TRATAMENTO Com relação ao diagnóstico das LPA, morfologicamente a confirmação deste se dá através da análise citogenética e avaliação molecular das células (SAGRILLO et al., 2005). Apesar de bastante sugestivo, na LPA o diagnóstico morfológico é considerado insuficiente (LEAL et al., 2009). Geneticamente, o diagnóstico pode ser obtido pela detecção do gene híbrido PML-RARα através da RT-PCR reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para constatação e demonstração da t(15;17) (LO-COCO et al., 2013). Outras alternativas para esta detecção são a citogenética convencional e o método de Fluorescence in

21 20 situ hybridization (FISH) (JÁCOMO et al., 2008). Por isso, muitos laboratórios, têm aliado à sua rotina o diagnóstico e monitoramento a nível molecular, para doenças oncológicas e genéticas, as técnicas de FISH e Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SAGRILLO et al., 2005). O método de FISH, apesar de ter menor sensibilidade, apresenta maior especificidade quando comparado à RT-PCR. A rapidez do diagnóstico da LPA, reflete diretamente no prognóstico da doença e inclusive na instituição da terapêutica específica a ser aplicada (JÁCOMO et al., 2008). A ocorrência da translocação t(15;17) ocasiona a formação de uma oncoproteína quimérica, onde há o envolvimento do gene receptor alfa do ácido retinoico (RARα) e do gene promotor promielocítico (PML), ocorrendo então uma fusão dos genes PML-RARα e RARα- PML. Essa oncoproteína ao se ligar a promotores que possuem elementos de resposta ao ácido retinoico, recruta histonas desacetilases (HDAC) para esses promotores, inibindo com êxito a expressão gênica. Com isso, há um bloqueio no processo de diferenciação no estágio de promielócito, ocorrendo então proliferação e sobrevivência de células tumorais (KASPER et al., 2017). De maneira resumida, a fusão implica no bloqueio da expressão de um dos genes que participam da diferenciação mieloide, agindo como um repressor da transcrição (COLTELLA et al., 2014). Localizado no cromossomo 15, o gene PML não tem funções bem definidas. Este gene possui 9 éxons e controla a estabilidade cromossômica, pois é um gene de supressão tumoral (LEAL et al., 2009). Fatores de transcrição evidenciam homologia estrutural e devido a isso acredita-se que este gene codifique um fator de transcrição (STRAPASSON, 1996). Localizado no cromossomo 17, o gene RARα é um receptor nuclear de hormônios e atua como regulador da transcrição. O receptor alfa do ácido retinoico é codificado pelo gene RARα e atua como regulador da transcrição, podendo se ligar a regiões específicas do DNA, com papel fundamental na diferenciação de células mieloides (LEAL et al., 2009), conforme figura 3. Figura 3 - Ilustração dos genes PML (cromossomo 15) e RARα (cromossomo 17) antes da translocação. Fonte:

22 21 Em geral as translocações envolvendo o gene RARα levam a uma repressão gênica deste receptor que contribui para o bloqueio da diferenciação mieloide, ocorrência de desregulação do ciclo celular e vantagem proliferativa. Estas alterações culminam com a transformação leucêmica (MELNICK, 1999; WANG, 2008; SAEED et al.,2011). A translocação cromôssomica t(15;17) é capaz de gerar produtos de diferentes tamanhos, pois o ponto de quebra no gene PML tem variabilidade. São eles: o longo, o variável e o curto. Estes três subtipos de transcritos do gene híbrido PML-RARα decorrem de três diferentes sítios onde podem haver as quebras cromossômicas (LEAL et al., 2009). Portanto, indubitavelmente, para o diagnóstico de LPA, faz-se necessário o conhecimento das alterações cromossômicas presentes, seja por técnicas de biologia molecular e/ou métodos de citogenética (SANTOS et al., 2004). Nos diferentes tipos de cânceres, frequentemente se observam mutações nos receptores de tirosina-quinase (RTK). Nas leucemias mieloides agudas, sabe-se que em 90% dos casos se expressa a tirosina-quinase 3 do tipo FMS (FLT3), sendo esta uma RTK do tipo III. A duplicação interna em tandem (ITD) é a mutação mais prevalente do gene FLT3, onde os doentes com LMA com FLT3-ITD tem péssimo prognóstico. O FLT3 atua no desenvolvimento de linhagens mieloides e linfoides, pois codifica um receptor de tirosina-quinase importante. Com isso, ocorre uma ativação da proteína codificada, a qual causa um amento significativo da proliferação e dos sinais apoptóticos na célula progenitora mieloide, bloqueando a diferenciação (KASPER, 2017; MOLONEY, 2017). Estudos recentes demonstram que as células que expressam o gene FLT3-ITD produzem níveis altíssimos de ERMOs devido diversos fatores fisiopatológicos da leucemia, porém os estudos na literatura ainda são insuficientes ao explicar como o FLT3-ITD gera tal estresse (MOLONEY et al., 2017). 2.3 TRATAMENTO No período inicial do tratamento, a LPA apresenta altas taxas de mortalidade precoce e isso se dá principalmente pelo fato da LPA, diferentemente das outras leucemias mieloides agudas, estar associada à coagulopatia, que corresponde em cerca de 60% a 90% dos pacientes. Distúrbios de coagulação, anemia, organomegalia e trombocitopenia estão entre os sintomais mais comuns dos pacientes acometidos por LPA. Rapidamente, estes paciente podem ir a óbito, em decorrência de alterações laboratoriais e quadro clínico associado à coagulação intravascular disseminada (CIVD) (SAGRILLO et al., 2005; JÁCOMO et al., 2008). Em 1988, em Shangai, Huang introduziu o ATRA na terapêutica de pacientes com LPA

23 22 e mudou o cenário da doença na época, pois obeteve êxito de 85% de remissão nos pacientes em tratamento. Em 1997, o Grupo Italiano para Doenças Hematológicas Adultas (GINEMA), relatou a associação do ATRA com antraciclinas no tratamento de pacientes com LPA, obtendo altas taxas de remissão da doença e incentivando a sobrevida livre, bem como as taxas de sobrevivência global. Em 1999, Sanz e cols., ao constatar leucocitose e plaquetopenia no pacientes com LPA, decidiram incluir o ATRA no grupo de quimioterápicos utilizados no tratamento e perceberam melhorias na resposta clínica dos pacientes (CRESPO-SOLIS et al., 2016). A associação entre quimioterapia baseada em antraciclina e ácido all-trans-retinóico (ATRA), resulta em altas taxas de cura, superior a 80% e de total remissão da doença de até 95%. Devido a isso, atualmente, a LPA é uma doença com grande possibilidade de cura e esta combinação farmacêutica é considerada como tratamento padrão para os doentes recentemente diagnosticados com este tipo de leucemia (LO-COCO et al., 2013). Conforme foi anteriormente comentado, o curso clínico da leucemia promielocítica aguda tem sido modificado, nos últimos anos, de uma leucemia aguda rapidamente fatal para um dos subtipos de leucemia mieloide aguda mais curável. Este revolucionário progresso no prognóstico da doença está associado essencialmente aos avanços notáveis em seu tratamento, mais especificamente com a introdução de novos agentes terapêuticos que atuam diretamente na alteração molecular, como é o caso do ácido retinoico derivado da vitamina A (ATRA) e do trióxido de arsênio (ATO). Estas terapêuticas são consideradas como o primeiro exemplo de sucesso de terapia alvo molecular relacionada com a indução da diferenciação celular e apoptose (SANZ et al., 2009). Isto porque o ATRA, em doses farmacológicas, induz a diferenciação celular das células neoplásicas. Dessa forma, o clone leucêmico progride na maturação mieloide, tornando-se suscetível aos mecanismos de morte celular programada (JÁCOMO et al., 2008). O ATRA faz parte da primeira geração de retinóides e é um produto metabólico da vitamina A, assim como a tretinoína (TTN). A TTN é um retinóide natural que, semelhantemente a isotretinoína, é um isômero cis do ácido all-trans-retinóico e é amplamente utilizada no tratamento tópico de diversas patologias dermatológicas e também de neoplasias (FACHINETTO et al., 2008). A TTN, que aprensenta altíssima instabilidade química, possui uma biodisponibilidade variável entre os pacientes e apresenta pequena solubilidade em meio aquoso, quando do seu uso por via oral ou parentérica (OURIQUE et al., 2011). Estudos têm demonstrado que a oncoproteína de fusão PML-RARα é o alvo direto do ATRA, uma vez que o medicamento leva a sua degradação. As concentrações farmacológicas

24 23 desse medicamento ( M) induzem diferenciação do promielócito leucêmico e a seguir a apoptose. Assim, o ATRA quando administrado por via oral, é dirigido para a proteína de fusão α do receptor de ácido retinóico (RAR), onde irá atuar na oncoproteína PML-RARα induzindo os promielócitos neoplásicos a se diferenciarem a granulócitos maduros; com isso, ocorre uma diminuição dos eventos hemorrágicos no paciente (KASPER et al., 2017). Esta oncoproteína PML-RARα também é alvo do trióxido de arsênio (ATO) (AS2O3). Pesquisas indicam que a região rica em cisteína do motivo PML da oncoproteína é a principal candidata para interagir com o ATO (REITER et al., 2004). Agente medicinal há mais de 2000 anos, o ATO atua na terapêutica da LPA através de duas funções dose dependentes: indução de apoptose via caspase (em altas concentrações) e diferenciação celular incompleta (em baixas concentrações). O processo de diferenciação se dá, pois, o ATO consegue degradar o produto de fusão dos genes PML-RARα levando a uma liberação do bloqueio da maturação (LORENZI, 2006). Pesquisas têm demonstrado que o ATRA, em combinação com o ATO, atua de forma sinérgica, aumentando a degradação da oncoproteína de fusão e a indução de apoptose celular, o que representa uma explicação plausível para os bons resultados observados na clínica (REITER et al., 2004). Dado o sucesso desta terapia, o tratamento com ATRA deve ser iniciado imediatamente diante da suspeita morfológica, mesmo antes da confirmação genética do diagnóstico, pois leva à melhora da coagulopatia e a diminuição do risco de sangramento grave. Entretanto, apesar de seu uso como monoterapia levar à remissão hematológica, todos os pacientes apresentam recaída. Assim, exceto para os pacientes com alguma contra-indicação clínica, o ATRA deve ser administrado junto à medicamentos antracíclicos (JÁCOMO et al., 2008). Com o esquema combinado (ATRA e antracíclico), alcança-se remissão molecular em até 99% dos pacientes, com sobrevida livre de doença de 90% aos cinco anos do diagnóstico (REITTER et al., 2004). O tratamento é usualmente dividido em três fases: indução de remissão, consolidação e manutenção. As duas primeiras fases são fundamentadas no uso de ATRA e algum antracíclico, enquanto que a última fase é composta pela administração de ciclos de ATRA associado à metotrexate e mercaptopurina em baixas doses (JÁCOMO et al., 2008). O mecanismo de ação terapêutica proposto é a indução à diferenciação dos precursores leucêmicos em células maduras. O ATRA exerce um efeito negativo no complexo PML/RARα, quebrando a proteína quimérica além do complexo nuclear diacetil-histona (PINHEIRO et al., 2003).

25 24 Apesar da excelente resposta ao ATRA em pacientes com LPA associada ao PML- RARα, os portadores de outras translocações envolvendo o RARα apresentam sensibilidade variável à medicação. Nesses grupos, outras opções devem ser buscadas para o tratamento, como o arsênico e outros agentes diferenciadores (JÁCOMO et al., 2008). Sendo assim, atualmente o tratamento molecular da LPA envolve a utilização do ATRA associada à antraciclina combinada com ATO. O uso destes medicamentos apresenta alta eficiência no controle e remissão da LPA, apesar de existirem ainda alguns casos de recidivas da doença (PINHEIRO et al., 2013). O ATRA e o ATO possuem atividade específica para cada alvo da proteína de fusão PML/RARα e isso serve como base molecular para terapias direcionadas e altamente eficazes (SHIGETO et al., 2016). Países em desenvolvimento relataram que o uso do ATRA e do ATO levaram pacientes em tratamento para LPA a morte, causada por hemorragia seguida de síndrome de diferenciação, o que tornou o uso destes quimioterápicos proibido para determinados pacientes (CRESPO-SOLIS et al., 2016). As terapias antitumorais têm como objetivos principais inibir a proliferação descontrolada das células alteradas, apresentar um índice eficaz de remissão do tumor e baixa incidência de efeitos adversos. Dentre os tratamentos para os diversos tipos de câncer, algumas abordagens vêm se destacando muito na literatura: indução da diferenciação celular, controle de proliferação e indução de apoptose (BROWN e HUGUES, 2012). 2.4 APOPTOSE: VIAS INTRÍNSECA E EXTRÍNSECA Na década de 70, o termo apoptose foi utilizado pela primeira vez e designava uma forma fisiológica de morte celular, podendo ocorrer conforme um programa genético, dando origem a um processo de autodigestão controlada, de acordo com a remoção de células lesadas ou envelhecidas, sem que haja a alteração do microambiente celular (ANAZETTI e MELO, 2007). Devido ao fato de muitas doenças estarem envolvidas em processos apoptóticos, surgiu então o interesse de estudos acerca da apoptose. Algumas delas, tais como doenças neurodegenerativas, Parkinson, Alzheimer, Atrofia Muscular Espinhal ou síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), são causadas por um excesso de processos apoptóticos, enquanto outras são causadas por uma diminuição desses processos, como por exemplo, o câncer (seja ele por infecção viral ou por mutações de DNA, através das proteínas p53 e BCL- 2) ou doenças Auto-imunes (Diabetes do tipo I e Encefalomielite). Muitas toxinas ou outros estresses celulares, como o oxidativo, podem também levar a apoptose. Sendo assim, a apoptose

26 25 está associada tanto a mudanças físicas como bioquímicas, que abrangem citoplasma, núcleo e membrana plasmática (LAWEN, 2003). A apoptose é considerada um processo ativo e fisiológico, ocorrendo todo o tempo no organismo. É indispensável para a homeostase do tecido normal e pode atuar como um contrapeso para a proliferação celular (TCHERNEV e NENOFF, 2009). Em linhas gerais, durante o fenômeno de apoptose ocorre uma retração da célula, levando a uma perda da aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. As organelas celulares mantêm a sua morfologia, na exceção de alguns casos em que as mitocôndrias podem apresentar ruptura da membrana externa. A cromatina condensa e se concentra junto à membrana nuclear, no entanto essa se mantém intacta. Após esses acontecimentos, a membrana celular forma prolongamentos, denominados blebs, e o núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana nuclear, fazendo com que os prolongamentos da membrana celular aumentem de número e tamanho, rompendo-se então e dando origem a estruturas que contém o conteúdo celular, denominados corpos apoptóticos. Todo esse processo ocorre em um curto período, que varia de 15 a 20 minutos (BIBHAS e SIVAMANI, 2010). Uma vez que os corpos apoptóticos são englobados por uma membrana plasmática intacta, a apoptose ocorre geralmente sem vazamento do conteúdo celular e sem inflamação. Quando a apoptose ocorre em situações que as células fagocíticas não são capazes de remover, pode ser então desencadeado um processo de necrose. Isso ocorre geralmente em culturas celulares, pois as células fagocíticas especializadas estão, na maioria das vezes, ausentes (GRIVICICH et al., 2007). Cada avanço científico recente envolvendo a apoptose foi gradativamente incorporado em uma sequência lógica de suicídio celular, conhecido por Morte Celular Programada (MCP). Este processo faz parte do ciclo de vida de animais e plantas multicelulares por causar a ativação de vias bioquímicas codificadas no genoma, por ser muito importante para o desenvolvimento celular normal e para as respostas imunológicas (ao controlar o número de células e estruturas que se formam e se desfazem), e também por eliminar as células danificadas ou infectadas (RASTOGI et al., 2009). Além disso, há a participação do gene supressor p53. Tudo isso culmina na ativação de caspases iniciadoras e efetoras, levando às alterações celulares e à morte. A via Extrínseca acontece por meio da interação receptor-ligante, como por exemplo o Fas e o receptor de TNF. Isso ativará uma cascata de proteínas adaptadoras, que também culminará na ativação das caspases (RUEDA et al., 2011). Nestes processos ocorre a participação de moléculas pró-apoptóticas como a Fas, Fas-

27 26 L, Bax, e Caspases 2, 3, 6, 7, 8 e 9, que são capazes de provocar drásticas alterações morfológicas e funcionais. Porém esse processo pode ser inibido pela ativação de moléculas anti-apoptóticas, Bcl-2 ou FLIP, que são capazes de bloquear o surgimento e a evolução destas alterações celulares, fazendo com que a homeostase dependa do balanço entre a ativação de moléculas pró e anti-apoptóticas (FERREIRA et al., 2010). Muitos fatores podem induzir o processo de apoptose através da ativação de moléculas pró-apoptóticas, alguns deles são lesões do DNA, sejam elas causadas por radiação ionizante, agentes quimioterápicos, privação de fatores de crescimento e nutrientes, choque térmico ou acúmulo intracelular de reativos tóxicos de oxigênio. Já os fatores de matriz extracelular, (zinco, alguns aminoácidos e hormônios esteroides e não esteroides) são inibidores de apoptose e atuam modulando a ativação de moléculas anti-apoptóticas (FERREIRA et al., 2010). Os principais mediadores de apoptose são enzimas denominadas caspases. Essas enzimas, conhecidas assim por possuírem cisteína no seu sítio ativo, ligam suas proteínas alvo em ácidos aspárticos específicos (SHAO et al., 2004). São responsáveis pela quebra de substratos que contenham resíduos de ácido aspártico, tal como a enzima poli-adp-ribosepolimerase, proteínas reguladoras de ciclo celular, proteínas estruturais, como laminina e actina, dentre outras (BOATRIGHT e SALVESEN, 2003). São reconhecidos mais de 14 tipos de caspases em humanos e a maior parte delas têm propriedade pró-apoptótica. As caspases 1, 4 e 5 são muito importantes no processo inflamatório, enquanto as caspases 2, 3 e 10 estão, predominantemente, se não exclusivamente, envolvidas na apoptose (FERREIRA et al., 2010). Elas podem ser classificadas como iniciadoras (caspases 8 e 10) ou executoras (caspases 1, 3 e 7), porém depende de qual processo na apoptose elas estão envolvidas para que haja essa classificação. Estudos genéticos mostram que a apoptose, assim como qualquer outro processo metabólico, pode ser interrompida por mutação (LOWE, LIN, 2000). Há três vias pelas quais as caspases podem ser ativadas. As duas vias principais de iniciação são as intrínsecas (também conhecidas como vias mitocondriais) e as extrínsecas, ou receptoras de morte, sendo que ambas as vias, eventualmente, levam a uma via comum ou à fase em que ocorre a execução da apoptose. Há também um terceiro caminho de iniciação, porém menos conhecido, denominado via intrínseca do retículo endoplasmático (WONG, 2011). A apoptose pode ser ativada por vários fatores como a remoção de sinais químicos da célula (fatores de crescimento ou de sobrevivência), mensagens químicas ignoradas por alguns receptores internos e externos ou pela presença de sinais com informação contraditória

28 27 (THOMAS et al., 1996). Pode ocorrer como sinal apoptótico externo, a ativação de receptores da superfície celular, como FAS-receptor. O FAS-ligante se liga ao FAS-receptor da membrana - chamados "death receptors", clivam o fator de ativação de proteases apoptóticas (FAPA), iniciando a cascata de caspases (MEIER et al., 2000). Figura 4 - Ativação das caspases por sinal apoptótico externo. Fonte: Thomas et al. (1996). A via intrínseca é iniciada dentro da célula, sendo então desencadeada através de estímulos internos, como danos genéticos irreparáveis, hipóxia, concentrações extremamente elevadas de Ca 2+ citosólico e estresse oxidativo grave (WONG, 2011). Independentemente dos estímulos à qual é submetida, é resultado do aumento da permeabilidade mitocondrial e da liberação de moléculas pró-apoptóticas dentro do citoplasma, tais como citocromo C (DANIAL e KORSMEYER, 2004). Essa via está regulada, quase que totalmente, por um grupo de proteínas que pertencem à família Bcl-2, sendo assim nomeadas em homenagem ao gene Bcl- 2, observado originalmente no ponto de interrupção cromossômico da translocação do cromossomo 18 para o 14 no linfoma folicular não-hodgkin (WONG, 2011). As proteínas Bcl-2 são divididas em dois grupos principais, denominadas proteínas próapoptóticas (Bax, Bak, Bad, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bim e HRK) e proteínas anti-apoptóticas (Bcl- 2, Bcl-X L, Bcl-W, Bfl-1 e Mcl-1). As proteínas anti-apoptóticas regulam a apoptose através do bloqueio da liberação mitocondrial do citocromo-c, enquanto as proteínas pró-apoptóticas agem

29 28 promovendo essa liberação, sendo que é o equilíbrio entre essas proteínas que determina se a apoptose será iniciada (WONG, 2011). 2.5 CICLO CELULAR Essencial para o desenvolvimento normal e para a realização do processo de reposição das células normais do indivíduo, o ciclo celular atua com o objetivo de manter um equilíbrio entre proliferação celular e a manutenção da quantidade de células nos tecidos. Para este equilíbrio ser mantido, ocorre no organismo o que chamamos de morte celular programada (apoptose) (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2005). Ainda de acordo com Junqueira e Carneiro (2005), o ciclo celular compreende duas etapas: uma de crescimento, chamada de intérfase e outra de divisão celular, chamada mitose. O ciclo é reiniciado pelas células originadas e através dessas repetições permite que o número de células aumente exponencialmente. A intérfase pode ser dividida em 4 períodos: G0, G1, S e G2. No período G0, desprovidas de fatores de crescimento, as células não recebem estímulos para se dividir, podendo permanecer assim por horas, dias, anos ou a vida inteira. Em G1 a célula pode continuar se multiplicando, reiniciando então a sua síntese de RNA e proteínas ou pode retirar-se do ciclo e entrar em estado de quiescência. No período S a célula passa por um processo de replicação, no qual o seu DNA é duplicado e elabora cópias perfeitas para que novas células possam ser originadas. Na fase G2 ocorre síntese de RNA e de outras estruturas necessárias para iniciar a divisão celular (VERMEULEN et al., 2003; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2005 e MADDIKA et al., 2007). Dentro do ciclo celular há pontos específicos, chamados pontos de checagem, nos quais pode haver parada ou atraso do ciclo caso alguns eventos anteriores não tenham sido concluídos. Se houver a identificação de dano no DNA, mecanismos de bloqueio são acionados para que a progressão através de G1 e G2 seja atrasada. Este atraso tem por objetivo permitir que o DNA danificado seja reparado, evitando que as células se dupliquem descontroladamente gerando células tumorais (VERMEULEN et al., 2003). A tumorigênese é promovida por modificações genéticas associadas à uma desregulação da progressão do ciclo celular durante o período G1. É neste período que pontos de checagem podem agir regulando a progressão de ciclo, seja através da inibição ou da proliferação celular (FOSTER et al., 2010). Muitos agentes terapêuticos que induzem parada irreversível do ciclo celular têm sido estudados (VANGESTEL et al., 2009). Um exemplo é o ATRA que, dentre outras ações, induz

30 29 parada do ciclo celular em G1, diferencia as células tumorais em normais e continua o ciclo até obter o Limite de Hayflick, para posteriormente acionar a apoptose em função da senescência celular (SOPRANO; QIN; SOPRANO, 2004). Apesar de possuir diversos efeitos farmacológicos, a aplicação terapêutica do ATRA via oral é bastante limitada também devido aos intensos efeitos adversos de hipervitaminose, os quais ocorrem mesmo em concentrações terapêuticas. Entretanto, este tratamento requer acompanhamento e suporte médico intensivo, já que, além dos efeitos adversos comuns aos retinoides, cerca de 25% dos pacientes em uso de ATRA desenvolvem a chamada síndrome de diferenciação em LPA (SANTOS et al., 2004). 2.6 SÍNDROME DA DIFERENCIAÇÃO EM LPA O ATRA tem um bom efeito no tratamento de pacientes com LPA, porém entre o 1º e 22º dia do tratamento, podem surgir algumas complicações em alguns pacientes, caracterizando a denominada sindrome de diferenciação em LPA. Esta é uma sindrome grave, que atinge de 6% a 27% dos pacientes em tratamento para LPA, os quais apresentam como sintomas sistêmicos: derrame pleural, hemorragia, hipotensão arterial, insuficiência renal, edema generalizado, insuficiência respiratória, infiltrado pulmonar na radiografia e febre, podendo levar ao óbito (SANTOS et al., 2004). As propriedades redox dos retinoides vem despertando atenção entre a comunidade científica desde os anos 80, quando se verificou que algumas complicações clínicas advindas do tratamento com derivados do ácido retinoico, poderia ser provinda de desequilíbrios oxidativos celulares (BROWN & GOODMAN, 1998). Este desequilíbrio redox é oriundo da formação de ERMOs e de espécies reativas ao metabolismo do nitrogênio e seu provável envolvimento em algumas fisiopatologias humanas, vêm atraindo o interesse de diversos setores da sociedade envolvidos com a saúde pública. O estresse oxidativo, causado pelo desbalanço entre os sistemas antioxidantes e a produção de compostos oxidativos aparentemente está associado com diversas doenças de cunho multifatorial, especialmente os vários tipos de câncer, doenças cardiovasculares e desordens inflamatórias. Os mecanismos pelos quais essas patologias se desenvolvem, geralmente envolvem alterações oxidativas de moléculas consideradas críticas, o que inclui proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos além das substâncias envolvidas na modulação da expressão gênica e em respostas inflamatórias (LAGUERRE et al., 2007).

31 ESTRESSE OXIDATIVO O processo de desbalanço oxidativo celular favorece a oxidação de biomoléculas com consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio homeostático (BARBOSA et al., 2010). Este desequilíbrio ocorre quando a produção de ERMOs está acelerada ou quando os mecanismos envolvidos na proteção contra as ERMOs encontram-se deteriorados, cuja manifestação é o dano oxidativo potencial contra células e tecidos. Toda célula viva exposta em uma atmosfera rica em oxigênio é passível de danos causados por ERMOs que podem ser originadas tanto exógena quanto endogenamente (BARBOSA et al., 2010). Compreendendo as etapas da formação de radicais livres como o ânion superóxido (O2) pode-se verificar que os radicais livres são formados em um cenário de reações de óxidoredução, isto é, ou cede o elétron solitário, oxidando-se, ou recebe outro, reduzindo-se. Portanto, os radicais livres ou provocam ou resultam dessas reações de óxido-redução (HALLIWELL, 1992). Na verdade, radical livre não é o termo ideal para designar os agentes reativos patogênicos, pois alguns deles não apresentam elétrons desemparelhados em sua última camada. Como em sua maioria são derivados do metabolismo do O2, no decorrer deste texto utilizaremos o termo "espécies reativas do metabolismo do oxigênio" (ERMOs) para referirmonos a eles (HALLIWELL, 1992). As ERMOs são encontradas em todos os sistemas biológicos em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, onde o oxigênio (O2) sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de H2O. Durante esse processo são formados intermediários reativos, como os radicais superóxido (O2 -. ), hidroperoxila (HO2. ) e hidroxila (OH), e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Normalmente, a redução completa do O2 ocorre na mitocôndria, e a reatividade das ERMOs é neutralizada com a entrada dos quatro elétrons (HALLIWELL, 1990). O peróxido de hidrogênio (H2O2) é um dos oxidantes mais versáteis que existe, é superior ao cloro, dióxido de cloro e permanganato de potássio; através de catálise, H2O2 pode ser convertido em radical hidroxila ( OH). Para o combate do câncer o organismo se defende através de mecanismos de defesas naturais que o protegem das agressões impostas por diferentes agentes que entram em contato com suas diferentes estruturas (INCA, 2008). O organismo humano possui sistemas de defesa para lidar com o estresse oxidativo. Essa defesa inclui sistemas enzimáticos (superóxido dismutase, catalases, glutationa peroxidase e sistemas tioredox) que são reconhecidamente muito eficientes na detoxificação de ERMOs (McLEAN et al., 2005). Os sistemas antioxidantes estão alterados durante a carcinogênese, em especial a enzima

32 31 superóxido dismutase (SOD). É claro que essa condição de oxidação celular pode variar, e muito, entre os organismos, tipos celulares e até mesmo entre células de um mesmo tecido, uma vez que cada célula possui uma capacidade antioxidante muitas vezes diferenciada. Sobre a relação entre ERMOs e câncer, hoje se sabe que as células tumorais apresentam maiores taxas dessas espécies em relação às células normais. Esse fenômeno ocorre devido a vários fatores, como a alta taxa metabólica. Esta característica parece ser importante para a sobrevivência das células tumorais e para a progressão da doença (KUMAR et al., 2008). Alguns quimioterápicos são conhecidos por aumentar as ERMOs e acredita-se que estes fármacos podem ser seletivos uma vez que o limiar de toxicidade é atingindo mais rapidamente nas células tumorais já que os níveis de ERMOs são elevados nestas células (KUMAR et al., 2008). Em função dos inúmeros efeitos adversos apresentados por esta classe de fármacos, a utilização da nanotecnologia seria uma alternativa pois permite direcionar o fármaco para o seu tecido ou célula-alvo, além de minimizar o desequilíbrio redox e a produção de radicais livres, reduzindo os efeitos colaterais (ROSSI-BERGMANN, 2008). Além disto os fármacos nanoencapsulados aumentam a eficácia, a especificidade, a tolerabilidade e o índice terapêutico do medicamento utilizado, através de uma liberação controlada, progressiva, a partir da degradação da matriz polimérica, além de reduzir os riscos com toxicidade, em comparação aos sistemas convencionais (KUMARI et al., 2009). 2.5 NANOTECNOLOGIA Os avanços recentes da nanotecnologia têm aumentado a utilização de nanoestruturas para diagnóstico, terapias e outros fins tecnológicos. O conhecimento da interação entre nanomateriais e meios biológicos permite a descoberta de aplicações mais racionais, podendo ajudar a entender e antever os seus efeitos adversos e citotóxicos (SAHAY, ALAKHOVA e KABANOV, 2010). Na área farmacêutica, a nanotecnologia tem sido alvo de destaque no que diz respeito à novas formulações, devido à sua interdisciplinaridade, abragendo áreas como biologia, química, física e medicina. As nanoestruturas apresentam diferentes propriedades e diferentes características de liberação de fármacos incorporados, ou seja, para a confecção delas, existe uma diversidade de possíveis materiais de escolha (VAUTHIER et al., 2003; PUTHETI, et al., 2008). A nanotecnologia e a nanociência englobam um campo do conhecimento onde materiais podem ser desenvolvidos e aplicados em escala nanométrica, ou seja, envolvendo uma escala

33 32 de partículas muito pequenas. Devido a isso, as nanoestruturas apresentam propriedades físicoquímicas bem distintas, sendo muito mais solúveis e apresentando um maior potencial de atravessar membranas e barreiras celulares (MANSOORI et al., 2002; YANG et al., 2008). Um exemplo de nanopartícula, são as nanocápsulas, as quais se caracterizam por terem um núcleo lipofílico, envolto por uma camada polimérica, podendo o fármaco ser dissolvido no óleo, ou seja, estar disperso dentro da nanoestrutura, ou podendo o fármaco estar adsorvido à camada. Estas nanocápsulas têm sido muito utilizadas como sistema de administração de fármacos, pois aumentam a eficácia da droga e diminuem a toxicidade (FACHINETTO et al., 2008). Um dos maiores desafios no desenvolvimento e uso de medicamentos para combater o câncer é conseguir levá-los aos tecidos doentes sem danificar outros órgãos. O tamanho da nanopartícula lhe confere propriedades especiais que determinam seu movimento no interior e através de tumores. Nanopartículas menores que 10 nm, como certos fármacos formados por pequenas moléculas, são rapidamente eliminados pelos rins, enquanto partículas maiores, de 100 nm, têm dificuldade de se mover pelo tumor (JAMES et al., 2008). Partículas na faixa de 10 nm a 100 nm deslocam-se pela corrente sanguínea à procura de tumores, embora sejam incapazes de escapar para a maioria dos tecidos sadios pelas paredes dos vasos sanguíneos. Pelo fato de tumores possuirem vasos sanguíneos anormais com paredes crivadas de poros grandes, as nanopartículas escapam para os tecidos que envolvem o tumor. Como resultado, tendem a se acumular nos tumores, enquanto minimizam os efeitos em outras partes do corpo, evitando os tradicionais e terríveis efeitos adversos provocados por fármacos anticâncer (HEATH e DAVIS, 2008). Mesmo quando um medicamento padrão consegue penetrar nas células tumorais, proteínas da maquinaria celular podem ejetar o fármaco antes que ele comece a agir, como um mecanismo natural de resistência. As nanopartículas penetram na célula por endocitose, processo natural que cria uma bolsa de membrana celular em torno de um objeto estranho, levando-o para dentro da célula e protegendo a carga de partículas das bombas celulares (DAVIS et al., 2008). A endocitose é um processo biológico dependente de energia que acontece com o rearranjo da membrana plasmática, dos microtúbulos, dos filamentos de actina e filamentos intermediários. Este processo é utilizado pela célula para internalizar nutrientes, realizar a transdução de sinais, reciclar receptores de membrana e fazer o transporte, ativo e passivo, através de células (DOHERTY e MCMAHON, 2009). Certos tratamentos para o câncer, que utilizam nanoestruturas para veiculação de

34 33 fármacos, que possuem o propósito de atingir células tumorais, já existem há algum tempo, como a doxorrubicina lipossomal por exemplo, que é um composto quimioterápico tradicional, dentro de uma cápsula de lipídeo, que tem sido usado para o tratamento do câncer ovariano e do mieloma múltiplo. A versão do fármaco revestido por lipídio apresenta muito menos toxicidade para o coração que a doxorrubicina sem revestimento, embora um novo efeito adverso tenha sido observado, a toxicidade da pele (HEATH et al., 2003). Novas nanopartículas, como por exemplo, a IT-101, que já passaram pela fase I dos testes clínicos de segurança para humanos, apresentam maior complexidade que lhes confere múltiplas funções. A IT-101 é uma partícula de 30 nm, formada por polímeros unidos à pequena molécula de camptotecina, que é muito semelhante a duas drogas quimioterápicas aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration): irinotecan e topotecan. As partículas de IT-101 foram criadas para circular na corrente sanguínea do paciente e lá permanecer durante 40 horas ou mais, enquanto a camptotecina sozinha pode circular apenas por alguns minutos. Esse longo período de circulação é suficiente para que as nanopartículas de IT-101 penetrem o tumor e lá permaneçam. Depois, elas atingem as células tumorais e, lentamente, liberam a camptotecina, intensificando seu efeito. Quando a droga é liberada, outros componentes da nanopartícula os polímeros se separam e são eliminados pelos rins, sem causar dano (HEATH e DAVIS, 2008). 3 MATERIAIS E MÉTODOS Este estudo foi desenvolvido nos laboratórios de Nanotecnologia (Centro Universitário Franciscano), de Cultura Celular (Centro Universitário Franciscano) de Biologia Molecular (Centro Universitário Franciscano) e em colaboração com o Laboratório de Biogenômica da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). 3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Este trabalho foi constituído de duas etapas: a primeira de produção e caracterização das suspensões de nanocápsulas e posteriormente foi conduzido um estudo prospectivo in vitro no qual utilizou-se a linhagem tumoral de LPA conhecida como NB4 como modelo experimental, a fim de se investigar potencial efeito terapêutico anticarcinogênico do quimioterápico ATRA na sua forma nanoencapsulada. 3.2 PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS As nanocápsulas carregadas com ATRA (NA) foram produzidas conforme a formulação descrita por Ourique e cols (2010), com algumas adaptações. Para a confecção das

35 34 nanocápsulas, foi utilizado o método por deposição interfacial do polímero, descrito por Fessi e cols (1989) adaptado. Após serem pesados em balança analítica (em béqueres separados), tanto os constituintes da fase orgânica quanto os da fase aquosa, foram mantidos por uma hora sob agitação magnética, à uma temperatura ajustada de aproximadamente 40 ºC. Em seguida, com o auxílio de um funil, verteu-se a fase orgânica na fase aquosa (momento no qual ocorre a formação espontânea das nanocápsulas), a qual foi mantida, durante 10 minutos, sob agitação magnética à uma temperatura ajustada de aproximadamente 40 ºC. Passados os 10 minutos, a suspensão foi levada ao rotaevaporador, a fim de evaporar o solvente orgânico e a água. Após, as suspensões foram levadas ao rotaevaporador, a fim de evaporar o solvente orgânico e o excesso de água, com um volume final ajustado para 25 ml. Este mesmo processo foi utilizado para a produção das nanocápsulas com ATRA (NA) e para a produção das nanocápsulas brancas (NB), que não continham o fármaco Composição das nanocápsulas A formulação das nanocápsulas constou de uma fase oleosa e uma fase aquosa. Tabela 1 - Constituintes das formulações de nanocápsulas contendo ATRA e nanocápsulas brancas. Constituintes Nanocápsulas com ATRA Nanocápsulas brancas Fase Orgânica Span 60 0,1925 g 0,1925 g Acetona 67 ml 67 ml Óleo (migliol) 825 µl 825 µl Polímero PCL 0,25 g 0,25 g ATRA 0,0125 g - Fase Aquosa Tween 80 0,1925 g 0,1925 g Água Ultra-Pura 134 ml 134 ml Caracterização físico-química das suspensões contendo nanocápsulas As suspensões foram analisadas e caracterizadas com relação ao ph, diâmetro médio das partículas, análise de distribuição do tamanho das partículas, índice de polidispersão e potencial zeta.

36 Determinação do ph Os valores de ph das suspensões foram determinados por imersão do eletrodo diretamente na suspensão, utilizando um potenciômetro Digimed DM 20, previamente calibrado Análise de distribuição das partículas A distribuição foi realizada com o auxílio de um equipamento chamado Microtrac, através da técnica de difração a laser. As formulações foram diluídas com água destilada no compartimento da amostra e a leitura das amostras utilizou como condições índice de refração de 1,81 e velocidade de fluxo de 4% Diâmetro médio e índice de polidispersão O tamanho das partículas foi medido através do espalhamento de luz por espectroscopia (Zetasizer ) e através da distribuição das partículas por difração a laser (Microtrac ) Potencial zeta O potencial zeta foi verificado através da técnica de mobilidade eletroforética, no aparelho Zetasizer Nano-ZS da Malvern. As formulações foram diluídas 500 vezes (v/v) em uma solução de cloreto de sódio na concentração de 10 mm e filtradas com o auxílio de uma seringa e uma membrana com porosidade de 0,45 μm de diâmetro da Millipore, para depois serem transferidas para um cubeta e lidas no aparelho. Os resultados foram expressos em milivolts (mv) através da leitura média de três repetições Co-validação do método para desenvolvimento e produção das nanocápsulas O método foi co-validado com base no trabalho de Ourique e cols (2010) através dos parâmetros de linearidade, especificidade, precisão intermediária e repetibilidade Linearidade Para a construção das curvas foi pesado 0,0125 g de ATRA, onde o volume foi completado com acetonitrila em um balão âmbar de 25 ml, originando a solução mãe. A partir desta solução foi construída a curva analítica nas concentrações de 2, 5, 10, 15 e 20 µg/ml, utilizando fase móvel como solvente. O procedimento foi realizado em triplicata e ao abrigo da luz. Na tabela abaixo encontram-se as diluições e concentrações finais de ATRA utilizadas para o preparo da curva analítica.

37 36 Tabela 2 - Valores expressos referentes a curva analítica do ATRA. Balão volumétrico (10 ml) Solução mãe (ml) Diluente (ml) Concentração final (µg/ml) 1 0,04 9, ,1 9, ,2 9, ,3 9, ,4 9, Especificidade Para realizar a especificidade do método, foram produzidas duas suspensões, uma de nanocápsulas com ATRA (NA) e a outra de nanocápsulas brancas (NB), com o objetivo de encontrar a pureza do pico do fármaco. Para cada suspensão preparada, foram retirados 200 µl, os quais foram transferidos para um balão volumétrico de 10 ml, ajustados com acetonitrila até o menisco. O conteúdo dos balões foi filtrado e levado para análise em aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os experimentos foram realizados em triplicata Teor de fármaco Para a obtenção do teor, as amostras foram analisadas através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Foram produzidas 3 formulações diferentes, cada uma com um volume final de 25 ml. O teor do fármaco foi determinado após a dissolução das nanocápsulas em acetonitrila (1 ml de suspensão a 10 ml de acetonitrila). Os resultados obtidos referentes às áreas dos picos gerados, foram calculados através da equação analítica obtida para a linearidade Avaliação de formação de corona proteica A avaliação da interação das proteínas do meio de cultura celular com as nanopartículas sintetizadas neste trabalho, foram avaliadas quanto a formação da corona proteica. Os experimentos foram realizados em triplicata e a análise dos parâmetros ocorreu nos tempos zero, 24 horas e 48 horas após tratamento com as NB e as NA. Dessa forma, as nanopartículas sintetizadas foram avaliadas in vitro sendo expostas ao meio de cultura completo, contendo RPMI 1640 com adição de 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina e 1.5 g l -1 de bicarbonato de sódio (produtos da Invitrogen e Sigma ) e foram mantidas nas mesmas condições de cultivo, tratamentos e tempo de acordo

38 37 com os testes realizados. Posteriormente ao período de cultivo avaliaram-se parâmetros como ph, diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta, sendo que estas variáveis deveriam se manter inalteradas caso não houvesse formação de corona proteica (NOGUEIRA et al., 2014). 3.3 CULTURA CELULAR E TRATAMENTOS As células foram cultivadas em estufa com 5% de CO2 a 37 ºC no Laboratório de Cultura Celular do Centro Universitário Franciscano. A linhagem NB4-LPA (American Type Culture Collection ATCC - ACC-207) foi cedida pelo Laboratório de Hematologia Experimental Hospital das Clínicas Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto São Paulo, e cultivada em meio RPMI 1640 com adição de 10% de soro bovino fetal (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina e 1.5 g l -1 de bicarbonato de sódio (produtos da Invitrogen e Sigma ) até a obtenção do número de células para a realização de todos os tratamentos e ensaios propostos. O ATRA foi adquirido comercialmente da Indústria Fagron - P344; SM Empreendimentos Farmacêuticos Ltda. Anápolis GO. O cultivo e tratamento das células foram conduzidos similarmente ao descrito por Falanga e cols (1996). As culturas celulares foram expostas a diferentes concentrações do ATRA livre (AL), ATRA nanoencapsulado (NA) e nanocápsula Branca (NB) a fim de verificar o comportamento das diferentes formulações em uma curva de concentração resposta. O AL foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), e o restante das formulações em meio RPMI Uma curva de concentrações foi estabelecida a partir do peso molecular do ATRA, bem como do valor obtido no teste de eficiência da encapsulação, originando a curva de concentração e resposta, onde os valores de concentração foram: 0,25; 0,5; 1; 1,5; 2 e 2,5 µm. Cultura e tratamento das células mostrada esquematicamente na figura 5. De acordo com estudos previamente realizados no Laboratório de Cultura Celular do Centro Universitário Franciscano, preconizou-se um volume de 20 µl de tratamento para um volume total de 250 µl, para qualquer tratamento independente da concentração. Isto, em virtude de que este volume - após uma padronização realizada no laboratório citado acima não altera as condições ideais de cultivo celular, como ph, aporte nutricional, aporte enzimático e densidade celular. Um grupo controle negativo (células em meio de cultura completo, com ausência de qualquer tratamento) foi mantido e analisado em todos os protocolos desenvolvidos. Os

39 38 tratamentos foram mantidos durante período de incubação de 24 h para avaliações de citotoxicidade e durante 72 h para medidas de proliferação celular. Além disso, para todos os tratamentos, foram também realizados brancos-controles para todos os testes, com intuito de eliminar possíveis interferências experimentais. Todos os testes realizados, segundo os objetivos propostos e elencados na figura abaixo, foram conduzidos em triplicata com um número de 2x10 5 células/ml. Figura 5 Cultura e tratamento das células. Fonte: Elaborada pelo autor. 3.4 ENSAIOS EXPERIMENTAIS Avaliação da citotoxicidade e taxa de proliferação celular A citotoxicidade e a taxa de proliferação celular foi investigada através do método tetrazolium (MTT) em procedimento similar ao descrito por Krishna e cols (2009), onde medidas de viabilidade celular e de proliferação celular são realizadas com este método. As células NB4 cultivadas previamente, foram semeadas em placas de 96 poços, numa concentração de 2x10 5 células por poço, as quais foram tratadas com AL, NA e NB. As placas foram incubadas em estufa com 5% de CO2 à 37 ºC por um período de 24 e 72 horas. O MTT

40 39 foi dissolvido em PBS (0,01 M; ph 7,4) a 5 mg/ml e adicionado na placa a qual foi incubada durante 4 horas. Após o período de incubação, retirou-se o sobrenadante e cada poço foi ressuspendido com 200 μl de DMSO. A leitura das amostras realizou-se em uma leitora de placas de ELISA, em um comprimento de onda de 460 nm Avaliação de indicadores de apoptose e diferenciação celular Inicialmente extraiu-se o RNA total em solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina com TRIZOL Reagent (Invitrogen) (CHOMCZYNSKI e SACCHI, 1987). Após, o produto da extração foi submetido à análise da concentração e grau de pureza em espectrofotômetro Picodrop. Assim, utilizou-se a concentração padrão de 3 ng e procedeu-se com a reação de transcrição utilizando a enzima transcriptase reversa (RT-PCR, do inglês reverse transcriptase PCR) para produção de DNA complementar (cdna) com o kit GoScript Reverse Transcription System (Promega), conforme recomendado pelo fabricante. Apoptose celular e mecanismos de indução de apoptose foram avaliados pela expressão dos genes BAX, atuante intracelularmente como agente pró-apoptótico; BCL-2, anti-apoptótico e Caspases 1, 3 e 8, as quais são relacionadas com o processamento de citocinas, caspase iniciadora e efetora no processo de apoptose, respectivamente (MURPHY e MARTIM, 2003; OZER et al., 2003; SAMBAZIOTIS et al., 2003). As sequências senso e anti-senso dos iniciadores (primers) utilizados encontram-se na tabela 3. A expressão do RNA dos genes de interesse foi mensurada por PCR em tempo real (qpcr), os resultados quantitativos foram avaliados determinando os valores de concentração relativa pelo método comparativo de CT (do inglês, Cycle Threshold) conforme descrito por Livak e Schmittgen (2001), sendo que a expressão foi normalizada em relação à expressão do gene endógeno GAPDH. Utilizou-se o kit Platinum SYBR Green qpcr SuperMix-UDG (Invitrogen) para desenvolvimento da qpcr baseada em trabalhos anteriores desenvolvidos pelo grupo, bem como o estudo de Khalfin-Rabinovich e cols (2011) com modificações. Os componentes da reação foram adaptados para um volume total de 12 µl e utilizou-se concentração de 0,2 µm de cada primer. A reação ocorreu em termociclador StepOne Real- Time PCR Systems, Applied Biosystems. Em condição de amplificação de 50 C por 2 minutos; 95 C por 2 minutos; 40 ciclos (95 C por 15 segundos e 60 C por 30 segundos) e curva de melting conforme o instrumento. A avaliação dos indicadores de diferenciação celular necessitou de otimização e modificações na metodologia já descrita por Van Dongen e cols (1999). Partiu-se de uma reação de PCR convencional para desenvolvimento da nested-rtqpcr, conforme segue: tampão da

41 40 reação 1x, 1,5 mm de MgCl2, 200 µm de dntp, 0,2 µm de cada primer (PML-A1 e RARA-B), 1 U/µL de Taq DNA polimerase, 1 µl de cdna e água em quantidade suficiente para 25 µl totais de reação. A condição de amplificação da reação foi de 95 ºC por 5 minutos, 35 ciclos (94 ºC por 30 segundos, 60 ºC por 1 minuto e 72 ºC por 1 minuto), 72 ºC por 5 minutos e 4 ºC de parada. Após o produto foi submetido à qpcr com utilização dos primers PML-C1 e RARA- D e reação conforme já descrito anteriormente. Tabela 3 - Sequências de primers utilizados na avaliação molecular. Primers PML-A1 RARA-B PML-C1 RARA-D GAPDH BAX BCL-2 CASPASE 1 CASPASE 3 CASPASE 8 Sequências (5 3 ) Forward/Reverse CAGTGTACGCCTTCTCCATCA GCTTGTAGATGCGGGGTAGA TCAAGATGGAGTCTGAGGAGG CTGCTGCTCTGGGTCTCAAT AGAAGGCTGGGGCTCATTTG GAAGACTGTGGATGGCCCCT CCCTTTTCTACTTTGCCAGCAA CCCGGAGGAAGTCCAATGT GAGGATTGTGGCCTTCTTTGAGT AGTCATCCACAGGGCGATGT CGCACACGTCTTGCTCTCAT TACGCTGTACCCCAGATTTTGTAG TTTGAGCCTGAGCAGAGACATG TACCAGTGCGTATGGAGAAATGG AGGAGCTGCTCTTCCGAATT CCCTGCCTGGTGTCTGAAGT Fragmento amplificado (pb) Análise da modulação de indicadores do metabolismo oxidativo Taxa de produção de radicais livres Foi monitorada através o uso de uma sonda fluorescente, a 2,7 - diclorofluoresceína (DCF). Este ensaio está baseado no seguinte pressuposto químico: o diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) é capaz de se difundir através de membranas celulares. Dentro das células esta molécula é desacetilada pela ação das enzimas esterases intracelulares (ROTA et al., 1999). Esta reação forma, por sua vez, um produto não-fluorescente, a

42 41 dihidroclorofluoresceína (DCFH). A DCFH na presença de espécies reativas é oxidada (preferencialmente a peróxidos, hidroperóxidos e NO ) passando para uma forma altamente fluorescente a diclorofluoresceína (DCF). Assim, quanto maior a fluorescência detectada pela maior absorbância avaliada pelo fluorímetro, maior a ocorrência de compostos oxidantes (H2O2). Vale ressaltar que para as análises das taxas totais de ERMOs, em amostra de sobrenadante, o reagente DCFH-DA foi diluído em álcool etílico (HALLIWELL e WHITEMAN, 2004) Análise do Ciclo Celular por Citometria de Fluxo Através da técnica de Citometria de Fluxo Multiparamétrica, foi possível identificar em qual período de divisão celular as células NB4, após os tratamentos, cessaram o seu ciclo celular de replicação. Para a realização da técnica, as células NB4 foram previamente expandidas, cultivadas e tratadas com NA, NB e AL nas concentrações de 1,5; 2 e 2,5 µm, as quais foram consideradas as mais eficazes, em termos de atividade antiproliferativa, baseando-se nos ensaios anteriores.após 72 horas de incubação, as células foram coradas com iodeto de propídio (Sigma-Aldrich-P4170, São Paulo, SP, Brasil) seguindo as instruções descritas por William- Foulos e cols (2006) e as amostras foram analisadas pelo aparelho BD Accuri C6 Flow Cytometer. 3.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS O programa estatístico GraphPad Prism versão 5.0 foi utilizado para a realização das análises estatísticas e os dados foram expressos em média ± desvio padrão (DP), considerando a porcentagem obtida nas condições de tratamento em relação ao controle negativo de cada teste individual. Todos os experimentos foram conduzidos em triplicata e os tratamentos foram comparados através da análise de variância de uma via seguida de teste post hoc de Dunnett ou Tukey. Foram considerados significativos os testes com p< 0,05. 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1 PRODUÇÃO DAS SUSPENSÕES DE NANOCÁPSULAS Este é o primeiro trabalho que utiliza nanocápsulas com ATRA especificamente para testes in vitro com células tumorais da linhagem NB4. As suspensões produzidas apresentaram aspecto homogêneo e leitoso, sendo que as NBs apresentaram tonalidade branca e as NAs apresentaram tonalidade levemente amarelada, devido a presença do fármaco, o qual na sua forma livre possui coloração amarela.

43 AVALIAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS SUSPENSÕES Para a avaliação das características físico-químicas das nanocápsulas foram analisados os seguintes parâmetros: ph, análise de distribuição das partículas, diâmetro médio, índice de polidispersão e potencial zeta. Os valores obtidos para tal estão representados logo abaixo na tabela 4. Tabela 4 - Características físico-químicas avaliadas nas formulações de nanocápsulas com ATRA (NA). Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão. Parâmetros Diâmetro (nm) PDI Potencial Zeta (mv) ph Teor (%) NA 218,52 ± 5,95 0,158 ± 0,03-12,26 ± 1,98 6,15 ± 0,06 98,1% ± 0, ph O ph é um indicativo de estabilidade das formulações, quando medido ao longo do tempo. Alterações discrepantes nos valores de ph das formulações podem dar indícios de degradação de algum dos componentes da formulação. Alterações nos valores podem indicar a degradação do polímero ou de algum componente da formulação e podem sugerir o rompimento e a liberação do princípio ativo no meio aquoso conforme estudos de Guterres e cols (1995). A média do ph das formulações foi de 6,1 para as nanocápsulas brancas e 6,3 para as nanocápsulas com ATRA. Os resultados estão de acordo com os resultados relatados por Fachinetto e cols (2008) o que indica que as formulações de nanocápsulas produzidas, de acordo com o ph, possuem estabilidade Distribuição das partículas Os resultados obtidos são referentes às NB e às NA, os quais estão ilustrados nas figuras 5 e 6, logo abaixo. Os picos do gráfico foram obtidos através de análise de tamanho por difração a laser (Microtrac ) e confirmam os resultados encontrados por espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer ), os quais mostram que todas as partículas estão na faixa de tamanho nanométrico. Figura 6 - Gráfico representativo da análise do tamanho de partícula. A. nanocápsulas brancas (NB). B.

44 43 nanocápsulas com ATRA (NA) Diâmetro médio e índice de polidispersão (PDI) Para que uma partícula seja considerada nanométrica é necessário que no mínimo uma das suas dimensões tenha tamanho inferior a 1000 nanômetros e que isso acarrete modificações nas suas propriedades naturais (AUFFAN et al., 2009). Sendo assim, os resultados encontrados para os tamanhos das nanocápsulas produzidas estão de acordo com os critérios estabelecidos pela literatura. Neste trabalho as suspensões apresentaram diâmetro médio de 209 nm para as NB e 218 nm para as NA. O PDI mede a distribuição no tamanho das partículas, as quais devem estar distribuídas de maneira homogênea. Lorenzoni e cols (2012) sugere que quando se trata de partículas manométricas, as formulações devem estar monodispersas, ou seja, com valores de PDI inferiores à aproximadamente 0,25. O PDI para as NB foi de 0,195 e para as NA de 0,158, sendo ambos os valores de PDI inferiores a 0,25, conforme o esperado pela literatura. As figuras abaixo ilustram os resultados acima descritos. Figura 7 - Análise do diâmetro médio e do PDI das NB.

45 44 Figura 8 - Análise do diâmetro médio e do PDI das NA Potencial Zeta O potencial zeta foi de -27,5 para as NB e -12,26 para as NA, o que indica estabilidade do sistema (suspensão), ou seja, provavelmente agregação e precipitação de nanoestruturas são improváveis. De acordo Santos e cols (2010), a medida do potencial zeta reflete a carga de superfície das partículas, a qual é um importantíssimo parâmetro de estabilidade do sistema. Os valores de potencial zeta encontrado para as suspensões produzidas neste trabalho estão de acordo com os relatos encontrados por Khurana e cols (2013), que sugerem valores de potencial zeta entre -30 mv e 60 mv como indicativo de estabilidade. Figura 9 - Análise do potencial zeta das NBs.

46 45 Figura 10 - Análise do potencial zeta das NAs. 4.3 CO-VALIDAÇÃO DO MÉTODO PARA DESENVOLVIMENTO E PRODUÇÃO DAS NANOCÁPSULAS Linearidade A linearidade diz respeito ao desenvolvimento de uma equação analítica, capaz de fornecer resultados linearmente proporcionais à concentração da substância em questão, dentro de uma faixa analítica específica para aplicação. A curva analítica deve gerar uma reta baseada em pelos menos cinco pontos, a fim de evitar possíveis erros (RIBANI et al., 2004). A geração da curva analítica, nos permite calcular os coeficientes de regressão linear a e b e também o coeficiente de correlação r. De acordo com a ANVISA, recomenda-se um coeficiente r superior a 0,99, indicando assim um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão (ANVISA, 2003). A equação linear obtida (y = x ) pela curva média mostrou um coeficiente de regressão linear adequado para validar o método como linear (r 2 = 0,9999), conforme ilustra a figura 11. A tabela 5, mostra os valores de desvio padrão gerados pelas áreas das curvas nas respectivas concentrações, tendo o desvio padrão relativo (CV) valores abaixo de 5% corroborando a linearidade do método.

47 46 Figura 11 - Representação gráfica da curva média das áreas geradas pelas concentrações Curva média y = x R = 0, Tabela 5 - Resultados das áreas obtidas com relação as concentrações. Concentração Área curva 1 Área curva 2 Área curva 3 X S CV , , , , , , , , , , , , , Especificidade Dentre os parâmetros avaliados num processo de validação, a especificidade é um deles. Também conhecido por seletividade, a especificidade é um método capaz de avaliar se a substância em estudo sobre interferências de outros compostos. Ou seja, a especificidade avalia qual é o grau de interferência que os excipientes da formulação têm com o analito (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004). A especificidade garante que dentro da metodologia analítica, o pico cromatográfico gerado seja exclusivamente referente a substância de interesse (BRASIL 2003). A figura 12, ilustra a integração dos picos das NB e das NA, mostrando que não há interferência dos excipientes da NB quando o ATRA é detectado pelo equipamento, através do pico de pureza.

48 47 Figura 12 - Gráfico representativo da integração dos picos demonstrando a pureza e especificidade do método, onde A é a NA e B é a NB. 4.4 TEOR DO FÁRMACO O teor de ATRA encontrado para as nanocápsulas carregadas com o fármaco foi de 98 %, para uma concentração de 0,5 µg/ml. 4.5 AVALIAÇÃO DA CORONA PROTEICA De acordo com Sánchez-Moreno e cols (2015), após a administração por via endovenosa no paciente, as nanopartículas podem ter suas características de superfície modificadas devido a exposição às proteínas contidas no plasma sanguíneo. Ao se ligarem na superfície da nanoestrutura, essas proteínas formam uma coroa de proteínas a qual deu nome ao que se chama atualmente de efeito corona. A formação dessa coroa de proteínas promove, além de outras desvantagens, o rápido reconhecimento do sistema imunológico que, imediatamente, entra em ação com o objetivo de remover essas nanopartículas injetadas no organismo. Os resultados encontrados no presente trabalho sugerem que não houve a formação de corona proteica nas suspensões de nanocápsulas utilizadas nos tratamentos. Isso fica evidenciado pelo fato dos parâmetros analisados nos testes não terem sofrido significativas alterações no decorrer dos dias em que foram feitas as análises. 4.6 ENSAIOS EXPERIMENTAIS Ensaio MTT O tetrazolium MTT amarelo (3-4-5-dimetiltiazolil-2)-2 e o brometo de 5-

49 48 difenitretazolium são quimicamente reduzidos através da ativação da enzima desidrogenase que gera NADPH e, portanto, ele é um marcador da função mitocondrial. Assim, na presença de maior quantidade de células ou de maior viabilidade a reação do MTT produz uma coloração roxa que pode ser quantificada por espectrofotometria. Valores de absorbância mais baixos que o controle, indicam redução na taxa de proliferação celular. Ao contrário, valores de absorbância mais altos indicam aumento na proliferação celular (MOSMANN, 1983). A figura 13 mostra os resultados do MTT do ATRA em sua forma livre após 24 e 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Figura 13 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, figuras 13A e 13B, respectivamente. 150 A ATRA livre 24h B 150 ATRA livre 72h Viabilidade celular (%) NC H2O2 0,25 0,5 *** 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Viabilidade celular (%) NC H2O2 0,25 0,5 *** 1 1,5 2 2,5 Tratamentos (µm) Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o Controle negativo: células em meio de cultura e H 2O 2 (peróxido de hidrogênio) controle positivo. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Os resultados evidenciados na figura 13 mostram que o AL se apresentou citotóxico e antiproliferativo em todas as suas concentrações testadas (p < 0,001) quando comparado ao controle negativo. A figura 14 mostra os resultados do MTT das NA após 24 e 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Figura 14 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, respectivamente figura 14C e

50 49 14D. C Nano ATRA 24h D Nano ATRA 72h Viabilidade celular (%) *** Viabilidade celular (%) *** 0 NC H2O2 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 0 NC H2O2 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o Controle negativo: células em meio de cultura e H 2O 2 (peróxido de hidrogênio) controle positivo. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 Quando testadas as diferentes concentrações de NA, percebeu-se nas 24 horas que não houve citotoxicidade das mesmas em relação ao controle negativo. Mas nas 72 horas, as mesmas concentrações mostraram um padrão antiproliferativo (p < 0,001) quando comparada ao controle negativo. A figura 15 mostra os resultados do MTT da NB após 24 e 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Figura 15 - Ensaio de viabilidade celular pelo MTT com 24 e 72 h de incubação, respectivamente figura 15E e

51 50 15F. E Nano branca 24h F Nano branca 72h Viabilidade celular (%) *** Viabilidade celular (%) *** ** *** *** 0 NC H2O2 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 0 NC H2O2 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o Controle negativo: células em meio de cultura e H 2O 2 (peróxido de hidrogênio) controle positivo. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. A figura 15, acima, mostra diferentes concentrações de NB testadas. Nas 24 horas de incubação, não foram detectados nenhum padrão de citotoxicidade, pois todas concentrações não apresentaram diferença estatística significativa em relação ao controle negativo. Nas 72 horas, as três maiores concentrações (1,5; 2 e 2,5 µm) apresentaram atividade antiproliferativa em relação ao controle negativo, indicando diminuição da viabilidade celular Avaliação da taxa de produção de radicais livres Em 2003, Sauer e cols propuseram um método capaz de avaliar a presença de espécies reativas no interior das células através da adição de uma susbtância chamada 2,7 diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) a qual, no citoplasma, pode ser desacetilada por esterases e reduzida para diclorodihidrofluoresceína (DCFH). A DCFH, por sua vez, quando em contato com espécies reativas do oxigênio, acaba por ser convertida para diclorofluoresceína (DCF). A DCF pode ser facilmente visualizada, devido a sua forte fluorescência. O conteúdo de espécies reativas ao oxigênio é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência captada pelo aparelho bem como do potencial antioxidante da substância que foi testada, o ATRA (BARRY et al., 2004). A figura 16 abaixo mostra os resultados do ensaio da diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA), após 24 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Observa-se que, em todas as concentrações analisadas, o AL e a NA

52 51 apresentaram altas taxas de espécies reativas, quando comparadas com as células não tratadas. Porém, quando comparamos o AL com a NA percebemos uma redução nas taxas de ERMOS produzidas, principalmente nas concentrações de 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 µm, verificando uma diminuição do desbalanço oxidativo celular. Vários fármacos utilizados nos tratamentos quimioterápicos, atuam no processo de destruição tumoral através da formação de radicais livres. Por exemplo, estudos com adriamicina (ADR), a qual é um fármaco utilizado no tratamento de diversas neoplasias e que tem como fator limitante a miocardiotoxicidade, têm demonstrado que este efeito citotóxico é mediado pela produção de radicais livres durante o metabolismo intracelular (BALIS et al., 1989). Estudos feito também por Li e cols (2000) demonstraram que, em ratos tratados com ADR ocorria um aumento do estresse oxidativo. Figura 16 - Ensaio da diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 24h de incubação. A B C Níveis totais de ROS (%) NC 0,25 ATRA livre 24h *** ** * * 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Níveis totais de ROS (%) NC Nano ATRA 24h *** *** *** ** *** *** 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Níveis totais de ROS (%) NC Nano branca 24h *** *** *** *** ** * 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o controle negativo: células em meio de cultura. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. A figura 17 abaixo mostra os resultados do ensaio da diclorofluoresceína diacetato DCFH-DA com células, após 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. Ao compararmos o AL nas 24 e nas 72 horas após a incubação, não se pode perceber significativas alterações com relação as taxas de produção de ERMOS. Porém, ao compararmos as taxas de ERMOS produzidas pelas NAs, percebe-se que a produção diminui consideravelmente após 72 horas de incubação, em comparação com 24 horas. Observa-se ainda um padrão estatístico observado no comportamento das NBs tanto para 24 quanto para 72 horas, onde não ocorrem significativas modificações na produção de ERMOS.

53 52 Figura 17 - Ensaio da DCFH-DA com células para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 72h de incubação. Níveis totais de ROS (%) A B C ATRA livre 72h Nano ATRA 72h *** ** *** * * 200 *** *** *** 100 ** *** NC 0,25 0,5 1 1,5 2 2,5 Níveis totais de ROS (%) Tratamentos (µm) Tratamentos (µm) 50 0 NC 0,25 0,5 1 1,5 2 2,5 Níveis totais de ROS (%) 50 0 NC Nano branca 72h *** *** *** *** ** * 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o controle negativo: células em meio de cultura. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. A figura 18 abaixo mostra os resultados do ensaio da DCFH-DA com sobrenadante, após 72 horas de incubação, com resultados expressos em porcentagem em relação ao controle. De acordo com Aranda e cols (2013), em testes colorimétricos e fluorimétricos realizados para avaliar estresse oxidativo utilizando nanoestruturas, ocorre que em alguns nanomateriais, há adsorção dos corantes sobre a superfície e com isso podem ser atenuadas ou alteradas as propriedades de fluorescência. Pesquisadores já relataram a interferência de diversos tipos de nanopartículas com a emissão de fluorescência da DCFH-DA. De encontro a estes fatos, Kroll e cols (2012) sugeriram que para serem evitadas essas alterações, modificações nos protocolos poderiam ser feitas, afim de descartar valores equivocados, advindos somente da interferência dos constituintes da nanopartícula. Por isso, realizou-se também, neste trabalho, a análise apenas do sobrenadante no protocolo da DCFH-DA, após 72 horas. Foi possível perceber que, em comparação com a análise celular realizada também após 72 horas de incubação, houve uma considerável diminuição da produção de ROS em todas as concentrações, para todos os tipos de tratamento. Possivelmente, isso se dê devido ao fato de que os constituintes da nanocápsula possuem atividade própria, mesmo quando da ausência do fármaco. Sugere-se que a composição da nanocápsula emite fluorescência e consequentemente gera também produção de ERMOS (ARANDA et al., 2013).

54 53 Figura 18 - Ensaio da DCFH-DA com células do sobrenadante para avaliação dos níveis de produção de radicais livres, após 72h de incubação. A B C Sobrenadante ATRA livre 72h Sobrenadante Nano ATRA 72h Sobrenadante Nano branca 72h Níveis totais de ROS (%) NC ** * * 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Níveis totais de ROS (%) NC ** 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Níveis totais de ROS (%) NC *** 0,25 0,5 1 1,5 Tratamentos (µm) 2 2,5 Os resultados foram expressos em porcentagem do controle negativo (100%). Sendo NC o controle negativo: células em meio de cultura. Os dados foram expressos com média ± desvio padrão (D.P.). As análises foram realizadas por variância (ANOVA) de 1 via, seguida por teste post hoc de Tukey. Os valores com p<0.05 foram considerados estatisticamente significativos. Sendo *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0, Análise do Ciclo Celular O gráfico da figura 19 representa os resultados encontrados para o ciclo celular das células NB4 expostas aos tratamentos com AL, NA e NB, nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µm e após 72 horas de incubação. Figura 19 - Análise do Ciclo Celular. 400 Contagem de células (%) G0/G1 S G2/M NC AL 1,5 AL 2,0 AL 2,5 NA 1,5 NA 2,0 NA 2,5 NB 1,5 NB 2,0 NB 2,5 Exposição das células NB4 aos tratamentos com AL, NA e NB nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µm, em comparação ao controle de células (NC). Tempo de exposição de 72 horas. O ciclo celular de células tumorais geralmente é desregulado. Isso se dá devido à instabilidade genômica e às alterações cromossomais que essas células costumam apresentar, associadas ainda à alta atividade proliferativa que as mesmas possuem (SOUZA, 2014). De acordo com os resultados encontrados na análise do ciclo celular, observou-se, com

55 54 relação ao AL, na fase G0/G1 (48%) contagem de células abaixo do controle negativo (100%). Nas fases S (154%) e G2/M (105%) do ciclo celular, a contagem de células tratadas com AL foi superior ao controle negativo (100%). Sugere-se que o AL, dentre outros agentes terapêuticos, atua induzindo a célula a entrar em senescência, ou seja, o ATRA induz a diferenciação celular e prossegue o ciclo, até atingir a senescência para posterior ativação da cascata de apoptose (SOPRANO et al., 2004; VANGESTEL et al., 2009). Provavelmente, a parada em G1 ocorre para que a célula possa corrigir a fusão PML/RARα e somente após as células voltarem a condição de normalidade é que o ciclo de divisão continua, conforme observamos no gráfico em S e G2/M. O motivo pelo qual observase alta contagem celular no tratamento com AL nos períodos S e G2/M é devido a capacidade do ATRA em diferenciar a célula rapidamente, tornando-a normal. Conforme afirma Gianni e cols (2000), o ATRA possui também efeito em LPA pois pode induzir a parada do ciclo celular ou induzir a maturação das células que desencadeiam a apoptose, por via das caspases (GANNI et al., 2000). Logo, após as células voltarem a condição de normalidade, possivelmente estas continuam o ciclo celular até que, em um determinado momento, a via das caspases seja ativada e o processo apoptótico aconteça. Com relação à NA e a NB, observou-se no ciclo celular um padrão semelhante para os dois tipos de tratamentos. Ambos demonstraram contagem de células acima do controle negativo nas fases G0/G1 (318% NB e 309% NA) e S (194% NB e 185% NA). Porém entre os períodos G0/G1 e G2/M a contagem de células apresenta um declínio e quando observamos a fase G2/M, percebe-se que tanto a NA quanto a NB apresentam níveis de contagem de células muito inferiores ao controle negativo, 25% e 28%, respectivamente. Sugere-se, a partir disso que ambos os tipos de tratamento (NA e NB) ocasionam um atraso no ciclo das células NB4 na fase G1 do ciclo celular. Provavelmente, a NA libera o ATRA de maneira mais gradativa e isso possibilita às células tumorais mais tempo para se diferenciarem em células normais. O fato da NA ocasionar um bloqueio, provavelmente se deve ao fato de que, no ciclo celular, em determinados pontos de controle, pode ser aumentado o período de reparo para o dano celular (SOUZA, 2014). Sob condições de dano, os mecanismos de controle das células bloqueiam o ciclo celular nas fases G1, S, G2 e M, prevenindo erros de replicação (G1 e S) e mitose (G2 e M), estresse osmótico, produção de espécies reativas de oxigênio, dano à maquinaria celular e senescência (SOUZA, 2014). Quando ocorre um dano, imediatamente as células ocasionam um bloqueio temporário do ciclo celular, para que possa ser realizado o reparo. Porém, quando não é possível reparar o

56 55 dano, proteínas específicas do ciclo celular ativam o mecanismo de morte celular programada (PAULOVICH et al., 1997). Bloqueando o ciclo celular nas fases G1 ou G2, diminui-se o número de células tumorais, assim como as células podem ficar mais tempo expostas aos efeitos nocivos de uma terapia combinada (WU et al., 2013). Várias moléculas também vêm sendo pesquisadas, com o intuito de inibir proliferação celular nas fases de transição de G1/S e GS/M (CARNEY et al., 2012). Souza (2014) também afirma que, sempre que houver dano, os mecanismos de controle celular irão bloquear o ciclo nas fases G1 e S (a fim de prevenir erros de replicação) e nas fases G2 e M (a fim de prevenir erros na mitose). Verificamos também que as NBs possuem o mesmo comportamento das NAs. Sabe-se que existe uma maior permeabilidade e tempo de retenção das nanocápsulas em células tumorais, mas estudos adicionais necessitam ser realizados para explicar tal mecanismo evidenciado. Baseados nisso, diversos estudos têm mostrado o potencial das nanopartículas como sistemas carreadores de fármacos antitumorais. Para que o efeito de permeabilidade e retenção aumentada seja efetivo, é necessário que o sistema nanoestruturado apresente uma circulação prolongada na corrente sanguínea, possibilitando maior acúmulo na região tumoral (MOONEY, 2005; TORCHILIN, 2011) Análise da expressão gênica Foram utilizados 6 primers para análise da expressão gênica, os quais todos foram comparados com o gene endógeno GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), que é frequentemente utilizado como controle em reações de RT-qPCR, para expressão gênica (SCHNEIDER, 2014). Este gene é utilizado para estudos de regulação e expressão gênica e achados recentes demonstram que o GAPDH está envolvido em diversos processos celulares, como por exemplo, reparo do DNA, replicação do DNA e apoptose (BARBOSA, 2007). No que diz respeito ao papel do GAPDH no processo de morte celular, seu envolvimento está relacionado ao estresse oxidativo (BARBOSA, 2007). Nos processos tumorais, sabe-se que o GAPDH tem papel fundamental no início do processo de formação tumoral e por isso esse gene é diferencialmente expresso em células tumorais. Quando é utilizada a quimioterapia, os níveis expressos de GAPDH diminuem consideravelmente, em decorrência do efeito de alguns fármacos utilizados no coquetel quimioterápico (BARBOSA, 2007). A figura 20 representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo BAX frente às diferentes concentrações dos tratamentos AL, NA e NB.

57 56 Figura 20 - A figura 20A representa a expressão do gene BAX e a figura 20B a gene Bcl-2. Exposição das células NB4 aos tratamentos com ATRA livre, ATRA nanoencapsulado e nanocápsulas brancas, nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µm, em comparação ao controle de células. Expressão relativa (Log2 RQ). Os resultados expressos em média ± desvio padrão (DP) através do cálculo da concentração relativa dos valores (ΔΔC T) utilizando o programa de informática StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems ). De acordo com os resultados expressos no gráfico, observa-se que o gene BAX foi expresso em todas as concentrações testadas em NA e nas concentrações de 1,5 e 2,0 µm tratadas com NB. Para todas as concentrações de AL e para a concentração de 2,5 µm da NB não houve expressão gênica durante o teste. Bcl-2 é uma família de genes que compreende aproximadamente 25 genes codificantes, dos quais BAX e Bcl-2 são os genes mais importantes envolvidos nos eventos apoptóticos e aparecem de diferentes maneiras regulando o ciclo celular. BAX é um exemplo de proteína próapoptótica; Bcl-2 é um exemplo de proteína antiapoptótica. Esses genes, associados a outros tipos de proteínas da mesma família, podem determinar se a célula responde ao estímulo de apoptose ou não (CORY e ADAMS, 2002). Por isso, foram testados outros genes envolvidos na via extrínseca de apoptose (via das caspases) para melhor compreensão dos resultados encontrados. BAX é um gene envolvido no processo de morte celular, o qual tem ação pró-apoptótica pois participa da via mitocondrial de apoptose (CESCATO, 2010). De acordo com a figura 20A, a ausência de expressão do gene BAX em todas as concentrações tratadas AL e na concentração de 2,5 µm tratada com NB sugere que as células não entraram em processo apoptótico por esta via intrínseca. A figura 20B representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo Bcl-2 frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos AL, NA e NB. De acordo com os resultados expressos na figura 20B, observa-se que o gene Bcl-2 foi expresso em todas as concentrações para todos os tipos de tratamento, exceto na concentração de 1,5 µm quando o tratamento foi com NB. Na concentração de 2,5 µm da NA e na

58 57 concentração de 2,0 µm da NB a expressão do gene Bcl-2 foi extremamente baixa. A ausência de expressão do gene BAX e a considerável expressão do gene Bcl-2 quando as células foram tratadas com AL demonstra que o ATRA na forma livre induz de maneira potencial à apoptose. De encontro a isso, há de se considerar que, a ausência de expressão do gene PML/RARα em todas as concentrações de AL sugere que as células tumorais tenham sido diferenciadas para células normais e programadas para entrar em apoptose. A figura 21 representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão dos genes por via das caspases frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos AL, NA e NB. Figura 21 - Expressão gênica dos genes caspase-1 (A), caspase-3 (B) e caspase-8 (C). A B C Exposição das células NB4 aos tratamentos com ATRA livre, ATRA nanoencapsulado e nanocápsulas brancas, nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µm, em comparação ao controle de células. Expressão relativa (Log2 RQ). Os resultados expressos em média ± desvio padrão (DP) através do cálculo da concentração relativa dos valores (ΔΔC T) utilizando o programa de informática StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems ). De acordo com os resultados expressos na figura 21A observa-se que as caspases 1, 3 e 8 foram expressas em todos os tipos de tratamento e em todas as concentrações. Nos resultados expressos na figura 21B, observa-se que a caspase-3 seguiu o mesmo padrão de expressão gênica encontrado nos resultados para a caspase-1 (figura 21A). Observou-se uma diminuição

59 58 na expressão da caspase-3 na concentração de 2,5 µm quando tratada com a NA e nas concentrações de 1,5 e 2,0 µm tratadas com NB. Na concentração de 1,5 µm do tratamento com a NA houve também uma diminuição na expressão da caspase-3. A figura 21C representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo caspase-8 frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos (AL, NA e NB). Assim, com os resultados expressos, observa-se que a caspase-8 seguiu o mesmo padrão de expressão gênica encontrado nos resultados para a caspase-3. Observou-se uma diminuição na expressão da caspase-8 na concentração de 2,5 µm quando tratada com a NA e nas concentrações de 1,5 e 2,0 µm tratadas com NB. Na concentração de 1,5 µm do tratamento com a NA houve também uma diminuição na expressão da caspase-8. Deste modo, percebe-se que o efeito potente do AL contra células de LPA é porque este tipo de leucemia é a única entre as leucemias mieloides que apresentam alta sensibilidade para ATRA. Em LPA o AL induz tanto a parada do ciclo celular quanto a maturação das células que desencadeiam a apoptose dependente das caspases por via extrínseca (GIANNI et al., 2000). Quando o ATRA é nanoencapsulado percebe-se uma alteração da via apoptótica em relação ao AL. O estudo realizado por Schultze e cols (2014) também verificou a alteração da rota apoptótica com nanocápsulas poliméricas de tretinoína em células tumorais de pulmão. Neste trabalho, os pesquisadores relataram a indução do gene p21 pelo ácido retinóico, regulação da transcrição do gene e retenção do ciclo celular na fase G1. A figura 22 representa os resultados, em escala logarítmica, da expressão do gene alvo PML-RARα frente às diferentes concentrações dos diferentes tratamentos (AL, NA e NB). Figura 22 - Expressão do gene PML-RARα. Exposição das células NB4 aos tratamentos com AL, NA e NB nas concentrações de 1,5; 2,0 e 2,5 µm, em comparação ao controle de células. Expressão relativa (Log2 RQ). Os resultados expressos em média ± desvio padrão (DP) através do cálculo da concentração relativa dos valores (ΔΔC T) utilizando o programa de informática StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems ).