Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos 4ª Rodada Matriz Café RELATÓRIO FINAL

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2 Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos 4ª Rodada Matriz Café RELATÓRIO FINAL ORGANIZAÇÃO E COORDENAÇÃO Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Avenida Brasil, Manguinhos Rio de Janeiro - RJ Brasil - Cx. Postal CEP: COMISSÃO ORGANIZADORA DA RODADA - COMISSÃO DO PROGRAMA DE ENSAIO DE PROFICIÊNCIA Armi Wanderley da Nóbrega Coordenador Geral Marcus Henrique Campino de la Cruz Coordenador Técnico Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso Coordenadora da Qualidade - COMITÊ TÉCNICO André Victor Sartori Maria Heloisa Paulino de Moraes Pauline Silva de Oliveira Rosana Pereira dos Santos Autorizada a emissão Armi W. da Nóbrega (Coordenador Geral) 30/JULHO/2012

3 SUMÁRIO 1. Introdução Objetivos Produção dos Itens de Ensaio Escolha da Matriz Preparo do Café Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Envio dos Itens de Ensaio Análise dos Resultados Resultados das Medições dos Laboratórios Estabelecimento dos Valores Designados Análise Estatística Análise de Resíduos Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Índice z Análise Robusta Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Avaliação da Homogeneidade Avaliação da Estabilidade Estabilidade de Armazenamento Estabilidade de Transporte Atribuição dos Valores Designados Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes Laboratórios Participantes Resultados dos Laboratórios Participantes Considerações Sobre as Metodologias de Análise Método e Informações Sobre a Metodologia Recuperação, Limite de Detecção e Limite de Quantificação Incerteza Cálculo do Índice z Conclusões Confidencialidade Referências Bibliográficas Laboratórios Participantes Anexo A Homogeneidade Segundo a Norma ISO Anexo B Valor Designado Segundo a Norma ISO Página 2 de 23

4 1. Introdução Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Além do baixo número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos, os custos cobrados para a participação nestes ensaios principalmente de provedores internacionais, são normalmente muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. A presença de Ocratoxina A (OTA) em alimentos tem sido correlacionada a várias patologias humanas. Por esse motivo, as autoridades de saúde em todo mundo têm implementado ações regulatórias para diminuir a ingestão dessa substância.; sua presença no plasma e no leite humano, demonstrada através de muitos trabalhos científicos recentes, tem motivado grande preocupação na Comunidade Econômica Europeia. A OTA é um metabólito secundário produzido, principalmente, por Aspergillus Ochraceus e Penicillium Verrucosum; é uma substância nefrotóxica e imunosupressora para o homem. A agencia internacional de investigação sobre o câncer inclui a Ocratoxina A na categoria B, a qual indica que as crescentes provas disponíveis permitem supor tratar-se de um possível agente cancerígeno para o homem. A OTA foi relatada contaminando vários alimentos (cereais, leguminosas, frutas secas, vinho, café, cerveja, dentre outros) e rações animais. A FAO e a OMS estimaram um nível provisório de ingestão semanal tolerável de 100 µg/kg de peso corporal para OTA. No Brasil, os limites para a concenetração de micotxinas em alimentos foram estabelecidos na RDC N 7 de 18 de Fevereiro de 2011 da ANVISA. São apresentados neste relatório os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes no Ensaio de Proficiência para Determinação de Ocratoxina A em Alimentos, 4ª Rodada - Matriz Café, seguindo as diretrizes da ISO/IEC e ILAC G-13, apresentando neste relatório os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes. Página 3 de 23

5 2. Objetivos O objetivo deste Ensaio de Proficiência é fornecer aos laboratórios participantes uma ferramenta efetiva para verificar sua competência nos ensaios de rotina. Este EP também poderá contribuir para: Identificar e quantificar a Ocratoxina A presente no café torrado utilizando metodologia analítica de rotina utilizada no laboratório; Determinar o desempenho de laboratórios para o ensaio proposto; Propiciar subsídios aos laboratórios para a identificação e solução de problemas. 3. Produção dos Itens de Ensaio Os procedimentos de preparo dos itens de ensaio e as análises foram realizados no Laboratório de Resíduos de Micotoxinas do INCQS/FIOCRUZ. A metodologia analítica empregada nos estudos de homogeneidade e estabilidade atende aos critérios da norma ABNT ISO/IEC Escolha da Matriz O café é um produto de grande importância na balança comercial do país e consumido em larga escala pelos brasileiros, o que torna a escolha relevante no que se refere à vigilância sanitária. Portanto, a sua inocuidade é de suma importância para que estes não venham a causar prejuízos às exportações e riscos à saúde do consumidor Preparo do Café Foi utilizada uma amostra naturalmente contaminada obtida no comércio e outra proveniente de fazendas produtoras de café. Antes do preparo do material foi verificada a presença da Ocratoxina A nas amostras para posteriormente proceder à mistura visando atingir uma concentração adequada ao ensaio proposto Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Foram separados aleatoriamente dez itens de ensaio representativos do conjunto preparado para o teste de homogeneidade. A amostra de café de cada item de ensaio foi dividida em duas partes, que foram analisadas de forma independente. Foram realizados os estudo de estabilidade de curta e de longa duração, ambos desenhados no modelo isócrono. Esta avaliação foi realizada, após o preparo das amostras, no período compreendido entre o envio dos itens de ensaio e o prazo final de recebimento dos resultados pelos laboratórios participantes. Os testes estatísticos foram feitos segundo a norma ISO e a ISO GUIDE 35; os resultados obtidos nos testes estão apresentados nos itens 5.1 e 5.2 deste relatório. Página 4 de 23

6 3.4. Envio dos Itens de Ensaio Para cada laboratório inscrito na 4ª Rodada do Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos Matriz Café foram enviados dois itens de ensaio contendo, cada um, 53 ± 2g de café torrado e moído. Os Itens de Ensaio foram armazenados em freezer (-25 a -10 C) até o momento em que foram enviados aos laboratórios participantes (Sedex ). Os itens de ensaio foram enviados aos participantes em envelopes aluminizados, rotulados com as seguintes informações: nome do programa, item a ser ensaiado, código da amostra e rodada em questão. 4. Análise dos Resultados 4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios Os laboratórios receberam dois itens de ensaio contendo amostra de café e foram orientados a proceder como uma análise de rotina. Além dos resultados analíticos, expressos em g.kg -1, os laboratórios participantes informaram também a recuperação (%), o limite de detecção e o limite de quantificação e a incerteza, inerentes ao método empregado, através do Formulário de Registro de Resultados, e outras informações sobre as técnicas e os equipamentos utilizados nos ensaios Estabelecimento dos Valores Designados As técnicas de estatística robusta são utilizadas para minimizar a influência de resultados extremos sobre estimativas de média e desvio-padrão. Assim, a Coordenação deste Ensaio de Proficiência adotou como valore designado para a Ocratoxina A, aquele oriundo do cálculo da estatística robusta apresentado no item 5.6 da norma lso 13528, que é uma norma específica de métodos estatísticos para uso em EP por comparações interlaboratoriais. Seguindo os critérios desta norma, o valor designado foi obtido pela média robusta dos resultados emitidos pelos laboratórios participantes, que reportaram valores de recuperação corrigidos pela recuperação do método, e pelo INCQS, conforme os procedimentos estatísticos descritos no item deste relatório Análise Estatística Neste tópico estão descritas as análises estatísticas utilizadas para a obtenção do valor designado e sua incerteza, do desvio padrão utilizado na análise da proficiência, para a avaliação da homogeneidade e da estabilidade das amostras, bem como para a avaliação do desempenho dos laboratórios participantes. Página 5 de 23

7 Análise de Resíduos A análise de resíduos foi empregada para avaliar a estabilidade das amostras de café em relação aos valores de referência da concentração de Ocratoxina A utilizada neste EP. Assim, foram estimadas as variâncias dos valores utilizados na regressão linear, observando-se se o valor de concentração apresentava alguma tendência através da ferramenta estatística de análise de variância (ANOVA). A Ocratoxina A foi considerada estável quando a inclinação da reta (ou a não linearidade) não foi significativa Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio A norma ISO (item 4.4, anexo B) foi seguida na avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio. A norma em questão permite incluir o desvio padrão devido à heterogeneidade das amostras, no desvio padrão de avaliação de proficiência. Um resumo do procedimento estabelecido na norma ISO para avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio é apresentado no Anexo A Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Nesta rodada de ensaio de proficiência o desvio padrão para avaliação de proficiência dos laboratórios participantes foi calculado como recomendado no item 6.4 da norma ISO 13528, isto é, como proposto originalmente por Horwitz, (Horwitz, 1980), onde a precisão interlaboratorial é avaliada em termos de um desvio padrão de reprodutibilidade (Equação 1). 0,8495 σ H 0,02c (1) onde : c é o nível de concentração expresso em fração mássica e H é o desvio padrão de Horwitz. Adotando-se as modificações propostas por Thompson (Thompson, 2000) onde se leva em consideração os níveis de concentração do analito expressos em fração mássica, conforme as Equações 2, 3 e 4: σ 0, 22c, se c < 1,2 x 10-7 (2) 0,8495 σ 0,02c, se 1,2 x 10-7 c 0,138 (3) 0,5 σ 0,01c, se c > 0,138 (4) onde : c é o nível de concentração expresso em fração mássica e é o desvio padrão de Horwitz modificado. Página 6 de 23

8 Índice z Para a qualificação dos resultados dos laboratórios, o índice z (z-score, medida da distância relativa do resultado da medição do laboratório em relação ao valor designado do ensaio de proficiência) foi calculado de acordo com a Equação 5. Y i Y ref z (5) onde: Y i representa o valor do laboratório participante, Y ref representa o valor designado e σ, o desvio padrão de Horwitz modificado. A interpretação do valor do índice z está descrita abaixo: z 2 - Resultado satisfatório 2 < z < 3 - Resultado questionável z 3 - Resultado insatisfatório Análise Robusta Nesta rodada o valor designado foi calculado através da análise robusta (ISO 13528), documento complementar à ISO/IEC 17043, e o desvio padrão estimado através das equações derivadas do modelo geral de Horwitz (Item 4.3.3). O procedimento adotado no cálculo do valor designado é descrito no Anexo B. 5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio 5.1. Avaliação da Homogeneidade Para o teste de homogeneidade foram separados, aleatoriamente, 10 itens de ensaio contendo, amostras representativas do café preparado. Para cada item de ensaio foram realizadas duas análises completas, utilizando em cada uma 25g de café, produzindo dois resultados (A e B), como mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Dados gerados no teste de homogeneidade, em g.kg -1. Identificação Ocratoxina A da Amostra A B 1 1,656 1, ,626 1, ,465 1, ,505 1, ,559 1, ,641 1, ,786 1, ,416 1, ,952 1, ,591 1,481 A Tabela 2 apresenta os resultados da análise estatística do estudo de homogeneidade para a Ocratoxina A. Página 7 de 23

9 Tabela 2: Sumário das análises estatísticas para o estudo de Homogeneidade, em ( g.kg -1 ). Micotoxina Média ˆ (1) 0,3 ˆ s x s w s s Resultado Ocratoxina A 1,611 0,354 0,106 0,090 0,132 0,0 Suficientemente homogêneo (1) Desvio padrão de Horwitz (modificado por Thompson), correlacionado a concentração média das vinte amostras Apesar da variância analítica, (s w ) 2 ter apresentado um valor ligeiramente mais alto que a variância das médias (s x ) 2, fazendo com que o termo do desvio padrão entre as amostras fosse considerado zero, os itens de ensaio se apresentaram suficientemente homogêneos para a finalidade deste Ensaio de Proficiência Avaliação da Estabilidade Estabilidade de Armazenamento A estabilidade das amostras armazenadas em geladeira (4 a 8 C), quanto a flutuações temporais na concentração da Ocratoxina A, foi avaliada no decorrer do EP (Tabela 3). A avaliação foi realizada utilizando-se a análise de resíduos da regressão linear. Os itens de ensaio foram considerados suficientemente estáveis para a finalidade deste Ensaio de Proficiência (Tabela 4). Tabela 3: Dados gerados no teste de estabilidade de armazenamento, em g.kg -1. Dias Ocratoxina A A B 0 1,435 1, , ,423 1, ,504 1, , ,690 1, ,498 1, ,720 1, ,405 1,384 Tabela 4: Análise de regressão para a Ocratoxina A em café, em g.kg -1.dias -1. Intervalo de confiança Micotoxina Coeficiente Angular Erro padrão Inferior Superior Resultado Ocratoxina A -0, , , ,00220 Estável Estabilidade de Transporte A fim de avaliar a influencia da temperatura no transporte dos itens de ensaio, foi realizado um experimento onde 8 itens de ensaio foram colocados à temperatura de 25 e 50ºC (4 em cada temperatura) simulando condições drásticas de transporte. O tempo que cada item de ensaio permaneceu a temperatura do estudo e os valores encontrados para as concentrações da Ocratoxina A estão apresentados na Tabela 5. Os valores encontrados na análise de regressão são apresentados na Tabela 6. Página 8 de 23

10 Tabela 5: Dados gerados no teste de estabilidade de transporte, em g.kg -1. Ocratoxina A Tempo 25 0 C 50 0 C A B A B 0 1,767 1,725 1,767 1, ,015 1,606 1,641 1, ,600 1,406 1,684 1, ,586 1,510 1,669 1, ,896 1,364 1,720 1, ,622 1,322 1,655 1,681 Tabela 6: Análise de regressão para os Ocratoxina A em café, em g.kg -1.dias -1. Intervalo de confiança Ocratoxina A Coeficiente Angular Erro padrão Inferior Superior Resultado 25 0 C -0, , , ,00810 Estável 50 0 C -0, , , ,00702 Estável Os resultados obtidos no tratamento estatístico dos dados gerados nos estudos de estabilidade de armazenamento e de transporte evidenciaram que o valor do intervalo de confiança para o coeficiente angular abrange o valor zero (0), concluindo-se, portanto, que este é um valor possível ao coeficiente angular da curva que descreve a estabilidade e que os itens de ensaio mostraram-se suficientemente estáveis nas condições estabelecidas nos estudos. 6. Atribuição dos Valores Designados O valor designado relativo à Ocratoxina A empregada neste ensaio de proficiência foi calculado segundo procedimento estatístico descrito no item 4.3.5; a incerteza do valor designado foi calculada de acordo com o que estabelece o item da norma ISO 13528; o desvio padrão para avaliação de proficiência foi obtido pelas equações modificadas baseadas no modelo de Horwitz, conforme o item O valor designado, a incerteza combinada, o fator de abrangência e a incerteza expandida e o seu respectivo desvio padrão estão apresentados na Tabela 7. Tabela 7: Valores designados e desvios padrão, em g.kg -1. Micotoxina Valor Designado (1) u c (VD) k U (VD) Desvio Padrão (σ H ) Ocratoxina A 3,70 0,98 2,65 2,6 0,81 (1) Os laboratórios MIC 04/001, MIC 04/010 e MIC 04/060 não tiveram seus dois resultados computados no cálculo do Algoritmo A. O Laboratório MIC 04/096 não teve o resultado do item de ensaio #42 computado. Como a incerteza combinada do valor designado foi maior que 0,3 H, esta não pode ser negligenciada. Página 9 de 23

11 7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes 7.1. Laboratórios Participantes Oito laboratórios se inscreveram na 4ª Rodada do Programa de Ensaio de Proficiência para a Determinação de Micotoxinas em Alimentos Matriz Café, oito (100 %) enviaram os resultados. Dos laboratórios, dois (25,0 %) são acreditados na norma ISO/IEC na análise de Ocratoxina A. A maior parte deles, sete (87,5 %), possuía a metodologia completamente validada para a análise em questão Resultados dos Laboratórios Participantes Os dados reportados pelos laboratórios participantes do ensaio de proficiência foram tratados de acordo com os procedimentos descritos na ISO/IEC e na ILAC G-13. A Tabela 8 apresenta os resultados dos laboratórios para a análise da Ocratoxina A, a recuperação, o limite de detecção e o limite de quantificação, a incerteza expandida, as técnicas de análise, bem como a massa de amostra utilizada pelos laboratórios participantes. O gráfico da dispersão dos resultados dos laboratórios participantes, para a Ocratoxina A, encontra-se na Figura 1. Neste gráfico a linha central representa o valor designado e as linhas pontilhadas em azul a incerteza expandida do valor designado. Página 10 de 23

12 Tabela 8: Método (S=Sim; N=Não), Massa de amostra (g), Volume de Injeção (Vol. Inj. L), Resultados por análise (Resultado; g.kg -1 ), Recuperação (Rec; %), Limite de Detecção (LD; g.kg -1 ), Limite de Quantificação (LQ; g.kg -1 ), Incerteza expandida (U; g.kg -1 ) e fator de abrangência. Laboratório Método Acreditado Validado Massa Amostra Determinação Sumário dos Resultados - Café Vol. Injeção Item 1 Resultado Rec. Item 2 Resultado Rec. LD LQ U k MIC 04/001 N S 12,5 CLAE-F 10 #01 12,88 42,7 #22 16,68 35,9 0,15 0,5 - - MIC 04/010 N S 5 CLAE-F 50 #28 6,2 50 #37 6,1 50 0,25 0,8 - - MIC 04/038 N S 25 CLAE-F 200 #43 5, #54 11, ,3 1 0,2 2 MIC 04/041 N S 10 CLAE-F 20 #30 5,05 106,1 #34 5,5 106,1 0,2 0,6 - - MIC 04/060 S S 5 CLAE-EM/EM 10 #06 3,21 na #24 2,92 na 0,25 0,5 - - MIC 04/088 S S 25 CLAE-F 20 #13 3,55 99 #07 4, ,8 2,48/2,87 2,08/2,00 MIC 04/090 N N 25 CLAE-EM/EM 10 #18 2,68 98 #46 2, , MIC 04/096 N S 10 CLAE-F 50 #04 2,83 71,65 #42 <1,7 71,65-1,7 - - INCQS N S 25 CLAE-F 20-1, , ,3 1,0 - - na = não analisado CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, F = Fluorescência e EM = Espectrometria de Massas Página 11 de 23

13 Figura 1: Dispersão dos resultados da ocratoxina A em café Página 12 de 23

14 7.3. Considerações Sobre as Metodologias de Análise Nesta rodada de EP os laboratórios foram orientados a reportarem também alguns parâmetros relativos à validação do método empregado. Assim pela análise do sumario dos resultados (Tabela 8), podemos considerar o seguinte: Método e Informações Sobre a Metodologia Somente um dos laboratórios participantes não tem a metodologia validada e poucos laboratórios são acreditados na ISO para esta análise. Cabe observar nestes casos, a importância de se concluir todas as etapas de validação de um método analítico, para que o laboratório possa ter total controle metrológico sobre os seus resultados. Somente a cromatografia em fase líquida foi utilizada como método de quantificação, sendo que o detector de fluorescência sendo o mais utilizado. A menor massa de amostra utilizada foi de 5 gramas, cinco vezes menor que o utilizado no estudo de homogeneidade do INCQS (25g). Os volumes de injeção também variaram muito, desde 10 à 200 microlitros. Todos os laboratórios participantes utilizaram coluna de imunoafinidade para a limpeza da amostra e coluna cromatográfica de fase reversa (C18). Como solvente de extração, somente um laboratório utilizou água:bicarbonato de sódio, tendo os outros laboratórios utilizado metanol:bicarbonato de sódio Recuperação, Limite de Detecção e Limite de Quantificação Verificamos que alguns laboratórios não reportaram os valores de recuperação e limites de detecção para a Ocratoxina A. Dois laboratórios, MIC 04/001 e MIC 04/010, encontraram valores de recuperação fora do esperado, comunicado este fato ao provedor Incerteza Somente dois laboratórios reportaram a incerteza dos seus resultados, sendo que um dos laboratórios acreditados na ISO não reportou esta informação. A incerteza reportada pelo laboratório MIC 04/038 é muito baixa em relação a dispersão dos resultados obtidos nas duas amostras idênticas, indicando que pode estar ocorrendo uma subestimação deste valor Cálculo do Índice z A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes e do INCQS, expressa através do índice z (Equação 5), está apresentada na Tabela 9. Página 13 de 23

15 Tabela 9: Valores do índice z obtidos pelos laboratórios participantes e pelo INCQS. Código do Laboratório Ocratoxina A Item 1 z-score Item 2 z-score MIC 04/001 #01 11,3 #22 15,9 MIC 04/010 #28 3,1 #37 2,9 MIC 04/038 #43 1,7 #54 9,6 MIC 04/041 #30 1,7 #34 2,2 MIC 04/060 #06-0,6 #24-1,0 MIC 04/088 #13-0,2 #07 0,5 MIC 04/090 #18-1,3 #46-1,4 MIC 04/096 #04-1,1 #42 ND INCQS H A -2,6 H B -2,6 ND = Não detectado; Azul = resultado questionável, Vermelho = resultado insatisfatório. H A = Média da homogeneidade, análise A e H B = Média da homogeneidade, análise B As Figuras 2 e 3 apresentam os resultados de índice z obtidos pelos laboratórios participantes para o Ocratoxina A, nos itens de ensaio 1 e 2. A Figura 4 apresenta um gráfico de dispersão de Youden, onde podem ser verificados os erros sistemáticos e/ou aleatórios contribuintes para os resultados do índice z. A área demarcada em pontilhado azul é a dos resultados satisfatórios, a área entre o azul e o pontilhado em amarelo a dos resultados questionáveis e a fora do pontilhado amarelo, a dos resultados insatisfatórios. Página 14 de 23

16 Figura 2: Gráfico de z-score dos laboratórios participantes para a Ocratoxina A, item 1. Página 15 de 23

17 Figura 3: Gráfico de z-score dos laboratórios participantes para a Ocratoxina A, item 2. Página 16 de 23

18 Figura 4: Gráfico de Youden dos laboratórios participantes para a Ocratoxina A. Página 17 de 23

19 Os resultados reportados como não detectados, quando o valor designado da Ocratoxina A encontrava-se efetivamente acima do Limite de Quantificação (LQ), foram considerados insatisfatórios. Assim, o laboratório MIC 04/096 teve seu resultado para o item 2 considerado insatisfatório. Assim, de acordo com os resultados obtidos, cinco dos oito laboratórios participantes obtiveram resultados questionáveis ou insatisfatórios para, pelo menos, um dos itens analisados. De um total de dezesseis resultados reportados, aproximadamente 56,3% foram considerados satisfatórios (nove resultados), 12,5% foram considerados questionáveis (dois resultados), e 31,2% insatisfatórios (cinco resultados). O resultado questionável, para o laboratório do INCQS em ambos os resultados, não é crítico para a confiabilidade dos estudos de homogeneidade e estabilidade, visto que um possível erro seria sistemático (para menos do valor designado, gráfico de Youden), não tendo influência em sua dispersão. Contudo, estudos estão sendo realizados para averiguar este desvio, sendo a correção pela recuperação um dos fatores investigados. O índice z é apenas um indicativo do desempenho do laboratório, cabendo a cada laboratório participante fazer a sua interpretação e implementar as ações corretivas, caso necessário. 8. Conclusões A análise criteriosa dos dados gerados neste EP sugere: Desempenho dos laboratórios: pode-se considerar como insatisfatório, uma vez que apenas três (37,5%) dos laboratórios participantes obtiveram ambos os resultados satisfatórios; Preenchimento do formulário: a maioria dos laboratórios preencheu o mesmo conforme estabelecido, contudo, alguns campos importantes ainda foram deixados em branco prejudicando a avaliação dos resultados; Ações corretivas: Para os laboratórios que obtiveram resultados insatisfatórios ou questionáveis, ações corretivas devem ser adotadas para o aprimoramento das suas medições, particularmente quando resultados insatisfatórios foram também obtidos em rodada anterior desse EP. Uma avaliação detalhada, desde o recebimento do material e seu armazenamento, até o preenchimento do Formulário para Registro dos Resultados, e a avaliação de todos os passos da metodologia de análise, serão importantes para a identificação dos pontos críticos. Finalmente, é importante ressaltar que o estabelecimento de ações corretivas e a contínua participação em ensaios de proficiência desta natureza são ferramentas de grande contribuição para o aprimoramento das medições realizadas pelos laboratórios. Página 18 de 23

20 9. Confidencialidade Os resultados deste Ensaio de Proficiência são confidenciais, isto é, cada laboratório é identificado por código individual que é conhecido apenas por ele e pela Coordenação deste Ensaio de Proficiência. Os resultados poderão ser utilizados em trabalhos e publicações pelo INCQS respeitando-se a confidencialidade dos laboratórios. 10. Referências Bibliográficas ABNT ISO/IEC Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração, CHUI, Q. S. H.; BISPO, J. M. de A.; Iamashita, C. O.; O papel dos programas interlaboratoriais para a qualidade dos resultados analíticos. Química Nova, Vol. 27 (06), , CODEX ALIMENTARIUS. Guidelines on Good Laboratory Practice in Residue Analysis: CAC/GL , Rev Rome: FAO/WHO Joint Publications, Vol. Horwitz, W; Kamps, L.R; Boyer, K.W; Quality Assurance in the Analysis of Foods for Trace Constituents ; J. Assoc. off Anal. Chem.; 63(6); ; Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Vocabulário Internacional de Metrologia: Conceitos Fundamentais e Gerais e Termos Associados (VIM 2008). Rio de Janeiro, International Laboratory Accreditation Cooperation - ILAC G13. Guidelines for the requirements for the competence of providers of proficiency testing schemes, 2007 International Organization for Standardization ISO/IEC Conformity assessment General requirement for proficiency testing. Geneva, International Organization for Standardization ISO GUIDE 35 - Reference materials General and statistical principles for certification. Geneva, 2006 International Organization for Standardization ISO Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons RDC n o 7, de 18 de fevereiro de 2011, ANVISA, DOU n o 37, 22/02/2011. The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of Analytical Chemistry Laboratories. Pure Appl. Chem., Vol. 78, N o. 1, pp , Thompson, M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. (DOI: /b000282h)Analyst, 125, , Página 19 de 23

21 11. Laboratórios Participantes A lista dos laboratórios que enviaram os resultados à coordenação do Programa é apresentada na Tabela 10. Tabela 10: Laboratórios participantes da 4ª Rodada do Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos. Bioagri Análise de Alimentos LTDA Eurofins do Brasil Análise de Alimentos LTDA Instituição Laboratório de Cromatografia do Centro de Qualidade Analítica LTDA CQA Laboratório de Micotoxinas da Fundação Ezequiel Dias/Instituto Octávio Magalhães FUNED Laboratório de Microbiologia do Instituto de Tecnologia de Alimentos ITAL Laboratório Nacional Agropecuário Lanagro MG Nestle Quality Assurance Center (NQAC-SP) da Nestlé Brasil LTDA Núcleo de Contaminantes Orgânicos (NCO1) do Instituto Adolfo Lutz IAL Total de participantes: 8 laboratórios O código de cada participante não está associado à ordem da lista de participantes. Página 20 de 23

22 Anexo A Homogeneidade Segundo a Norma ISO Primeiramente, seleciona-se aleatoriamente um número g (onde g 10) de amostras do lote de itens de ensaio preparado retiram-se duas porções de teste de cada item de ensaio e realizam-se as análises de todas as porções (2g) de forma aleatória, completando-se todas as séries de medição sob condições de repetitividade. Calcula-se a média, x t,., entre as duas porções de teste (x t,1 e x t,2 ), para cada amostra, e em seguida, calcula-se a media geral, x, definida como a média das médias de cada amostra. A partir destes valores, calcula-se o desvio padrão das médias das amostras, s x, conforme a Equação 1 e as diferenças entre as porções de teste, w t, também para cada amostra, a partir da Equação 2. s x ( x t,. x) 2 /( g 1) (1) w t x x (2) t, 1 t,2 A partir dos valores definidos acima, calcula-se o desvio padrão dentro das amostras s w e o desvio padrão entre as amostras s s, conforme as Equações 3 e 4, a seguir: sw w t²/( 2 g) (3) s s sx² ( sw² / 2) (4) As amostras podem ser consideradas adequadamente homogêneas para este ensaio de proficiência, se for atendido o critério definido na Equação 5: ss 0,3sˆ (5) onde, ŝ é o desvio padrão alvo, obtido através da equação de Horwitz (4.3.3), da concentração média para cada micotoxina no estudo de homogeneidade. Caso este critério não seja alcançado, a norma ISO permite ainda a inclusão da variação existente entre as amostras, no desvio padrão para avaliação de proficiência, conforme a Equação 6: σ σ1² ss² (6) Esta inclusão permite que possíveis variações na homogeneidade entre os itens de ensaio com relação aos valores de concentração, não influenciem diretamente na avaliação de desempenho do laboratório participante do EP. Contudo, inicialmente deve ser verificada a possibilidade de melhorias no processo de preparo das amostras. Página 21 de 23

23 Anexo B Valor Designado Segundo a Norma ISO A Norma ISO é um documento complementar à ISO GUIA 43 e fornece os métodos estatísticos a serem empregados nos ensaios de proficiência. Este documento descreve a análise robusta envolvendo o emprego da estimativa do algoritmo A para o cálculo do valor designado e do desvio padrão. Neste EP, somente o valor designado foi calculado através da análise robusta, sendo o desvio padrão estimado através das equações derivadas do modelo geral de Horwitz (4.3.3). Inicialmente, todos os valores objetos da análise (valores enviados pelos laboratórios participantes e pelo INCQS) foram colocados em ordem crescente. A seguir, foram calculados os valores da mediana de x i (x*) e do desvio padrão (s*), conforme as Equações 1 e 2. x* medianade x i (1) s* x * 1,483 med xi (2) Onde: med é a mediana; x i valor de concentração reportado pelo laboratório. Em seguida, foi calculado o valor de F i, segundo a Equação 3, e a partir da estimativa de F i, calculou-se o novo valor inferior (concentração inferior), e o novo valor superior (concentração superior), através das Equações 4 e 5. F i = 1,5s* (3) Novo Valor Superior = x* + F i (4) Novo Valor Inferior = x* - F i (5) Os novos valores, superior e inferior, foram comparados a cada um dos resultados individuais dos laboratórios participantes, e os que estavam acima do valor superior ou abaixo do valor inferior foram descartados, ou seja, foram considerados valores dispersos ou discrepantes e substituídos pelos novos valores superiores e inferiores. Este procedimento compreende a um ciclo ou Ciclo 0. Iniciou-se um novo ciclo, a partir do cálculo da média robusta (x*) 1 e do desvio padrão (s) dos novos valores encontrados, e a seguir calculou-se o novo desvio padrão robusto (s*) 2. O novo valor de s* foi calculado pela Equação 6: (6) 1 Na ISO quando se inicia o Ciclo 1, x* passa a ser denominado como média robusta, uma vez que advém de um algoritmo robusto. 2 Na ISO quando se inicia o Ciclo 1, s* passa a ser denominado como desvio padrão robusto, uma vez que advém de um algoritmo robusto. Página 22 de 23

24 Em seguida, calculou-se novamente o valor de F i, os novos valores superiores e inferiores, conforme descrito, respectivamente, nas Equações 3, 4 e 5, sendo os valores discrepantes substituídos pelos novos limites. Este procedimento corresponde a outro ciclo ou Ciclo 1. O ciclo é reiniciado até o momento em que os valores da nova média robusta (x*) e do novo desvio padrão robusto (s*) convergirem, ou seja, até que não haja nos ciclos, diferença entre eles. Neste momento o ciclo é finalizado e os novos valores de x* e s*, que são os valores da média robusta (valor designado do EP) e do desvio padrão robusto. Para a incerteza do valor designado, foi adotada a fórmula apresentada no item da norma ISO 13528, específica para valores designados obtidos a partir do algoritmo A. A incerteza padrão foi calculada pela Equação 7: (7) Onde, s * é o desvio padrão robusto e p é o número de laboratórios. Página 23 de 23

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