Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas 9ª Rodada Aflatoxinas em Milho EP MIC 09/16

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1 Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas 9ª Rodada Aflatoxinas em Milho Pána 2 de 41

2 Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas 9ª Rodada Aflatoxinas em Milho RELATÓRIO FINAL ORGANIZAÇÃO E COORDENAÇÃO Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Avenida Brasil, 4365 Manguinhos Rio de Janeiro - RJ Brasil - Cx. Postal CEP: COMISSÃO ORGANIZADORA DA RODADA - COMISSÃO DO PROGRAMA DE ENSAIO DE PROFICIÊNCIA Armi Wanderley da Nóbrega Coordenador Geral Marcus Henrique Campino de la Cruz Coordenador Técnico Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso Coordenadora da Qualidade - COMITÊ TÉCNICO André Victor Sartori Eloiza Rodrigues Pimentel de Sá Maria Heloisa Paulino de Moraes Rosana Pereira dos Santos Autorizada a emissão Armi W. da Nóbrega (Coordenador Geral) 29/Novembro/2016

3 SUMÁRIO 1. Introdução Objetivos Produção dos Itens de Ensaio Escolha da Matriz Preparo dos Itens de Ensaio Faixa de Concentração Esperada Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Armazenamento e Envio dos Itens de Ensaio Recebimento dos Itens de Ensaio Análise dos Resultados Resultados das Medições dos Laboratórios Estabelecimento dos Valores de Referência Análise Estatística Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio Análise de Resíduos Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Índice z Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Avaliação da Homogeneidade Avaliação da Estabilidade Estabilidade de Transporte Estabilidade de Armazenamento Atribuição dos Valores de Referência Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes Laboratórios Participantes Resultados dos Laboratórios Participantes Considerações Sobre as Metodologias de Análise Método e Informações Sobre a Metodologia Recuperação, Limite de Detecção e Limite de Quantificação Incerteza Cálculo do Índice z Conclusões Confidencialidade Referências Bibliográficas Laboratórios Participantes Anexo A Metodologia para a Atribuição do Valor de Referência Anexo B Homogeneidade Segundo a Norma ISO Página 2 de 43

4 1. Introdução Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Além do baixo número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos, os custos cobrados para a participação nestes ensaios principalmente de provedores internacionais, são normalmente muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. O consumo de alimentos contaminados por micotoxinas tem sido correlacionado a várias patologias humanas, e as autoridades de saúde no mundo todo tem implementado ações para diminuir a ingestão dessas substâncias pela dieta. Aflatoxinas são consideradas uma importante classe de micotoxinas. Devido à toxicidade, alto potencial de contaminação e consumo, a presença de aflatoxinas em milho tem sido regulamentada em diversos países. No Brasil, o limite máximo tolerável para o somatório das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em milho é 20 g.kg -1. Esse fato reflete a importância da utilização de metodologias analíticas confiáveis para determinação de aflatoxinas em milho para assegurar a qualidade das medições. As investigações sobre a incidência de micotoxinas em alimentos são de suma importância para que esforços possam ser concentrados na prevenção e no controle da contaminação dos produtos susceptíveis a esse tipo de contaminação. Assim, a realização de programas de ensaio de proficiência no Brasil é fundamental para o aumento da confiabilidade dos resultados das medições aqui realizadas, trazendo maior confiança aos resultados emitidos, facilitando o comércio internacional e prevenindo barreiras técnicas. Este relatório tem como objetivo apresentar os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes no Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos, 9ª Rodada - Aflatoxinas em Milho, seguindo as diretrizes da ABNT ISO/IEC Página 3 de 43

5 2. Objetivos O objetivo deste Ensaio de Proficiência é fornecer aos laboratórios participantes uma ferramenta efetiva para verificar a sua competência nos ensaios de rotina. Portanto: As aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 deverão ser identificadas e quantificadas pelos laboratórios participantes nas amostras de milho recebidas empregando a metodologia analítica utilizada em sua rotina; A partir daqueles resultados, o desempenho dos laboratórios participantes para o ensaio proposto será avaliado; Subsídios serão, então, fornecidos aos laboratórios para a identificação e solução de problemas. 3. Produção dos Itens de Ensaio Os procedimentos de preparo dos itens de ensaio e as análises foram realizados no Departamento de Química / Laboratório de Alimentos / Setor de Resíduos e Contaminantes - Laboratório de Resíduos de Micotoxinas do INCQS/FIOCRUZ. A metodologia analítica empregada está acreditada nos requisitos da norma ABNT ISO/IEC Escolha da Matriz O milho é um alimento muito consumido pelos brasileiros e de grande importância na balança comercial do país. Por outro lado, as condições predominantes de clima e temperatura brasileiras propiciam o crescimento de micotoxinas no armazenamento do milho. Estes fatos tornam o controle da qualidade do produto relevante no que se refere à saúde pública e à vigilância sanitária nacionais Preparo dos Itens de Ensaio A amostra de milho em grão foi adquirida diretamente no mercado local. Esta foi moída, peneirada, homogeneizada e então separada em dois lotes: Lote 1 e Lote 2. O lote 2 foi contaminado com níveis de concentrações aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 significativos, quando levamos em conta o somatório das mesmas, mas ainda assim abaixo LMT pela legislação brasileira, ANVISA, Após a homogeneização de cada lote, as amostras foram envazadas a vácuo em saches aluminizados, contendo cada um 27 ± 2g de milho moído Faixa de Concentração Esperada Lote 1: Lote Branco Amostra preparada foi considerada branco pois a concentração de cada aflatoxina foi inferior ao limite de detecção do método utilizado no Setor de Resíduos de Micotoxinas/INCQS. 1 Número da Acreditação CRL0169 Página 4 de 43

6 Lote 2: Lote Contaminado Amostra preparada com uma concentração alvo de cada aflatoxina (B1, B2, G1 e G2), que estava acima do limite de quantificação do método analítico utilizado pelo INCQS e entre a concentração de 1 a 5 ng.g Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio O estudo da homogeneidade foi realizado com 10 (dez) itens de ensaio para cada lote, separados aleatoriamente, antes do envio para os laboratórios. Estudos de estabilidade de curta e de longa duração foram realizados. O estudo de curta duração foi conduzido no modelo isócrono na temperatura de 40 º C (Lamberty, Schimmel e Pauwels, 1997), enquanto o estudo de longa duração foi realizado seguindo o modelo misto (clássico e isócrono), na temperatura de armazenamento (4 o C). A avaliação da estabilidade de longa duração foi realizada no período compreendido entre o envio dos itens de ensaio e o prazo final de recebimento dos resultados pelos laboratórios participantes. As análises de homogeneidade e estabilidade foram realizadas em duplicatas completas produzindo dois resultados (A e B) por item de ensaio. Os testes estatísticos seguiram a norma ISO e a ISO GUIDE 35. Os resultados obtidos nos testes estão apresentados nos itens 5.1 e 5.2 deste relatório Armazenamento e Envio dos Itens de Ensaio Os itens de ensaio foram armazenados em freezer (temperatura menor que -15 C) até o momento em que foram enviados aos laboratórios participantes. Para cada laboratório inscrito na 9ª Rodada do Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos Aflatoxinas em Milho, foram enviados 4 (quatro) itens de ensaio: dois (2) itens branco e dois (2) itens contaminado. Os saches foram devidamente identificados com as seguintes informações: o número da rodada, número do lote, o item a ser ensaiado e o código da amostra; foram enviados aos laboratórios por correio, acondicionados em envelopes de papel revestidos com plástico bolha. Os laboratórios receberam as informações necessárias para realizar o armazenamento adequado dos itens de ensaio, através do formulário de Instruções para Armazenamento e Preparo dos Itens de Ensaio, disponibilizado no site do INCQS/EP Recebimento dos Itens de Ensaio Ao receber os itens de ensaio, os laboratórios foram instruídos a inspecioná-los quanto a integridade da embalagem e das amostras. As informações foram registradas no Formulário de Recebimento de Item de Ensaio. Página 5 de 43

7 4. Análise dos Resultados 4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios Os laboratórios participantes foram orientados a realizar a quantificação das aflatoxinas na amostra segundo a sua metodologia de trabalho. Além dos resultados analíticos, expressos em ng.g -1, os laboratórios participantes também deveriam informar a recuperação (%), os limites de detecção e quantificação e a incerteza, referentes ao método empregado. As informações foram apresentadas no Formulário de Registro de Resultados. As informações sobre as técnicas e os equipamentos utilizados nos ensaios também foram registradas Estabelecimento dos Valores de Referência Como não foi atingido o mínimo de 11 resultados válidos 2, reportados pelos laboratórios participantes, para cada aflatoxina, o valor designado não foi calculado a partir das técnicas de estatística robusta e sim fornecido pelo INCQS, passando a ser denominado como Valor de Referência. O procedimento adotado no cálculo do valor de referência e de sua incerteza é descrito no Anexo A Análise Estatística Neste tópico estão descritas as análises estatísticas utilizadas para a avaliação da homogeneidade e da estabilidade das amostras, para a obtenção dos valores de referência e suas incertezas, do desvio padrão utilizado na avaliação dos laboratórios (desvio padrão robusto), bem como para a avaliação do desempenho dos laboratórios participantes Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio A norma ISO (Item 4.4, Anexo B da norma) foi seguida na avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio. Esta norma permite incluir o desvio padrão devido à heterogeneidade das amostras, no desvio padrão de avaliação de proficiência. Um resumo do procedimento estabelecido na norma ISO para avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio está apresentado no Anexo B deste relatório Análise de Resíduos A análise de resíduos foi empregada para avaliar a estabilidade dos itens de ensaio de milho em relação aos valores de referência da concentração das aflatoxinas avaliadas neste EP. Assim, foram estimadas as variâncias dos valores utilizados na regressão linear, observando-se se o valor de concentração apresentava alguma tendência através da ferramenta estatística de análise de variância (ANOVA). As aflatoxinas foram consideradas estáveis quando a inclinação da reta (ou a não linearidade) não foi significativa Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência 2 Critério 5, item 12 do Protocolo da Rodada. Página 6 de 43

8 Nesta rodada de EP o desvio padrão para avaliação de proficiência foi calculado como recomendado no item 6.4 da norma ISO 13528, isto é, como proposto originalmente por Horwitz (1980), onde a precisão interlaboratorial é avaliada em termos de um desvio padrão de reprodutibilidade (Equação 1). 0,8495,02 (1) H 0 c onde: c é o nível de concentração expresso em fração mássica e H é o desvio padrão de Horwitz. Adotando-se as modificações propostas por Thompson (Thompson, 2000) onde se leva em consideração os níveis de concentração expressos em fração mássica, conforme as Equações 2, 3 e 4: H 0, 022c, se c < 1,2 x 10-7 (2) 0,8495,02, se 1,2 x 10-7 c 0,138 (3) H 0 c 0,5,01, se c > 0,138 (4) H 0 c Para este EP o valor de referência de cada aflatoxina foi utilizado no cálculo do desvio padrão para avaliação da proficiência Índice z Para a qualificação dos resultados dos laboratórios, o índice z (z-score, medida da distância relativa do resultado da medição do laboratório em relação ao valor designado do ensaio de proficiência) foi calculado de acordo com a Equação 5. * x i x z (5) H Onde x i representa o valor do laboratório participante, x* representa o valor de referência e o desvio padrão de Horwitz. H A interpretação do valor do índice z está descrita abaixo: z 2 - Resultado satisfatório 2 < z < 3 - Resultado questionável z 3 - Resultado insatisfatório 5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio 5.1. Avaliação da Homogeneidade Para o teste de homogeneidade, foram separados, aleatoriamente, 10 itens de ensaio de cada lote ( branco e contaminado ). O lote branco foi considerado homogêneo visto que todos os itens de ensaio apresentaram resultado inferior ao limite de detecção do método utilizado para todas as aflatoxinas. Página 7 de 43

9 Os resultados do teste de homogeneidade realizado em duplicata com os itens de ensaio do lote contaminado estão demonstrados na Tabela 1. Tabela 1: Dados gerados no teste de homogeneidade, em ng.g -1. Item de Ensaio Aflatoxina B1 Aflatoxina B2 Aflatoxina G1 Aflatoxina G2 Totais A B A B A B A B A B 1 2,81 2,75 1,53 1,45 3,93 3,82 1,83 1,83 10,09 9,86 2 2,89 2,76 1,49 1,42 3,98 3,55 1,72 1,73 10,08 9,46 3 3,07 2,60 1,59 1,40 3,91 3,47 1,86 1,73 10,43 9,20 4 2,84 3,00 1,52 1,59 3,87 4,06 1,87 1,85 10,10 10,50 5 3,01 2,84 1,59 1,47 3,86 3,57 1,78 1,61 10,24 9,48 6 2,60 2,80 1,47 1,56 3,65 3,91 1,74 1,86 9,46 10,13 7 2,95 2,84 1,73 1,58 4,35 3,96 2,12 1,83 11,15 10,20 8 2,96 2,47 1,58 1,43 4,13 3,32 1,94 1,63 10,61 8,85 9 3,09 3,10 1,56 1,62 4,10 4,16 1,83 1,96 10,57 10, ,74 3,06 1,47 1,58 4,08 3,48 1,77 1,85 10,06 9,97 A Tabela 2 apresenta os resultados da análise estatística do estudo de homogeneidade para as Aflatoxinas. Tabela 2: Sumário das análises estatísticas para o estudo de Homogeneidade, em ng.g -1. Aflatoxinas Média ˆ (1) 0,3 ˆ s x s w s s Resultado B1 2,85 0,629 0,189 0,117 0,185 0,0 Suficientemente Homogêneo B2 1,53 0,337 0,101 0,057 0,083 0,0 Suficientemente Homogêneo G1 3,86 0,849 0,255 0,169 0,295 0,0 Suficientemente Homogêneo G2 1,82 0,400 0,120 0,080 0,116 0,0 Suficientemente Homogêneo Totais 10,06 2,214 0,664 0,369 0,601 0,0 Suficientemente Homogêneo (1) Desvio padrão de Horwitz (modificado por Thompson), correlacionado à concentração média das dez amostras Os itens de ensaio se apresentaram suficientemente homogêneos, apesar da variância analítica (s w) para todas as aflatoxinas ter apresentado valor mais alto que o desvio padrão das médias (s x), indicando baixa repetitividade do método e fazendo com que o termo do desvio padrão entre as amostras fosse considerado zero. Desta forma, consideraram-se os itens de ensaio suficientemente homogêneos para a finalidade deste EP em relação a todas as aflatoxinas presentes Avaliação da Estabilidade Estabilidade de Transporte A influência da temperatura durante o transporte dos itens de ensaio foi estudada por 15 dias, à temperatura de 40ºC. O tempo que cada item de ensaio permaneceu na temperatura do estudo e os valores encontrados para as concentrações das aflatoxinas estão apresentados na Tabela 3. Os valores encontrados na análise de regressão estão apresentados na Tabela 4. Página 8 de 43

10 Tabela 3: Estudo de estabilidade de transporte, em ng.g -1 (40 o C). Aflatoxinas Dias B1 B2 G1 G2 Totais A B A B A B A B A B 0 2,53 2,34 1,43 1,33 3,39 3,21 1,58 1,50 8,93 8,38 3 2,49 2,29 1,44 1,32 3,40 3,09 1,50 1,49 8,83 8,19 7 2,62 2,55 1,50 1,41 3,59 3,37 1,65 1,51 9,36 8, ,70 2,65 1,50 1,41 3,68 3,43 1,70 1,59 9,58 9, ,63 2,50 1,43 1,37 3,64 3,17 1,64 1,53 9,34 8,57 Tabela 4: Análise de regressão para as aflatoxinas em milho, em ng.g -1.dias -1 (40 o C). Aflatoxinas Coeficiente Angular Erro padrão Intervalo de confiança Inferior Superior Resultado B1 0, , , ,03722 Estável B2 0, , , ,01366 Estável G1 0, , , ,04352 Estável G2 0, , , ,01859 Estável Totais 0, , , ,11160 Estável Estabilidade de Armazenamento A estabilidade dos itens de ensaio armazenados na geladeira a 4 C foi avaliada no decorrer do EP, para verificar possíveis flutuações temporais na concentração das aflatoxinas. Os resultados estão demonstrados na Tabela 5. Este estudo foi realizado utilizando-se a análise de resíduos da regressão linear (Tabela 6). Tabela 5: Estudo de estabilidade de armazenamento, em ng.g -1 (4 C). Aflatoxinas Dias B1 B2 G1 G2 Totais A B A B A B A B A B 0 2,62 2,35 1,44 1,45 3,59 3,77 1,70 1,83 9,34 9, ,25 2,94 1,42 1,60 3,22 3,90 1,72 1,82 8,61 10, ,19 2,28 1,30 1,42 3,46 3,73 1,59 1,81 8,55 9, ,23 2,92 1,70 1,55 4,16 3,84 1,92 1,77 11,02 10, ,98 2,89 1,62 1,59 4,10 3,97 1,96 1,86 10,65 10, ,81 2,72 1,55 1,56 3,83 3,72 1,77 1,87 9,96 9,88 Tabela 6: Análise de regressão para as aflatoxinas do amendoim, em ng.g -1.dias -1 (4 C). Aflatoxinas Coeficiente Angular Erro padrão Intervalo de confiança Inferior Superior Resultado B1 0, , , ,00910 Estável B2 0, , , ,00304 Estável G1 0, , , ,00607 Estável G2 0, , , ,00219 Estável Totais 0, , , ,01970 Estável Página 9 de 43

11 Os resultados obtidos no tratamento estatístico dos dados gerados nos estudos de estabilidade de transporte (40 o C) e de armazenamento evidenciaram que o valor do intervalo de confiança para o coeficiente angular abrange o valor zero (0), para um nível de confiança de 95%. Conclui-se, portanto, que este é um valor possível ao coeficiente angular da curva que descreve a estabilidade e que os itens de ensaio mostraram-se suficientemente estáveis para todas as aflatoxinas nas condições estabelecidas nestes estudos. 6. Atribuição dos Valores de Referência Os valores de referência relativo às aflatoxinas empregadas neste ensaio de proficiência foi calculado segundo procedimento descrito no item 4.2 deste relatório; o desvio padrão para avaliação de proficiência foi obtido pelas equações modificadas baseadas no modelo de Horwitz, conforme o item O valor de referência, a incerteza combinada (u c), o fator de abrangência (k) e a incerteza expandida (U) e seu respectivo desvio padrão estão apresentados na Tabela 7. Tabela 7: Valores de referência, incertezas e desvios padrão, em ng.g -1. Aflatoxina Valor de Referência u c (VR) k U (VR) Desvio Padrão (σ H) B1 3,06 0,064 2,65 0,17 0,672 B2 1,59 0,033 2,65 0,088 0,351 G1 3,99 0,12 2,65 0,33 0,878 G2 1,85 0,047 2,65 0,12 0,407 Total 10,50 0,25 2,65 0,67 2,309 Como a incerteza combinada do valor de referência foi menor que 0,3σH, segundo a norma ISO 13528, esta pode ser negligenciada. 7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes 7.1. Laboratórios Participantes Nove laboratórios se inscreveram na 9ª Rodada do Programa de Ensaio de Proficiência para a Determinação de Micotoxinas em Alimentos Aflatoxinas em Milho, e todos eles enviaram os resultados. Dos laboratórios participantes três (33,3%) são acreditados na norma ABNT ISO/IEC para a análise de aflatoxinas. Apenas um participante (11,1%) não utilizou a metodologia analítica validada para a análise em questão. A Tabela 12 apresenta a listagem dos Laboratórios participantes Resultados dos Laboratórios Participantes Os dados reportados pelos laboratórios participantes foram tratados de acordo com os procedimentos descritos na ABNT ISO/IEC As Tabelas 8, 9 e 10 apresentam a técnica de análise e a massa de amostra utilizada pelos laboratórios, os resultados dos laboratórios Página 10 de 43

12 para a análise de cada aflatoxina, os limites de detecção e quantificação, a recuperação e incertezas. Os gráficos das dispersões dos resultados dos laboratórios para as Aflatoxinas deste EP encontram-se nas Figuras 1 a 5. No gráfico a linha central representa o valor de referência e as linhas pontilhadas em azul a incerteza expandida do valor de referência. Página 11 de 43

13 Tabela 8: Método (S=Sim; N=Não), Massa de Amostra (g), Solvente de Extração, Limpeza da Amostra, Técnica de Análise, Detector, Volume de Injeção (Vol. Injeção; L), Composição da Fase Móvel, Fluxo (ml/min) e Derivatização. Laboratório Acreditado Método Validado Massa Amostra MIC 09/005 N S 6,25 Solvente Extração MeOH:ACN: H2O Limpeza Amostra Centrifugação e Diluição Técnica de Análise Detector Vol. Injeção MIC 09/029 S S 25 MeOH:H2O IA CLAE F 50 MIC 09/032 N S 25 MeOH:H2O IA CLAE F 20 Fase Móvel Fluxo Derivatização UPLC MS/MS TQ 5 ACN:H2O:Ac.Form 0,3 Nenhuma ACN:MeOH:H2O 1:3,5:5,5 0,035 % Ac. Nítrico 4 mol.l mol L-1 (v/v) (3.2) 0,012% KBr (m/m) H2O:ACN:MeOH (6:2:3) +119mg KBr + 350uL Ac. Nítrico 4M 1 Pós 1 Pós MIC 09/033 N S 20 MeOH - ELISA MIC 09/036 S S 25 MeOH:H2O IA Fluorimétrica MIC 09/037 N - 20 MeOH IA CLAE F 20 MeOH:ACN:H2O 1,5 Pós MIC 09/064 N S 25 CHCl3 Celite; CuSO4 CCD - 1;3;5;7 e 10 C3H6O:CHCl3 (9:1) - - MIC 09/070 S S 25 MeOH:H2O IA CLAE F 200 MeOH:ACN:HAc 1 Pós MIC 09/085 N S 2 MeOH: ACN:H2O Não CLAE MS/MS 20 ACN 0,1% Ac. Form/ H2O 0,1% Ac. Form 0,5 Nenhuma ACN = Acetonitrila; MeOH = Metanol; H2O = Água; CHCl3 = Clorofórmio; CuSO4 = Sulfato de Cobre; KBr = Brometo de Potássio; C3H6O = Acetona; HAc = Ácido Acético; Ac. Form = Ácido Fórmico; IA = Imunoafinidade; UPLC = Cromatografia Líquida de Ultraeficiência; CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência; CCD = Cromatografia em Camada Delgada; CL= Cromatografia Líquida; TQ = Triplo Quádruplo e F = Fluorescência. Página 12 de 43

14 Tabela 9: Resultados por análise (ng.g -1 ) 1º e 2º itens de ensaio branco e 3º e 4º itens de ensaio contaminado. Sumário dos Resultados Laboratório Item de Ensaio B1 B2 G1 G2 Totais MIC 09/005 MIC 09/029 MIC 09/032 MIC 09/033 MIC 09/036 MIC 09/037 ND = Não Detectado; NT = Não Testado. 63 ND ND ND ND ND 85 ND ND ND ND ND 33 4,36 1,65 4,26 1,51 11, ,62 1,72 4,66 1,72 12,72 21 < 1,5 < 0,5 < 1,5 < 0,5 < 4 39 < 1,5 < 0,5 < 1,5 < 0,5 < ,54 1,24 3,30 1,22 9, ,37 1,14 3,03 1,23 8,77 26 ND ND ND ND ND 49 ND ND ND ND ND 15 3,29 1,44 3,72 1,48 9, ,20 1,41 3,65 1,43 9,68 89 NT NT NT NT ND 92 NT NT NT NT ND 65 NT NT NT NT 2,70 73 NT NT NT NT 3, ND ND , ,90 71 ND ND ND ND ND 88 ND ND ND ND ND 57 3,48 1,33 2,36 0,65 7, ,48 1,33 2,36 0,65 7,83 Página 13 de 43

15 Tabela 9: Resultados por análise (ng.g -1 ) - 1º e 2º itens de ensaio branco e 3º e 4º itens de ensaio contaminado. (Continuação) Sumário dos Resultados Laboratório Item de Ensaio B1 B2 G1 G2 Totais MIC 09/064 MIC 09/070 MIC 09/085 ND = Não Detectado; NT = Não Testado. 58 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 83 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 50 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 67 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 < 2,00 25 ND ND ND ND ND 47 ND ND ND ND ND 28 2,09 1,50 2,89 1,26 7, ,77 1,24 2,46 1,12 6,59 23 ND ND ND ND ND 27 ND ND ND ND ND 13 4,45 1,37 2,46 2,23 10, ,26 1,51 2,64 2,90 11,31 Página 14 de 43

16 Tabela 10: Parâmetros das análises: Limite de Detecção (ng.g -1 ), Limite de Quantificação (ng.g -1 ), Recuperação (%) e Incerteza (U) - 1º e 2º itens de ensaio branco e 3º e 4º itens de ensaio contaminado. Laboratório # Parâmetros das Análises Limite de Detecção Limite de Quantificação Recuperação Incerteza B1 B2 G1 G2 Total B1 B2 G1 G2 Total B1 B2 G1 G2 Total B1 B2 G1 G2 Total MIC 09/ ,37 0,37 0,37 0,34-1,22 1,22 1,22 1,14-96,67 98,60 103,81 104,98-0,71 0,38 0,78 0, ,37 0,04 0,37 0,34-1,22 1,22 1,22 1,14-96,67 98,60 103,81 104,98-0,75 0,40 0,85 0, ,04 0,01 0,04 0,01 0,10 1,50 0,50 1,50 0,50 4,00 83,50 94,50 87,90 86,90 88,20 0,25 0,08 0,25 0,08 0,66 MIC 09/ ,04 0,01 0,04 0,01 0,10 1,50 0,50 1,50 0,50 4,00 83,50 94,50 87,90 86,90 88,20 0,25 0,08 0,25 0,08 0, ,04 0,01 0,04 0,01 0,10 1,50 0,50 1,50 0,50 4,00 83,50 94,50 87,90 86,90 88,20 0,25 0,08 0,25 0,08 0, ,04 0,01 0,04 0,01 0,10 1,50 0,50 1,50 0,50 4,00 84,50 94,50 94,40 80,30 88,40 0,25 0,08 0,25 0,08 0, ,02 0,01 0,02 0,01 0,06 0,06 0,05 0,06 0,02 0,19 101,09 98,99 102,52 89,15 99, MIC 09/ ,02 0,01 0,02 0,01 0,06 0,06 0,05 0,06 0,02 0,19 101,09 98,99 102,52 89,15 99, ,02 0,01 0,02 0,01 0,06 0,06 0,05 0,06 0,02 0,19 101,09 98,99 102,52 89,15 99, ,02 0,01 0,02 0,01 0,06 0,06 0,05 0,06 0,02 0,19 101,09 98,99 102,52 89,15 99, MIC 09/ ND , ,70 MIC 09/ ND , , ND , , ND , , ,50 0,50 0,50 0,50-0,50 0,50 0,50 0, MIC 09/ ,50 0,50 0,50 0,50-0,50 0,50 0,50 0, ,50 0,50 0,50 0,50-0,50 0,50 0,50 0, ,50 0,50 0,50 0,50-0,50 0,50 0,50 0, # Número do item de ensaio Página 15 de 43

17 Tabela 10: Parâmetros das análises: Limite de Detecção (ng.g -1 ), Limite de Quantificação (ng.g -1 ), Recuperação (%) e Incerteza (U) - 1º e 2º itens de ensaio branco e 3º e 4º itens de ensaio contaminado. (Continuação) Laboratório # Parâmetros das Análises Limite de Detecção Limite de Quantificação Recuperação Incerteza B1 B2 G1 G2 Total B1 B2 G1 G2 Total B1 B2 G1 G2 Total B1 B2 G1 G2 Total 58 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3, ,00 2,00 2,00 2,00 2,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3, MIC 09/ ,00 2,00 2,00 2,00 2,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3, ,00 2,00 2,00 2,00 2,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3, ,066 0,012 0,099 0,015-0,20 0,06 0,20 0, ,066 0,012 0,099 0,015-0,20 0,06 0,20 0, MIC 09/ ,066 0,012 0,099 0,015-0,20 0,06 0,20 0, ,09 0,33 0,13 0, ,066 0,012 0,099 0,015-0,20 0,06 0,20 0, ,20 0,21 0,00 0, ,10 0,10 0,10 0,30-0,30 0,30 0,30 1, ,10 0,10 0,10 0,30-0,30 0,30 0,30 1, MIC 09/ ,10 0,10 0,10 0,30-0,30 0,30 0,30 1, ,10 0,10 0,10 0,30-0,30 0,30 0,30 1, # Número do item de ensaio Página 16 de 43

18 Figura 1: Dispersão dos resultados da Aflatoxina B1 em Milho Página 17 de 43

19 Figura 2: Dispersão dos resultados da Aflatoxina B2 em Milho Página 18 de 43

20 Figura 3: Dispersão dos resultados da Aflatoxina G1 em Milho Página 19 de 43

21 Figura 4: Dispersão dos resultados da Aflatoxina G2 em Milho Página 20 de 43

22 Figura 5: Dispersão dos resultados da Aflatoxinas Totais em Milho Página 21 de 43

23 7.3. Considerações Sobre as Metodologias de Análise Nesta rodada de EP os laboratórios foram orientados a reportarem também alguns parâmetros relativos à validação do método empregado. Assim, pela análise do sumário dos resultados (Tabelas 8 a 10) podemos considerar o seguinte: Método e Informações Sobre a Metodologia Dos nove laboratórios participantes, três (33,3%) são acreditados na norma ISO para a determinação de micotoxinas e oito (88,9%) relataram ter a metodologia validada. A cromatografia em fase líquida foi a técnica de separação e quantificação utilizada por seis (66,7%) laboratórios, sendo o detector de fluorescência o mais utilizado, tendo dois laboratórios utilizado a espectrometria de massas sequencial. A menor massa de amostra utilizada foi 2 g e a maior 25g. Lembramos que a massa mínima de amostra informada no formulário de Instruções para o Armazenamento e Preparo dos Itens de Ensaio foi de 6g. Os volumes de injeção variaram de 5 à 200 L. Todos os laboratórios que utilizaram a cromatografia como técnica de separação utilizaram coluna C18. Cinco laboratórios participantes utilizaram a coluna de imunoafinidade para a limpeza da amostra, enquanto um laboratório relatou ter usado centrifugação e diluição e outro utilizou celite e sulfato de cobre Recuperação, Limite de Detecção e Limite de Quantificação Dois laboratórios (MIC 09/033 e MIC 09/064) não informaram os valores de recuperação Incerteza Quatro laboratórios (MIC 09/005, MIC 09/029, MIC 09/036 e MIC 09/070) reportaram a incerteza dos seus resultados. Página 22 de 43

24 7.4. Cálculo do Índice z A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes, expressa através do índice z (Equação 5), está apresentada na Tabela 11. Tabela 11: Valores do índice z obtidos pelos laboratórios participantes. Código do Laboratório Aflatoxinas B1 B2 G1 G2 Totais Itens Itens Itens Itens Itens MIC 09/005 1,9 2,3 0,2 0,4 0,3 0,8-0,8-0,3 0,6 1,0 MIC 09/029 0,7 0,5-1,0-1,3-0,8-1,1-1,6-1,5-0,5-0,7 MIC 09/032 0,3 0,2-0,4-0,5-0,3-0,4-0,9-1,0-0,2-0,4 MIC 09/033 NT NT NT NT NT NT NT NT -3,4-3,2 MIC 09/036 NT NT NT NT NT NT NT NT -2,2-2,4 MIC 09/037 0,6 0,6-0,8-0,8-1,9-1,9-2,9-2,9-1,2-1,2 MIC 09/064 < LD < LD < LD < LD < LD < LD < LD < LD < LD < LD MIC 09/070-1,4-1,9-0,3-1,0-1,3-1,7-1,5-1,8-1,2-1,7 MIC 09/085 2,1 1,8-0,6-0,2-1,7-1,5 0,9 2,6 0,0 0,4 NT = Não Testado; LD = Limite de Detecção; Azul = resultado questionável, Vermelho = resultado insatisfatório. As Figuras 6 a 15 apresentam os resultados de índice z obtidos pelos laboratórios participantes para as aflatoxinas deste EP, para os dois itens de ensaio considerados contaminado. As Figuras 16 a 20 apresentam gráficos de dispersão semelhantes ao de Youden, onde podem ser verificados os erros sistemáticos e/ou aleatórios contribuintes para os resultados do índice z. A área demarcada em pontilhado azul é a dos dois resultados satisfatórios, a área entre o azul e o pontilhado em amarelo a dos dois resultados questionáveis e a fora do pontilhado amarelo, a dos dois resultados insatisfatórios. Quanto mais próximo da linha vermelha diagonal, e afastado do centro, maiores os erros sistemáticos. Página 23 de 43

25 Figura 6: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina B1, item 1. Página 24 de 43

26 Figura 7: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina B1, item 2. Página 25 de 43

27 Figura 8: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina B2, item 1. Página 26 de 43

28 Figura 9: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina B2, item 2. Página 27 de 43

29 Figura 10: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina G1, item 1. Página 28 de 43

30 Figura 11: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina G1, item 2. Página 29 de 43

31 Figura 12: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina G2, item 1. Página 30 de 43

32 Figura 13: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxina G2, item 2. Página 31 de 43

33 Figura 14: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxinas totais, item 1. Página 32 de 43

34 Figura 15: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes para a aflatoxinas totais, item 2. Página 33 de 43

35 Figura 16: Gráfico semelhante ao de Youden dos laboratórios participantes para a aflatoxina B1. Página 34 de 43

36 Figura 17: Gráfico semelhante ao de Youden dos laboratórios participantes para a aflatoxina B2. Página 35 de 43

37 Figura 18: Gráfico semelhante ao de Youden dos laboratórios participantes para a aflatoxina G1. Página 36 de 43

38 Figura 19: Gráfico semelhante ao de Youden dos laboratórios participantes para a aflatoxina G2. Página 37 de 43

39 Figura 20: Gráfico semelhante ao de Youden dos laboratórios participantes para a aflatoxinas totais. Página 38 de 43

40 O laboratório MIC 09/064 informou, para todos os resultados, valores <2,0 ng.g -1. Como os valores de referência (já considerado a incerteza expandida; Tabela 9) das aflatoxinas B1, G1 e totais estavam acima dos limites de detecção deste laboratório, seus resultados, para estas aflatoxinas, foram considerados insatisfatórios. De acordo com os resultados obtidos, três dos nove laboratórios participantes obtiveram resultados satisfatórios para todos os seus resultados informados. De um total de setenta e quatro resultados reportados, 79,7% foram considerados satisfatórios (cinquenta e nove resultados), 9,5% foram considerados questionáveis (sete resultados), e outros 10,8% insatisfatórios (oito resultados). Lembramos que o índice z é apenas um indicativo do desempenho do laboratório, cabendo a cada laboratório participante fazer a sua interpretação e implementar as ações corretivas, caso necessário. 8. Conclusões A análise dos dados gerados neste EP sugere: Desempenho dos laboratórios: pode-se considerar como razoável, uma vez que apenas três (33,3 %) dos laboratórios participantes obtiveram todos os resultados satisfatórios. Se levarmos em consideração os resultados dos laboratórios somente para o somatório das aflatoxinas, como exigido pela legislação, seis laboratórios (66,7 %) obtiveram resultados satisfatórios; Preenchimento do formulário: a maioria dos laboratórios preencheu o mesmo conforme solicitado, contudo, alguns campos importantes ainda foram deixados em branco prejudicando a avaliação dos resultados; Ações corretivas: para os laboratórios que obtiveram resultados insatisfatórios ou questionáveis, ações corretivas devem ser adotadas para o aprimoramento das suas medições, particularmente quando resultados insatisfatórios foram também obtidos em rodada anterior a esse EP. Uma avaliação detalhada, desde o recebimento do material e seu armazenamento, até o preenchimento do Formulário para Registro dos Resultados, e a avaliação de todos os passos da metodologia de análise, serão importantes para a identificação dos pontos críticos. Finalmente, é importante ressaltar que o estabelecimento de ações corretivas e a contínua participação em ensaios de proficiência desta natureza são ferramentas de grande contribuição para o aprimoramento das medições realizadas pelos laboratórios. 9. Confidencialidade Os resultados deste Ensaio de Proficiência são confidenciais, isto é, cada laboratório é identificado por código individual que é conhecido apenas por ele e pela Coordenação deste Ensaio de Página 39 de 43

41 Proficiência. Os resultados poderão ser utilizados em trabalhos e publicações pelo INCQS respeitando-se a confidencialidade dos laboratórios. 10. Referências Bibliográficas ABNT ISO GUIA 35 Materiais de Referência Princípios Gerais e Estatísticos para Certificação., ABNT NBR ISO/IEC Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração, ABNT NBR ISO/IEC Avaliação de Conformidade Requisitos Gerais para Ensaios de Proficiência. Rio de Janeiro: ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas, BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RDC Nº 7 de 18 de fevereiro de Diário Oficial da União, Brasília, 9 de março de Seção I. p. 66. Horwitz, W; Kamps, L.R; Boyer, K.W; Quality Assurance in the Analysis of Foods for Trace Constituents ; J. Assoc. off Anal. Chem.; 63(6); ; Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia. Vocabulário Internacional de Metrologia: Conceitos Fundamentais e Gerais de Termos Associados (VIM 2012). Duque de Caxias, Rio de Janeiro, International Organization for Standardization ISO Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons Lamberty, H. Schimmel e J. Pauwels, The Study of the Stability of Reference Materials by Isochronous Measurements Fresenius J. Anal. Chemistry, pp , Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 th Edition, Sampling for Aflatoxins Preparation for Sample Procedure. Natural Toxins, , p2, Thompson, M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. (DOI: /b000282h) Analyst, 125, , Página 40 de 43

42 11. Laboratórios Participantes A lista dos laboratórios que enviaram os resultados à coordenação do Programa é apresentada na Tabela 12. Tabela 12: Laboratórios participantes da 9ª Rodada do Ensaio de Proficiência para Determinação de Micotoxinas em Alimentos Aflatoxinas em Milho. Centro de Qualidade Analítica LTDA Cooperativa Agrária Agroindustrial Laboratório de Micotoxinas Eurofins do Brasil Análises de Alimentos LTDA Fundação ABC do Paraná Laboratório de Análises Ambientais e Resíduos - LAAR Fundação Ezequiel Dias Laboratórios Participantes ITAL Laboratório de Microbiologia do Centro de Ciências e Qualidade de Alimentos Lacen - PA Laboratório Central do Estado do Pará Lacen - PR LACEN PR / DVLSA / FQAL / MICOTOXINAS Pró-Ambiente Análises Químicas e Toxicológicas Total de participantes: 9 laboratórios. O código de cada participante não está associado à ordem da lista de participantes. Página 41 de 43

43 Anexo A Metodologia para a Atribuição do Valor de Referência Processo: Dois itens de ensaio foram analisados em três dias distintos. Cada item de ensaio foi analisado em duplicata. O valor de referência de cada aflatoxina foi a média aritmética de todos os resultados. Analítica: O procedimento analítico é baseado em um método do Official Methods of Analysis of AOAC International (AOAC, 2005). Para o tratamento da amostra, 6 g de milho foram extraídas com solução de MeOH à 70% (v/v). O extrato foi filtrado, diluído em água e uma alíquota foi eluída em coluna de imunoafinidade contendo anticorpos monoclonais específicos para as aflatoxinas alvo. A coluna foi lavada com água para retirada dos interferentes e em seguida as aflatoxinas carreadas com MeOH. Os extratos foram analisados por técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência empregando derivatização pós-coluna com iodo. A separação cromatográfica ocorreu em uma coluna C18 (5 m, 250 x 4,6 mm) mantida à 25 0 C. Os comprimentos de onda do detector de fluorescência foram fixados em Ex.: 360 nm / Em.: 420 nm. O volume de injeção utilizado foi 50 L. A razão de fluxo da fase móvel (água:acetonitrila:metanol (3:1:1 v/v/v)) foi de 1 ml/min e a solução derivatizante (solução de iodo 0,05% p/v) à 0,3 ml/min. A câmera de derivatização pós-coluna foi mantida à 70 0 C. Incerteza: A incerteza do valor de referência foi calculada considerando como fonte de incerteza somente a dispersão dos resultados. O fator de abrangência foi calculado em função dos graus de liberdade, para uma confiança de 95%. Página 42 de 43

44 Anexo B Homogeneidade Segundo a Norma ISO Primeiro, seleciona-se aleatoriamente um número g (onde g 10) de amostras do lote de itens de ensaio preparado retiram-se duas porções de teste de cada item de ensaio e realizam-se as análises de todas as porções (2g) de forma aleatória, completando-se todas as séries de medição sob condições de repetitividade. Calcula-se a média, x t,., entre as duas porções de teste (x t,1 e x t,2), para cada amostra, e em seguida, calcula-se a media geral, x, definida como a média das médias de cada amostra. A partir destes valores, calcula-se o desvio padrão das médias das amostras, s x, conforme a Equação 1 e as diferenças entre as porções de teste, w t, também para cada amostra, a partir da Equação 2. s x ( x t,. x) 2 /( g 1) (1) wt x x (2) t, 1 t,2 A partir dos valores definidos acima, calcula-se o desvio padrão dentro das amostras s w e o desvio padrão entre as amostras s s, conforme as Equações 3 e 4, a seguir: sw w t²/( 2 g) (3) s s sx² ( sw² / 2) (4) As amostras podem ser consideradas adequadamente homogêneas para este ensaio de proficiência, se for atendido o critério definido na Equação 5: ss 0,3sˆ (5) onde, ŝ é o desvio padrão alvo, obtido através da equação de Horwitz (4.3.3), da concentração média da micotoxina no estudo de homogeneidade. Caso este critério não seja alcançado, a norma ISO permite ainda a inclusão da variação existente entre as amostras, no desvio padrão para avaliação de proficiência, conforme a Equação 6: σ σ1² ss² (6) Esta inclusão permite que possíveis variações na homogeneidade entre os itens de ensaio com relação aos valores de concentração, não influenciem diretamente na avaliação de desempenho do laboratório participante do EP. Contudo, inicialmente deve ser verificada a possibilidade de melhorias no processo de preparo das amostras. Página 43 de 43

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