Ensaio de Proficiência para Determinação de Medicamentos Veterinários em Alimentos 4ª Rodada Matriz Leite

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2 Ensaio de Proficiência para Determinação de Medicamentos Veterinários em Alimentos 4ª Rodada Matriz Leite RELATÓRIO FINAL ORGANIZAÇÃO E COORDENAÇÃO Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Avenida Brasil, Manguinhos Rio de Janeiro - RJ Brasil - Cx. Postal CEP: COMISSÃO ORGANIZADORA DA RODADA COORDENAÇÃO Armi Wanderley da Nóbrega Coordenador Geral Marcus Henrique Campino de la Cruz Coordenador Técnico Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso Coordenadora da Qualidade COMITÊ TÉCNICO Betânia de Souza Carlos Bernardete Ferraz Spisso Mararlene Ulberg Pereira Mychelle Alves Monteiro Rafaela Pinto da Costa Rosana Gomes Ferreira 11/JUNHO/2012 Página 1 de 25

3 ÍNDICE 1. Introdução Objetivos Preparo e Envio dos Itens de Ensaio Escolha da Matriz Fortificação da Matriz Faixa de Valor Esperada Branco da Matriz Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Envio dos Itens de Ensaio Análise dos Resultados Resultados das Medições dos Laboratórios Análise Quantitativa - Estabelecimento dos Valores Designados Análise Qualitativa - Estabelecimento dos Valores Designados Análise Estatística Análise de Resíduos Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio Análise Quantitativa - Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Análise Quantitativa - Índice z Análise Quantitativa - Análise Robusta Análise Qualitativa - Sensibilidade, Especificidade e Exatidão dos Laboratórios Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade Avaliação da Homogeneidade Avaliação da Estabilidade Atribuição dos Valores Designados Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes Laboratórios Participantes Resultados dos Laboratórios Participantes - Quantitativo Resultados dos Laboratórios Participantes - Qualitativo Considerações Sobre as Metodologias de Análise Parâmetros de Desempenho do Método Informações Analíticas Cálculo do Índice z - Quantitativo Avaliação dos Laboratórios Participantes - Qualitativo Conclusões Referências Bibliográficas Laboratórios Participantes Anexo A Homogeneidade Segundo A Norma ISO Anexo B Valor Designado Segundo A Norma ISO Página 2 de 25

4 1. Introdução Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o ensaio de proficiência propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o ensaio de proficiência é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Embora o número de provedores de ensaios de proficiência na área de alimentos seja grande, principalmente de provedores internacionais, os custos cobrados para a participação nestes ensaios são, normalmente, muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. Uma avaliação dos níveis residuais de medicamentos veterinários em produtos de origem animal é extremamente importante para referenciar os produtores quanto às boas práticas veterinárias e, caso estas não estejam sendo seguidas, permitir a tomada de medidas preventivas e de controle antes que estes tipos de resíduos químicos afetem o meio ambiente e a saúde da população ou causem graves perdas econômicas. Por ser muito elevado o número de medicamentos veterinários utilizados nos alimentos, por se encontrarem em concentrações muito baixas (da ordem de g/kg), e também por estarem presentes em uma grande variedade de matrizes, cada uma com suas particularidades, a identificação e a quantificação destas substâncias nos alimentos torna-se extremamente complexa. Não obstante, é crescente a exigência no mercado internacional quanto a níveis de resíduos e contaminantes em alimentos, cada vez mais reduzidos. Assim, a realização de programas de ensaio de proficiência no País é fundamental para o aumento da confiabilidade dos resultados das medições nele realizados, trazendo maior confiabilidade nos resultados emitidos, facilitando o comércio internacional e prevenindo barreiras técnicas. Visando a promoção da saúde e em apoio à política industrial brasileira e objetivando a maior competitividade da indústria nacional, o INCQS promoveu com recursos do CNPq, edital 064/2008 (578409/2008-9), o Ensaio de Proficiência para a Determinação de Medicamentos Veterinários em Alimentos, 4ª Rodada - Matriz Leite, seguindo as diretrizes da ISO GUIDE e ILAC G-13. Página 3 de 25

5 Este relatório apresenta os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes. 2. Objetivos Identificar resíduos de Beta-lactâmicos em leite utilizando metodologia de triagem (screening) do laboratório; Quantificar resíduos de Beta-lactâmicos em leite utilizando metodologia analítica de rotina do laboratório. 3. Preparo e Envio dos Itens de Ensaio Os procedimentos de amostragem, preparo dos itens de ensaio e análise foram realizados no Laboratório de Resíduos de Medicamentos Veterinários do INCQS/FIOCRUZ Escolha da Matriz O leite foi a matriz selecionada para este ensaio de proficiência por ser o alimento mais consumido entre as crianças e os idosos e por ser uma das matrizes analisadas nos dois principais programas nacionais de controle de resíduos de medicamentos veterinários em alimentos, o Programa de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos de Origem Animal (PAMVet) da ANVISA e o Plano Nacional de Controle de Resíduos em Produtos de Origem Animal (PNCR) do MAPA Fortificação da Matriz Foi utilizado o padrão de benzilpenicilina sódica (Farmacopéia Americana, USP Cat. N , Lote L4C366) para o preparo de solução a 10µg/mL a ser empregada na fortificação do leite Faixa de Valor Esperada A concentração de benzilpenicilina na matriz foi definida de modo a garantir que o nível resultante de analito no Item de Ensaio pudesse ser detectado em todos os laboratórios que participariam do EP. A concentração escolhida foi de 10µg/mL e corresponde a um valor próximo ao LMR e está dentro da faixa linear da curva de calibração recomendada para análise de resíduos de 0,5 2,5 LMR da substância, ou 2 a 10 g/l. Página 4 de 25

6 3.4. Branco da Matriz Uma amostra de leite cru que não apresentou resíduos de beta-lactâmicos de acordo com os critérios de detecção por cromatografia em fase líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial descritos na Decisão 2002/657/EC foi empregada para o preparo do material Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Foram separados aleatoriamente, de cada lote (A e B) preparado, dezesseis (16) itens de ensaio representativos do conjunto para o teste de homogeneidade. Para cada amostra de leite reconstituído, realizaram-se análises em duplicatas de forma aleatória, completando-se todas as séries de medição sob condições de repetitividade. Os itens de ensaio reservados para o estudo de estabilidade foram avaliados no período de tempo compreendido após o preparo do item de ensaio e o prazo final de recebimento dos resultados pelos laboratórios. Os testes estatísticos foram feitos segundo a ISO GUIDE 35 e a norma ISO 13528; os resultados obtidos estão apresentados nos itens 5.1 e 5.2 deste relatório Envio dos Itens de Ensaio Os itens de ensaio foram distribuídos aos participantes em frascos devidamente identificados com rótulo, contendo as seguintes informações: logo do programa, item a ser ensaiado, código da amostra e rodada em questão. Foram enviados aos laboratórios 4 frascos lacrados, cada um com aproximadamente 0,25 g de leite liofilizado e podendo conter ou não resíduos de beta-lactâmicos. Após a reconstituição seguindo o procedimento descrito em Instruções para a Reconstituição do Item de Ensaio, cada frasco continha cerca de 2,5mL de leite. 4. Análise dos Resultados 4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios Os laboratórios receberam quatro itens de ensaio contendo leite liofilizado e foram orientados a proceder como uma amostra de rotina após a reconstituição do mesmo. Além dos resultados analíticos quantitativos, expressos em g/kg, os laboratórios participantes informaram também a recuperação (%), o limite de decisão (CC) e a capacidade de detecção (CC), o limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ), inerentes ao método empregado, através do Formulário de Registro de Resultados. Os laboratórios que realizaram análises qualitativas Página 5 de 25

7 reportaram seus resultados como PRESENÇA ou AUSÊNCIA 1 de resíduos de betalactâmicos. Outras informações sobre as técnicas e os equipamentos utilizados nos ensaios também foram solicitadas Análise Quantitativa - Estabelecimento dos Valores Designados As técnicas de estatística robusta são utilizadas para minimizar a influência que resultados extremos podem ter sobre estimativas de média e desvio-padrão. Sendo assim, a Coordenação deste Ensaio de Proficiência adotou como valores designados para benzilpenicilina, aqueles oriundos do cálculo da estatística robusta apresentado no item 5.6 da norma lso 13528:2005, que é uma norma específica de métodos estatísticos para uso em EP por comparações interlaboratoriais. Seguindo os critérios desta norma, os valores designados foram obtidos pela média robusta dos resultados emitidos por todos os laboratórios participantes, que reportaram valores de recuperação e não apresentaram valores dispersos, e pelo INCQS, conforme os procedimentos estatísticos descritos no item deste relatório Incerteza do Valor Designado A incerteza do valor designado foi calculada de acordo com a fórmula do item da ISO e a mesma não deve ser negligenciada Análise Qualitativa - Estabelecimento dos Valores Designados A composição de cada um dos quatro frascos enviados aos participantes foi de conhecimento exclusivo da coordenação do EP. 1 Alguns laboratórios reportaram o valor zero (0) e outros < LOD. Neste relatório todos estes resultados foram normalizados para presença e ausência. Página 6 de 25

8 4.4. Análise Estatística Este tópico descreve as análises estatísticas utilizadas para a obtenção dos valores designados, para a avaliação da homogeneidade e da estabilidade das amostras, assim como para a avaliação do desempenho dos laboratórios participantes Análise de Resíduos A análise de resíduos foi empregada para avaliar a estabilidade dos resíduos de betalactâmicos em relação aos valores de referência das concentrações. Assim, foram estimadas as variâncias dos valores utilizados na regressão linear, observando-se se os valores de concentração apresentavam alguma tendência através da ferramenta estatística de análise de variância (ANOVA). Os itens de ensaio foram considerados estáveis quando a inclinação da reta ou a não linearidade não foram significativas Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio A norma ISO (item 4.4, anexo B) foi seguida na avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio. A norma em questão permite incluir o desvio padrão devido à heterogeneidade das amostras, no desvio padrão de avaliação de proficiência. O procedimento abordado pela norma ISO para avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio encontra-se resumidamente no Anexo A Análise Quantitativa - Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Nesta rodada de ensaio de proficiência o desvio padrão para avaliação de proficiência dos laboratórios participantes que realizaram a análise quantitativa foi calculado como recomendado no item 6.4 da norma ISO 13528, isto é, como proposto originalmente por Horwitz, (Horwitz, 1980), onde a precisão interlaboratorial é avaliada em termos de um desvio padrão de reprodutibilidade (Equação 1). σ H 0,02c onde : c é o nível de concentração expresso em fração mássica e H é o desvio padrão de Horwitz. Adotando-se as modificações propostas por Thompson (Thompson, 2000) onde se leva em consideração os níveis de concentração do analito expressos em fração mássica, conforme as Equações 2, 3 e 4: σ 0, 22c, se c < 1,2 x 10-7 (2) 0,8495 σ 0,02c, se 1,2 x 10-7 c 0,138 (3) 0,5 σ 0,01c, se c > 0,138 (4) 0,8495 (1) Página 7 de 25

9 onde : c é o nível de concentração expresso em fração mássica e é o desvio padrão de Horwitz modificado Análise Quantitativa - Índice z Para a qualificação dos resultados dos laboratórios, o índice z (z-score, medida da distância relativa do resultado da medição do laboratório em relação ao valor designado do ensaio de proficiência) foi calculado de acordo com a Equação 5. (5) onde: y i representa o valor do laboratório participante, y ref representa o valor designado e σ, o desvio padrão de Horwitz modificado. A interpretação do valor do índice z está descrita abaixo: z 2 - Resultado satisfatório 2 < z < 3 - Resultado questionável z 3 - Resultado insatisfatório Análise Quantitativa - Análise Robusta Nesta rodada o valor designado foi calculado através da análise robusta (ISO 13528), documento complementar à ISO GUIA 43, e o desvio padrão estimado através das equações derivadas do modelo geral de Horwitz (Item 4.3.3). O procedimento adotado no cálculo do valor designado é descrito no Anexo B Análise Qualitativa - Sensibilidade, Especificidade e Exatidão dos Laboratórios Os resultados relatados pelos laboratórios foram avaliados em relação a sua sensibilidade, especificidade e exatidão como proposto por Greenhalgh (1997). O laboratório teve o seu resultado considerado satisfatório quando obteve os valores de sensibilidade, especificidade e exatidão de 100%. Estes valores foram calculados em função das respostas relatadas pelos laboratórios aos itens de ensaio enviados. Foram adotados os seguintes critérios: Página 8 de 25

10 1. Onde os laboratórios indicaram corretamente a presença de resíduos de betalactâmicos o resultado foi considerado: Positivo ; 2. Onde os laboratórios indicaram erroneamente presença de resíduos de betalactâmicos o resultado foi considerado: Falso Positivo ; 3. Onde os laboratórios indicaram corretamente a ausência de resíduos de betalactâmicos o resultado foi considerado: Negativo ; 4. Onde os laboratórios indicaram erroneamente a ausência de resíduos de betalactâmicos. o resultado foi considerado: Falso Negativo ; As Equações que descrevem os percentuais de sensibilidade, especificidade e exatidão estão descritas a seguir: Sensibilidade Este critério avaliou a capacidade do laboratório em identificar a presença de resíduos de beta-lactâmicos. A sensibilidade percentual do laboratório, quanto à presença de resíduos de beta-lactâmicos no leite, foi avaliada pela seguinte Equação (6): Especificidade Positivos Sensibilidade 100 Positivo Falso _ Negativo (6) Este critério avaliou a capacidade do laboratório diferenciar resíduos de beta-lactâmicos no ensaio de outros interferentes. A especificidade percentual do laboratório, quanto à presença de resíduos de beta-lactâmicos no leite, foi avaliada pela seguinte Equação (7): Negativo Especifici dade 100 Negativo Falso_ Positivo (7) Exatidão Este critério avaliou a capacidade do laboratório em identificar corretamente a presença ou ausência de resíduos de beta-lactâmicos. A exatidão percentual do laboratório, quanto à presença de resíduos de beta-lactâmicos no leite, foi avaliada pela seguinte Equação (8): Positivo Negativo Exatidão 100 Positivo Negativo Falso _ Positivo Falso _ Negativo (8) Página 9 de 25

11 5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade 5.1. Avaliação da Homogeneidade Para o teste de homogeneidade foram separados, aleatoriamente, 16 itens de ensaio (de cada lote) contendo cada um aproximadamente 2,5 g de amostra após a reconstituição. Para cada item de ensaio foram realizadas duas análises produzindo, para cada analito, dois resultados (Replicata 1 e 2), conforme dispostos na Tabela 1. Tabela 1: Dados gerados no teste de homogeneidade Benzilpenicilina (g/l) Amostras Lote A Lote B Replicata 1 Replicata 2 Replicata 1 Replicata 2 1 9,039 9,249 10,684 10, ,401 9,641 10,608 9, ,429 9,040 9,291 8, ,328 9,196 9,138 8, ,949 8,339 8,726 8, ,766 8,716 9,237 8, ,527 9,177 8,721 8, ,372 9,101 9,850 9, ,666 9,084 9,538 8, ,887 10,007 8,989 9, ,332 8,192 8,265 8, ,199 10,110 9,407 9, ,019 10,420 9,531 8, ,784 9,454 8,701 8, ,934 9,755 8,952 7, ,998 9,848 9,161 9,131 A Tabela 2 apresenta os resultados da análise estatística do estudo de homogeneidade dos lotes A e B. Tabela 2: Sumário das análises estatísticas para o estudo de Homogeneidade. Lote Média (g/l) (g/l) 0,3 (g/l) s x (g/l) s w (g/l) s s (g/l) Resultado A 9,311 2,048 0,615 0,553 0,433 0,461 B 9,072 1,996 0,599 0,633 0,465 0,541 Suficientemente homogêneo Suficientemente homogêneo Desta forma, consideraram-se os itens de ensaio dos três lotes (A e B) suficientemente homogêneos para a finalidade deste Ensaio de Proficiência, com relação aos valores de concentração de benzilpenicilina. Página 10 de 25

12 5.2. Avaliação da Estabilidade A estabilidade das amostras quanto a flutuações temporais na concentração de benzilpenicilina foi avaliada no decorrer do EP (Tabela 3). A avaliação foi realizada utilizandose a análise de resíduos da regressão linear. Tabela 3: Dados obtidos para o estudo de estabilidade à temperatura de C. Dia [Benzilpenicilina] (g/l) Amostra1 Amostra 2 0 9,311 9, ,715 8, ,655 8, ,630 8, ,430 10,117 A Tabela 4 apresenta o resultado obtido na estimativa da variância dos valores utilizados na regressão linear segundo a ISO GUIDE 35. Tabela 4: Análise de regressão para a Benzilpenicilina, em g/(l.dias). Intervalo de confiança Beta-Lactâmico Coeficiente Angular Erro padrão Inferior Superior Resultado Benzilpenicilina 0, , , ,04875 Estável Os resultados obtidos no tratamento estatístico dos dados gerados mostraram que, o valor de do intervalo de confiança para o coeficiente angular abrange o valor zero (0), concluindo-se portanto, que este é um valor possível ao coeficiente angular da curva que descreve a estabilidade e que os itens de ensaio mostraram-se suficientemente estáveis nas condições estabelecidas para a realização do estudo. 6. Atribuição dos Valores Designados Os valores designados relativo à concentração de benzilpenicilina nos dois lotes empregados neste ensaio de proficiência foram calculados segundo procedimento estatístico descrito no item 4.4.5; os respectivos desvios padrão para avaliação de proficiência foram obtidos pelas equações modificadas baseadas no modelo de Horwitz, conforme o item Os valores designados com seus respectivos desvios padrão estão apresentados na Tabela 5. Devido ao pequeno número de laboratórios que enviaram dados quantitativos, decidiu-se por apenas um valor designado, e não um para cada lote. Isto foi possível uma vez que, apesar das variâncias do estudo de homogeneidade dos lotes A e B serem significativamente diferentes (F crit =0,549; F calc =0,788; =0,05), seus valores médios não apresentam diferença significativa (t crit =2,000; t calc =1,431; =0,05). Página 11 de 25

13 Tabela 5: Valore designado, desvio padrão e incerteza do desvio padrão para o EP. Lote (g/l) Valor designado Desvio Padrão (σ) Incerteza do Desvio Padrão A+B 8,28 1,82 0,52 Os resultados reportados pelo laboratório MVT 04/022 não entraram nos cálculos dos parâmetros acima, pois nem todas as informações do formulário de resultados estavam devidamente preenchidas. 7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes 7.1. Laboratórios Participantes Trinta e dois laboratórios se inscreveram na 4ª Rodada do Programa de Ensaio de Proficiência para a Determinação de Medicamentos Veterinários em Alimentos Matriz Leite, vinte e três (71,9 %) enviaram os resultados, sendo que destes, somente três (13,0 %) laboratórios reportaram resultados quantitativos. Dos laboratórios que reportaram resultados, dezoito (78,3 %) informaram que a metodologia utilizada era validada, dezesseis (69,6 %) utilizavam em rotina e treze (56,5 %) nunca tinham participado de ensaio de proficiência em medicamentos veterinários. Dos que já haviam participado (nove laboratórios), sete participaram da rodada anterior, MVT 03/ Resultados dos Laboratórios Participantes - Quantitativo Os dados reportados pelos laboratórios participantes do ensaio de proficiência foram tratados de acordo com os procedimentos descritos na ABNT NBR ISO/IEC A Tabela 6 apresenta os resultados dos laboratórios para as análises quantitativas, bem como a recuperação, o limite de detecção e o limite de quantificação e outras informações da metodologia utilizada. Os gráficos da dispersão dos resultados dos laboratórios participantes, para a benzilpenicilina, encontra-se na Figura 1. Neste gráfico a linha central representa o valor designado, e as linhas pontilhadas, azuis e vermelhas representam, respectivamente, os intervalos do desvio padrão (y ref ), de duas vezes o desvio padrão (y ref 2) e de três vezes o desvio padrão (y ref 3). Página 12 de 25

14 Tabela 6: Resultados por análise (g/l), Informação sobre o ensaio, Limite de Detecção (LOD; g/l), Limite de Quantificação (LOQ; g/l), CCe CC (g/l), Repetitividade (%), Precisão intemediária (Pre. Int., %) e Exatidão (%) Laboratório MVT 04/022 MVT 04/056 MVT 04/100 Item de ensaio Resultado (código) Informações sobre o Ensaio Desempenho do Método Lote A Lote B Branco Validado Diretriz LOD LOQ CC CC Repetitividade Pre. Int. Exatidão 35,2 34,0 ND ND (#077) (#162) (#014) (#050) - MAPA 0,4 1,0 4,5 7,9 88,0 88,0 88,0 7,06 7,36 NQ NQ (#057) (#127) (#147) (#178) S 2002/657/EC 0,7 2 4,85 6,18 6,2 10,56 93,69 8,5 8,4 NQ NQ (#056) (#160) (#081) (#116) S 2002/657/EC 2,5 5 52,1 54,3 8,9 7,7 101,1 (1) Resultados de benzilpenicilina = média do estudo de homogeneidade do lote A e B. ND = Não detectado; NQ = Não Quantificado Página 13 de 25

15 Figura 1: Gráfico de dispersão dos resultados dos laboratórios participantes Página 14 de 25

16 A partir de uma análise visual dos gráficos de dispersão pode-se observar a incompatibilidade de alguns resultados, fora do limite de três vezes o desvio padrão (y ref ± 3), com relação aos demais. Para a qualificação dos resultados dos laboratórios foram calculados os índices z (zscore) Resultados dos Laboratórios Participantes - Qualitativo A Tabela 7 apresenta os resultados dos laboratórios para a análise de cada item de ensaio recebido, bem como os resultados esperados (valores designados) e o resultado final. Tabela 7: Resultados relatados pelos laboratórios, resultados esperados e resultado final Laboratório MVT 04/002 MVT 04/003 MVT 04/005 MVT 04/010 MVT 04/014 MVT 04/016 MVT 04/026 MVT 04/029 MVT 04/031 Item de Ensaio Resultado Apresentado Resultado Esperado Resultado Final 002 Ausência Ausência Negativo 029 Presença Presença Positivo 039 Ausência Ausência Negativo 149 Presença Presença Positivo 008 Ausência Ausência Negativo 016 Presença Presença Positivo 076 Ausência Ausência Negativo 174 Presença Presença Positivo 011 Presença Presença Positivo 073 Ausência Ausência Negativo 108 Ausência Ausência Negativo 145 Presença Presença Positivo 045 Presença Presença Positivo 055 Ausência Ausência Negativo 133 Presença Presença Positivo 153 Ausência Ausência Negativo 007 Ausência Ausência Negativo 013 Presença Presença Positivo 041 Ausência Ausência Negativo 155 Presença Presença Positivo 037 Presença Presença Positivo 042 Ausência Ausência Negativo 078 Ausência Ausência Negativo 151 Presença Presença Positivo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Ausência Ausência Negativo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Presença Presença Positivo 005 Presença Presença Positivo 038 Ausência Ausência Negativo 071 Ausência Ausência Negativo 171 Presença Presença Positivo Página 15 de 25

17 MVT 04/092 1 Laboratório Item de Ensaio Resultado Apresentado Resultado Esperado Resultado Final Presença Ausência Falso Positivo MVT 04/ Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Presença Presença Positivo Presença Presença Positivo MVT 04/ Ausência Ausência Negativo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Ausência Ausência Negativo MVT 04/ Presença Presença Positivo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo 003 Presença Presença Positivo MVT 04/ Ausência Ausência Negativo 163 Presença Presença Positivo 170 Ausência Ausência Negativo 035 Presença Presença Positivo MVT 04/ Ausência Ausência Negativo 114 Ausência Ausência Negativo 148 Presença Presença Positivo 059 Presença Presença Positivo MVT 04/ Ausência Ausência Negativo 146 Ausência Ausência Negativo 157 Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo MVT 04/ Presença Presença Positivo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Ausência Ausência Negativo MVT 04/ Presença Presença Positivo Presença Presença Positivo Ausência Ausência Negativo Presença Ausência Ausência Ausência Negativo 175 Presença Presença Positivo 010 Presença Presença Positivo MVT 04/ Ausência Ausência Negativo 138 Ausência Ausência Negativo 172 Presença Presença Positivo 018 Presença Presença Positivo MVT 04/ Ausência Ausência Negativo 144 Ausência Ausência Negativo 156 Presença Presença Positivo 1 O Laboratório informou para o item de ensaio de código #047, ausência e presença. E não informou resultado para o Item de Ensaio de Código # Considerações Sobre as Metodologias de Análise Nesta rodada de EP os laboratórios foram orientados a reportarem também alguns parâmetros relativos à validação do método empregado. Página 16 de 25

18 Todos os laboratórios que realizaram a análise quantitativa utilizaram espectrometria de massas. Dos laboratórios que realizaram a análise qualitativa (20), dezoito (18) utilizaram o kit SNAP, um não informou a marca do teste e o outro laboratório utilizou o kit DELVOTEST. Não foi este kit que apresentou o resultado falso positivo Parâmetros de Desempenho do Método Analisando a Tabela 6, podemos verificar que todos os laboratórios reportaram os valores de CCe CC conforme solicitado pela diretriz da Comunidade Européia (2002/657/EC). Todos os laboratórios que quantificaram desenvolveram métodos multiresíduos e utilizaram a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas. Somente um dos laboratórios utilizou a padronização interna, sendo o padrão interno a benzilpenicilina deuterada. É importante ressaltar que os limites de identificação informados pelos laboratórios que realizaram a análise qualitativa estavam na ordem de 1-2 g/l. Dos laboratórios que realizaram somente a identificação de beta-lactâmicos, dezesseis (80,0%) tinham a metodologia validada. Dos que realizaram a quantificação, somente dois (66,7 %) dos três. Cabe observar nestes casos, a importância de se concluir todas as etapas de validação de um método analítico, para que o laboratório possa ter total controle metrológico sobre os seus resultados Cálculo do Índice z - Quantitativo A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes e do INCQS, expressa através do índice z (Equação 5), está apresentada na Tabela 8. Tabela 8: Valores do índice z obtidos pelos laboratórios participantes e pelo INCQS. Código do Laboratório (número do item de ensaio) Índice z MVT 04/100 (#056) 0,1 MVT 04/100 (#160) 0,1 MVT 04/056 (#057) -0,7 MVT 04/056 (#127) -0,5 MVT 04/022 (#077) 14,8 MVT 04/022 (#162) 14,1 INCQS (A) 0,6 INCQS (B) 0,4 Vermelho = resultado insatisfatório A Figura 2 apresenta o resultado de índice z obtido pelos laboratórios participantes para este EP. Os valores do INCQS são os valores médios do estudo de Homogeneidade (Tabela 2). Página 17 de 25

19 Figura 2: Gráfico de índice z dos laboratórios participantes. Página 18 de 25

20 Assim, de acordo com os resultados obtidos, dois (66,7 %) dos três laboratórios participantes obtiveram resultados satisfatórios. De um total de seis resultados reportados, quatro (66,7 %) foram considerados satisfatórios e dois (33,3%) foram considerados insatisfatórios. Cabe salientar que o índice z é apenas um indicativo do desempenho do laboratório, cabendo a cada laboratório participante fazer a sua interpretação e implementar as ações corretivas, caso necessário Avaliação dos Laboratórios Participantes - Qualitativo A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes, expressa através da sensibilidade, da especificidade e da exatidão, está apresentada na Tabela 9. Tabela 9: Valores de Sensibilidade, Especificidade e Exatidão (%) e resultado do laboratório. Cód. do Laboratório Sensibilidade Especificidade Exatidão Resultado MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ MVT 04/ Satisfatório MVT 04/ Satisfatório 1 O Laboratório informou o mesmo código do item de ensaio, #047, para amostra que apresentou ausência e presença. Observamos que dos 20 laboratórios que enviaram resultados, dezoito (90,0 %) apresentaram resultados de 100% para os parâmetros de sensibilidade, especificidade e exatidão, sendo considerados satisfatórios. Salienta-se que estes resultados são apenas um indicativo do desempenho dos laboratórios neste momento, cabendo a cada laboratório participante fazer a sua interpretação e implementar as ações corretivas, caso necessário. Página 19 de 25

21 8. Conclusões Através de uma análise dos dados gerados neste EP, conclui-se: Somente 13,0% dos laboratórios inscritos nesta rodada demonstrou ter capacidade de determinar quantitativamente resíduos de benzilpenicilina na matriz leite; Dentre estes, o número de laboratórios (dois) que obtiveram resultados satisfatórios é relativamente baixo; A única técnica analítica de quantificação empregada foi a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas; A maior parte dos laboratórios que realizaram somente a identificação, utilizou um kit baseado na técnica de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) fornecido por um mesmo fabricante; Estes laboratórios reportaram faixas de limite de detecção que variavam de 1 a 2 g/l; Somente um laboratório não obteve resultado considerado satisfatório devido à baixa especificidade analítica demonstrada ao relatar resultado falso-positivo; Um laboratório não preencheu corretamente o código de identificação do Item de Ensaio recebido, o que acarretou resultados não satisfatórios na sensibilidade, especificidade e exatidão. Para os laboratórios que obtiveram resultados insatisfatórios ou questionáveis, ações corretivas podem ser adotadas para o aprimoramento das suas medições. Uma avaliação detalhada, desde o recebimento do material e seu armazenamento, até o preenchimento do Formulário para Registro dos Resultados, e a avaliação de todos os passos da metodologia de análise, será importante para a identificação dos pontos críticos. Em relação ao preenchimento do formulário, a maioria dos laboratórios preencheu o mesmo conforme estabelecido, contudo, alguns campos importantes ainda foram deixados em branco. O estabelecimento de ações corretivas e a contínua participação em ensaios de proficiência desta natureza são ferramentas de grande contribuição para o aprimoramento das medições realizadas pelos laboratórios. Página 20 de 25

22 9. Referências Bibliográficas CHUI, Q. S. H.; BISPO, J. M. de A.; Iamashita, C. O.; O papel dos programas interlaboratoriais para a qualidade dos resultados analíticos. Química Nova, Vol. 27 (06), , CODEX ALIMENTARIUS. Guidelines on Good Laboratory Practice in Residue Analysis: CAC/GL , Rev Rome: FAO/WHO Joint Publications, Vol. GREENHALGH, T. How to read a paper - Papers that reports diagnostic or screening tests. BMJ, v.315, p.540-3, 1997 Horwitz, W; Kamps, L.R; Boyer, K.W; Quality Assurance in the Analysis of Foods for Trace Constituents ; J. Assoc. off Anal. Chem.; 63(6); ; Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Vocabulário Internacional de Metrologia: Conceitos Fundamentais e Gerais e Termos Associados (VIM 2008). Rio de Janeiro, International Laboratory Accreditation Cooperation - ILAC G13. Guidelines for the requirements for the competence of providers of proficiency testing schemes, 2007 International Organization for Standardization ISO GUIDE 35 - Reference materials General and statistical principles for certification. Geneva, 2006 International Organization for Standardization ISO Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons International Organization for Standardization ISO/IEC Conformity assessment General requirement for proficiency testing. Geneva, The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of Analytical Chemistry Laboratories. Pure Appl. Chem., Vol. 78, N o. 1, pp , Thompson, M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. (DOI: /b000282h)Analyst, 125, , UNIÃO EUROPÉIA Comissão das Comunidades Européias. Decisão nº2002/657/ce, de 12 de agosto de Página 21 de 25

23 10. Laboratórios Participantes Os resultados do EP são confidenciais. Cada resultado está identificado por um código individual que somente é conhecido pelo próprio laboratório e pela coordenação deste EP. Os resultados poderão ser utilizados em trabalhos e publicações pelo INCQS respeitando a confidencialidade dos laboratórios. A lista dos laboratórios que enviaram os resultados à coordenação do Programa é apresentada na Tabela 10. Tabela 10: Laboratórios participantes da 4ª Rodada do Ensaio de Proficiência para Determinação de Medicamentos Veterinários em Alimentos. Instituição JM Bioanálises Sociedade Simples Ltda Laboratório Bom Conselho - BRF Brasil Foods (Bom Conselho) Laboratório BRF - BRF Brasil Foods (Ijuí) Laboratório Central de Saúde Pública LACEN CE Laboratório Central de Saúde Pública LACEN ES Laboratório Central de Saúde Pública do Piauí LACEN PI Laboratório de Alimentos - IPB LACEN / FEPPS RS - LACEN RS Laboratório de Análises Físico-Químico de Produtos e Ambiente - LACEN RN Laboratório de Bromatologia e Química - Instituto Oswaldo Cruz LACEN MA Laboratório de Carambeí - BRF Brasil Foods (Carambeí) Laboratório de Controle de Qualidade - BRF Brasil Foods (Três de Maio) Laboratório de Lácteos - BRF Brasil Foods (Itumbiara) Laboratório de Química Bromatológica e Cromatografia - Fundação Ezequiel Dias LACEN - MG Laboratório de Resíduos de Medicamentos Veterinários - LANAGRO MG Laboratório de Resíduos de Pesticidas - Laboratório Central de Saúde Pública LACEN DF Laboratório Físico-Químico e Microbiológico - BRF Brasil Foods (Santa Rosa) Laboratório Interno - BRF Brasil Foods (Concórdia) Laboratório Nacional Agropecuário de Goiás - LANAGRO GO Laboratório Recepção de Leite - BRF Brasil Foods (Três de Maio) Seção de Toxicologia - Laboratório Central de Saúde Pública LACEN GO Setor de Resíduos e Contaminantes (Gerência Técnica de Produtos) - LACEN AL Setor Físico-Químico de Medicamentos LACEN PA Toxicologia - Laboratório Central de Saúde Pública LACEN MS Total de participantes: 23 laboratórios O código de cada participante não está associado à ordem da lista de participantes. Página 22 de 25

24 Anexo A Homogeneidade Segundo A Norma ISO Primeiramente, seleciona-se aleatoriamente um número g (onde g 10) de amostras do lote de itens de ensaio preparado retiram-se duas porções de teste de cada item de ensaio e realizam-se as análises de todas as porções (2g) de forma aleatória, completando-se todas as séries de medição sob condições de repetitividade. Calcula-se a média, x t,., entre as duas porções de teste (x t,1 e x t,2 ), para cada amostra, e em seguida, calcula-se a media geral, x, definida como a média das médias de cada amostra. A partir destes valores, calcula-se o desvio padrão das médias das amostras, s x, conforme a Equação 1 e as diferenças entre as porções de teste, w t, também para cada amostra, a partir da Equação 2. s x ( x t,. x) 2 /( g 1) (1) w t x x (2) t, 1 t,2 A partir dos valores definidos acima, calcula-se o desvio padrão dentro das amostras s w e o desvio padrão entre as amostras s s, conforme as Equações 3 e 4, a seguir: s s w t²/( g) w 2 (3) s sx² ( sw² / 2) (4) As amostras podem ser consideradas adequadamente homogêneas para este ensaio de proficiência, se for atendido o critério definido na Equação 5: ss 0,3sˆ (5) onde, é o desvio padrão alvo, obtido através da equação de Horwitz (4.3.3), da concentração média no estudo de homogeneidade. Caso este critério não seja alcançado, a norma ISO permite ainda a inclusão da variação existente entre as amostras, no desvio padrão para avaliação de proficiência, conforme a Equação 6: σ σ1² ss² (6) Esta inclusão permite que possíveis variações na homogeneidade entre os itens de ensaio com relação aos valores de concentração, não influenciem diretamente na avaliação de desempenho do laboratório participante do EP. Contudo, inicialmente deve ser verificada a possibilidade de melhorias no processo de preparo das amostras. Página 23 de 25

25 Anexo B Valor Designado Segundo A Norma ISO A Norma ISO é um documento complementar à ISO GUIA 43 e fornece os métodos estatísticos a serem empregados nos ensaios de proficiência. Este documento descreve a análise robusta envolvendo o emprego da estimativa do algoritmo A para o cálculo do valor designado e do desvio padrão. Neste EP, somente o valor designado foi calculado através da análise robusta, sendo o desvio padrão estimado através das equações derivadas do modelo geral de Horwitz (4.3.3). Inicialmente, todos os valores objetos da análise (valores enviados pelos laboratórios participantes e pelo INCQS) foram colocados em ordem crescente. A seguir, foram calculados os valores da mediana de x i (x*) e do desvio padrão (s*), conforme as Equações 1 e 2. x* medianade x i (1) s* x * 1,483 med xi (2) Onde: med é a mediana; x i valor de concentração reportado pelo laboratório. Em seguida, foi calculado o valor de F i, segundo a Equação 3, e a partir da estimativa de F i, calculou-se o novo valor inferior (concentração inferior), e o novo valor superior (concentração superior), através das Equações 4 e 5. F i = 1,5s* (3) Novo Valor Superior = x* + F i (4) Novo Valor Inferior = x* - F i (5) Os novos valores, superior e inferior, foram comparados a cada um dos resultados individuais dos laboratórios participantes, e os que estavam acima do valor superior ou abaixo do valor inferior foram descartados, ou seja, foram considerados valores dispersos ou discrepantes e substituídos pelos novos valores superiores e inferiores. Este procedimento compreende a um ciclo ou Ciclo 0. Iniciou-se um novo ciclo, a partir do cálculo da média robusta (x*) 2 e do desvio padrão (s) dos novos valores encontrados, e a seguir calculou-se o novo desvio padrão robusto (s*) 3. O novo valor de s* foi calculado pela Equação 6: (6) 2 Na ISO quando se inicia o Ciclo 1, x* passa a ser denominado como média robusta, uma vez que advém de um algoritmo robusto. 3 Na ISO quando se inicia o Ciclo 1, s* passa a ser denominado como desvio padrão robusto, uma vez que advém de um algoritmo robusto. Página 24 de 25

26 Em seguida, calculou-se novamente o valor de F i, os novos valores superiores e inferiores, conforme descrito, respectivamente, nas Equações 3, 4 e 5, sendo os valores discrepantes substituídos pelos novos limites. Este procedimento corresponde a outro ciclo ou Ciclo 1. O ciclo é reiniciado até o momento em que os valores da nova média robusta (x*) e do novo desvio padrão robusto (s*) convergirem, ou seja, até que não haja nos ciclos, diferença entre eles. Neste momento o ciclo é finalizado e os novos valores de x* e s*, que são os valores da média robusta (valor designado do EP) e do desvio padrão robusto. Página 25 de 25

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