SIMP.TCC/Sem.IC. 2018(13); FACULDADE ICESP / ISSN:

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1 CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA O USO DA IMUNOCROMATOGRAFIA INDIRETA COMO TESTE AUXILIAR NO DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO DE ERLIQUIOSE MONOCÍTICA CANINA THE USE OF INDIRECT IMMUNOCROMATOGRAPHY AS AN AUXILIARY TEST IN PRESUMPTIVE DIAGNOSIS OF CANINE MONOCYTIC ERLIQUIOSIS Como citar esse artigo: Aguiar BG, Souza SMO. O USO DA IMUNOCROMATOGRAFIA INDIRETA COMO TESTE AUXILIAR NO DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO DE ERLIQUIOSE MONOCÍTICA CANINA. Anais do 13 Simpósio de TCC e 6 Seminário de IC da Faculdade ICESP. 2018(13); Bruno Gomes Aguiar Stefânia Márcia de Oliveira Souza Resumo A Erliquiose Monocítica Canina pode ser descrita como doença infecciosa, causada por uma rickettsia de nome Ehrlichia canis. O teste de imunocromatografia indireta é responsável pela detecção de anticorpos séricos anti-ehrlichia canis. Faz-se necessário para os médicos veterinários um teste para auxiliar na triagem e posterior tratamento com antibióticos específicos. Foram escolhidos em uma clínica do Recanto das Emas, Brasília; entre 01 de Abril e 31 de Dezembro do ano de 2017, 459 cães adultos, sendo 43,1% (198/459) machos e 56,9% (261/459) fêmeas, com suspeita de Erliquiose Monocítica Canina. Tais animais foram submetidos a um teste rápido de imunocromatografia indireta, visando a triagem para que pudessem ser tratados. Foram soropositivos 403 cães, esses tratados com Doxiciclina. Após 10 dias,de tratamento, 88,3% dos cães tiveram a complete remissão dos sinais clínicos. Conclui-se assim que o teste imunocromatográfico indireto apresenta potecial para a triagem de animais suspeitos, auxiliando no diagnóstico presuntivo e tratamento de cães possivelmente infectados com Ehrlichia canis, podendo ser uma alternativa para os clínicos pelo rápido resultado, facilidade de realização do teste e baixo custo. Palavras-chave: Erliquiose, diagnóstico, triagem. Abstract Canine Monocytic Ehrlichiosis can be described as infectious disease, caused by a rickettsia of the name Ehrlichia canis. The indirect immunochromatography test is responsible for the detection of anti-ehrlichia canis serum antibodies. Veterinarians are required to have a test to aid in screening and subsequent treatment with specific antibiotics. They were chosen in a clinic of Recanto das Emas, Brasília; between April 1 and December 31 of 2017, 459 adult dogs, 43.1% (198/459) males and 56.9% (261/459) females, with suspected Canine Monocytic Ehrlichiosis. Such animals were subjected to a snap test of indirect immunochromatography, aiming at the screening so that they could be treated. 403 dogs were seropositive, those treated with Doxycycline. After 10 days of treatment, 88.3% of dogs had complete remission of clinical signs. It is concluded that the indirect immunochromatographic test presents a potential for the screening of suspect animals, assisting in the presumptive diagnosis and treatment of dogs possibly infected with Ehrlichia canis, and may be an alternative for clinicians due to the fast result, ease of test performing and low costs. Keywords: Ehrlichiosis, diagnosis, screening. stefania.oliveira@icesp.edu.br Introdução Para Dos Reis e Pinto (2017), a Erliquiose Monocítica Canina pode ser definida como enfermidade causada pela bactéria Ehrlichia Canis, tendo como vetor o carrapato denominado Rhipichephalus sanguineus, tratando-se de um vetor de alta prevalência em áreas urbanas. Segundo Jericó (2015), dentre os cães infectados, não há predisposição racial ou etária, sendo de ampla distribuição no Brasil. Dentre os sinais clínicos e hematológicos estão apatia, inapetência, depressão, anorexia, êmese, epistaxe, possíveis hemorragias, emaciação, leucopenia, trombocitopenia e anemia, dependendo de que fase a doença se apresenta, podendo variar entre aguda, subclínica e crônica. Pode-se observar também esplenomegalia e hepatomegalia. (CESAR, 2008). 2341

2 Estudos sugerem a utilização de contagem plaquetária em áreas endêmicas como indicador para que seja possível direcionar um diagnóstico, é claro, faz-se necessário nesse caso o uso de testes complementares como pesquisa de hematozoários, PCR, exames de imagem como ultrassonografia, sorologia. (BULLA et al., 2004; SANTOS et al., 2007) A imunocromatografia pode ser usada como auxiliar na triagem de cães para tratamento com antibióticos específicos como por exemplo a Doxiciclina, partindo do princípio de que aquela é capaz de detectar anticorpos séricos anti-ehrlichia canis. (BORGES; SANTOS; JUNIOR, 2016). Segundo Cesar (2008) e Borges; Santos e Junior (2016), a métodos sorológicos juntamente com alterações clínicas e hematológicas são eficientes para triagem e/ou diagnósticos presuntivos, porém, devido a possibilidade de falsos-positivos e falsos-negativos, o diagnóstico definitivo deve ser feito por meio de outros métodos como PCR, tornado possível inclusive diferenciar espécies de Ehrlichia, pela detecção de sequências específicas no DNA dos microorganismos. O presente estudo tem como objetivo demonstrar que o diagnóstico presuntivo com o uso do exame imunocromatográfico é capaz de propiciar um resultado satisfatório após tratamento com Doxiciclina em animais suspeitos para Erliquiose Monocítica Canina. Materiais e Métodos Foram utilizados para o teste animais adultos (> que 18 meses), com sinais clínicos e hematológicos sugestivos de Erliquiose, de uma clínica veterinária na cidade satélite do Recanto das Emas, Brasília, Distrito Federal, entre 01 de Abril de 2017 e 31 de Dezembro de Dentre os cães utilizados (n=459), 43,1% (198/459) foram machos e 56,9% (261/459) fêmeas. Dentre os machos, 21,2% (42/198) apresentavam idade entre 18 e 24 meses; 27,8% (55/198) idade entre 24 e 36 meses e 51% (101/198) idade maior do que 36 meses. Dentre as fêmeas, 29,9% (78/261) apresentavam idade entre 18 e 24 meses, 17,2% (45/261) idade entre 24 e 36 meses e 52,9% (138/261) idade maior do que 36 meses como é possível observar na Tabela 1. Todos os animais foram autorizados pelos respectivos tutores a participarem do presente estudo, mediante termo de autorização por escrito, no momento da primeira visita realizada, declarando estarem cientes dos materiais e métodos empregados e cientes também da aptidão de retornarem a clínica para a verificação ou não da remissão dos sinais clínicos após o tratamento. Todos os tutores receberam a medicação na posologia e quantidade indicadas pelo clínico, assim como foram instruídos a aplicá-la e quais seriam os possíveis efeitos colaterais do medicamento. O teste utilizado no estudo foi o Alere Erliquiose Ac Test Kit; imunoensaio imunocromatográfico para detecção qualitativa de anticorpos (IgG e IgM) anti-ehrlichia canis. O teste fora realizado em ambiente desinfetado e limpo, com temperatura controlada de 21 graus, com o uso de equipamento de proteção individual (luvas de procedimento de látex, jaleco, touca, máscara e propés). Segundo o fabricante (Alere ), o teste comercial apresenta sensibilidade de 98,2% e 100% de especificidade. Utilizou-se sangue coletado da veia cefálica dos animais suspeitos, com devida autorização dos respectivos tutores. Fora adicionado 10μL de sangue total, utilizando a pipeta capilar proveniente do próprio fabricante do teste, no orifício S do cassete. Após, adicionou-se 2 gotas de tampão no mesmo orifício S e aguardou-se 20 minutos, com o cassete em superfície plana. Após os 20 minutos consideraram-se positivos os testes em que foi possível observar no cassete a presença das linhas C Controle e T Teste, independente da intensidade delas. Consideraram-se negativos os testes em que, após 20 minutos, fora possível a observação no cassete a presença apenas da linha C ; seguindo desta forma as recomendações apresentadas na bula do teste comercial em questão. Após a obtenção de um diagnóstico presuntivo, por meio da sorologia, sinais clínicos e achados hematológicos, os animais soropositivos foram tratados com Doxicilina por via oral, na dosagem de 10mg/kg, de 12/12 horas, pelo período de 28 dias, sendo este o antibiótico de predileção. (Greene, 2015). Segundo Greene (2015), podem ocorrer falso-positivos por reação cruzada com outras espécies de Ehrlichia e falso-negativos podem ocorrer devido ao período de infecção que poderia ser curto para que sejam sintetizados anticorpos específicos, causando um período de janela imunológica. 2342

3 Tabela 1 Total de cães suspeitos 18 a 24 meses 24 a 36 meses > 36 meses Total Machos Fêmeas Total: 459 Não foram incluídos no presente estudo cães filhotes, uma vez animais com idade inferior a 18 meses tem um sistema imunológico ainda em formação, o que poderia tanto facilitar a infecção por E. canis, como aumentar o período de janela imunológica, prejudicando assim os resultados do teste. (Greene, 2015) Dentre os achados clínicos, foram observados inapetência 60,5% (278/459); apatia 44% (202/459); febre 61,2% (281/459); êmese 53,6% (247/459); epistaxe 6,1% (28/459). Nos achados hematológicos, foram notados 91% (418/459) trombocitopenia; 78,2% (358/459) leucopenia e anemia 51,8% (238/459). Fora realizado o acompanhamento com retorno após 10 dias após o início do tratamento com os animais soropositivos. Resultados Dentre o total de 459 cães suspeitos, foram positivos no teste 403 animais, representando 87,8% do total; sendo soropositivos 59,3% (239/403) fêmeas e 40,7% (164/403) machos como pode-se observar na Tabela 2. Não foram observadas nenhuma amostra inconclusiva ou inválida (no caso em que a linha T não é observada, conforme informações fornecidas pelo fabricante do teste imunocromatográfico, Alere ). Após 10 dias de tratamento, fora realizado o retorno onde não observou-se a persistência de sinais clínicos em 88,3% (356/403) dos animais positivados em teste. Tabela 2 Cães soropositivos 18 a 24 meses 24 a 36 meses > 36 meses Total 2343

4 Machos Fêmeas Total: 403 Discussão A ocorrência significativamente maior em fêmeas, dentre os soropositivos, confirma os resultados já obtidos em outros estudos e acreditase ser pela questão imunológica decorrente do ciclo estral, o que não ocorre com os machos. (Moreira et al., 2003; Borges et al., 2016). É de extrema importância ressaltar que os testes sorológicos possuem uma desvantagem como método diagnóstico, uma vez que não é possível diferenciar se a infecção é atual ou prévia a titulação de anticorpos tende a diminuir de forma vagarosa, ao passo que o animal só se tornará negativo após 15 a 30 meses após tratamento. (Cesar, 2008). Comparando os resultados obtidos no presente estudo com outros estudos que utilizam a mesma metodologia de imunocromatografia indireta, observa-se resultados bem próximos como no estudo realizado por Borges, Santos, Junior (2016), onde 82,8% dos animais diagnosticados e tratados tiveram a remissão dos sinais clínicos em sete dias pós tratamento. O estudo limita-se a animais adultos, visto que, em animais jovens a imunidade ainda em formação pode alterar drasticamente os resultados e que estudos específicos devem ser realizados para que se tenham dados mais confiáveis a respeito do tema. Outra grande limitação do teste é a fase subclínica da doença possa ser a responsável pela remissão de sinais clínicos após os 10 dias em parte da população de amostragem, divergindo assim dos dados expostos no presente trabalho no que diz respeito a remissão de sinais clínicos. (Greene, 2015) Conclusão: Um diagnóstico presuntivo para Erliquiose Monocítica Canina fora realizado, levando em consideração os sinais clínicos sugestivos, exames de imagem, teste de imunocromatografia indireta e alterações como anemias normocíticas e normocrômicas, trombocitopenia. Tais animais positivos passaram por tratamento com doxiciclina por 28 dias, 10mg/kg, de 12/12 horas. Comprova-se através do estudo, com remissão dos sinais clínicos após tratamento da ampla maioria dos animais soropositivos. O enorme potencial do teste imunocromatográfico na triagem dos animais com suspeita clínica de Erliquiose Monicítica Canina além de auxiliar também no diagnóstico presuntivo, uma vez que é um teste de rápida obtenção do resultado, fácil de ser realizado e de ter um custo relativamente baixo, além de ser adquirido de maneira muito menos dificultosa pelo clínico. Agradecimentos:. Agradeço a minha esposa Monique Magno Macário dos Santos Araújo pela paciência, dedicação e conhecimento técnico, sem tudo isto meu trabalho durante todos esses meses seria em vão. A minha mãe, senhora. Mirian Cristina Gomes de Farias, a minha maior fonte de inspiração em liderança, estudos, ética e bom senso. Exemplo não só materno, mas de ser humano a ser seguido pelos seus pares. Muitíssimo obrigado! Agradeço aos excelentíssimos senhores Rodrigo de Araújo Matos, Rafael Seiça, Luís Eduardo Gaudino, Talles Antônio, Gerson Correa, João Lucas Correa, Pedro Lima, Daniel Moura; que contribuíram com seus conhecimentos técnicos e para a elaboração do artigo, esclarecendo inúmeras dúvidas que foram surgindo no desenrolar do estudo. A todos os meus colegas de trabalho da CLINVIP pelo incentivo e motivação diários recebidos durante essa longa jornada. A todos os meus professores durante a minha graduação, pelos conhecimentos e experiências compartilhados nos incontáveis dias e horas de aulas. 2344

5 Referências: 1 - Borges, F.V.; Santos, J.P.; Júnior, A.F. Imunocromotografia indireta auxilia na triagem de cães para realização de tratamento contra Ehlichia canis: Relato de caso. Ciência & Tecnologia: Fatec-JB, Jaboticabal, v. 8, n.1, Número especial Bulla, C.; Takahira, R.K.; Araujo JR., J.P.; Trinca, L.A.; Lopes, R.S.; Weidmeyer, D.C.E. The relationship between the degree of thrombocytopenia and infection with Ehrlichia canis in an endemic area. Vet. Res., v. 35, p , CESAR, M. F. G. Ocorrência de Ehrlichia canis em cães sintomáticos atendidos no Hospital Veterinário da Universidade de Brasília e análise de variabilidade em regiões genômicas de repetição. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2008, 57 p. Dissertação de Mestrado. 4 - Dos Reis, C. M. M.; Pinto, L. C. Erliquiose Monocitica Canina: Relato de caso. Revista Científica de Medicina Veterinária UNORP, v.1, n.1, p. 1-11, Greene, C. E. Doenças Infecciosas em Cães e Gatos. 4ª Edição. Rio de Janeiro: Guanabara- Koogan, Jerico, M.M. Tratado de medicina interna de cães e gatos. 2 v. 1ed. São Paulo: Roca, 2015, 2464 p. 7 - Moreira, S.M.; Bastos, C.V.; Araújo, R.B. et al. Estudo retrospectivo (1998 a 2001) da erliquiose canina em Belo Horizonte. Arq. Bras.Med. Vet. Zootec., v.55, p , Santos, F.; Coppede, J. S.; Pereira, A. L. A.; Oliveira, L. P.; Roberto, P. G.; Benedette, sr. B. R.; Zucoloto, L. B.; Lucas, F.; Sobreira, L. And Marins, M. Molecular evaluation of the incidence of Ehrlichia canis, Anaplasma platys and Babesia spp. in dogs from Ribeirão Preto, Brazil. The Vet. Journal (article in press)