UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE JOÃO HÉLIO VENÂNCIO GOMES

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE JOÃO HÉLIO VENÂNCIO GOMES DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO TOPOTECANO ENCAPSULADO EM CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS PARA APLICAÇÃO TÓPICA Goiânia

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3 JOÃO HÉLIO VENÂNCIO GOMES DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO TOPOTECANO ENCAPSULADO EM CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS PARA APLICAÇÃO TÓPICA Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Goiás, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde. Orientadora: Profa. Dra. Stephânia Fleury Taveira Goiânia

4 Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática do Sistema de Bibliotecas da UFG. VENÂNCIO GOMES, JOÃO HÉLIO DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO TOPOTECANO ENCAPSULADO EM CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS PARA APLICAÇÃO TÓPICA [manuscrito] / JOÃO HÉLIO VENÂNCIO GOMES XLI, 41 f.: il. Orientador: Profa. STEPHÂNIA FLEURY TAVEIRA. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Faculdade de Medicina (FM), Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Goiânia, Bibliografia. Inclui siglas, fotografias, abreviaturas, gráfico, tabelas, lista de figuras, lista de tabelas. 1. CLORIDRATO DE TOPOTECANO. 2. CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS. 3. PERMEAÇÃO CUTÂNEA. 4. GEL DE HIDROXIETILCELULOSE. 5. GEL DE QUITOSANA. I. FLEURY TAVEIRA, STEPHÂNIA, orient. II. Título. CDU 615 4

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6 Aos meus pais Jane Maria Gomes Caixeta e Silva Valdevardes Venâncio da Silva 6

7 AGRADECIMENTOS Deus: Inteligência suprema e causa primária de todas as coisas (L.E 1:1). Agradeço primeiramente a Deus, pelas oportunidades cedidas, pelo amparo e pelas bênçãos. Aos meus familiares, em especial à minha filha Cecília, que mesmo à distância me proporcionaram suporte o entusiasmo necessários para esta conquista. À professora Dr. Stephânia Fleury Taveira pela oportunidade dada, e também pela paciência que teve comigo, principalmente nos momentos difíceis enfrentados. Ao professor Dr. Ricardo Neves Marreto, que sempre solucionou as dúvidas que surgiram, nos norteando para o caminho correto. Ao Dr. Leonardo Gomes Souza pelos ensinos prestados no decorrer da pesquisa. Ao amigo Luis Antônio e a Ligia por me auxiliarem nos primeiros passos dentro do laboratório. Aos colegas de trabalho e amigos do FARMATEC (André, Aline, Ana Paula, Fernanda, Percília, Kamilla, Priscila, Mariliza, Relton, Letícia, Emílio, Fabiana) pelas companhias agradáveis, descontraídas, e pelos laços de profissionalismo e amizade que fizemos. A CAPES pelo auxílio financeiro. Pela distância dos familiares, acabamos construindo uma segunda família. Obrigado Luis, Danillo e Rafael pela amizade sincera. 7

8 Colhemos o que plantamos (L.E) 8

9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ESTRUTURA DA PELE, TUMORES CUTÂNEOS E MELANOMA Estrutura da pele: barreira à penetração de fármacos Cânceres de pele e melanoma CLORIDRATO DE TOPOTECANO NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS OBTENÇÃO DE FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS Obtenção de géis e incorporação de nanopartículas OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAIS E MÉTODOS MATERIAIS Substâncias e reagentes Equipamentos e utensílios diversos MÉTODOS Metodologia analítica Preparo e liofilização dos CLN contendo TPT Produção das formulações semissólidas contendo TPT encapsulado ou não encapsulado: hidrogéis de hidroxietilcelulose (HEC) e quitosana (QUIT)

10 4.2.5 Caracterização das formulações Estudo de estabilidade das formulações Avaliação do perfil de liberação in vitro do TPT Estudos de permeação in vitro Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO METODOLOGIA ANALÍTICA Quantificação do TPT por cromatografia líquida de alta eficiência Linearidade Seletividade Recuperação do TPT das camadas da pele PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT MORFOLOGIA DOS NANOCARREADORES POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA ESTUDO DE ESTABILIDADE A Tabela 5 apresenta os valores de diâmetro médio e PdI, dos CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT após estudo de estabilidade, realizado durante 30 dias AVALIAÇÃO DO PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO DO TPT ESTUDOS DE PERMEAÇÃO DO TPT CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

11 TABELAS Tabela 1: Características físico-químicas dos carreadores lipídicos nanoestruturados encapsulados com TPT (CLN-TPT) Tabela 2: Concentração de TPT antes e após ultrafiltração em vivaspin 2 após centrifugação das amostras por 90 minutos a xg Tabela 3: Diâmetro médio, PdI, potencial zeta, REC%, EE% e CF% das formulações de CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT (n=3) Tabela 4: Valores de d 10, d 50 e d 90 e distribuição de tamanho (SPAN) dos CLN- TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT pela técnica de difração a laser Tabela 5: Valores de diâmetro médio e PdI dos CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT durante 30 dias Tabela 6: Valores de EE% e REC% dos CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT durante 30 dias Tabela 7: Potencial zeta dos CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT durante estudo de estabilidade por 30 dias Tabela 8: Quantidade total de fármaco acumulado no EC e PR e incremento de permeação entre as formulações encapsuladas e não encapsuladas

12 FIGURAS Figura 1: Esquema ilustrativo da estrutura da pele em suas diferentes camadas Figura 2: Esquema ilustrativo do melanoma metastático, originado nos melanócitos localizados na epiderme Figura 3: Estrutura química da camptotecina Figura 4: Topotecano obtido a partir da campotecina pela adição de um grupo dimetilamino e uma hidroxila no anel A da campotecina Figura 5: Esquema representativo das NLS e CLN Figura 6: Prováveis maneiras de interação das nanopartículas com a pele Figura 7: Preparo de dispersão semissólida de NL através de processo de produção em um único passo Figura 8: Estrutura química da hidroxietilcelulose (HEC) Figura 09: Estrutura molecular da quitina e quitosana Figura 10: Esquema ilustrativo da produção de CLN-TPT pelo método da diluição da microemulsão Figura 11: Sistema de ultrafiltração Vivaspin Figura 12: Células de fluxo estático tipo Franz acopladas em equipamento de coleta automatizada, Hanson Research Figura 13: Células de fluxo estático tipo Franz Figura 14: Cromatograma da solução de TPT em MeAC, na concentração de 60 µg/ml Figura 15: Curva de calibração do cloridrato de topotecano Figura 16: Cromatogramas obtidos após análise do EC, em comparação com solução de TPT em MeAc Figura 17: Cromatograma obtido após análise da PR, em comparação com solução de TPT em MeAc Figura 18: Cromatograma obtido após análise da formulação CLN-HEC, em comparação com solução de TPT em MeAc Figura 19: Cromatogramas obtidos após análise da formulação CLN-QUIT, em comparação com solução de TPT em MeAc

13 Figura 20: Diâmetro médio em função da intensidade de espalhamento de luz do CLN- TPT Figura 21: Diâmetro médio em função da intensidade de espalhamento de luz do CLN- TPT-HEC Figura 22: Diâmetro médio em função da intensidade de espalhamento de luz do CLN- TPT-QUIT Figura 23: Imagem topográfica obtida por AFM dos CLN contendo TPT Figura 24: Perfil de liberação do TPT-HEC, TPT-QUIT, CLN-TPT-HEC e CLN-TPT- QUIT após 24 horas de experimento Figura 25: Quantidade de TPT retida no EC após 24 horas de permeação das formulações: Figura 26: Quantidade de TPT retida na PR após 24 horas de permeação das formulações:

14 SIGLAS E ABREVIATURAS CLAE AFM CF% CLN CLN-HEC CLN-QUIT CLN-TPT Cromatógrafo líquido de alta eficiência Microscopia de força atômica Carga de fármaco Carreadores lipídicos nanoestruturados Carreadores lipídicos nanoestruturados dispersos em hidroxietilcelulose Carreadores lipídicos nanoestruturados dispersos em quitosana Carreadores lipídicos nanoestruturados contendo topotecano CLN-TPT-HEC Carreadores lipídicos nanoestruturados contendo topotecano incorporados em gel de hidroxietilcelulose CLN-TPT-QUIT Carreadores lipídicos nanoestruturados contendo topotecano incorporados em gel de quitosana EC EE% FDA MeAc NL PdI PR REC% TPT Estrato córneo Eficiência de encapsulação Food and Drug Administration Metanol acidificado com 8,5% de ácido fosfórico Nanopartículas lipídicas Índice de polidispersividade Pele remanescente Recuperação de topotecano Topotecano 14

15 RESUMO O topotecano (TPT) é um potente agente citotóxico utilizado no tratamento de diversos tumores, e estudos têm relatado a sua eficácia no tratamento de melanoma. O tratamento local de melanoma com TPT parece ser uma alternativa viável, visto que os tratamentos convencionais resultam em cicatrizes desagradáveis, dor, inflamação e possíveis recidivas. Entretanto, a permeação de fármacos hidrofílicos, como o TPT, é bastante difícil. A encapsulação deste fármaco em carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) poderá facilitar a permeação do TPT para as camadas mais profundas da pele. Para tanto, a formulação final deve apresentar viscosidade adequada para facilitar a aplicação e manter-se no local desejado. Desta forma, o objetivo do trabalho foi incorporar os CLN-TPT em hidrogéis de hidroxietilcelulose (CLN-TPT-HEC) e quitosana (CLN-TPT-QUIT) e avaliar a permeação cutânea do TPT a partir das diferentes formulações. Os CLN incorporados nos hidrogéis foram caracterizados quanto ao diâmetro médio, índice de polidispersividade (PdI), potencial zeta, recuperação (REC%) e eficiência de encapsulação (EE%). Os perfis de liberação e permeação in vitro foram determinados utilizando células de difusão tipo Franz, utilizando membrana sintética e pele de orelha suína, respectivamente. Para a quantificação do TPT utilizou-se metodologia desenvolvida e validada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e um método para a sua extração das camadas da pele foi desenvolvido. Os CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT apresentaram, respectivamente, diâmetros médios de 117,8 nm e 183,2 nm; PdI de 0,32 e 0,33 e potencial zeta -12,0mV e 75,9mV. Aproximadamente 60% do TPT foi recuperado ao final do preparo das formulações e a EE% manteve-se maior que 85% após a incorporação das partículas nos géis. Os CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT demonstraram uma liberação significativamente menor (p<0,05) do que do fármaco incorporado nos hidrogéis e nos CLN em dispersão aquosa, demonstrando uma potencialização no controle da liberação do TPT, quando os CLN estão dispersos nos hidrogéis. As formulações CLN-TPT, CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT aumentaram respectivamente 1,93, 2,37 e 2,06 vezes a permeação do fármaco para as camadas mais profundas da pele, em relação ao fármaco não encapsulado (nas mesmas formulações). Os CLN-TPT-HEC/QUT demonstraram menor permeação do fármaco para as camadas mais profundas da pele quando comparado com o CLN-TPT disperso em água. O controle da liberação resultou em uma quantidade menor de fármaco disponível para permeação. Desta forma, as formulações permitiram o controle da permeação através do controle da liberação do fármaco, podendo atender a diferentes necessidades. O gel de QUIT, por exemplo, diminuiu a quantidade de fármaco retido no EC e aumentou a quantidade de TPT permeado para as camadas mais profundas. As formulações desenvolvidas têm potencial de utilização para tratamento tópico do melanoma. Palavras-chave: Cloridrato de topotecano. Carreadores lipídicos nanoestruturados. Permeação cutânea. Gel de hidroxietilcelulose. Gel de quitosana. 15

16 ABSTRACT Topotecan (TPT) is a potent cytotoxic agent used in the treatment of various tumors, and studies have reported its effectiveness in the treatment of melanoma. Local treatment of melanoma with TPT appears to be a viable alternative since conventional treatments result in scarring, pain, inflammation and possible recurrence. However, the permeation of hydrophilic drugs such as TPT, is quite difficult. The encapsulation of the drug into nanostructured lipid carriers (NLC) may facilitate TPT permeation to deeper skin layers. Therefore, the final formulation shall provide appropriate viscosity for easy application and remain in the desired location. Thus, the objective was to incorporate the CLN-TPT in hydrogels hydroxyethyl cellulose (NLC-TPT-HEC) and chitosan (NLC- TPT-QUIT) and evaluate the skin permeation of the merged formulations or not in gels. NLC were incorporated into the hydrogels and were characterized as mean diameter, polydispersity index (PdI), zeta potential, drug recovery (REC%) and encapsulation efficiency (EE%). The release profiles and in vitro permeation studies were carried out in Franz-type diffusion cells using synthetic membrane and porcine ear skin, respectively. To quantify the TPT, high-performance liquid chromatography (HPLC) was used and a method for its extraction and quantitation in different skin layers was developed. The NLC-TPT-HEC and NLC-TPT-QUIT obtained respectively mean diameters of nm and nm; PdI of 0.32 and 0.33 and zeta potential -12,0mV and 75,0mV. Approximately 60% of TPT was recovered at the end of the preparation of formulations and EE% remained higher than 85% after the incorporation of the particles in the gels. The NLC-TPT-HEC and NLC-TPT-QUIT demonstrated a significantly lower drug release (p <0.05) than the drug incorporated in the hydrogel and in NLC aqueous dispersion, demonstrating a potentiation in controlling the release of TPT. The NLC-TPT formulations CLN-TPT-HEC and CLN-TPT-QUIT increased respectively 1.93, 2.37 and 2.06 times the permeation of the drug into the deeper layers of the skin, compared to unloaded drug in same formulations. The NLC-TPT-HEC / QUIT showed a lower permeation of the drug into the deeper skin layers when compared with the CLN-TPT dispersed in water. The controlled release resulted in a lower amount of drug available for permeation. Thus, the formulations allow control of permeation through the control of the drug release, which can meet different needs. The gel QUIT, for example, decreased the amount of drug retained in the EC and increases the amount of TPT permeated to the deeper layers. The developed formulations have potential use for topical treatment of melanoma. Keywords: Topotecan Hydrochloride. Nanostructured lipid carriers. Skin permeation. Hidroxietilcelulose gel. Chitosan gel. 16

17 1 INTRODUÇÃO A pele é estruturada em diferentes camadas, sendo a mais externa denominada estrato córneo (EC), a principal responsável pela proteção da pele e a principal barreira à penetração de substâncias (BOUWSTRA et al., 2003). Dentre as diversas patologias que podem acometer este órgão, destacam-se os cânceres de pele, que se subdividem em dois principais tipos: não melanoma e melanoma (DEMERS et al., 2005; FRANSEN et al., 2012). Os cânceres de pele do tipo melanoma são derivados dos melanócitos da pele (HAYWARD, 2003), constituindo um tipo de câncer maligno, propenso à metástase sistêmica e morte (EINSPAHR et al., 2002). Dentre os tratamentos disponíveis para o melanoma, o principal é a cirurgia, estando os tratamentos medicamentosos limitados à terapias adjuvantes (DAVIDS; KLEEMANN, 2011). Os tratamentos medicamentosos locais são de grande aceitação pela sua comodidade na aplicação, e pela possibilidade de redução dos efeitos adversos sistêmicos. Assim, o tratamento tópico do melanoma, utilizando agentes citotóxicos parece ser uma interessante alternativa. O topotecano (TPT) é um potente agente citotóxico utilizado para o tratamento de diversos tumores, como de ovário e de células pequenas de pulmão (GARCIA- CARBONERO; SUPKO, 2002). Estudos recentes têm demonstrado uma interessante ação deste fármaco contra o melanoma (JANIK et al., 2001; YANG; CHAPMAN, 2009; YU et al., 2012). Assim, uma aplicação diferenciada e inovadora para o TPT, seria sua administração tópica e localizada para o tratamento do melanoma cutâneo. Atualmente a sua apresentação farmacêutica é na forma de solução para adminsitração parenteral, e cápsulas para uso oral. A adminsitração tópica do TPT exigiria o desenvolvimento de uma formulação bastante diferenciada, visto que a permeação de fármacos hidrofílicos na pele, como é o caso do TPT, é bastante difícil. Outro fator a ser considerado é que o TPT é uma molécula instável em ph neutro a alcalino, que se converte em uma forma menos ativa, o que dificulta o desenvolvimento destas formulações. A encapsulação do TPT em nanopartículas lipídicas pode ser uma opção viável para sua administração tópica. Os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) constituem a segunda geração de nanopartículas lipídicas, compostas por uma matriz 17

18 lipídica biocompatível e biodegradável, além de poderem controlar a liberação, e fornecerem estabilidade aos fármacos nanoencapsulados (MULLER et al., 2002; WISSING et al., 2004). Sua aplicação tópica tem sido bastante difundida, pois estes nanocarreadores podem formar um filme lipídico na superfície da pele, aumentando a hidratação e permeação cutânea de fármacos. Ainda, através de interações eletrostáticas entre fármaco e carreador, é possível a encapsulação de fármacos hidrofílicos neste sistema, como já reportado para o TPT (SOUZA et al., 2011) e também para outros fármacos hidrofílicos (TAVEIRA et al., 2011). Uma das desvantagens dos CLN é que a formulação final obtida é uma dispersão aquosa. Este tipo de formulação não favorece a aplicação tópica, visto que a baixa viscosidade da formulação resulta em perdas durante a aplicação e baixa retenção da formulação no local aplicado. Para viabilizar a sua aplicação tópica, a incorporação em formulações semissólidas pode melhorar a espalhabilidade e aumentar o tempo de permanência da formulação na pele, além de poder auxiliar no controle da liberação do fármaco. Várias estratégias têm sido propostas para aumentar a viscosidade das dispersões de CLN. Algumas têm proposto aumento do teor lipídico e uso de homogeneização a alta pressão (LIPPACHER et al., 2001). Apesar de este processo ser bastante prático, utiliza-se equipamento específico e altas temperaturas, o que limita a produção destes sistemas. Outras propostas incluem a utilização de polímeros, seja por obtenção do hidrogel separadamente e incorporação no sistema, seja por dispersão do polímero na formulação final de CLN. A versatilidade deste processo e diversidade de polímeros que podem ser utilizados nas formulações tem despertado o interesse na obtenção de hidrogéis como formulações semissólidas para veicular os CLN. A hidroxietilcelulose (HEC) é um polímero semissintético, derivado da celulose (KENNEDY et al., 1995). Sua característica não iônica e estabilidade frente a diferentes phs favorece sua aplicação tópica, visto que uma diversidade de ativos podem ser incorporados nesta formulação, sem prejudicar sua estabilidade da formulação (WANG et al., 2011). Este polímero tem sido utilizado para produção de formulações semissólidas com CLN. A característica não iônica também minimiza as interações 18

19 entre carreador e rede polimérica, o que pode ser vantajoso para evitar instabilidade física do sistema (SOUTO et al., 2004). Outros estudos têm realizado a incorporação de nanopartículas em dispersões poliméricas iônicas, como no caso da quitosana, que é um polímero catiônico. Suas propriedades de bio/mucoadesão favorecem a interação do polímero com diferentes membranas, aumentando o tempo de retenção das formulações no local aplicado (GRATIERI et al., 2011). É sabido também que a quitosana pode agir como promotor de absorção, interagindo com o EC e favorecendo a permeação de substâncias na pele (SÁ et al., 2015). Dentro deste contexto a incorporação de CLN em hidrogéis, é bastante viável e tem sido explorada para veiculação de substâncias através da pele. 19

20 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ESTRUTURA DA PELE, TUMORES CUTÂNEOS E MELANOMA Estrutura da pele: barreira à penetração de fármacos A pele é o maior órgão do corpo humano, constituindo uma barreira à penetração de microrganismos, partículas e moléculas, além de proteger contra impactos mecânicos, desidratação e radiação ultravioleta (FOLDVARI, 2000). É composta por diferentes camadas morfologicamente distintas: a epiderme, sendo a camada avascularisada, a derme e a hipoderme. Também fazem parte de sua estrutura os apêndices cutâneos: glândulas sebáceas, sudoríparas e folículos pilosos (FOLDVARI, 2000; MOSER et al., 2001), conforme ilustrado na Figura 1. Figura 1: Esquema ilustrativo da estrutura da pele em suas diferentes camadas Fonte: LAMOREA. Transporte através da pele, Ilustração. A camada mais externa é chamada estrato córneo (EC), sendo esta a principal responsável pela proteção da pele. O EC é constituído basicamente por células mortas preenchidas com queratina e água (denominados corneócitos), que estão embebidos em uma matriz lipídica composta principalmente por ceramidas, ácidos graxos livres e 20

21 colesterol. Esta estrutura possui características hidrofóbicas e é a principal barreira à penetração de substâncias na pele (BOUWSTRA et al., 2003). Subjacente ao estrato córneo encontra-se a epiderme viável, estruturada em várias camadas: estratos basal, espinhoso, granuloso, e em algumas regiões do corpo, o estrato lúcido. Na camada basal as células se proliferam, se diferenciam nos demais estratos e migram em direção à superfície da pele. Assim, a epiderme é um tecido dinâmico em constante renovação. As células mortas na superfície do estrato córneo são eliminadas e este equilíbrio é mantido pela diferenciação de novas células advindas das camadas subjacentes. (BOUWSTRA; PONEC, 2006). Por ser um tecido complexo, as doenças que acometem a pele podem atingir diferentes os estratos. Sendo assim, se as camadas mais profundas são atingidas, mais difícil é o tratamento local, visto que o fármaco deve atravessar o EC para exercer seu efeito terapêutico (MOSER et al., 2001). Geralmente, substâncias que possuem algumas características físico-químicas favoráveis, tais como coeficiente de partição óleo/água maior que 10 e menor que 1000, massa molecular menor que 500 Da, dentre outros fatores, podem ter a permeação facilitada. Entretanto, a maior parte dos fármacos não possuem essas características, apresentando baixa capacidade de penetrar a pele. Todavia a partição dos fármacos para as camadas mais profundas da pele pode ser aumentada pela utilização de formulações adequadas (NAIK et al., 2000). Dentro deste contexto, o estudo criterioso sobre as doenças da pele, o estrato que cada tipo de doença acomete, se faz necessário, para proposição dos melhores tratamentos tópicos. Dentre as diferentes doenças que acometem a pele, os cânceres são as mais agressivas e por isso, muita atenção tem sido dada a esta patologia Cânceres de pele e melanoma Câncer é o nome dado ao conjunto de mais de cem doenças que possuem em comum o crescimento desordenado de células que invadem tecidos e órgãos. Estas células se dividem rapidamente, de forma incontrolável, determinando a formação de tumores malignos que podem espalhar-se para outras regiões do corpo. As causas do câncer podem ser externas ou internas ao organismo, estando inter-relacionadas. As 21

22 causas externas referem-se ao meio ambiente e aos hábitos/costumes de uma sociedade, as internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, e estão relacionadas com a capacidade do organismo de se defender de agressões externas. (INCA, 2015). Os cânceres de pele possuem alta taxa de incidência, sendo superior a incidência de todos os outros tipos de cânceres (SIMONETTI et al., 2009). Podem ser classificados em dois tipos: não melanoma e melanoma. Os subtipos mais comuns de câncer de pele do tipo não melanoma são carcinoma de células basais, responsável por aproximadamente 75% dos casos, e carcinoma de célula escamosa, constituindo aproximadamente 25% dos casos (LOMAS et al., 2012). A incidência dos cânceres de pele do tipo não melanoma vem crescendo em vários países do mundo (DEMERS et al., 2005; FRANSEN et al., 2012; HOLME; MALINOVSZKY; ROBERTS, 2000). Apesar da taxa de mortalidade ser extremamente baixa, podem destruir regiões faciais como orelha, nariz e lábios (LOMAS et al., 2012). Os tratamentos disponíveis para os tumores não melanômicos incluem remoção cirúrgica, curetagem, crioterapia, radioterapia, quimioterapia e terapia fotodinâmica (WAGNIERES et al., 1998; DE ROSA; BENTLEY, 2000). A remoção cirúrgica é o método preferido na maioria dos casos (LUXENBERG; GUTHRIE, 1986; DE ROSA; BENTLEY, 2000). Atualmente existem também tratamentos medicamentosos de uso tópico. Entretanto estes tratamentos são indicados apenas para lesões pré-cancerígenas, como por exemplo, a queratose actínica. O Imiquimode, o diclofenaco de sódio e o 5- fluorouracil são exemplos de fármacos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) para esta aplicação. O imiquimode foi aprovado em 2004, porém efeitos adversos como inflamação local, eritema, edema e ulceração foram relatados com seu uso (BURNS; BROWN, 2005). A formulação tópica de gel contendo diclofenaco também pode ser utilizada, mas o tratamento é bastante longo, com duas aplicações diárias por sessenta a noventa dias. Por fim o 5-fluorouracil é outra alternativa para o tratamento destas lesões, mas efeitos adversos, como inflamação local, também têm sido relatados. (BARRERA; HERRERA, 2007) 22

23 Todos estes problemas somados à falta de adesão do paciente, que descontinua o uso da medicação quando a inflamação local é intensa, limitam o uso desses medicamentos. Outras desvantagens são o período de tratamento relativamente longo, e a provável ineficácia dos tratamentos, devido a recidivas. Acredita-se que os fármacos não atinjam as camadas mais profundas da pele, principalmente devido ao espessamento do EC, característico destas lesões cancerígenas e pré-cancerígenas (BARRERA; HERRERA, 2007). Os tumores do tipo melanoma são derivados dos melanócitos da pele, que são células produtoras de pigmentos localizadas na epiderme, conforme demonstrado na Figura 2 (HAYWARD, 2003). Podem se originar em pele saudável ou a partir de uma lesão pré-neoplásica, chamada nevo displásico (EINSPAHR et al., 2002). Figura 2: Esquema ilustrativo do melanoma metastático, originado nos melanócitos localizados na epiderme. Fonte: Disponível em Um dos fatores de risco para o melanoma é a história familiar da doença. Estima-se que aproximadamente 10% dos casos da doença apresentam relação de parentesco de primeiro ou segundo grau. Outro fator de risco é a exposição crônica à luz solar (HAYWARD, 2003). O melanoma é maligno, sendo o câncer de pele mais propenso à metástase sistêmica e morte, constituindo a principal doença fatal originada na pele (EINSPAHR et al., 2002; JIN et al., 2009). Possui taxa anual de crescimento de 6%, e na população branca a incidência é de dez a cem vezes maior do que em negros ou asiáticos (JIN et al., 2009; GIBOT et al., 2015). O diagnóstico precoce do melanoma 23

24 é extremamente importante para o início da terapêutica, visto que o tratamento tardio é limitado, sendo praticamente ineficaz (EINSPAHR et al., 2002). Diferentes abordagens terapêuticas para o melanoma têm sido utilizadas nos últimos anos, incluindo curetagem, cirurgia, crioterapia e quimioterapia, sendo os tratamentos não cirúrgicos limitados a terapias adjuvantes (DAVIDS; KLEEMANN, 2011). Estes tratamentos podem levar a inflamações severas, dor e cicatrizes desagradáveis (LOPEZ et al., 2004). Outro problema é que em muitos casos eles falham, o tumor se torna resistente e se espalha rapidamente, resultando em morte do paciente (KHAYAT; COEFFIC, 2000; SERRONE et al., 2000; DAVIDS; KLEEMANN, 2011). Assim, é evidente a necessidade de abordar estratégias terapêuticas adicionais, com mais eficácia e menos efeitos adversos (JIN et al., 2009; SYED et al., 2014). Uma interessante alternativa para a terapia adjuvante do melanoma, a fim de melhorar o tratamento do melanoma, é o uso local de agentes citotóxicos nos estágios iniciais da doença, ou realizar a quimioprevenção, combatendo o nevo displásico, um provável precursor (EINSPAHR et al., 2002). O tratamento tópico pode evitar os efeitos adversos sistêmicos aos fármacos, proporcionando aumento na adesão do paciente ao tratamento, reduzindo custos cirúrgicos e cicatrizes desagradáveis, além de ser mais conveniente para o paciente. 2.2 CLORIDRATO DE TOPOTECANO O cloridrato de topotecano (TPT) é um potente agente citotóxico. Este fármaco é um derivado hidrofílico semissintético da camptotecina (GERRITS et al., 1997) (Figura 3), que é um alcaloide presente na madeira, casca e fruto da Camptotheca acuminata, um arbusto encontrado na Ásia e China (GARCIA-CARBONERO; SUPKO, 2002; PIZZOLATO; SALTZ, 2003). A camptotecina foi identificada em 1966 como um fármaco com potencial atividade antitumoral pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos. Este composto é um alcaloide quinoleínico, e sua estrutura química consiste em um anel pentacíclico que inclui um anel quinolona (estruturas A e B da Figura 3), um pirrol (anel C da Figura 3), e um centro assimétrico com um anel α-lactona em configuração S (anel E da Figura 3) (SRIVASTAVA et al., 2005). 24

25 Figura 3: Estrutura química da camptotecina F onte: Adaptado de PIZZOLATO; SALTZ, 2003 Ensaios pré-clínicos utilizando a camptotecina demonstraram atividade interessante contra leucemia em alguns modelos de carcinomas, entretanto, problemas derivados de sua reduzida solubilidade dificultaram seu desenvolvimento clínico. Para contornar este problema começou a se utilizar o seu sal sódico, sendo necessárias doses muito altas para o efeito terapêutico, as quais causavam efeitos tóxicos nos pacientes. Estudos clínicos apresentaram efeitos adversos graves, como mielosupressão, cistite hemorrágica, vômitos e diarreia, limitando assim seu uso. (PIZZOLATO; SALTZ, 2003). A melhor compreensão de sua estrutura química e do seu mecanismo de ação levou ao desenvolvimento de análogos com propriedades adequadas para o desenvolvimento clínico, dentre eles o TPT, o primeiro aprovado para uso clínico (GARCIA-CARBONERO; SUPKO, 2002). O TPT (9-dimetilamino-10-hidroxicamptotecina), cuja estrutura química está representada na Figura 4, apresenta maior solubilidade em água devido ao grupo dimetilamino no carbono 9 do anel A. Este fármaco apresenta logp -0,36 e dois grupos ionizáveis, com valores de pka 8 e 9,83. Seu mecanismo de ação consiste na inibição da enzima nuclear topoisomerase-i, envolvida nos processos de transcrição e replicação do DNA (STAKER et al., 2002). Sua principal indicação é na terapia de segunda linha contra câncer de ovário e câncer de células pequenas de pulmão. Contudo o fármaco tem demonstrado atividade interessante contra outros tipos de tumores, como hematológicos: leucemia mielomonocítica crônica e síndromes mielodisplásicas, tumores pediátricos: rabdomiosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, osteosarcoma e sarcoma de tecidos moles (GARCIA-CARBONERO; 25

26 SUPKO, 2002), e melanoma (JANIK et al., 2001; YANG; CHAPMAN, 2009; YU et al., 2012). O TPT está disponível comercialmente em formas farmacêuticas para administração endovenosa de 4 mg e cápsulas para administração oral de 0,25 e 1 mg. Seu nome comercial é Hycamtin, produzido pela empresa Glaxo-Smithkline. Figura 4: Topotecano obtido a partir da campotecina pela adição de um grupo dimetilamino e uma hidroxila no anel A da campotecina Grupo dimetilamino A B C D E Fonte: Adaptado de SRIVASTAVA et al., O TPT apresenta instabilidade ph dependente. Em meio neutro a alcalino ele sofre hidrólise, ocorrendo a conversão reversível da sua forma ativa (lactona) em sua forma menos ativa (carboxilato), através da abertura do anel lactônico (anel E) (BURKE et al., 1993). A hidrólise diminui sua ligação às membranas, a difusão pela bicamada lipídica e sua afinidade pela topoisomerase I (HATEFI; AMSDEN, 2002). Quando administrado pela via endovenosa, a forma lactona sofre a conversão na forma carboxilato nos primeiros 5 a 10 minutos de infusão, resultando em apenas 30-40% da forma lactona ao final da administração (GARCIA-CARBONERO; SUPKO, 2002). Desta forma, formulações contendo o TPT devem minimizar esta conversão e proteger o fármaco ao máximo durante sua administração. A encapsulação do TPT tem sido estudada em diferentes sistemas nanométricos, com o propósito de aumentar a estabilidade do fármaco e controlar a liberação do mesmo na formulação. Os lipossomas foram os nanossitemas mais estudados para encapsulação do TPT (ABRAHAM et al., 2004; TAGGAR et al., 2006; 26

27 DADASHZADEH et al., 2008; CUI et al., 2010; DRUMMOND et al., 2010; MA et al., 2012; YANG et al., 2012; YU et al., 2012; LI et al., 2013; FUGIT; ANDERSON, 2014; FUGIT et al., 2015; LI et al., 2015). Observa-se, pelos trabalhos citados, que nos últimos anos vários estudos têm sido publicados com este fármaco em lipossomas. Os trabalhos mais atuais estudam a liberação in vivo do TPT em plasma (FUGIT et al., 2014), e o tempo e mecanismos de clearence do TPT in vivo nos lipossomas desenvolvidos (MA et al., 2012; LI et al., 2013; FUGIT et al., 2015; LI et al., 2015). O TPT também tem sido encapsulado em nanopartículas poliméricas (KHUROO et al., 2014), nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores lipídicos nanoestruturados (SOUZA et al., 2011), ciclodextrinas (NUNZIO et al., 2013), hidrogéis injetáveis (CHANG et al., 2011) e quantum dots (WANG et al., 2015) YU e colaboradores 2012 investigaram a eficácia do TPT encapsulado ou não em diferentes lipossomas visando o tratamento do melanoma mestastático in vivo. Para tanto células melanoma B16 foram injetadas na veia da calda de camundongos, e os mesmos foram tratados com: (I) TPT em solução, (II) TPT encapsulado em lipossomas e (III) TPT encapsulado em lipossomas com alvo mitocondrial. Após 27 dias de tratamento, os animais foram sacrificados e o número de colônias metastáticas na superfície do pulmão foi contado, considerando o grupo controle (não tratado) como 100%. O número de colônias encontradas em relação ao grupo controle foi de 61,58% (±4,6), 51,22% (±10,00) e 23,17% (±2,79) para as formulações TPT em solução, TPT encapsulado em lipossoma e TPT encapsulado em lipossoma direcionado, respectivamente. Tais achados comprovaram a eficiência do TPT no controle de metástase de células melanoma B16. Foi possível observar o efeito da encapsulação do fármaco na resposta ao tratamento, possivelmente devido ao aumento de estabilidade do fármaco e incremento da captação celular do fármaco encapsulado. Ainda, a liberação controlada deste fármaco a partir dos sistemas desenvolvidos pode aumentar a citotoxicidade do mesmo. Isso ocorre porque quando as células atingem a fase S e o fármaco está disponível nas proximidades das células, o efeito citotóxico acontece, sendo este efeito observado somente quando a liberação do TPT é controlada a partir dos nanossistemas. O mesmo não aconteceria se o fármaco fosse 27

28 liberado rapidamente, já que nem todas as células do tumor se encontrariam nesta fase específica do ciclo celular, onde TPT atua (PIZZOLATO; SALTZ, 2003). Sendo assim o TPT demonstra ser uma molécula promissora para o tratamento do melanoma. Entretanto, além da sua instabilidade química, o TPT após administrado, pode acarretar alguns efeitos adversos, como: mielosupressão, trombocitopenia, anemia cumulativa, neutropenia, febre e fadiga. Há também efeitos adversos gastrointestinais como mucosite e diarreia (GARCIA-CARBONERO; SUPKO, 2002). Desta forma, uma alternativa seria a sua administração por via tópica, pois o TPT exerceria o seu efeito apenas no local desejado, além de minimizar estes efeitos indesejados. Dentre os sistemas nanométricos, as nanopartículas lipídicas são bastante promissoras, especialmente para aplicação tópica. 2.3 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS No início da década de 1990 alguns pesquisadores, como os dos grupos de Müller (Berlin, Alemanha), Gasco (Turin, Itália) e Westesen (Braunschweig, Alemanha) foram os pioneiros na pesquisa das nanopartículas lipídicas (NL). Atualmente existem muitos grupos que se dedicam ao desenvolvimento de formulações farmacêuticas e cosméticas contendo estas nanopartículas, o que demonstra o interesse crescente nestes sistemas. Dentre as NL destacam-se as nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) por serem amplamente estudados (PARDEIKE et al., 2009). A incorporação de fármacos em nanopartículas tem sido evidenciada em diversos estudos, a fim de se reduzir a sua toxicidade (DANESH et al., 2015), aumentar a estabilidade e controlar a liberação de fármacos (SOUZA et al., 2011), além de aumentar a retenção e a permeação do fármaco para as camadas mais profundas da pele. (ANDRADE, L. M). As NLS e os CLN são sistemas de tamanho nanométrico compostos por uma matriz lipídica, e constituídos por substâncias bem toleradas pelo organismo. São biocompatíveis e biodegradáveis, além de possuírem potencial para fornecer liberação 28

29 controlada e estabilidade ao fármaco encapsulado (MÜLLER et al., 2002; WISSING et al., 2004). As NLS foram as primeiras partículas lipídicas a serem desenvolvidas (primeira geração). Este sistema apresenta algumas desvantagens, como limitada capacidade de carga de fármacos, rápida liberação, e instabilidade durante o armazenamento. Os CLN foram desenvolvidos para contornar estes problemas, sendo sua matriz constituída por mistura de lipídeos sólidos e líquidos ou de lipídeos com diferentes tamanhos de cadeias carbônicas. Esta combinação de lipídeos permite, na grande maioria dos casos, maior acomodação de fármaco, controle na liberação do fármaco, e maior estabilidade ao longo do tempo, e geralmente apresentam maior capacidade de carga de fármaco. Estas vantagens são observadas porque a mistura de lipídeos permite a formação de uma matriz lipídica mais desorganizada, que favorece a acomodação de mais fármaco e sua estabilidade ao longo do tempo (MEHNERT; MÄDER, 2001), conforme ilustrado na Figura 5. Figura 5: Esquema representativo das NLS e CLN. A formação de uma estrutura cristalina quase perfeita nas NLS (à esquerda-inferior), semelhante a uma parede de tijolos e argamassa, resultando em capacidade de carga limitada e possível expulsão do fármaco durante o tempo de armazenamento. À direita-inferior está representada a estrutura do CLN com uma matriz lipídica imperfeita, com possibilidade de acomodação de maior quantidade de fármaco e geralmente maior estabilidade com menor expulsão do fármaco durante o período de armazenamento. Fonte: Muller, Radtke, Wissing, Diferentes técnicas de produção podem ser utilizadas na obtenção destes sistemas, como homogeneização a alta pressão a quente, homogeneização a alta 29

30 pressão a frio, preparo de emulsão múltipla e diluição da microemulsão, sendo que a técnica de produção influencia diretamente nas características físico-químicas das partículas (LIPPACHER et al., 2001). As NL vêm sendo investigadas para aplicações em diversas vias de administração, como ocular (UGAZIO et al., 2002), parenteral (WISSING et al., 2004; BLASI et al., 2007) endovenosa, pulmonar, oral, intraperitoneal, tópica e transdérmica (MÜLLER et al., 2000). Quando administradas pela via tópica as nanopartículas lipídicas podem se fundir na superfície da pele promovendo oclusão e hidratação do estrato córneo, favorecendo a penetração do fármaco (LOMBARDI BORGIA et al., 2005). Ademais, os nanocarreadores podem favorecer o acúmulo do fármaco nos apêndices cutâneos, seguido de sua penetração até o seu sítio de ação, através de diferentes mecanismos, conforme demonstrado na Figura 6. (PROW et al., 2011) Figura 6: Prováveis maneiras de interação das nanopartículas com a pele. (a) Interação das nanopartículas com o estrato córneo, (b) acúmulo das nanopartículas nas imperfeições da pele e (c) acúmulo nos folículos pilosos. Fonte: Prow, et al., 2011 Para serem aplicados na pele os sistemas nanoestruturados precisam estar em uma forma farmacêutica adequada, que mantenha a formulação na pele, evitando que eles escorram. Em dispersão aquosa as formulações possuem baixas viscosidades, o que é desvantajoso para aplicação tópica. A incorporação dos nanocarreadores em formulações semissólidas adequadas pode facilitar a sua aplicação, aumentando o 30

31 tempo de permanência da formulação sobre a pele, além de poderem auxiliar no controle da liberação do fármaco. 2.4 OBTENÇÃO DE FORMULAÇÕES SEMISSÓLIDAS CONTENDO NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS Diferentes estratégias estão sendo propostas para aumentar a viscosidade dos sistemas nanoparticulados, através da adição de polímeros nas dispersões de nanopartículas, ou mesmo pela incorporação das dispersões em emulsões o/a para se obter a consistência semissólida desejada para a aplicação tópica (JENNING et al., 2000; LIPPACHER et al., 2004). Lipacher e colaboradores (2001) desenvolveram um processo único para obtenção das NL com consistência semissólida, sem necessidade de dispersá-las em um veículo semissólido. Como ilustrado na Figura 7 este processo se inicia com o lipídeo sendo fundido e disperso em uma solução aquosa de tensoativos à quente, cerca de 20 C acima do seu ponto de fusão, utilizando homogeneizador (ultra turrax) a 9500 rpm por 1 minuto. Ao contrário das dispersões de NL comuns, que possuem baixa quantidade de lipídeos, um conteúdo maior de lipídeos é utilizado, de 30 a 50%. A dispersão é então passada por um homogeneizador a alta pressão por 3 ciclos, a 500 bar e 85 C. Após o primeiro ciclo de homogeneização, a dispersão adquire um aspecto viscoso. A nanoemulsão final viscosa quente é resfriada a temperatura ambiente, e as gotículas de lipídeo se recristalizam formando nanopartículas sólidas, obtendo um gel com consistência semissólida. Através desse processo de produção não se observam incompatibilidades com outros componentes, a carga de NL é alta e a adição de inúmeros excipientes é evitada. Apesar do conteúdo lipídico e viscosidade maiores devido ao caráter semissólido, o tamanho coloidal ainda é preservado (LIPPACHER et al., 2001). Este processo, apesar de bastante prático, apresenta limitações, como a exigência de equipamento específico, e a alta temperatura empregada no processo de produção, que pode levar à degradação de fármacos termolábeis. Muitos estudos têm investido em processos em que se obtêm os dois sistemas separadamente, as dispersões de nanopartículas e as formulações semissólidas e, em seguida um sistema 31

32 é incorporado no outro. Dependendo do processo escolhido, pode-se consumir muito tempo de operação. Outra dificuldade encontrada é que as dispersões de NL contêm em média 10% de lipídeos e 90% de água, o que dificulta sua incorporação em cremes, sendo, portanto, mais fácil de incorporá-las em hidrogéis (JENNING et al., 2000). Figura 7: Preparo de dispersão semissólida de NL através de processo de produção em um único passo. Fonte: LIPPACHER et al., Obtenção de géis e incorporação de nanopartículas Géis são sistemas dispersos, semissólidos, em que a fase líquida está dentro de uma matriz polimérica tridimensional, que se forma devido ao intumescimento das cadeias ao entrarem em contato com a água (HENNINK; VAN NOSTRUM, 2002; HAMIDI et al., 2008). As cadeias de polímeros interagem com as moléculas do solvente e expandem-se para o estado de completa solvatação. Enquanto o material se expande a estrutura reticulada oferece a força de retração para conter as cadeias de polímeros, resultando em equilíbrio entre a força de intumescimento e a força de reticulação. A difusão de agentes terapêuticos para fora do hidrogel depende principalmente do tamanho dos poros da malha e o tamanho da molécula do fármaco (BHATTARAI et al., 2010). Os hidrogéis podem ser constituídos por polímeros naturais (gomas, ágar, pectinas, entre outros), materiais semissintéticos (metilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose e carboximetilcelulose) e polímeros sintéticos (carbômeros) 32

33 (HOFFMAN, 2002). Ainda, podem ser classificados como iônicos (catiônicos e aniônicos) ou não iônicos (DELIGKARIS et al., 2010). Devido a grande diversidade de polímeros, maior destaque será dado aos dois utilizados no presente trabalho. A hidroxietilcelulose (HEC) é um polímero semissintético, não iônico derivado da celulose (KENNEDY et al., 1995). É constituída pela celulose e cadeias laterais de hidroxietil (Figura 8). Sua produção consiste no tratamento alcalino da celulose purificada com hidróxido de sódio, formando uma celulose alcalina, que é mais reativa. Em seguida, há a reação da celulose alcalina com óxido de etileno, que confere maior solubilidade em água (MARTÍNEZ-RICHA, 2012). Figura 8: Estrutura química da hidroxietilcelulose (HEC). Uma das vantagens de se utilizar este polímero para obtenção de formulação semissólida com nanopartículas é o fato de o polímero apresentar estabilidade frente a diferentes phs, e formar um gel não iônico estável (WANG et al., 2011). Esta característica é interessante, pois evita que as partículas interajam eletrostaticamente com a rede polimérica, formando agregados durante o período de estocagem (SOUTO et al., 2004). Entretanto, diferentes estudos têm investigado a incorporação de nanopartículas em dispersões poliméricas iônicas, como no caso da utilização da quitosana. Este polímero, apesar da presença de cargas positivas, é amplamente utilizado para produção de hidrogéis e incorporação de nanopartículas. É um derivado natural da quitina, o segundo polissacarídeo mais abundante na Terra (DUTTA; DUTTA; TRIPATHI, 2004). Sua função é estrutural e está presente no exoesqueleto de artrópodes e crustáceos e nas paredes celulares de fungos e leveduras. Pode ser obtida a partir de caranguejos, camarões ou micélio fúngico (DUTTA; DUTTA; TRIPATHI, 2004; RAVI KUMAR, 2000). 33

34 A quitina (Figura 9a) é um material insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos (RAVI KUMAR, 2000), e tem ganhado interesse por ser um biomaterial funcional de alto potencial em várias áreas de pesquisa (DUTTA; DUTTA; TRIPATHI, 2004). A quitosana (Figura 9b) é derivada do tratamento alcalino da quitina, o qual leva à sua desacetilação. Quando o grau de desacetilação da quitina é maior que 50% ela passa a ser chamada de quitosana (RAVI KUMAR, 2000; DUTTA; DUTTA; TRIPATHI, 2004). A dissolução da quitosana é possível devido à protonação do grupamento amino, responsável pela natureza polieletrolítica do polissacarídeo (Figura 9c) (RAVI KUMAR, 2000). A quitosana é solúvel em soluções aquosas ácidas, como ácido acético, fórmico, entre outros. A sua habilidade em formar hidrogel tem proporcionado a sua utilização como sistema de liberação de fármacos (RAVI KUMAR, 2000). Uma propriedade bastante explorada da quitosana é a sua capacidade de bioadesão, devido às forças eletrostáticas atrativas entre os resíduos de cargas negativas das membranas celulares e grupos amino protonados da quitosana (AZEVEDO et al., 2007). A incorporação de nanopartículas em hidrogéis, tanto no gel de quitosana, quanto em géis de outros polímeros, é algo bastante viável e tem sido estudado extensivamente nos últimos anos (LEACH; SCHMIDT, 2005). Figura 09: Estrutura molecular da quitina e quitosana (a) Quitina 100% acetilada, (b) quitosana 100% desacetilada e (c) quitosana 100% desacetilada e ionizada. Fonte: Mertins,

35 Souto e colaboradores (2004) incorporaram NLS e CLN em quatro diferentes formulações: goma xantana (gel com cargas residuais negativas), carbopol 943 (gel não iônico), hidroxietilcelulose (gel não iônico) e quitosana (gel com residuais de cargas positivas) e avaliaram a estabilidade física dos sistemas por 90 dias. Para obtenção das formulações semissólidas com as partículas, as dispersões de NLS e CLN foram adicionadas nas dispersões poliméricas sob vigorosa agitação (1.000 rpm por 5 minutos), resultando em formulações com 5% de partículas lipídicas. Os estudos de estabilidade demonstraram que um alto índice de polidispersão (PdI) foi encontrado para as nanopartículas incorporadas nas formulações com quitosana (aproximadamente 0,4). Os autores acreditam que podem ter ocorrido interações entre as partículas de carga negativa e as cargas positivas das cadeias poliméricas do gel de quitosana. Outros estudos incorporaram nanopartículas lipídicas em outros géis, como de poloxamer (RAVANI et al., 2013) e carbopol (OURIQUE et al., 2011; UPRIT et al., 2013) para diferentes aplicações. Todos os trabalhos mencionados discutem a melhor forma de preparar as formulações e avaliam a estabilidade ao longo do tempo. Desta forma, ainda não existe um consenso de qual a melhor forma para obtenção destes sistemas. Uma possibilidade é a adição do agente gelificante na dispersão aquosa contendo as NL sob agitação (UPRIT et al., 2013). Outra possibilidade é a produção separada dos nanocarreadores e dos géis, e em seguida a adição de um sistema sobre o outro (SOUTO et al., 2004a). Por fim, a liofilização da dispersão de NL, seguida pela sua redispersão no gel, é uma outra alternativa para produção de formulações semissólidas com NL. Esta técnica possui como vantagem a manutenção da concentração do fármaco na formulação. Ao serem incorporadas em hidrogéis há a formação de sistemas complexos e por isso, as propriedades físicas das nanopartículas e sua estabilidade devem ser reavaliadas. O uso de agentes neutralizantes, como o hidróxido de sódio, para o preparo de géis de ácido poliacrílico, por exemplo, pode afetar no tamanho das partículas. O uso de eletrólitos, como os íons sódio, pode reduzir o potencial zeta das partículas, também levando à agregação das mesmas (FREITAS e MÜLLER, 1999). Além disso, sais solúveis, como cloreto de sódio, reduzem a consistência do gel e desestabilizam as dispersões de NL depois de sua incorporação (SILVA et al., 2007). 35

36 Em resumo, mais estudos devem ser realizados para elucidar a interação de NL com a rede polimérica, além dos diferentes métodos de preparo destas formulações. A estabilidade destas formulações ainda é um fator crítico que deve ser elucidado. Alguns estudos demonstraram aumento da estabilidade das NL após incorporação na rede polimérica (SOUTO et al., 2004) e outros, por exemplo, evidenciaram queda de viscosidade e agregação das formulações (SILVA et al., 2007). As características reológicas das formulações podem ser alteradas e, estudos têm relatado a produção de formulações mais elásticas com a incorporação de NLS ao invés de CLN (Khuranaa et al., 2013). Dentro deste contexto, a encapsulação de fármaco citotóxico, como o TPT, em nanopartículas lipídicas e sua incorporação em formulação semissólida parece ser uma estratégia interessante para favorecer a sua permeação para as camadas mais profundas da pele. Para tanto, a estabilidade e possíveis interações entre as NL e a rede polimérica devem ser estudadas, e ainda, o efeito da formulação semissólida na liberação e permeação do fármaco também deve ser elucidada. 36

37 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Desenvolver, caracterizar e avaliar a estabilidade de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo cloridrato de topotecano (CLN-TPT) incorporados em hidrogéis de hidroxietilcelulose (HEC) e quitosana (QUIT) para aplicação tópica. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Desenvolver metodologia para a extração do TPT das diferentes camadas da pele; 2. Incorporar e caracterizar CLN-TPT em hidrogéis de HEC (CLN-TPT-HEC) e QUIT (CLN-TPT-QUIT); 3. Avaliar a estabilidade das formulações obtidas; 4. Avaliar a liberação in vitro do TPT solubilizado nos hidrogéis de HEC e QUIT, e a partir de CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT; 5. Avaliar a permeação in vitro do TPT solubilizado em tampão acetato de sódio ph 4,5, solubilizado nos hidrogéis de HEC e QUIT, e a partir de CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT 37

38 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 MATERIAIS Substâncias e reagentes Acetato de sódio Synth, Brasil Acetonitrila CLAE JT Baker, EUA. Ácido Acético Merck, Alemanha. Ácido esteárico puríssimo Vetec, Brasil. Ácido Fosfórico Merck, Alemanha. Ácido Oléico Sigma Aldrich, EUA. Água ultra-pura Mili-Q Millipore, EUA. Cloridrato de Topotecano AK Scientific, EUA Fosfatidilcolina de soja Lipoid S100 (100% PC), Lipoid, Alemanha. Hidroxietilcelulose Cellosize QP 100MH DOW, EUA Metanol CLAE JT Baker, EUA. Pele de orelha de porco Frigorífico Sol Nascente, Goiânia, Brasil. Quitosana baixo peso molecular, com grau de desacetilação entre 75-85% Sigma Aldrich, EUA Taurodeoxicolato de Sódio Sigma Aldrich, EUA. Trietilamina Sigma Aldrich, EUA. Trietanolamina - Sigma Aldrich, EUA Trealose Sigma Aldrich, EUA Equipamentos e utensílios diversos Agitador de tubos Vortex VG3 IKA, Alemanha. Balança analítica Adveturer Ohaus, México. Banho de Ultrassom USC-2899A Unique, Brasil. Célula de fluxo estático tipo Franz acoplada em equipamento de coleta automatizada Hanson Research, EUA. 38

39 Centrífuga 3-18K Sigma, Inglaterra Chapa aquecedora com agitação magnética C-MAGHS7 IKA, Alemanha. Coluna ChromSep SS OmniSpher 3 C18 (100x3,0 mm) 3 μm Varian, EUA. Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE) Bomba isocrática (ProaStar 240), com amostrador automático (ProStar 410) e detector na região do ultravioleta (ProStar 310) Varian, EUA. Dispositivo de ultrafiltração Vivaspin 2 com membrana filtrante (peso molecular Da) Hydrosart - Sartorius, Alemanha. Fita adesiva (Durex Original 500) 3M, Brasil. Freezer (-80ºC) Thermo Fisher Scientific, EUA. Liofilizador Micromodulyo-115 ThermoFisher Scientific, Reino Unido. Membrana de diálise FisherBrand (peso molecular Da) de celulose regenerada Fisher Scientific, Reino Unido. phmetro PG1800 Gehaka, Brasil. Pipetadores automáticos (calibragem: µL, µL e 0,5-10mL) Brand, Alemanha. Sistema de permeação com células de fluxo estático tipo Franz com coleta manual (modelo sistema microette plus ) - Hanson Research, EUA. Termômetro de infravermelho Incoterm, Brasil. Ultracentrífuga 3-18k - Sigma Ultra-Turrax T25 Digital IKA, Alemanha. Viscosímetro Fungilab-Visco Basic Plus ZetaSizer Nano-S Malvern Instruments, Reino Unido. ZetaPlus Brookhaven Instruments Corporation, EUA. 39

40 4.2 MÉTODOS Metodologia analítica MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DO TPT EM CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA O TPT foi quantificado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado a detector UV (λ=381 nm), utilizando método previamente desenvolvido por Souza e colaboradores A quantificação foi realizada utilizando como fase estacionária coluna C18 (100 x 3 mm, 3 μm) mantida a 50 C e fase móvel composta por tampão acetato ph 5,5 contendo 2,5% de trietilamina e acetonitrila na proporção 88:12. Foram utilizados fluxo de 0,7 ml/min e volume de injeção de 10 μl VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA A metodologia analítica foi validada por Souza e colaboradores (2011) seguindo os parâmetros recomendados pela U.S. FDA/2001. Neste estudo foram avaliados apenas os parâmetros de linearidade e seletividade (dos componentes das formulações e das diferentes camadas da pele). Ainda, um método de recuperação do TPT em matriz biológica foi desenvolvido (FDA, 2001) para quantificação do TPT nos estudos de permeação cutânea LINEARIDADE A linearidade do método foi demonstrada pelas análises de curvas de calibração em triplicata, realizadas com resoluções de TPT solubilizado em metanol acidificado com 8,5% de ácido fosfórico (MeAc) com concentrações variando de 0,5 a 60 µg/ml. O desvio padrão relativo das áreas dos picos foi calculado e o coeficiente de correlação de cada ponto da curva (r²) foi determinado. 40

41 SELETIVIDADE Para os estudos de seletividade foram utilizadas peles retiradas de orelhas de suínos, que foram adquiridas imediatamente após o abate do animal, no Frigorífico Sol Nascente, localizado em Goiânia -GO (CNPJ / ), estabelecimento este devidamente regulamentado pela Vigilância Sanitária local. A pele foi retirada da parte dorsal da orelha, com auxilio de bisturi e armazenada a -80ºC por período máximo de 60 dias antes do uso. Primeiramente, as camadas da pele foram separadas pela técnica do tape stripping. Esta técnica consiste em separar o estrato córneo (EC) das demais camadas da pele (pele remanescente PR) através da aplicação sucessiva de aproximadamente 15 fitas adesivas na superfície da pele. Estas fitas, contendo o EC foram adicionadas em um tubo. Em seguida, a PR foi cortada em pequenos pedaços e adicionada em outro tubo. Ambas as camadas foram submetidas a processo de extração com MeAc, sendo que, o EC permaneceu em contato com o solvente extrator por 20 minutos e PR com solvente extrator foi homogeneizada em ultraturrax por 2 minutos (6.000 rpm) e submetida ao banho de ultrassom por 20 minutos. Finalmente, ambas as amostras foram filtradas em filtro com porosidade de 0,45 µm e analisadas por CLAE. Foram avaliados também os possíveis interferentes das formulações semissólidas na quantificação do fármaco. Para tanto as formulações semissólidas contendo CLN sem a presença de TPT foram diluídas (1:9) em MeAc e avaliadas nas mesmas condições cromatográficas utilizadas para a quantificação do TPT (item ) RECUPERAÇÃO DO FÁRMACO A PARTIR DA MATRIZ BIOLÓGICA Amostras de pele tiveram o EC separado da PR pela técnica de tape striping e ambas amostras foram transferidas para tubos de fundo cônico. As amostras foram contaminada com 500 µl da solução de TPT (500 µg/ml) diluído em tampão acetato de sódio ph 5,5 e agitadas em vórtex por 2 minutos. Posteriormente as amostras foram secas com ar nitrogênio, e passaram por processo de extração, conforme descrito 41

42 anteriormente (item ). Para a quantificação de TPT recuperado das diferentes camadas da pele utilizou-se a Equação 1. Onde: Co = concentração de TPT obtida após a sua extração das camadas da pele Ct = concentração teórica de TPT adicionado às amostras Preparo e liofilização dos CLN contendo TPT Os carreadores lipídicos nanoestruturados contendo topotecano (CLN-TPT) foram produzidos pela técnica de diluição da microemulsão descrita por Gasco e colaboradores (1993), e modificada segundo Souza e colaboradores (2011). Para tanto ácido esteárico, ácido oleico, lecitina de soja e taurodeoxicolato de sódio foram aquecidos/fundidos a temperatura de 100 C sob agitação magnética. Após todos os componentes se fundirem, a temperatura foi reduzida (70 C) e 250 µl de água ultrapurificada ph 2,0 (corrigido com ácido acético glacial) foi adicionada ao sistema para se formar a microemulsão (Figura 10 I). Em seguida o TPT foi adicionado ao sistema sob rigoroso controle de temperatura (70 C) (Figura 10 II). Finalmente a mistura foi gotejada em água ultrapurificada resfriada (2-4 C) (1:20) sob agitação no ultraturrax a rpm por 10 minutos (Figura 10 III). Ao final, a dispersão obtida continha 2% de lipídeos (ácido esteárico e oleico na proporção de 3:1), estabilizados com 1,25% de tensoativos e co-tensoativo (lecitina e taurodeoxicolato na proporção de 4:1). A concentração teórica de TPT na dispersão final é de 1,6 mg/ml. 42

43 Figura 10: Esquema ilustrativo da produção de CLN-TPT pelo método da diluição da microemulsão. Ácido Esteárico; Ácido oleico; Taurodeoxicolato Água. Topotecano I II III Fusão de ácido esteárico, ácido oleico, lecitina de soja e taurodeoxicolato de sódio, seguido da adição de água ultrapura ph 2,0 corrigido com ácido acético glacial (I). Adição do topotecano (II). Diluição da microemulsão em água gelada (III). Fonte: Souza e colaboradores Após produção dos CLN-TPT, 15% (p/v) de trealose (crioprotetor) foram dissolvidos na dispersão de nanopartículas para o processo de liofilização. As formulações foram fracionadas em frascos contendo 1 ml da dispersão, em seguida, foram congeladas a -20 C por 12 horas, seguido de liofilização em liofilizador (-115 a - 40 C), sob pressão de 2,0 Pa por um período de 24 horas em liofilizador. As características das partículas produzidas (pelo método de Souza e colaboradores (2011)) estão descritas na Tabela 1. 43

44 Tabela 1: Características físico-químicas dos carreadores lipídicos nanoestruturados contendo TPT (CLN-TPT). Características dos CLN-TPT* Antes da liofilização Após liofilização Diâmetro médio (nm)** 125,1 ± 19,3 130,7 ± 7,0 Índice de polidispersividade (PdI)** 0,214 ± 0,07 0,228 ± 0,06 Potencial Zeta (mv) - 30,2 ± 1,1-33,0 ± 4,4 REC (%, p/p) 65,5 ± 2,6 65,3 ± 4,2 EE (%, p/p) 97,5 ± 0,8 98,7 ± 0,17 CF(% P/P) 2,5 ±1,1 2,5 ± 0,17 ph 4,5 ± 0,1 4,5 ± 0,2 *Cada parâmetro foi obtido após pelo menos 3 análises de cada amostra. **Medida de tamanho realizada pela técnica de espalhamento dinâmico de luz Produção das formulações semissólidas contendo TPT encapsulado ou não encapsulado: hidrogéis de hidroxietilcelulose (HEC) e quitosana (QUIT) PREPARO DE HIDROGEL DE HIDROXIETILCELULOSE (HEC) O hidrogel de HEC 1% (p/v) foi preparado através da completa dispersão do polímero em água ultrapurificada, com auxílio de agitação magnética a 40 C. Em seguida o ph do hidrogel foi corrigido para 4,5 com ácido acético PREPARO DE HIDROGEL DE QUITOSANA (QUIT) Quitosana de baixo peso molecular 2% (p/v) foi dispersa, com auxílio de agitação magnética, em solução aquosa acidificada com ácido acético glacial 1% (v/v) (H 2 O ac). A mistura foi deixada em agitação over night para obter completa dispersão da quitosana e formação do hidrogel. Em seguida o ph do hidrogel foi ajustado para 4,5 com trietanolamina. 44

45 INCORPORAÇÃO DE TPT E CLN-TPT NOS HIDROGÉIS DE HIDROXEITILCELULOSE E QUITOSANA As formulações CLN-TPT liofilizadas foram incorporadas nos hidrogéis de hidroxietilcelulose (CLN-TPT-HEC) ou quitosana (CLN-TPT-QUIT) através da transferência de 1mL dos hidrogéis para os frascos contendo as formulações liofilizadas, mantendo a concentração teórica do TPT em 1,6 mg/ml, conforme as dispersões aquosas de CLN-TPT. Em seguida a mistura foi agitada em vórtex por 5 minutos, tempo necessário para completa redispersão do sistema. Incorporação do TPT nos hidrogéis de HEC e QUIT Para obtenção de formulações controle, o TPT foi dissolvido em hidrogéis de HEC e QUIT (TPT-HEC e TPT-QUIT). Para tanto, o TPT foi triturado com auxílio de gral e pistilo, seguido de adição gradativa dos hidrogéis de HEC ou QUIT sob homogeneização com pistilo. A concentração do TPT nestas formulações foi mantida como nas formulações CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT, a fim de se obter parâmetro de comparação nos estudos de liberação e permeação Caracterização das formulações Os CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT foram caracterizados, assim como os CLN- TPT, quanto ao diâmetro médio, índice de polidispersividade (PdI), potencial zeta, eficiência de encapsulação, capacidade de carga, recuperação do fármaco DIÂMETRO MÉDIO E ÍNDICE DE POLIDISPERSIVIDADE A princípio o diâmetro médio e o (PdI) foram determinados pela técnica de espalhamento dinâmico de luz, em equipamento ZetaSizer Nano-S. Para tanto, as amostras CLN-TPT-HEC foram diluídas (100 vezes) em água ultrapurificada, e agitadas por dois minutos em vórtex. As mostras CLN-TPT-QUIT foram diluídas (100 vezes) em água acidificada (1% ácido acético glacial) e homogeneizadas em ultrassom por três minutos. 45

46 Para garantir que o tamanho das partículas nas dispersões de hidrogel mantivesse a escala nanométrica, as dispersões foram também foram analisadas pela técnica de difração a lase. Para tanto utilizou-se o método Mie, e os valores dos índices de refração das formulações foram previamente determinados. Os diâmetros de 10%, 50% e 90% das partículas (d 10%, d 50% e d 90%) foram também determinados. A distribuição de tamanho foi calculada através do valor do SPAN, obtido pela correlação dos valores de d 10, d 50 e d 90, conforme representado pela Equação 2. Onde: d 90: Diâmetro médio de 90% das partículas. d 10: Diâmetro médio de 10% das partículas. d 50: Diâmetro médio de 50% das partículas AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ZETA O potencial zeta das partículas foi avaliado pela medida da velocidade de migração eletroforética dos nanocarreadores, em equipamento Zeta Plus. As leituras foram realizadas a partir de diluição das formulações (1:17) em água ultrapurificada (CLN-TPT-HEC) e água acidificada (1% ácido acético glacial) (CLN-TPT-QUIT), seguido de agitação em vórtex por 2 minutos RECUPERAÇÃO DE FÁRMACO (REC%) Determinou-se a quantidade de TPT ao final do processo de obtenção das formulações, a fim de se determinar as perdas que ocorreram durante o processo (porcentagem de recuperação do fármaco ao final do processo - %REC). A Equação 3 demonstra o cálculo da quantidade recuperada de TPT, através da relação entre a quantidade de fármaco recuperada ao final do preparo das formulações e do fármaco adicionado inicialmente para o preparo dos carreadores. Para tanto, uma 46

47 alíquota das formulações obtidas foi solubilizada com MeOH (1:26), seguido de agitação e quantificação do fármaco em CLAE. Equação EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DO TPT NAS FORMULAÇÕES (EE%) Nem todo o fármaco presente no sistema se encontra encapsulado nos nanocarreadores. Para o cálculo da determinação da eficiência de encapsulação (%EE) do TPT, utilizou-se a relação entre a quantidade total de fármaco encontrada ao final do processo de obtenção das formulações (conforme descrito anteriormente) e a quantidade de fármaco livre (não encapsulada nos CLN), conforme descrito na Equação 4. Equação 4 O fármaco livre foi separado do encapsulado por ultrafiltração em Vivaspin 2 (Figura 11). Para tanto µl de formulação CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT foram diluídas (1:15) em água ultrapurificada e água acidificada (1% ácido acético glacial), respectivamente, e foram adicionadas no compartimento superior do dispositivo. Em seguida, as amostras foram submetidas à centrifugação a xg por 90 minutos. O fármaco livre (que difundiu através da membrana filtrante para o compartimento inferior) foi diluído 5 vezes em metanol acidificado e analisado em CLAE. As amostras foram previamente diluídas com a finalidade de diminuir a viscosidade das formulações, garantindo a passagem de todo fármaco livre para o compartimento inferior do dispositivo. 47

48 Figura 11: Sistema de ultrafiltração Vivaspin 2 Amostra Membrana filtrante Filtrado Fonte: Adaptado do manual Vivaspin, Sartorious DETERMINAÇÃO DA CARGA DE FÁRMACO (CF%) A determinação da carga de fármaco (CF%) relaciona a quantidade de fármaco incorporada nas nanopartículas com a massa de lipídeos adicionada para obtenção das nanopartículas. Conforme representado pela Equação 5, a %CF foi calculada pela relação entre a quantidade de fármaco recuperada ao final do processo subtraído da quantidade de fármaco não encapsulado e a massa de lipídeos adicionada à formulação. Equação AVALIAÇÃO DO ph DAS FORMULAÇÕES O ph das formulações foi avaliado por simples imersão de eletrodo de phmetro digital previamente calibrado nas amostras. As análises foram realizadas em triplicata MORFOLOGIA DOS NANOCARREADORES POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA (AFM) A microscopia de força atômica (AFM) foi realizada para avaliação da morfologia dos CLN-TPT, CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT. As imagens foram obtidas em 48

49 microscópio Agilent Technologies 5500, no modo não contato, com sonda/ponta de silício padrão. Para tanto uma alíquota de amostra, diluída 1:100 para os CLN-TPT- HEC e 1:10 para os CLN-TPT-QUIT, em água destilada e água acidificada, respectivamente, foi adicionada em uma lâmina e secada a temperatura ambiente por três horas Estudo de estabilidade das formulações As formulações CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT foram avaliadas quanto a sua estabilidade em relação ao diâmetro médio, PdI, potencial zeta, ph %EE e %REC nos tempos um, sete, quinze e trinta dias. As amostras foram mantidas resfriadas (4-8 C) durante os trinta dias de armazenamento Avaliação do perfil de liberação in vitro do TPT Os estudos de liberação foram realizados em células de difusão tipo Franz, acopladas em equipamento de coleta automática (Figura 12). Figura 12: Células de fluxo estático tipo Franz acopladas em equipamento de coleta automatizada, Hanson Research. Fonte: manual Microette, Hanson Research. Uma membrana de diálise de celulose regenerada com peso molecular KDa foi colocada entre o compartimento doador (local onde a formulação é adicionada) e o receptor da célula de difusão tipo Franz (Figura 13). No compartimento doador 49

50 foram adicionados 250 µl de diferentes formulações: TPT-HEC, TPT-QUIT, CLN-TPT- HEC e CLN-TPT-QUIT. O compartimento receptor foi preenchido com tampão acetato de sódio ph 5,5 e mantido sob agitação magnética a 300 rpm e temperatura de 37 C, conforme demonstrado na Figura 13. Cada ensaio foi realizado em sextuplicata A análise do perfil de liberação teve duração de 24 horas, com coletas do compartimento receptor realizadas em 30 minutos, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas, volume de coleta de meio receptor de 0,5 ml, sendo este imediatamente reposto, e volume de rinse 1 ml. As amostras foram diluídas em MeAc e quantificadas em CLAE. Figura 13: Células de fluxo estático tipo Franz Compartimento doador Compartimento receptor Jaqueta de aquecimento Barra magnética e hélice de agitação 1 Disco de acrílico Pele de orelha suína Braço para amostragem Braço para reposição de meio receptor Fonte: Adaptado do manual Microette, Hanson Research Estudos de permeação in vitro. Os estudos de permeação in vitro foram realizados utilizando células de difusão tipo Franz, com sistema de fluxo estático e coleta manual, sendo a pele de orelha suína colocada entre os compartimentos doador e receptor. No compartimente doador foi adicionado 250 µl de formulação, o compartimento receptor foi preenchido com tampão acetato de sódio ph 5,5, mantido sob agitação magnética a 300 rpm durante todo o estudo. As células tiveram a temperatura mantida a 37 C e cada estudo de permeação teve duração de 24 horas. Cada ensaio foi realizado em sextuplicata. As 50

51 formulações testadas foram: TPT solubilizado em tampão acetato ph 4,5 (TPT), TPT- HEC, TPT-QUIT, CLN-TPT, CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT. Para quantificação do TPT nas camadas da pele, o EC foi separado da pele remanescente PR pela técnica do tape stpripping e ambas as amostras adicionadas em tubo de fundo cônico. A extração e quantificação do fármaco das camadas da pele foram realizadas segundo item Análise estatística Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. As análises estatísticas foram realizadas com o software Graphpad Prisma versão 5.01 (GraphPad Inc., USA). As diferenças estatísticas foram determinadas usando ANOVA seguida pelo teste de Tukey com comparação múltipla, com p < 0,05 utilizado como nível mínimo de significância 51

52 Intensidade (mau) 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 METODOLOGIA ANALÍTICA Quantificação do TPT por cromatografia líquida de alta eficiência O método utilizado apresentou tempo total de análise de cinco minutos, com eluição do TPT em 3,8 minutos, simetria próxima a 1 e número de pratos teóricos maior 2.000, conforme ilustrado na Figura 14. O método demonstrou conformidade com o desenvolvido por Souza e colaboradores (2011), o qual apresentou tempo de corrida de cinco minutos, com retenção do TPT em 3,45 minutos e simetria próxima de 1. Figura 14: Cromatograma da solução de TPT em MeAC, na concentração de 60 µg/ml Tempo (minutos) Topotecano Fase estacionária constituída por coluna C18 (100 x 3 mm, 3 μm) mantida a 50 C, e fase móvel composta por tampão acetato de sódio ph 5,5 contendo 2,5% de trietilamina e acetonitrila na proporção 88:12. Foram utilizados fluxo de 0,7 ml/min e volume de injeção de 10 μl. 52

53 Áreas (mau.seg) Linearidade A Figura 15 apresenta uma das curvas de calibração obtidas, a qual resultou na seguinte equação da reta: y=21,317x 5,9716. O método de quantificação do TPT demonstrou linearidade para as concentrações de 0,5 a 60 µg/ml, com desvio padrão relativo menor que 5% e r² 0,9999. Os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra. Figura 15: Curva de calibração do cloridrato de topotecano Concentração de Topotecano (μg/ml) Seletividade O EC e a PR foram submetidos aos mesmos procedimentos utilizados para os estudos de recuperação, porém sem a presença do fármaco. Os cromatogramas obtidos estão demonstrados na Figuras 16 e 17. Observa-se que não há picos interferentes (EC e PR) no mesmo tempo de eluição do fármaco, demonstrando a seletividade do método proposto. 53

54 Intensidade (mau) Intensidade (mau) Figura 16: Cromatogramas obtidos após análise do EC, em comparação com solução de TPT em MeAc. 60 EC TPT Tempo (minutos) Fase estacionária constituída por coluna C18 (100 x 3 mm, 3 μm) mantida a 50 C, e fase móvel composta por tampão acetato de sódio ph 5,5 contendo 2,5% de trietilamina e acetonitrila na proporção 88:12. Foram utilizados fluxo de 0,7 ml/min e volume de injeção de 10 μl. Figura 17: Cromatograma obtido após análise da PR, em comparação com solução de TPT em MeAc. 60 PR TPT Tempo (minutos) Fase estacionária constituída por coluna C18 (100 x 3 mm, 3 μm) mantida a 50 C, e fase móvel composta por tampão acetato de sódio ph 5,5 contendo 2,5% de trietilamina e acetonitrila na proporção 88:12. Foram utilizados fluxo de 0,7 ml/min e volume de injeção de 10 μl. 54

55 Intensidade (mau) As Figuras 18 e 19 apresentam os cromatogramas obtidos após a análise das formulações semissólidas contendo CLN dispersos nos hidrogéis de HEC e QUIT sem a presença de fármaco (CLN-HEC e CLN-QUIT). Como pode ser observado, os componentes das formulações CLN-HEC e CLN-QUIT não apresentam picos interferentes no tempo de retenção do fármaco. Estas análises demonstram a seletividade do método frente aos compostos endógenos da pele e aos componentes das formulações. Figura 18: Cromatograma obtido após análise da formulação CLN-HEC, em comparação com solução de TPT em MeAc. CLN-HEC TPT Tempo (minutos) Fase estacionária constituída por coluna C18 (100 x 3 mm, 3 μm) mantida a 50 C, e fase móvel composta por tampão acetato de sódio ph 5,5 contendo 2,5% de trietilamina e acetonitrila na proporção 88:12. Foram utilizados fluxo de 0,7 ml/min e volume de injeção de 10 μl. 55

56 Intensidade (mau) Figura 19: Cromatogramas obtidos após análise da formulação CLN-QUIT, em comparação com solução de TPT em MeAc. 60 CLN-QUIT TPT Tempo (minutos) Fase estacionária constituída por coluna C18 (100 x 3 mm, 3 μm) mantida a 50 C, e fase móvel composta por tampão acetato de sódio ph 5,5 contendo 2,5% de trietilamina e acetonitrila na proporção 88:12. Foram utilizados fluxo de 0,7 ml/min e volume de injeção de 10 μl Recuperação do TPT das camadas da pele A recuperação do fármaco das matrizes biológicas é um parâmetro de grande importância, visto que os componentes endógenos da pele como lipídeos e proteínas podem interagir com o fármaco, levando à baixa recuperação nos processos de extração. O método utilizado demonstrou boa recuperação do TPT das camadas da pele. Para o EC foi possível recuperar 92,16% (± 8,05), e para a PR 83,30% (± 1,48) do fármaco. Estes resultados demonstraram boa eficácia do método de extração para recuperar o fármaco da matriz biológica. 5.2 PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT As partículas produzidas foram caracterizadas quanto ao diâmetro médio, PdI, potencial zeta, EE% e REC%. Para os estudos de EE%, utilizou-se um dispositivo de ultrafiltração para separação do fármaco não encapsulado (livre) do fármaco encapsulado. Entretanto, antes de iniciar o estudo, o TPT foi solubilizado nos géis de hidroxietilcelulose e quitosana, na concentração presente nos CLN, foi submetida a 56

57 centrifugação nas mesmas condições dos estudos de EE%, para verificar se o fármaco não encapsulado passaria de um compartimento ao outro, nas condições estabelecidas para o ensaio. Desta forma, verificou-se também se o fármaco presente na amostra iria ficar retido na membrana do sistema de ultrafiltração. A Tabela 2 mostra os valores encontrados de TPT antes e após a ultrafiltração. Como pode ser observado não houve variações consideráveis, garantindo que o fármaco não ficou retido na membrana filtrante. Tabela 2: Concentração de TPT antes e após ultrafiltração em vivaspin 2 após centrifugação das amostras por 90 minutos a xg. Amostra Concentração de TPT antes da ultrafiltração (µg/ml) Concentração de TPT após a ultrafiltração (µg/ml) TPT em hidroxietilcelulose 61,0 ± 3,3 60,0 ± 2,0 TPT em quitosana 59,0 ± 1,2 63,0 ± 1,1 A Tabela 3 apresenta os valores de diâmetro médio e PdI, potencial zeta, EE% e REC% das formulações de CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT. Tabela 3: Diâmetro médio, PdI, potencial zeta, REC%, EE% e CF% das formulações de CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT (n=3). Caracterização das formulações CLN-TPT-HEC Formulações CLN-TPT-QUIT Diâmetro médio (nm)* 117,8 ± 17,0 183,2 ± 23,3** PdI* 0,32 ± 0,01 0,33 ± 0,02 Potencial zeta (mv) - 12,0 ± 4,0 75,9 ± 3,3 REC (%, p/p) 60,3 ± 3,4 59,5 ± 5,3 EE (%, p/p) 87,2 ± 8,2 84,9 ± 6,8 CF% 2,4 ± 0,2 2,3 ± 0,07 *O diâmetro médio e o índice de polidispersão (PdI) foram obtidos pelo método de espalhamento dinâmico de luz. **CLN-TPT-QUIT são significativamente maiores que as CLN-TPT-HEC. 57

58 Observa-se na Tabela 3, que o diâmetro médio das partículas no gel de HEC foi bastante similar as dispersões aquosas de CLN após o processo de liofilização (ver metodologia, Tabela 1), sem diferença significativa (p>0,05). Entretanto, as partículas dispersas em gel de QUIT, apresentaram-se significativamente maiores do que as dispersas em gel de HEC ou nas dispersões aquosas (p<0,05). Muito provavelmente, existe uma interação entre a rede polimérica catiônica e a partícula aniônica, podendo resultar tanto aumento de tamanho quanto alteração do potencial zeta (conforme observado na Tabela 3), pelo recobrimento da partícula com a quitosana. O efeito da quitosana no recobrimento de nanossistemas é bastante conhecido (SILVA, 2013). Estudos têm relatado o recobrimento destes sistemas através da inserção do polímero lentamente (por gotejamento) na dispersão aquosa. A porcentagem de polímero adicionado no sistema também influencia no processo de recobrimento, podendo resultar no recobrimento total, parcial ou em um sistema heterogêneo, composto por agregados de diferentes tamanhos. No trabalho de Silva e colaboradores (2012), a concentração de QUIT adicionada ao sistema não visava a mudança de viscosidade da formulação, e os CLN contendo o fármaco clobetasol encapsulado passaram de 124,56 para 257,5 nm de diâmetro após o recobrimento com quitosana. No presente trabalho a porcentagem de QUIT adicionada ao sistema foi superior ao trabalho de Silva, porém acredita-se que o efeito, neste caso, tenha sido o mesmo. É possível então, que parte do polímero adicionado na formulação encontre-se organizado ao redor da partícula, alterando tanto o potencial zeta do sistema quanto o tamanho médio obtido. Não houve diferença estatisticamente significativa do índice de polidispersividade entre as nanopartículas em formulações semissólidas e as nanopartículas em dispersão aquosa (p>0,05), entretanto é possível observar uma tendência de aumento. Enquanto nas dispersões de nanopartículas liofilizadas e reconstituídas em água o PdI foi de 0,228 (± 0,06), as CLN liofilizadas e reconstituídas nos géis apresentaram PdI de 0,32 a 0,33. Observa-se nas Figuras 20, 21 e 22 um discreto alargamento do pico de distribuição de tamanho, apesar da distribuição ser monomodal. Tendo em vista estes achados, uma investigação mais detalhada foi realizada em relação ao tamanho e distribuição de tamanho das partículas, visto que a tendência de aumento do PdI das formulações pode ser um indício da presença de 58

59 alguns agregados no sistema. A técnica de espalhamento dinâmico da luz não é capaz de detectar agregados micrométricos maiores do que 3 µm. A técnica de difração a laser foi empregada, utilizando-se a teoria de Mie. Figura 20: Diâmetro médio em função da intensidade de espalhamento de luz do CLN- TPT. Figura 21: Diâmetro médio em função da intensidade de espalhamento de luz do CLN- TPT-HEC Figura 22: Diâmetro médio em função da intensidade de espalhamento de luz do CLN- TPT-QUIT. 59

60 A Tabela 4 apresenta os valores de diâmetro médio, d 10, d 50, d 90 e SPAN das amostras analisadas por difração a laser. Tabela 4: Valores de d 10, d 50 e d 90 e distribuição de tamanho (SPAN) dos CLN- TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT pela técnica de difração a laser. Formulação Diâmetro médio* d 10 (nm) d 50 (nm) d 90 (nm) SPAN CLN-TPT-HEC 112 ± 94 57,3 90,6 185,3 1,4 CLN-TPT-QUIT 111 ± 83 55,3 86,0 167,3 1,3 Os valores de SPAN das formulações CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT foram próximos de um, confirmando assim a distribuição de tamanho monomodal das nanopartículas. Verifica-se ainda que a maioria das partículas (d 90), possui diâmetro menor que 200 nm. As formulações não apresentaram agregados micrométricos, mesmo as que continham o polímero catiônico (QUIT). Acredita-se então, que provavelmente a interação entre a rede polimérica catiônica e as partículas aniônicas ocorram na superfície das mesmas, como um recobrimento, deixando o sistema homogeneamente disperso, sem agregados micrométricos, conforme também observado por Silva e colaboradores (2012). A ocorrência de recobrimento pode ser evidenciado também pela análise do potencial zeta dos sistemas obtidos (Tabela 3). O potencial zeta do CLN-TPT-HEC permaneceu negativo, mas diminuiu consideravelmente comparado com o valor do CLN-TPT. O potencial zeta dos CLN-TPT-QUIT foi positivo devido à característica catiônica da quitosana, sendo que os grupos amino positivamente carregados são capazes de neutralizar as cargas negativas das superfícies das partículas, e mudam o valor de potencial zeta (SOUTO et al., 2004b). Desta forma, acredita-se que tanto o polímero de HEC quanto o de QUIT devam interagir com as partículas, alterando o potencial zeta e, no caso da QUIT, alterando também o tamanho médio do sistema. Os valores de potencial zeta permitem previsões sobre a estabilidade das dispersões coloidais. Quanto maior o potencial zeta, em módulo, maior a carga da 60

61 partícula, e, portanto, as partículas irão se repelir umas das outras, dificultando a agregação do sistema. Geralmente as partículas são mais estáveis quando os valores de potencial zeta são maiores (> 30 mv ). No caso de valores de potencial zeta mais próximos de zero, a força de atração excede a força de repulsão, levando à coagulação ou floculação do sistema (FREITAS E MÜLLER, 1998). Não houve diferença significativa entre os valores de REC% EE% e CF%, de TPT nas formulações semissólidas em relação às dispersões aquosas (p>0,05), conforme observado na Tabela 3. Desta forma, a quantidade de fármaco foi mantida, sem maiores interferências na obtenção das formulações semissólidas. O ph de todas as formulações foi 4,5. É muito importante manter o ph ácido da formulação para que não haja diminuição da atividade do fármaco, pela conversão da sua forma lactona em carboxilato, a qual ocorre em ph neutro a alcalino, e deve ser controlada pois é cerca de 10 vezes menos ativa (BURKE et al., 1993). 5.3 MORFOLOGIA DOS NANOCARREADORES POR MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA A Figura 23 apresenta a imagem topográfica obtida por AFM dos CLN-TPT, CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT. É possível observar a distribuição de tamanho homogênea das NL conforme também observado nos dados de diâmetro médio e distribuição de tamanho apresentados acima. Observa-se também que mesmo após a incorporação das NL na rede polimérica é possível identificar as partículas com tamanho nanométrico, totalmente dispersas na formulação, sem formação de agregados, concluindo assim, que os géis não interferem nas características das partículas. 61

62 Figura 23: Imagem topográfica obtida por AFM dos CLN contendo TPT. (A) CLN-TPT, (B) CLN-TPT-HEC e (C) CLN-TPT-QUIT 5.4 ESTUDO DE ESTABILIDADE A Tabela 5 apresenta os valores de diâmetro médio e PdI, dos CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT após estudo de estabilidade, realizado durante 30 dias. Tabela 5: Valores de diâmetro médio e PdI dos CLN-TPT-HEC e CLN-TPT-QUIT durante 30 dias. Tempo (dias) CLN-TPT-HEC CLN-TPT-QUIT Diâmetro PdI Diâmetro PdI 0 117,8 ± 17,0 0,32 ± 0,01 183,2 ± 23,3 0,33 ± 0, ,1 ± 13,6 0,30 ± 0,03 181,3 ± 12,5 0,31 ± 0, ,6 ± 15,5 0,30 ± 0,08 191,3 ± 37,7 0,36 ± 0, ,7 ± 9,2 0,32 ± 0,06 244,1 ± 11,1 0,37 ± 0,04 Não houve diferença significativa dos parâmetros avaliados (p<0,05), demonstrando que os nanocarreadores apresentaram valores de diâmetro médio e PdI estáveis durante os trinta dias de armazenamento. A Tabela 6 apresenta os valores de REC% e EE% dos CLN-TPT-HEC e CLN- TPT-QUIT após estudo de estabilidade, realizado durante 30 dias. 62