CRISTIANE APARECIDA PEREIRA

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1 CRISTIANE APARECIDA PEREIRA EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA IN VITRO EM BIOFILMES FORMADOS POR Candida albicans, Staphylococcus aureus E Streptococcus mutans 2009

2 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download.

3 CRISTIANE APARECIDA PEREIRA EFEITOS DA TERAPIA FOTODINÂMICA IN VITRO EM BIOFILMES FORMADOS POR Candida albicans, Staphylococcus aureus E Streptococcus mutans. Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Biopatologia Bucal. Orientador: Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge São José dos Campos 2009

4 Apresentação gráfica e normalização de acordo com: Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2008 P414e Pereira, Cristiane Aparecida. Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans / Cristiane Aparecida Pereira. São José dos Campos : [s.n.], f. : il. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) Faculdade de Odontologia de São Jose dos Campos,Universidade Estadual Paulista, Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge 1. Biofilme. 2. Candida albicans. 3. Staphylococcus aureus. 4. Streptococcus mutans. 5. Terapia fotodinâmica. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. III. Título Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos UNESP td17 AUTORIZAÇÃO Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte. São José dos Campos, 20 de julho de Assinatura : cricabio@gmail.com

5 BANCA EXAMINADORA Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador) Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista UNESP Prof. Dr. Aguinaldo Silva Garcez Segundo Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN Universidade de São Paulo USP Prof a Dra Luciane Dias de Oliveira Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista UNESP São José dos Campos, 20 de Julho de 2009.

6 DEDICATÓRIA À eterna guerreira, minha amada mãe Maria da Conceição Pereira. Mulher de fibra, que sozinha educou e criou os cinco filhos, nos guiando sempre pelo caminho da honestidade. Ao meu noivo, Renato Santana Correia, pela paciência, compreensão e dedicação. Minha fortaleza, meu porto-seguro, meu amor, amigo e companheiro. Aos meus queridos irmãos Simone, César, Elisiane e Elisimar. Mesmo tão diferentes vocês são parte de mim, por isso são essenciais. sobrinhos Pedro e Laura. Aos meus tesouros, razão da minha vida, meus amados Àquela que sempre foi o meu maior incentivo, minha inesquecível amiga Érica de Sá Lopes da Costa (in memorian).

7 AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao meu orientador, Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge. Toda minha admiração por sua sabedoria e profissionalismo acadêmico se torna secundária quando contemplo o seu lado humano simples, sensato e honesto, que contribui para construir um mundo bem mais bonito. Orientar é ajudar a trilhar um caminho até então desconhecido, e sob sua orientação eu dei os primeiros passos para este novo mundo. Muito obrigada pela confiança, amizade e conhecimentos transmitidos.

8 AGRADECIMENTOS este sonho. À Deus, por ter me dado o privilégio de concretizar mais À Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, na pessoa do diretor Prof. Dr. José Roberto Rodrigues e do vicediretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, na coordenação da Prof.ª Dra. Cristiane Yumi Koga Ito e Prof.ª Adj. Rosilene Fernandes da Rocha. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa de estudo concedida. Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria Aparecida Consíglio de Souza, por serem sempre solícitas. Biopatologia Bucal. Aos docentes do Programa de Pós-graduação em À querida Prof.ª Dra. Juliana Campos Junqueira, pessoa sábia, que além de compartilhar todo conhecimento adquirido, sempre foi paciente e atenciosa, e tornou-se uma grande amiga.

9 À Prof.ª Dra. Luciane Dias de Oliveira, a primeira pessoa que me acolheu no laboratório, com toda calma e carinho. À Prof.ª Sônia Khouri, quem me abriu as portas deste fascinante mundo da Microbiologia. À Prof.ª Dra Adriana Aigotti Haberbeck Brandão, e toda a sua família, em especial ao Henrique Haberbeck Brandão, pelo incentivo e amizade. À querida Sílvia Scarpel, por toda atenção sempre. Às minhas adoradas amigas que sempre torceram por mim e entenderam a minha ausência em muitos momentos: Flávia Villas Boas Simões Lopes, Flávia Morciani, Aline Carvalho Fava Gomes, Isabel Chaves Silva Carvalho, Hérica Braga Carneiro, Suzana Costa, Rafaela Costa, Tábata Bagatim e Bruna Renata Sperandim. À minha companheira e grande amiga, a aluna de PROAC Anna Carolina Borges Pereira da Costa. Obrigada seria pouco para agradecer o quanto você sempre me ajudou e incentivou. À minha equipe, que sempre me ajudou nos experimentos e nos demais trabalhos do laboratório, e que se tornaram grandes amigas, as alunas de Iniciação Científica: Fernanda Freire, Jéssica Mina Zambrana, Sarah Almeida Coelho Oliveira e Fernanda Silva Aos meus companheiros do curso de mestrado e do laboratório de Microbiologia/Imunologia: Joyce da Silva Martins, Bruno Mello de Matos e Polyana das Graças Figueiredo Vilela. Eu nunca poderia ter escolhido pessoas tão maravilhosas para trilhar comigo mais este

10 caminho. Vocês tornaram esta fase muito mais especial, muito obrigada pela amizade e o carinho. Às alunas de PROAC, Ana Karina Machado e Vanessa Maria de Campos Rasteiro, que chegaram recentemente, mas já enriqueceram a nossa equipe. amizade. À querida Claudia Carreira, por toda sua simpatia e toda ajuda e companheirismo. Ao aluno de doutorado Rogério de Lima Romeiro, por Aos alunos de Iniciação Científica, Rodney Rossoni e Evelyn Santos, pela determinação e amizade. Às alunas do curso de doutorado Graziella Nuremberg Back Brito, Marta Majewski e Rosilene Batista de Aguiar Almeida. Às alunas de mestrado Mary Anne Moreira Bárbara, Nívea Cristina Sena Costa, Ana Paula Lima e Simone Vilela, muito obrigada pelo companheirismo sempre. Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Dias Colombo, por ter participado do meu exame geral de qualificação, contribuindo com sugestões que foram essenciais para o desenvolvimento desta dissertação. Aos funcionários do laboratório: Sérgio, Domingos e Ana Paula, muito obrigada pela colaboração e paciência.

11 Âb wxzütâ wx âåt xávtwt ÇûÉ áxüäx á ÅÑÄxáÅxÇàx ÑtÜt Öâx täzâ Å ÑxÜÅtÇx t xå v Åt wxäx? wxáà Çt@áx áx t áâáàxçàtü É Ñ wx âå {ÉÅxÅ ÑxÄÉ àxåñé áây v xçàx ÑtÜt Öâx xäx véäéöâx É ÉâàÜÉ âå ÑÉâvÉ Åt á täàéaê g{éåtá [âåäxç

12 SUMÁRIO RESUMO LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Biofilme dentário Colonização por Streptococcus mutans Colonização por Candida albicans Colonização por Staphylococcus aureus Terapia fotodinâmica Fotossensibilizador Laser Terapia fotodinâmica antimicrobiana PROPOSIÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS Corpos-de-prova Microrganismos e preparo de suspensões padronizadas Grupos e condições experimentais Formação dos biofilmes Lavagem dos corpos-de-prova Terapia fotodinâmica em biofilmes Microscopia eletrônica de varredura RESULTADOS DISCUSSÃO... 59

13 7 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS APÊNDICE A ANEXO A ABSTRACT... 91

14 PEREIRA CA. Efeitos da terapia fotodinâmica in vitro em biofilmes formados por Candida albicans, Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans [dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; RESUMO O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por C. albicans (GI), S. aureus (GII) e S. mutans (GIII), isolados e em associações (GIV-VII). Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada para remover as células não-aderidas. Foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/ml por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultrasônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log 10 foram analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser. As reduções (log 10 ) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22% para C. albicans (GI), 55.91% para S. aureus (GII) e 47.35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log 10 ) foram: 35.08% para C. albicans e 43.9% para S. aureus (GIV); 31.54% para C. albicans e 38.7% para S. mutans (GV); 40.12% para S. aureus e 37.14% para S. mutans (GVI); 19.56% para C. albicans, 28.41% para S. aureus e 24.94% para S. mutans (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes. Conclui-se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais. PALAVRAS-CHAVES: Biofilme. Candida albicans. Staphylococcus aureus. Streptococcus mutans. Terapia fotodinâmica.

15 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS %= por cento µg/ml= microgramas por mililitro µl= microlitro µm= micrômetro AM= azul de metileno AsGaAl= arseneto gálio alumínio AT= azul de toluidina BHI= Brain heart infusion (infusão cérebro coração) células/ml= células por mililitro cm 2 =centímetro quadrado CO 2 = gás carbônico F= fotossensibilizador FDA= ftalocianina dissulfonada de alumínio h= hora He-Ne= Hélio-Neônio HILT= Hight Intensity Laser Treatment J/cm 2 = Joule por centímetro quadrado J= Joule kgy= KiloGray L= laser L= litro Laser= Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LED= Light Emitting Diode LILT= Low Intensity Level Treatment Log= logarítmo MEV= microscopia eletrônica de varredura

16 mg/l= miligrama por litro mg/ml= miligrama por mililitro min= minuto ml= mililitro mm= milímetro MSBS= Mitis salivarius bacitracina sacarose mw/cm 2 = miliwatts por centímetro quadrado mw= miliwatts NaCl= cloreto de sódio NADH= nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida nm= nanômetro ºC= grau Celsius p/v= peso por volume s= segundo TFD= Terapia fotodinâmica UFC/mL= unidade formadora de colônia por mililitro UI/mL= unidade internacional por mililitro W= watt

17 1 INTRODUÇÃO A cavidade bucal apresenta diversos nichos ecológicos que são colonizados por microrganismos, permitindo a sobrevivência de uma diversidade de bactérias, vírus e fungos (Socransky et al., 1998). Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de microrganismos já foram detectadas na cavidade bucal de seres humanos, e grande parte dessas espécies encontram-se organizadas na forma de biofilme (Wilson, 2004). O biofilme dentário é formado por uma comunidade diversificada de microrganismos que se acumula em tecidos duros (dentes) como um filme, embebidos em uma matriz extracelular de polímeros do hospedeiro e de origem microbiana (Marsh, 2004). A colonização da cavidade bucal é influenciada diretamente pela película adquirida (Marsh, 2004); uma camada acelular constituída de proteínas, glicoproteínas e lipídios (Marcotte; Lavoie, 1998). A película adquirida é formada pela saliva imediatamente após a profilaxia dos dentes, e pode favorecer a adsorção de microrganismos à superfície dentária (Marsh, 2004). Se as condições forem favoráveis, os colonizadores primários, primeiros microrganismos a aderirem à película adquirida, podem multiplicar-se no substrato e formar micro-colônias (Rickard et al., 2003). A seguir, ocorre o aumento da diversidade microbiana até atingir uma comunidade clímax em duas ou três semanas (Nyvad; Fejerskov, 1995). Os estreptococos do grupo mutans, principalmente as espécies Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus são os principais agentes etiológicos do desenvolvimento da cárie de superfície lisa dos dentes. O acúmulo de estreptococos na superfície dentária é

18 15 considerado um fator crítico no desenvolvimento do biofilme cariogênico, devido à produção de ácidos que proporcionam diminuição do ph do biofilme, aumentando a possibilidade de desmineralização dos tecidos dentários (O Toole et al., 2000). As leveduras mais freqüentes na cavidade bucal são do gênero Candida, sendo a espécie Candida albicans considerada um dos fungos patogênicos normalmente encontrados neste local (O Sullivan et al., 2000). As leveduras também podem ser isoladas do biofilme dentário (Sen et al., 1997) e coagregam-se a espécies bacterianas presentes ou aderidas diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980; Nikawa et al., 1998). Outro microrganismo patogênico oportunista que pode ser isolado da cavidade bucal é Staphylococcus aureus. Esta bactéria pode atuar como microbiota suplementar, sendo freqüentemente encontrada em abscessos periapicais e estomatites protéticas (Martins et al., 2002). Staphylococcus aureus possui um plasmídio que codifica para ß- lactamase e proporciona o desenvolvimento de resistência a antibióticos, principalmente à penicilina (Machado, 2000). Além disso, tem a capacidade de produzir enzimas extracelulares, tornando-se uma bactéria muito agressiva (Sader et al., 1993). Os antimicrobianos auxiliam a remoção química do biofilme, porém o uso prolongado de tais agentes pode levar à seleção de espécies resistentes (Moran et al., 1992). A estrutura do biofilme e as características das células que o constituem conferem resistência aos agentes antimicrobianos e às defesas naturais do organismo (Dunne, 2003). Desta forma, vê-se a necessidade de se desenvolver tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana, capazes de interferir no desenvolvimento do biofilme. Neste contexto, a terapia fotodinâmica (TFD) surge como uma alternativa de tratamento.

19 16 O processo de TFD consiste na irradiação de uma luz de comprimento de onda apropriado que ativa uma substância fotossensibilizadora, causando a morte celular por meio da produção de espécies reativas de oxigênio (Machado, 2000). Em vista do decréscimo da susceptibilidade de microrganismos aos métodos convencionais de tratamentos, a avaliação do efeito antimicrobiano da TFD em biofilmes formados in vitro por Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e suas associações, sobre resina acrílica, torna-se de interesse científico.

20 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Biofilme dentário A cavidade bucal dos seres humanos apresenta microbiota complexa, que reflete a diversidade dos habitats e dos ecossistemas ali localizados (Thylstrup; Fejerskov, 1995). Diferentes locais na cavidade bucal são colonizados por populações distintas de microrganismos. Todas as superfícies expostas da boca (dentes, tecidos periodontais e língua) apresentam microrganismos residentes (Wen; Brune, 2002). Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de microrganismo já foram detectadas na cavidade bucal dos seres humanos e grande parte delas encontra-se organizada na forma de biofilmes (Wilson, 2004). Biofilme pode ser definido como uma comunidade estruturada de micro-colônias de células microbianas envolvidas em uma matriz extracelular de polissacarídeos, aderida a um substrato sólido úmido ou meio líquido do qual elas podem retirar seus nutrientes (Costerton et al.,1999; Portera, 1999; Wimpenny et al., 2000). A colonização microbiana não é um processo passivo e requer aderência do microrganismo à superfícies dentárias (Nyvad; Fejerskov, 1995). A adesão inicial ocorre por meio da película adquirida (Marsh, 1992), uma camada acelular que se deposita no esmalte superficial dos dentes, tendo como principais constituintes substâncias originárias da saliva e do fluido gengival, como proteínas, glicoproteínas e lipídios, além de componentes bacterianos, como as glicosiltransferases (Marcotte; Lavoie, 1998). Por este processo de especificidade, os

21 18 microrganismos com pouca ou nenhuma afinidade à película são eliminados pelo fluxo salivar. Assim as interações microrganismo/película são de suma importância nos estágios iniciais de formação do biofilme dentário (Gibbons et al., 1990). A película adquirida começa a ser formada poucas horas após a limpeza profissional (Bowden; Edwardsson, 1995), e atua como substrato para a primeira população de microrganismos, conhecida como colonizadores primários. Após a colonização inicial, os microrganismos primários crescem rapidamente formando micro-colônias que ficam embebidas em uma matriz extracelular (Thylstrup; Fejerskov, 1995). Quando ocorrem mudanças nas condições ambientais no interior do biofilme em formação e o substrato existente apresenta-se coberto por bactérias responsáveis pela colonização primária, microrganismos distintos tornam-se capazes de se unirem aos primários, e a partir deste momento o biofilme começa a se desenvolver com múltiplas espécies (Rickard et al., 2003), até atingir uma comunidade clímax em duas ou três semanas (Nyvad; Fejerskov, 1995). A formação de biofilme tem sido considerada uma importante estratégia microbiana para a sobrevivência e proliferação no ambiente bucal. A complexa estrutura do biofilme permite a organização das populações de microrganismos de modo a oferecer proteção contra os mecanismos de remoção pela saliva e dificultar a ação de agentes antimicrobianos (Kirkpatrick et al., 2000). Por estar intimamente relacionada à formação de biofilmes, a prevenção da doença cárie baseia-se principalmente na remoção mecânica desses biofilmes (Marsh; Martin, 1992). No entanto, muitos indivíduos são incapazes ou desmotivados para realizar esse procedimento com a regularidade e eficiência necessárias. Outro aspecto importante foi o aumento nas últimas décadas do uso de agentes antisépticos, o que resultou na seleção de espécies resistentes (Wilson et al., 1996).

22 19 Os microrganismos organizados em biofilmes apresentam características de resistência, principalmente devido a penetração insuficiente de antimicrobianos, velocidade de crescimento e alteração do estágio metabólico que garante a sobrevivência de tais células em ambientes hostis (Stewart; Costerton, 2001). Adicionalmente, os biofilmes apresentam característica de desenvolvimento e traços fenotípicos únicos, quando comparados com as mesmas células crescidas em culturas planctônicas, que os tornam 10 a 1000 vezes mais resistentes a agentes antimicrobianos e fatores imunes do hospedeiro (Davey; O Toole, 2000; Zanin et al., 2006). Frente às limitações dos métodos mecânicos de remoção, e do decréscimo da susceptibilidade de microrganismos em biofilmes aos antimicrobianos convencionais, a avaliação da eficácia de novas alternativas como a TFD, torna-se de interesse científico Colonização por Streptococcus mutans Estreptococos são as bactérias predominantes no biofilme dentário (Jenkinson; Lamont, 1997), sendo Streptococcus mutans considerado o principal agente etiológico no desenvolvimento da cárie de superfície lisa (Shen et al., 2004). Para aderir à superfície dos dentes no biofilme, S. mutans produz enzimas extracelulares, como as glicosiltransferases que atuam na formação dos polissacarídeos extracelulares da sacarose. Os glucanos promovem o acúmulo dos estreptococos (e outros microrganismos bucais) na superfície do dente, sendo um fator crítico para a formação e estrutura integral do biofilme, com o acúmulo de ácidos que levam a diminuição do ph e desmineralização do esmalte dos dentes (Ooshima et al., 2000; Duarte et al., 2006).

23 20 O potencial cariogênico de S. mutans é principalmente dependente das suas propriedades acidogênicas e da habilidade de se acumular nos dentes, principalmente devido à síntese de glucanos extracelulares a partir da sacarose (Gibbons, 1984). A produção de ácidos e a capacidade de metabolização de substratos em meio ácido, foram os primeiros fatores de virulência atribuídos a microrganismos específicos relacionados à etiologia da cárie (Köhler et al., 1995). Além da tolerância aos ácidos e sua produção, S. mutans ainda possuem como mecanismos de virulência, a capacidade de sobrevivência no biofilme dentário devido à alta capacidade de adaptação ao ambiente, presença de adesinas na superfície celular, produção de glicosiltransferases, mutacinas e polissacarídeos extracelulares (Harrington; Russel, 1994; Jackson et al., 1999) Colonização por Candida albicans As leveduras mais comuns na cavidade bucal são as do gênero Candida, sendo Candida albicans considerado um dos fungos patogênicos normalmente encontrados neste local (O Sullivan et al., 2000). C. albicans são encontradas principalmente no dorso da língua, onde as papilas filiformes e reentrâncias, como o forame cego e fissura mediana, servem de sítios que fornecem proteção e favorecem o desenvolvimento de infecções (Arendorf; Walker, 1980). A mudança entre a forma de leveduras para hifas desempenha papel importante no desenvolvimento do biofilme. Observações realizadas em microscopia demonstraram que as primeiras camadas do biofilme são formadas pela forma de levedura e em seguida, nas camadas de hifas, envolvidas por uma extensiva matriz de

24 21 exopolissacarídeo (Lamfon et al., 2003; El-Azizi et al., 2004; Jãrvensivu et al., 2004). Durante a maturação do biofilme, as leveduras desenvolvem novas propriedades fisiológicas diferentes dos seus similares planctônicos, o que torna C. albicans resistente a vários componentes antifúngicos que são rotineiramente utilizados no ambiente clínico. Dados da literatura relatam que já existem biofilmes formados por C. albicans resistentes a uma variedade de antifúngicos, incluindo anfotericina B e fluconazol (Chandra et al., 2001). Os mecanismos responsáveis pela resistência a antifúngicos podem estar relacionados com limitações difusionais à passagem do agente pela matriz extracelular, com as alterações fenotípicas das células no biofilme e ainda com o desenvolvimento de mecanismos de resistência por alteração do genótipo das células (Dunne, 2003). As diferentes formas de candidose bucal, superficial ou sistêmica, são freqüentemente associadas a biofilmes formados por C. albicans (Ramage et al., 2005). Porém, existem relatos de isolamento dessas leveduras em biofilmes dentários (Sen et al., 1997; Nikawa et al., 1998) coagregadas a espécies bacterianas presentes ou aderidas diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980; Nikawa et al., 1998), o que demonstra que os mesmos podem estar correlacionados no desenvolvimento de cáries e na patogênese de doenças periodontais (Hannula et al., 2001; Jãrvensivu et al., 2004) Colonização por Staphylococcus aureus A espécie Staphylococcus aureus é uma bactéria reconhecida como um dos principais patógenos responsáveis por ampla

25 22 incidência de infecções, desde moderadas infecções de pele até bacteriemias e septicemias graves (Hardy et al., 2004; Kim et al., 2004). A presença de S. aureus como residente da microbiota bucal ainda é controversa. Porém, estudos relatam a presença da bactéria S. aureus na cavidade bucal, sendo neste caso consideradas pertencentes à microbiota transitória. Dados da literatura revelaram que 94 a 100% dos adultos saudáveis apresentam Staphylococcus spp. na cavidade bucal, e que o predomínio de S. aureus é de 24 a 36% (Jackson et al., 1999; Kim et al., 1995). As infecções bucais causadas por S. aureus incluem: infecções endodônticas, osteomielites da mandíbula, infecção da glândula parótida e, uma forma de mucosite oral em idosos, principalmente em pacientes recebendo nutrição parenteral (Smith et al., 2001). O uso de antibióticos para o tratamento de doença periodontal ou outras infecções pode predispor o aumento do número de Staphylococcus spp. na cavidade bucal, pois estes adquirem facilmente resistência aos antibióticos podendo resultar em superinfecção. S. aureus foi o primeiro microrganismo no qual foi verificado o desenvolvimento de resistência a antibióticos, através do plasmídio ß-lactamase, que proporcionou resistência à penicilina (Loberto et al., 2004). Os biofilmes formados por S. aureus são comunidades embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares, composta principalmente de polissacarídeos de adesão intercelular (Chokr et al., 2005), que diminuem a penetração de agentes antimicrobianos, representando uma significante barreira terapêutica para muitos antibióticos.

26 Terapia fotodinâmica (TFD) A primeira demonstração dos efeitos da TFD sobre microrganismos foi realizada por Raab em 1900, que durante um estudo sobre os efeitos da acridina em Paramecium caudatum descobriu que a associação deste corante com a luz era letal para este protozoário causador da malária. Em 1907, Von Tappeiner e Jodlbauer demonstraram a necessidade da presença de oxigênio nas reações de fotossensibilização e introduziram o termo Ação Fotodinâmica para descrever este fenômeno (Ackroyd et al., 2001). O processo de TFD pode ocorrer por dois mecanismos. No mecanismo do tipo I ocorrer a transferência de elétron entre o fotossensibilizador no estado triplete excitado e componentes do sistema, gerando íons-radicais que tendem a reagir com o oxigênio no estado fundamental, resultando em produtos oxidados. Já no mecanismo do tipo II ocorre a transferência de energia do fotossensibilizador no estado triplete, com a geração de oxigênio singleto, um agente altamente citotóxico (Machado, 2000) Fotossensibilizador Para produzir o efeito fotodinâmico, o fotossensibilizador precisa ser biologicamente estável, fotoquimicamente eficiente e minimamente tóxico aos tecidos normais (Garcez et al., 2003). Quanto menos tóxicos forem os corantes e com bandas de absorção próximas ao comprimento de onda das luzes utilizadas, a eficácia da TFD é elevada, sem causar danos aos tecidos adjacentes (Bhatti et al., 1997).

27 24 Como a maioria das espécies bacterianas não apresenta componentes fotossensíveis ao comprimento de onda utilizado, é importante a utilização de um fotossensibilizador que absorva para si esta luz e inicie a formação de radicais livres (Wilson et al., 1992). Assim, células desprovidas de componentes fotossensíveis endógenos podem tornar-se sensíveis a luz, quando coradas com fotossensibilizadores ou agentes cromóforos exógenos, como o azul de metileno (AM), azul de toluidina (AT), eosina e hematoporfirinas (Wilson, 1993). O AM é um corante catiônico da classe das fenotiazinas. É solúvel tanto em água como em álcool, e tem sido utilizado como corante indicador bacteriológico. Seu estudo tem despertado interesse por apresentar propriedade eletrocatalítica em relação ao NADH, uma coenzima da classe das desidrogenases, que tem participação em várias reações enzimáticas (Shiavo et al., 2000). O AM possui alta absorção de luz, com picos de bandas em 660 nm, é efetivo na TFD, demonstrando habilidade em gerar espécies reativas de oxigênio sendo constantemente utilizado em aplicações clínicas contra diversas doenças (Tardivo et al., 2005) Laser A palavra laser é o acrônimo de Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, ou seja, amplificação da luz por emissão estimulada de radiação. É uma luz monocromática que produz linhas espectrais estreitas, altamente direcional, coerente, podendo ser focalizada em região muito pequena com grande precisão, concentrando alta quantidade da energia luminosa (Halliday et al., 2003). Os lasers são classificados em duas famílias conforme sua potência e a capacidade de interação com os tecidos: laser de baixa intensidade de energia (LILT -

28 25 Low Intensity Level Treatment); também chamados de terapêuticos e lasers de alta intensidade de energia (HILT - Hight Intensity Laser Treatment) conhecidos como cirúrgicos (Neves et al., 2005). Os lasers de alta intensidade interagem com os tecidos por reações fototérmicas, nas quais a energia da luz absorvida pelos tecidos é transformada em calor. Os de baixa potência são baseados em efeitos onde a radiação absorvida desencadeará reações fotoquímicas ou fotofísicas intracelulares ou teciduais, não ocorrendo aumento de temperatura. O comprimento de onda dos lasers pode cobrir do infravermelho ao ultravioleta, cada tipo emite um determinado comprimento de onda (Mello et al.,2004; Rosa et al, 2005). Os lasers de baixa intensidade também denominados laser mole, laser frio, laser terapêutico ou soft-laser, emitem radiação de baixa potência, sem potencial destrutivo e possuem uma ação fotoquímica de analgesia, anti-inflamatória e de bioestimulação tecidual, caracterizados por um comprimento de onda no espectro eletromagnético geralmente do ultravioleta ao infravermelho, variando de 630 a 940 nm (Kurachi et al., 2002). Os lasers de baixa potência mais utilizados na TFD são aqueles com emissão na região vermelha do espectro eletromagnético, como os lasers de Hélio Neônio (He-Ne) e diodo Arseneto Gálio Alumínio (AsGaAl). Os lasers de He-Ne estão sendo substituídos pelos lasers de diodo, que apresentam maior potência, são mais robustos, não necessitam de espelhos e possuem menor custo (Garcez et al., 2003) Terapia fotodinâmica antimicrobiana Os primeiros trabalhos utilizando a TFD em bactérias orais in vitro foram realizados por Wilson et al. (1992) que demonstraram

29 26 a eficácia de diferentes associados ao laser He-Ne, com 7,3 mw de potência, na redução de Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum e Actinobacillus actinomycetemcomitans. Os autores observaram que os fotossensibilizadores AT, AM foram eficazes, pois possibilitaram a eliminação das quatro espécies, após a exposição a luz laser por apenas 30 s. Dobson e Wilson (1992) observaram destruição de biofilmes formados in vitro por Streptococcus sanguis, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum e Actinobacillus actinomycetemcomitans, sensibilizados por AT e AM seguido da irradiação pelo laser de baixa potência He-Ne, com 632,8 nm de comprimento de onda e potência de 7,3 mw. Estes achados sugerem que a fotossensibilização letal pode ser um meio eficaz de eliminar as bactérias periodontopatogênicas do biofilme dental. Sarkar e Wilson (1993) testaram amostras de biofilme dentário subgengival de pacientes com periodontite crônica utilizando o laser com 7,3 mw de potência e AT como fotossensibilizador, o que reduziu significativamente a viabilidade de bactérias aeróbias e anaeróbias, sendo esta redução de 94,2% para os estreptococos. Em 1994, Burns et al. aplicaram laser AsGaAl e o fotossensibilizador ftalocianina dissulfonada de alumínio (FDA) em algumas espécies de bactérias cariogênicas tal como Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei e Actinomyces viscosus. Os autores relataram que o fotossensibilizador isoladamente não demonstrou efeito satisfatório na viabilidade dos microrganismos tratados. Porém, quando o fotossensibilizador foi associado a irradiação laser foi observada uma redução das bactérias de lesões cariogênicas. Em estudo realizado para avaliar o potencial bactericida da TFD na remoção de biofilmes dentários, Wilson (1994) utilizou os lasers de baixa potência de He-Ne e AsGaAl, conjugados respectivamente com os fotossensibilizadores AT e FDA por 60 s. O autor

30 27 confirmou como efetivo o uso da TFD na eliminação de bactérias cariogênicas e periodontopatogênicas. Wilson e Pratten (1995) estudaram o efeito da TFD sobre cepas de Staphylococcus aureus resistente a meticilina, utilizando um laser de AsGaAl, de 660 nm de comprimento de onda e 11 mw de potência, em conjunto com uma FDA por 60 s e 300 s. Os resultados demonstraram uma redução de 99,6% (60 s) e 99,9% (300 s). Wood et al. (1999) analisaram, in vitro, o uso da TFD na eliminação de bactérias em biofilmes formados in vivo, utilizando ftalocianina catiônica e luz branca de uma lâmpada de filamento de tungstênio de 600/700 nm de comprimento de onda. Os autores observaram redução considerável das bactérias do biofilme. Além disso, os biofilmes tratados apresentaram-se mais delgados e com estruturas diferentes daquelas dos biofilmes controles. Usacheva et al. (2001) avaliaram a eficácia bactericida dos fotossensibilizadores AM e AT sobre diferentes bactérias, na presença e na ausência dos lasers de argônio e diodo, com 630 e 664 nm de comprimento de onda, respectivamente. Foram testados os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Haemophylus influenzae, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. O aumento da densidade de energia e potência dos lasers, mantendo a concentração constante de fotossensibilizador, resultou em uma eliminação maior das bactérias. Zeina et al. (2001) avaliaram a redução microbiana através da TFD in vitro, utilizando uma combinação de AM e luz visível e algumas espécies microbianas representativas daquelas encontradas na pele saudável e doente como: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Corynebacterium minutissimum, Propionibacterium acnes e Candida albicans. Todas as espécies testadas foram susceptíveis à TFD, porém a redução de Candida albicans foi menor do que as bactérias. Os autores concluíram que a TFD na pele

31 28 pode representar uma alternativa ao tratamento antimicrobiano convencional. Com laser de He-Ne, de 632,8 nm de comprimento de onda e 35 mw de potência, e o fotossensibilizador AT, Komerik e Wilson (2002) conseguiram redução microbiana das seguintes bactérias Gramnegativas: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebisiella pneumoniae. Zanin et al. (2002) observaram que quando um pool de saliva humana era sensibilizado por AT e irradiado pelo laser AsGaAl com 660 nm de comprimento de onda, ocorria um efeito bactericida total sobre estreptococos do grupo mutans, e efeito bactericida parcial sobre estreptococos totais. A relevância desse estudo está na eliminação das espécies mais patogênicas com a preservação de parte da microbiota residente, já que a atividade antimicrobiana sobre todos os microrganismos da cavidade bucal não é recomendada por tornar o hospedeiro mais susceptível ao aparecimento de infecções oportunistas. O Neill et al. (2002) obtiveram redução de 97,4% dos microrganismos de biofilmes bucais multi-espécies após a aplicação de AT e irradiação com laser de He-Ne com 632 nm de comprimento de onda e 35 mw de potência. Williams et al. (2003) estudaram a ação antibacteriana do fotossensibilizador AT e do laser de He-Ne, com 632,8 nm de comprimento de onda, sobre uma matriz de colágeno e dentina cariada, ambos infectados por Streptococcus mutans. No colágeno a terapia foi testada por 30 s e 180 s, já na dentina os tempos utilizados foram de 30 s e 60 s. Os resultados foram mais eficazes quando utilizado o período de tempo maior (180 s no colágeno e 60 s na dentina). Lee et al. (2006) demonstraram a ação do laser diodo na redução de biofilmes de S. mutans formados em dentina humana com espessuras variadas (500, 1000 e 2000 µm). Os resultados demonstraram

32 29 eliminação de 97,7% das bactérias em dentinas com 500 µm de espessura. Com o aumento da espessura, a redução bacteriana diminuiu. Soukos et al. (2006) analisaram os efeitos da TFD em patógenos endodônticos, como Enterococcus faecalis. Os microrganismos foram sensibilizados com azul de metileno e expostos a irradiação de luz vermelha por 5 min com 665 nm e densidade de energia de 35 J/cm 2. Os autores concluíram que a TFD pode ser um procedimento complementar para eliminar microrganismos residuais no canal radicular após tratamento endodôntico convencional. Wood et al. (2006) compararam a eficácia do corante eritrosina, azul de metileno e photofrin em biofilme formado por Streptococcus mutans. Os corantes foram utilizados e irradiados por 15 min com 400 W de energia. A eritrosina foi mais efetiva do que o photofrin, que por sua vez foi mais efetivo que o azul de metileno. Os autores concluíram que a PDT utilizando a eritrosina como fotossensibilizador é um tratamento eficaz para prevenir a formação do biofilme dentário. Garcez et al. (2007) avaliaram o efeito de dois fotossensibilizadores associados a laser diodo (660 nm) na eliminação de bactérias em biofilmes crescidos por 3 dias em canais radiculares. A TFD promoveu uma redução microbiana de 95%, o que, segundo os autores, pode desempenhar um importante papel na terapia endodôntica. Fimple et al. (2008) encontraram 80% de redução de biofilmes multi-espécies do canal radicular, com a aplicação de AM e irradiação de laser diodo (665 nm), e concluíram que a TFD pode ser um complemento eficaz ao tratamento endodôntico convencional. Recentemente, Fontana et al. (2009) compararam o efeito antimicrobiano do AM e luz vermelha tanto em culturas planctônicas como em biofilmes multi-espécies formados por bactérias isoladas da cavidade bucal. Os autores alcançaram 64% e 32% de redução para culturas planctônicas e biofilmes, respectivamente. Os autores concluíram que os

33 30 biofilmes formados por bactérias orais são menos afetados pela TFD do que na forma planctônica.

34 3 PROPOSIÇÃO O objetivo desta dissertação foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica, aqui representada pelo fotossensibilizador azul de metileno e laser de Arseneto Gálio Alumínio (AsGaAl), na viabilidade de biofilme formados sobre resina acrílica por Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, isolados e em associação.

35 4 MATERIAIS E MÉTODOS Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos/UNESP-SJC, conforme protocolo n 019/2008 PH/CEP (Anexo A) 4.1 Corpos-de-prova Para o desenvolvimento do presente estudo foram utilizados como corpos-de-prova 280 discos para confecção de prótese ocular com pino (Clássico, São Paulo, Brasil), constituídos de resina acrílica incolor, com 11 mm de diâmetro (figura 1a). Cada corpo-de-prova recebeu duas camadas de esmalte para unhas (Colorama, São Paulo, Brasil), no pino (figura 1b) e na base (figura 1c). Desta forma, a área de aderência do microrganismo para a formação do biofilme foi delimitada somente para a parte superior do corpo-de-prova. A seguir, os corpos-deprova foram embalados e encaminhados para esterilização por radiação gama (cobalto 60), com dosagem de 20 kgy por 6 h (Embrarad, São Paulo, Brasil).

36 Microrganismos e preparo de suspensões padronizadas Inicialmente foram preparadas suspensões padronizadas utilizando cepas padrão de C. albicans (ATCC 18804), S. aureus (ATCC 6538) e S. mutans (ATCC 35688). As cepas de C. albicans (figura 2a) foram repicadas em ágar Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, USA). Já as cepas de S. aureus (figura 2b) e S. mutans (figura 2c) foram repicadas em ágar infusão cérebro coração - BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit, USA). Os microrganismos foram incubados em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 h. Todos os ensaios com cepas de S. mutans foram incubados em estufa bacteriológica sob condições de microaerofilia (5% de CO 2 ). Decorrido o período de incubação, colônias dos microrganismos foram suspensas em solução fisiológica esterilizada (NaCl 0,9%), e ajustada em espectrofotômetro (B 582, Micronal, São Paulo, Brasil), até obtenção de suspensão padronizada contendo 10 6 células/ml. Os parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda utilizados foram, respectivamente: 0,284 e 530 nm para C. albicans (figura 3a), 0,374 e 490 nm para S. aureus (figura 3b), e 0,620 e 398 nm para S. mutans (figura 3c). 4.3 Grupos e condições experimentais Após a esterilização, os corpos-de-prova foram divididos aleatoriamente em 7 grupos, os quais foram submetidos às seguintes condições experimentais: a) L+F-: biofilmes com a associação de solução fisiológica e laser; b) L-F+: biofilmes tratados somente com o

37 34 fotossensibilizador; c) L-F-: biofilmes que receberam apenas solução fisiológica; e, d) L+F+: biofilmes tratados com o fotossensibilizador e irradiados pelo laser, conforme quadro 1. Quadro 1 - Grupos de microrganismos e condições experimentais analisadas Grupos Condições Experimentais Microrganismos L+F- L-F+ L-F- L+F+ I C. albicans II S. aureus III S. mutans IV C. albicans e S. aureus V C. albicans e S. mutans VI S. aureus e S. mutans VII - C. albicans, S. aureus e S. mutans Total Formação dos biofilmes Os corpos-de-prova esterilizados foram colocados, com o auxílio de pinça estéril (figura 4a), na primeira fileira de placas de 24 poços (Costar Corning, New York, EUA). Em seguida foram adicionados 2 ml de caldo infusão de cérebro coração - BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit, USA) acrescido de 5% de sacarose em cada poço da placa (figura 4b). Para a formação de biofilmes isolados (grupos I, II e III) cada poço da placa contendo caldo BHI e um corpo-de-prova foi inoculado com 0,1 ml da suspensão microbiana (figura 4c). Já nos grupos com associações (grupos IV, V, VI e VII) foram inoculados 0,1 ml de cada suspensão

38 35 microbiana referente ao microrganismo utilizado. Por exemplo, para o grupo IV, foi utilizado 0,1 ml da suspensão de C. albicans e 0,1 ml da suspensão de S. aureus. As placas foram mantidas incubadas em estufa bacteriológica à 37ºC por cinco dias Lavagem dos corpos-de-prova A fim de remover as células microbianas não-aderidas após o período de formação dos biofilmes, foi realizada a lavagem dos corpos-de-prova. Os corpos-de-prova foram transferidos para os poços da segunda fileira contendo 2 ml de solução fisiológica esterilizada (figura 5a), e a placa foi agitada por 5 min (figura 5b) em agitador orbital (Solab, Piracicaba, Brasil). Este processo de lavagem foi realizado novamente nos poços da terceira fileira da placa (figura 5c). 4.5 Terapia fotodinâmica em biofilmes No processo de TFD foi utilizado laser de baixa potência de Arseneto Gálio Alumínio (figura 6a) - AsGaAl- (Photon lase III, DMC Equipamentos, São Carlos, Brasil), com sistema de entrega por fibra óptica. Como fotossensibilizador foi utilizado azul de metileno (Sigma, Aldrich, Germany), dissolvido em solução fisiológica esterilizada a uma concentração de 0,1 mg/ml, seguido de filtração em membrana de acetato de celulose estéril (figura 6b), com poros de 0,22 µm de diâmetro (Millipore, São Paulo, Brasil).

39 36 demonstrado no quadro 2. A irradiação pelo laser AsGaAl, seguiu o protocolo Quadro 2 - Protocolo utilizado para irradiação com laser AsGaAl Comprimento de onda nm: nanômetros J/cm 2 :joules por centímetro quadrado J: joules mw: miliwats cm 2 : centímetro quadrado min: minutos s: segundos 660 nm Densidade de energia 10,42 J/cm 2 Energia Potência 9,8 J 100 mw Área irradiada 0,94 cm 2 Tempo 98 s Após a lavagem todos os corpos-de-prova foram transferidos para a quarta fileira da placa de 24 poços. Os corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L-F+ receberam 0,1 ml de azul de metileno (figura 7a), por 5 min. Já os corpos-de-prova das condições experimentais L+F- e L-F- receberam 0,1 ml de solução fisiológica esterilizada, também por 5 min (figura 7b). Decorrido este período, os corpos-de-prova das condições experimentais L+F+ e L+F- foram irradiados, com as placas abertas, pelo laser por 98 s (figura 7c). Todo o experimento de TFD foi realizado no escuro, em câmara de fluxo laminar, com o auxílio de um anteparo negro fosco colocado sob as placas para evitar o espalhamento de luz. Para avaliar o efeito das diferentes condições experimentais realizadas foram quantificados os números de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de microrganismos, obtidos a partir da suspensão de cada biofilme dos corpos-de-prova.

40 37 Cada corpo-de-prova foi colocado em um tubo falcon contendo 10 ml de solução fisiológica esterilizada, e em seguida homogeneizada por 30 s, utilizando homogeneizador ultra-sônico (Sonoplus HD 2200 Bandelin Eletronic) com potência de 50 W (figura 8a), a fim de desprender o biofilme. A suspensão microbiana obtida foi considerada com fator diluição 10-1, e a partir desta foram realizadas novas diluições decimais (10-2, 10-3 e 10-4 ) em solução fisiológica esterilizada. Alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram semeadas em duplicatas em placas de Petri com meio de cultura sólido (figura 8b). No grupo I, as diluições obtidas do biofilme isolado de C. albicans foram semeadas em ágar Sabouraud dextrose. Nos biofilmes isolados de S. aureus e S. mutans (grupos II e III, respectivamente) as diluições foram semeados em ágar BHI. Já nos grupos mistos, as diluições dos biofilmes foram semeadas em meios de cultura seletivos para cada microrganismo, como segue: a) C. albicans em ágar Sabouraud dextrose com 50 mg/l de cloranfenicol (União Química, São Paulo, Brasil); b) S. aureus em ágar manitol (Difco, Detroit, USA); e, c) S. mutans em ágar Mitis Salivarius (Difco, Detroit, USA) acrescido de 0,2 UI/mL de bacitracina (União Química, São Paulo, Brasil) e 15% de sacarose (MSBS). As placas foram incubadas em estufa a 37 ºC por 48 h. Após o período de incubação, as placas contendo de 30 a 300 colônias foram contadas e o número UFC/mL transformado em logarítmo de base 10 (Log 10 ). Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente pela análise de variância ANOVA, teste Tukey, considerando-se diferença estatística quando p < 0,05, com o software Minitab 14 (Inc. PA, USA).

41 Microscopia eletrônica de varredura Com o objetivo de ilustrar os efeitos da TFD sobre os biofilmes formados nos corpos-de-prova foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) no Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE) de São José dos Campos/SP. Para a MEV os biofilmes foram crescidos conforme mencionado anteriormente, sendo dois corpos-de-prova por grupo, (quadro 3) submetidos as condições experimentais L-F- e L+F+. Quadro 3 - Corpos-de-prova submetidos a microscopia eletrônica de varredura Grupos Condições Experimentais Microrganismos L-F- L+F+ I C. albicans II S. aureus III S. mutans IV C. albicans e S. aureus V C. albicans e S. mutans VI S. aureus e S. mutans VII - C. albicans, S. aureus e S. mutans Em seguida, os corpos-de-prova transferidos para placas de 24 poços e fixados em 2 ml de glutaraldeído a 2,5% por 1 h. Posteriormente os corpos-de-prova foram submersos por 20 min em cada uma das seguintes concentrações de álcool: 10%, 25%, 50%, 75% e 90%. E finalmente, por 1 h em álcool a 100%. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica por 24 h para a secagem completa dos corposde-prova.

42 39 Após a secagem os corpos-de-prova foram transferidos para stubs metálicos (figura 9a) e submetidos ao processo de metalização por sputtering (Denton Vacuum Desk II, Denton Vacuum, USA) com 10-9 m de espessura de fio de ouro (figuras 9b e 9c). Posteriormente, os corpos-de-prova foram examinados e fotografados em microscópico eletrônico de varredura (JSM-5310, JEOL, Japão), operando em 15 kv nos aumentos de 1000 e 5000 vezes (figura 9d).

43 40 A B C Figura 1 Preparo do corpo-de-prova utilizado para formação de biofilme. a) corpo-deprova sem pintura; b) corpo-de-prova com o pino pintado; c) corpo-de-prova pronto para esterilização, com pino e base pintados com esmalte para unhas. A B C Figura 2 - Placas com crescimentos de 24 h em meio de cultura sólido, dos microrganismos utilizados para a formação dos biofilmes. a) C. albicans em ágar Sabouraud dextrose; b) S. aureus em ágar BHI; c) S. mutans em ágar BHI. A B C Figura 3 - Parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda, em espectrofotômetro, utilizados para os diferentes microrganismos. a) parâmetros utilizados para C. albicans; b) parâmetros utilizados para S. aureus; c) parâmetros utilizados para S. mutans.

44 41 A B C Figura 4 - Processo de formação do biofilme. a) transferência dos corpos-de-prova da placa de 24 poços; b) adição do caldo BHI sacarosado; c) inoculação da suspensão para a primeira fileira microbiana. A B C Figura 5 - Lavagem dos corpos-de-prova. a) lavagem dos corpos-de-prova realizada com solução fisiológica esterilizada nos poços da segunda fileira da placa; b) agitador orbital onde as placas permaneceram por 5 minutos para auxiliar o processo de remoção das células microbianas não-aderidas; c) repetição da lavagem dos corpos-de-prova na terceira fileira da placa. A B Figura 6 - Laser e fotossensibilizador utilizados na TFD. a) aparelho de laser AsGaAl; b) filtração do fotossensibilizador azul de metileno.

45 42 A B C Figura 7 - Processo de TFD. a) aplicação do fotossensibilizador azul de metileno, por 5 minutos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L-F+; B) aplicação de solução fisiológica, por 5 minutos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F- e L-F-; c) irradiação pelo laser AsGaAl, por 1 minuto e 38 segundos, nos corpos-de-prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L+F-. A B Figura 8 - Quantificação de microrganismos. a) dispersão do biofilme formado no disco de resina acrílica, através da homogeneização em solução fisiológica com homogeneizador ultra-sônico; b) semeadura em meio de cultura sólido.

46 43 A B C D Figura 9 - Processos de metalização e análise em MEV dos corpos-de-prova; A) corpos-de-prova no stub metálico antes da metalização. B) aparelho metalizador. C) stub com os corpos-de-prova metalizados; D) microscópio eletrônico de varredura.

47 5 RESULTADOS As médias obtidas através dos ensaios realizados e as análises estatísticas de UFC/mL (Log 10 ) para os biofilmes isolados de C. albicans, S. aureus e S. mutans, grupos GI, GII e GIII, estão apresentadas na tabela 1. Através destes resultados foi possível visualizar os efeitos produzidos pela TFD nos biofilmes isolados. Tabela 1 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log 10 ) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, nos seguintes grupos: GI - biofilmes de C. albicans; GII - biofilmes de S. aureus; e, GIII - biofilmes de S. mutans Condição Experimental GI Biofilme de GII Biofilme de GIII - Biofilme de C. albicans S. aureus S. mutans L+F- 5,69±0,03 A 5,75±0,04 A 5,85±0,02 A L-F+ 5,71±0,04 A 5,81±0,04 AB 5,87±0,02 A L-F- 5,77±0,03 A 5,89±0,03 B 5,93±0,04 A L+F+ 3,45±0,12 B 2,60±0,21 C 3,12±0,13 B Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser. Na tabela 2 estão os valores de p obtidos quando as diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente.

48 45 Tabela 2 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais nos seguintes grupos: GI - biofilmes de C. albicans; GII - biofilmes de S. aureus; e, GIII - biofilmes de S. mutans Comparação GI Biofilme de GII Biofilme de GIII - Biofilme de C. albicans S. aureus S. mutans L-F- e L-F+ 0,267 0,371 0,295 L-F- e L+F- 0,052 0,036 0,061 L-F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000 L-F+ e L+F- 0,854 0,636 0,848 L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000 L+F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000 Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser. Para os ensaios realizados com biofilmes dos grupos GIV, GV, GVI e GVII formados pela associação de microrganismos, as médias e as análises estatísticas, bem como os valores de p obtidos quando as diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente, estão apresentadas nas tabelas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10.

49 46 Tabela 3 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log 10 ) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV: biofilme associado de C. albicans e S. aureus Condição Experimental GIV Biofilme de C. albicans S. aureus L+F- 5,38±0,03 A 5,45±0,06 A L-F+ 5,41±0,04 A 5,50±0,07 AB L-F- 5,43±0,04 A 5,55±0,07 B L+F+ 3,52±0,11 B 3,11±0,10 C Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser Tabela 4 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GIV: biofilme associado de C. albicans e S. aureus Comparação GIV Biofilme de C. albicans S. aureus L-F- e L-F+ 0,874 0,555 L-F- e L+F- 0,386 0,056 L-F- e L+F+ 0,000 0,000 L-F+ e L+F- 0,827 0,555 L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 L+F- e L+F+ 0,000 0,000 Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

50 47 Tabela 5 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log 10 ) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV: biofilme associado de C. albicans e S. mutans Condição Experimental GV Biofilme de C. albicans S. mutans L+F- 5,42±0,06 A 5,63±0,04 A L-F+ 5,43±0,05 A 5,66±0,02 A L-F- 5,48±0,05 A 5,71±0,04 A L+F+ 3,75±0,14 B 3,50±0,15 B Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser Tabela 6 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GV: biofilme associado de C. albicans e S. mutans Comparação GV Biofilme de C. albicans S. mutans L-F- e L-F+ 0,569 0,421 L-F- e L+F- 0,474 0,156 L-F- e L+F+ 0,000 0,000 L-F+ e L+F- 0,998 0,929 L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 L+F- e L+F+ 0,000 0,000 Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

51 48 Tabela 7 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log 10 ) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI: biofilme associado de S. aureus e S. mutans Condição Experimental GVI Biofilme de S. aureus S. mutans L+F- 5,44±0,06 A 5,57±0,06 A L-F+ 5,48±0,06 A 5,60±0,06 A L-F- 5,53±0,06 A 5,65±0,07 A L+F+ 3,31±0,14 B 3,55±0,12 B Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser Tabela 8 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GVI: biofilme associado de C. albicans e S. mutans Comparação GVI Biofilme de S. aureus S. mutans L-F- e L-F+ 0,672 0,514 L-F- e L+F- 0,107 0,149 L-F- e L+F+ 0,000 0,000 L-F+ e L+F- 0,624 0,858 L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 L+F- e L+F+ 0,000 0,000 Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

52 49 Tabela 9 - Médias e desvio-padrão dos números de UFC/mL (Log 10 ) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII: biofilme associado de C. albicans, S. aureus e S. mutans Condição Experimental GVII Biofilme de C. albicans S. aureus S. mutans L+F- 5,07±0,07 A 5,08±0,08 A 5,14±0,06 A L-F+ 5,08±0,07 A 5,13±0,07 A 5,15±0,06 A L-F- 5,12±0,07 A 5,18±0,06 A 5,21±0,06 A L+F+ 4,12±0,11 B 3,71±0,20 B 3,96±0,10 B Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser Tabela 10 - Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GVI: biofilme associado de C. albicans, S. aureus e S. mutans Comparação GVII Biofilme de C. albicans S. aureus S. mutans L-F- e L-F+ 0,704 0,741 0,358 L-F- e L+F- 0,637 0,272 0,161 L-F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000 L-F+ e L+F- 0,999 0,842 0,964 L-F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000 L+F- e L+F+ 0,000 0,000 0,000 Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey). G: Grupo L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

53 50 A aplicação do fotossensibilizador azul de metileno por 5 minutos, seguida pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s, promoveu uma redução significativa no número de UFC/mL (Log 10 ) dos microrganismos organizados em todos os biofilmes dos grupos testados, quando comparados com os grupos que receberam somente solução fisiológica (L-F-). Os percentuais de redução de UFC/mL em Log 10 dos biofilmes analisados estão ilustrados na figura 10. Nos biofilmes isolados os percentuais de redução foram: 40,22% para C. albicans (GI); 55,91% para. S. aureus (GII); e, 47,35% para S. mutans (GIII). Nos biofilmes mistos os percentuais foram: 35,08% para C. albicans e 43,9% para S. aureus (GIV); 31,54% para C. albicans e 38,7% para S. mutans (GV); 40,12% para S. aureus e 37,14% S. mutans (GVI); 19,56% para C. albicans, 28,41% para S. aureus 24,94% para S. mutans (GVII). 60 Redução Percentual (%) de UFC/mL GI C. albicans S.aureus GII GIII GIV GV GVI Grupos S. mutans GVII Figura 10 Médias e desvio-padrão das reduções de UFC/mL (Log 10 ) obtidas entre os grupos sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiadoo pelo laser (L-F-) e, com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+ +).

54 51 Pela análise das imagens produzidas por MEV foi possível visualizar a aderência dos microrganismos apresentadas pelos diferentes grupos, condição controle (L-F-), bem como compará-las com os mesmos submetidos ao processo de TFD (L+F+). Através desta comparação, observou-se que as reduções ocorreram predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes (figuras 11 a 17).

55 52 A B C D Figura 11 MEV de biofilmes de C. albicans (grupo I) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L- F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

56 53 A B C D Figura 12 MEV de biofilmes de S. aureus (grupo II) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L- F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

57 54 A B C D Figura 13 MEV de biofilmes de S. mutans (grupo III) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L- F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

58 55 A B C D Figura 14 MEV de biofilmes de associados de C. albicans e S. aureus (grupo IV) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpo- pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

59 56 A B C D Figura 15 MEV de biofilmes de associados de C. albicans e S. mutans (grupo V) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

60 57 A B C D Figura 16 MEV de biofilmes de associados de S. aureus e S. mutans (grupo VI) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

61 58 A B C D Figura 17 MEV de biofilmes de associados de C. albicans, S. aureus e S. mutans (grupo VII) formados em corpos-de-prova de resina acrílica após 5 dias de crescimento. A) MEV do corpo-de-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 1000x; B) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV do corpode-prova com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não-irradiado pelo laser (L-F-), aumento de 5000x; D) MEV do corpo-de-prova com aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser por 98 s (L+F+), aumento de 5000x.

62 6 DISCUSSÃO A análise macroscópica dos biofilmes formados nos corpos-de-prova de resina acrílica, após 5 dias de crescimento, revelou padrões diferenciados para os grupos com microrganismos isolados em relação aqueles onde houve associação microbiana. Nos grupos com microrganismos isolados, observou-se no GI ausência de biofilme visível a olho nu, formado pela levedura C. albicans. Já no grupo GII, o biofilme formado por S. aureus foi mais visível. Entretanto, o grupo GIII de S. mutans foi aquele onde se obteve biofilme mais aparente. Nas associações de microrganismos, a análise macroscópica mostrou aumento da espessura dos biofilmes formados. Tal característica ficou mais evidente quando os microrganismos C. albicans e S. mutans foram inoculados juntos, o que produziu um biofilme mais espesso. Resultado semelhante foi obtido por Barbieri et al. (2007), que ao analisarem a aderência, in vitro, de S. mutans na superfície dentária verificaram que a mesma foi mais extensa quando esta bactéria foi cultivada com C. albicans. Esses dados indicam que a interação de C. albicans e S. mutans em biofilmes pode ter uma característica mutualística, onde ambos os microrganismos são favorecidos. Corroborando com esta afirmação, Branting et al. (1989), ao estudarem a aderência de C. albicans em associação com S. mutans em superfícies acrílicas, sugeriram que a presença de glucanos insolúveis produzidos pela bactéria podem aumentar a capacidade adesiva da levedura. Ainda sobre tal característica, Barbieri et al. (2007) concluíram que as células de C. albicans poderiam ser usadas pela bactéria S. mutans como suporte para sua aderência.

63 60 Os biofilmes representam o tipo de crescimento microbiano predominante na natureza e são cruciais no desenvolvimento de infecções, uma vez que servem de nicho aos agentes patogênicos e estão associados a altos níveis de resistência aos antimicrobianos (Kuhn et al. 2002). Pode-se atribuir ao biofilme uma série de vantagens para a colônia microbiana, como melhor comunicação entre células, em função da continuidade entre as mesmas, o que facilita as atividades bioquímicas, maior proliferação, acesso a nichos e recursos que não poderiam ser utilizados por células isoladas e a defesa coletiva contra os mecanismos de remoção pela saliva e ação de agentes antimicrobianos (Kirkpatrick et al. 2000). Neste contexto, a TFD surge como uma alternativa de tratamento, pois apresenta potente atividade antimicrobiana, apresenta baixo custo, efeitos colaterais mínimos, ausência de efeitos sistêmicos e não causa resistência microbiana (Garcez et al., 2003). A TFD é baseada nos chamados fotossensibilizadores que são ativados por luz, com comprimento de onda apropriado, gerando espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singleto, e superóxidos (Machado 2000, Romanova et al. 2003). Estes produtos são citotóxicos para a célula alvo, causando desordens na parede celular (Malik et al. 1990) e danos no DNA (Romanova et al. 2003), levando a morte do microrganismo. No presente estudo a fotossensibilização pelo AM por 5 min, seguido pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s (L+F+), promoveu reduções estatisticamente significantes nos biofilmes formados em resina acrílica em todos os grupos analisados, tanto em relação aqueles onde só foram utilizadas solução fisiológica, considerado controle (L-F-), quanto nas demais condições experimentais testadas (L-F+ e L+F-). Esta redução foi mais acentuada quando os microrganismos estavam organizados em biofilmes isolados.

64 61 Dentre os biofilmes isolados, aqueles formados por C. albicans (GI) foram os que sofreram menores reduções, apresentando média de 2,32 Log 10 (40,22%) em relação aos controles. No estudo de Donnelly et al. (2007), os biofilmes formados por uma cepa de C. albicans isolada de da cavidade bucal de um paciente com estomatite, crescidos por 24 h em discos plásticos, apresentaram reduções que variaram de 1,5 log 10 até 100%, de acordo com o tempo de incubação do fotossensibilizador AT e o aumento da densidade de energia da fonte de luz utilizada (635 nm). Os biofilmes mais sensíveis a TFD foram aqueles formados isoladamente por S. aureus, os quais apresentaram uma redução média de 3,29 Log 10 (47,35%). Lin et al., (2004) obtiveram reduções que variaram de 1,2 log até 100%, quando biofilmes de S. aureus foram submetidos ao fotossensibilizador merocianina por 10 min, seguido de irradiação por diferentes densidades de energia de uma fonte de luz verde (512 nm). Já no estudo de Sharma et al. (2008), a média de redução foi de aproximadamente 3,5 log em biofilmes formados por uma cepa de S. aureus resistente a meticilina, tratados com AT e irradiados por laser (640 nm). A TFD promoveu redução média de 2,81 Log 10 (55,91%) nos biofilmes isolados formados por S. mutans (GIII). Resultado semelhante foi obtido por Wood et al. (2006), que alcançaram reduções de 1,5 a 2,6 Log 10 em biofilmes de S. mutans com 2 e 12 dias de crescimento, respectivamente, quando utilizaram o fotossensibilizador AM em conjunto com uma fonte de luz de 400 W. No estudo realizado por Zanin et al. (2005), os autores também encontraram reduções similares, de 2,10 a 3,11 log 10 de S. mutans organizados em biofilmes tratados com AT, conforme o aumento do tempo de irradiação pelo laser He-Ne (632,8 nm). Os biofilmes mistos foram mais resistentes aos processos de TFD utilizados no presente estudo, com reduções médias que

65 62 variaram de 1,00 (19,56%) até 2,44 (43,9%) log 10. Estes resultados demonstram que quanto mais complexo o biofilme, maior é a resistência a TFD. Qin et al. (2008) também conseguiram uma redução mínima, em torno de 21%, do biofilme coletado de pacientes com periodontite, com a aplicação do AT e laser diodo. Porém no estudo realizado por Müller et al. (2007) com biofilmes mistos crescidos em discos de esmalte bovino, foi alcançada redução de apenas 0,4 log 10, considerada sem diferença estatística, com a aplicação de azul de metileno e laser diodo (665 nm). Atualmente, existe um consenso de que a obtenção de efeito antimicrobiano de um determinado agente sobre microrganismos crescidos em cultura planctônica é apenas um dado indicativo. Os microrganismos organizados na forma de biofilmes apresentam um aumento expressivo de resistência aos agentes antimicrobianos (Mah; O`Toole, 2001). Esta resistência parece estar relacionada à presença da matriz de polissacarídeos, a alterações na composição da parede celular, a uma taxa de crescimento celular mais lento, bem como pela expressão de genes de resistência aos agentes antimicrobianos (Costerton et al., 1999). Assim, quando estudamos o uso TFD sobre biofilmes devemos considerar que essas bactérias encontram-se mais resistentes. Através de relatos da literatura, se observou uma diferença quanto aos efeitos produzidos pela TFD em culturas planctônicas dos mesmos microrganismos utilizados no presente estudo. De acordo com os estudos de William et al. (2003) e Bevilacqua et al. (2007), onde foi utilizado o fotossensibilizador AT e laser diodo no primeiro e, Led no segundo, ambos conseguiram reduções de 100% de S. mutans em culturas planctônicas. Porém, em outros estudos as reduções encontradas foram similares, ou até menores as mesmas obtidas na presente dissertação. Em relação às reduções similares, o estudo realizado por

66 63 Peloi et al. (2008) com células em suspensão, utilizando Led (663 nm) e fotossensibilizador AM, as reduções foram de 2,32 a 3,69 log 10 e 2,78 a 3,88 log 10, para S. aureus e C. albicans, respectivamente, conforme o aumento do tempo de irradiação da fonte de luz. Outro Já no trabalho realizado por Souza et al., (2006) com culturas planctônicas de C. albicans, as reduções obtidas foram inferiores as observadas no atual estudo, com 0,99 log 10 com aplicação de AM e laser diodo (685 nm). Alguns autores concluíram que a capacidade de formar biofilmes está estritamente relacionada com a resistência dos microrganismos a TFD. Gad et al. (2004) relataram que as cepas de S. aureus incazapes de produzir biofilmes são as mais sensíveis aos procedimentos de TFD. Esta informação ficou mais evidente no estudo realizado por Grinholc et al. (2008), onde cepas de S. aureus formadoras de biofilmes foram mais resistentes, do que as mesmas sem esta capacidade, quando sensibilizadas por porfirina e irradiadas por fonte de luz de 624 nm. Além da resistência produzida por cepas formadoras de biofilmes a TFD, alguns parâmetros utilizados são alterados para que os efeitos produzidos nessas situações sejam semelhantes àqueles obtidos em culturas planctônicas de microrganismos. Lin et al. (2004) demonstraram que as doses de luz requeridas para inativar biofilmes de S. aureus, usando merocianina 540, são muito mais altas daquelas utilizadas para culturas planctônicas, devido a penetração de luz dentro dos biofilmes. No estudo realizado por Donnelly et al. (2007), também foram observadas tais diferenças pois os autores necessitaram de concentrações maiores de fotossensibilizador e doses mais altas de laser para conseguir reduções iguais de C. albicans em biofilmes em relação aos seus similares planctônicos. A diferença de susceptibilidade de microrganismos em culturas planctônicas e biofilmes, também foram encontradas em outras espécies. Rovaldi et al. (2000) obitveram 6 log 10 de redução pela

67 64 fotossensibilização com AM e laser de baixa potência. Entretanto, o mesmo modelo de tratamento aplicado às amostras de biofilmes bacterianos, isolados do periodonto de pacientes, realizado por Soukos et al. (2003), reduziu uma média de 2 Log 10. Em relação aos efeitos isolados do laser (L+F-), foram observadas reduções significativas nos biofilmes isolados de S. aureus (GII), quando comparadas com a condição controle (L-F-), o que sugere uma possível suscetibilidade deste microrganismo ao laser. O efeito isolado do fotossensibilizador AM na ausência de irradiação laser (L-F+) não apresentou diferença estatisticamente significante em relação a condição controle (L-F-) em todos os grupos analisados. Estes resultados sugerem que o AM não possui efeito citotóxico para os microrganismos testados. Porém tais dados divergem de relatos de estudos nos quais, sem a irradiação de luz, o AM demonstrou atividade antifúngica e antibacteriana natural (Wainwright e Crossley, 2002, Calzavara-Pinton et al., 2005). Através das imagens de MEV pode-se observar que a TFD produziu reduções predominantemente nas primeiras camadas dos biofilmes, deixando alguns microrganismos em seu interior. De acordo com O'Neill et al. (2002), este fato pode ser devido a incapacidade do fotossensibilizador de se difundir através das camadas superficiais para as mais internas do biofilme. Isto ilustra um potencial problema associado a TFD, que segundo os autores, poderia ser superado com a seleção de um fotossensibilizador capaz de penetrar através da matriz do biofilme, seguido pela irradiação interna do mesmo através de fibra óptica. As divergências encontradas no presente estudo, em relação à literatura vigente, devem-se a ausência de protocolos prédefinidos para utilização da TFD. Ocorre que a grande variedade de modelos laboratoriais, luzes, fotossensibilizadores e parâmetros utilizados para se estudar a TFD sobre biofilmes orais, tornam a comparação dos resultados bastante complexa. A concentração, tempo de incubação e

68 65 tipo do fotossensibilizador, além do estágio fisiológico dos microrganismos, período de exposição e densidade de energia do laser, também pode influenciar os resultados da técnica de TFD (Wilson e Mia, 1993).

69 7 CONCLUSÃO Tendo em vista os parâmetros utilizados, pode-se concluir que a terapia fotodinâmica (TFD), representada neste estudo pela fotossensibilização com azul de metileno seguida pela irradiação com laser de baixa potência AsGaAl, apresentou significativo efeito antimicrobiano nos biofilmes formados in vitro pelos microrganismos C. albicans, S. aureus e S. mutans, isolados e em associações. Assim, parece ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais.

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81 78 APÊNDICE A Dados individuais dos ensaios realizados para cada grupo de biofilme Tabela 11 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GI de biofilme de C. albicans. Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,74 5,76 5,80 3,40 2 5,68 5,70 5,81 3,48 3 5,69 5,71 5,73 3,30 4 5,65 5,62 5,76 3,43 5 5,70 5,77 5,79 3,30 6 5,72 5,71 5,76 3,54 7 5,69 5,76 5,78 3,34 8 5,69 5,72 5,75 3,48 9 5,67 5,69 5,73 3, ,66 5,68 5,75 3,54 Média 5,69 A 5,71 A 5,77 A 3,45 B DP 0,03 0,04 0,03 0,12 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

82 79 Tabela 12 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GII de biofilme de S. aureus Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,72 5,81 5,88 2,60 2 5,82 5,88 5,90 2,30 3 5,73 5,73 5,86 2,48 4 5,73 5,80 5,95 2,70 5 5,74 5,83 5,88 2,90 6 5,78 5,83 5,93 2,30 7 5,72 5,81 5,89 2,85 8 5,72 5,80 5,92 2,60 9 5,78 5,83 5,91 2, ,81 5,82 5,83 2,78 Média 5,75 A 5,81 AB 5,89 B 2,60 C DP 0,04 0,04 0,03 0,21 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

83 80 Tabela 13 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIII de biofilme de S. mutans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,83 5,83 5,94 3,15 2 5,81 5,86 5,95 3,18 3 5,88 5,89 5,91 3,00 4 5,86 5,88 5,89 3,08 5 5,88 5,90 5,98 3,18 6 5,83 5,90 5,93 3,00 7 5,83 5,85 5,87 3,00 8 5,86 5,89 5,90 3,34 9 5,84 5,88 5,98 3, ,87 5,86 5,94 3,00 Média 5,85 A 5,87 A 5,93 A 3,12 B DP 0,02 0,02 0,04 0,13 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

84 81 Tabela 14 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV de biofilme de C. albicans e S. aureus. Os dados referem-se a levedura C. albicans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,35 5,45 5,40 3,38 2 5,40 5,38 5,41 3,48 3 5,38 5,37 5,38 3,60 4 5,36 5,34 5,40 3,48 5 5,34 5,40 5,45 3,40 6 5,41 5,44 5,48 3,70 7 5,37 5,45 5,51 3,54 8 5,38 5,40 5,41 3,65 9 5,45 5,45 5,45 3, ,37 5,38 5,39 3,40 Média 5,38 A 5,41 A 5,43 A 3,52 B DP 0,03 0,04 0,04 0,11 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

85 82 Tabela 15 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV de biofilme de C. albicans e S. aureus. Os dados referem-se a bactéria S. aureus Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,54 5,59 5,62 3,04 2 5,54 5,54 5,57 3,00 3 5,38 5,41 5,45 3,18 4 5,45 5,63 5,69 3,08 5 5,39 5,54 5,56 3,18 6 5,40 5,43 5,54 3,00 7 5,51 5,47 5,57 3,18 8 5,45 5,43 5,46 3,20 9 5,45 5,51 5,53 3, ,43 5,45 5,47 3,00 Média 5,45 A 5,50 AB 5,55 B 3,11 C DP 0,06 0,07 0,07 0,10 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

86 83 Tabela 16 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV de biofilme de C. albicans e S. mutans. Os dados referem-se a levedura C. albicans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,32 5,34 5,41 3,85 2 5,40 5,45 5,45 3,78 3 5,52 5,41 5,57 3,70 4 5,51 5,53 5,54 3,88 5 5,42 5,44 5,46 3,90 6 5,38 5,45 5,48 3,81 7 5,37 5,40 5,45 3,70 8 5,43 5,38 5,44 3,48 9 5,45 5,46 5,51 3, ,40 5,40 5,45 3,85 Média 5,42 A 5,43 A 5,48 A 3,75 B DP 0,06 0,05 0,05 0,14 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

87 84 Tabela 17 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV de biofilme de C. albicans e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,53 5,68 5,66 3,48 2 5,67 5,62 5,72 3,30 3 5,65 5,64 5,68 3,65 4 5,60 5,63 5,66 3,40 5 5,63 5,66 5,72 3,70 6 5,65 5,64 5,76 3,60 7 5,67 5,68 5,71 3,54 8 5,64 5,66 5,72 3,30 9 5,62 5,70 5,73 3, ,68 5,65 5,76 3,65 Média 5,63 A 5,66 A 5,71 A 3,50 B DP 0,04 0,02 0,04 0,15 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

88 85 Tabela 18 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI de biofilme de S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. aureus Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,47 5,48 5,59 3,00 2 5,40 5,42 5,45 3,34 3 5,46 5,51 5,56 3,30 4 5,34 5,40 5,45 3,40 5 5,36 5,45 5,51 3,18 6 5,46 5,57 5,62 3,40 7 5,48 5,54 5,54 3,30 8 5,40 5,40 5,45 3,48 9 5,46 5,51 5,54 3, ,54 5,56 5,57 3,30 Média 5,44 A 5,48 A 5,53 A 3,31 B DP 0,06 0,06 0,06 0,14 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

89 86 Tabela 19 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI de biofilme de S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,53 5,58 5,62 3,70 2 5,53 5,57 5,68 3,54 3 5,62 5,65 5,65 3,60 4 5,56 5,62 5,66 3,70 5 5,48 5,51 5,53 3,54 6 5,68 5,68 5,76 3,48 7 5,62 5,65 5,68 3,65 8 5,60 5,64 5,71 3,48 9 5,53 5,51 5,54 3, ,60 5,63 5,72 3,30 Média 5,57 A 5,60 A 5,65 A 3,55 B DP 0,06 0,06 0,07 0,12 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

90 87 Tabela 20 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans, S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a levedura C. albicans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,08 5,10 5,11 4,26 2 5,11 5,08 5,15 4,00 3 5,00 5,06 5,10 3,95 4 4,95 5,00 5,04 4,20 5 5,10 5,08 5,11 4,11 6 5,13 5,15 5,15 4,15 7 5,11 5,13 5,18 4,08 8 5,13 5,08 5,16 4,00 9 5,16 5,18 5,20 4, ,98 4,93 4,98 4,18 Média 5,07 A 5,08 A 5,12 A 4,12 B DP 0,07 0,07 0,07 0,11 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

91 88 Tabela 21 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans, S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. aureus Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,02 5,08 5,18 3,30 2 5,10 5,11 5,18 3,78 3 5,11 5,18 5,26 3,70 4 5,00 5,04 5,11 3,85 5 5,11 5,11 5,13 3,90 6 5,16 5,18 5,20 3,60 7 5,13 5,20 5,23 3,48 8 5,22 5,24 5,26 3,85 9 5,00 5,02 5,06 3, ,98 5,10 5,18 3,90 Média 5,08 A 5,13 A 5,18 A 3,71 B DP 0,08 0,07 0,06 0,20 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

92 89 Tabela 22 Números de UFC/mL (Log 10 ), médias e desvio-padrão obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII de biofilme de C. albicans, S. aureus e S. mutans. Os dados referem-se a bactéria S. mutans Ensaio L+F- L-F+ L-F- L+F+ 1 5,13 5,16 5,30 4,04 2 5,18 5,22 5,28 4,11 3 5,08 5,11 5,15 3,95 4 5,20 5,24 5,27 3,90 5 5,15 5,11 5,15 3,78 6 5,08 5,10 5,13 3,85 7 5,26 5,23 5,26 4,00 8 5,15 5,18 5,23 3,90 9 5,11 5,08 5,18 3, ,04 5,11 5,15 4,08 Média 5,14 A 5,15 A 5,21 A 3,96 B DP 0,06 0,06 0,06 0,10 Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste TUKEY). DP: Desvio-padrão L+F-: biofilme irradiado somente com laser L-F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L-F-: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.

93 ANEXO A Certificado do comitê de ética em pesquisa 90