SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE POLIURETANOS PARA USO COMO BIOMATERIAIS

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1 SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE POLIURETANOS PARA USO COMO BIOMATERIAIS Christian Viezzer 2,3 *, Natália A. de Carvalho 1,Vanusca D. Jahno 1, Denise C. Machado 3, Sandra M. O. Einloft 1,2,Jeane E. L. Dullius 1,2,Rosane A. Ligabue 1,2 1 Faculdade de Química- PUCRS, Campus Central, Porto Alegre-RS 2 Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais- PUCRS, Campus Central, Porto Alegre-RS 3 Instituto de Pesquisas Biomédicas PUCRS, Campus Central, Porto Alegre-RS *chviezzer@pucrs.br Este trabalho descreve a síntese e caracterização de poliuretanos para uso como biomateriais, onde os biopoliuretanos (BPU), foram sintetizados a partir de HDI e poliól Policaprolactona (PCL). As reações de formação dos biopoliuretanos foram acompanhadas através do consumo do diisocianato ao longo do tempo, verificado através da diminuição da concentração de NCO (método titulométrico com n-dibutilamina) e também pela técnica de infravermelho através da diminuição da banda característica de NCO livre, aproximadamente 2270 cm -1. Os BPU sintetizados foram caracterizados através da técnica de Cromatografia de Permeação em Gel (GPC), Infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). Um estudo preliminar de citotoxicidade e adesão celular foram realizados com BPU, mostrando que este polímero é um interessante suporte para crescimento celular. Palavras-chave: Poliuretano, biomaterial, Policaprolactona, biopolimero. Synthesis and characterization of polyurethanes for use as biomaterials This paper describes the synthesis and characterization of polyurethanes for use as biomaterials, where biopolyurethanes (BPU), were synthesized from HDI and Polycaprolactone polyol (PCL). The reactions of formation of biopolyurethanes were accompanied by consumption of diisocyanate over time, found by reducing of the concentration of NCO (titulometric method with N-dibutylamino) and also by the technique of infrared by the reducing band characteristic of free NCO, approximately 2270 cm -1. The BPU synthesized were characterized by the technique of Chromatography Gel Permeation (GPC), Fourier Transform Infrared (FTIR) and Differential Scanning Calorimetry (DSC). A preliminary study of cytotoxicity and cell adhesion were performed with BPU, showing that this polymer is an interesting support for cell growth. Keywords: Polyurethanes, biomaterial, polycaprolactone, biopolymer. Introdução Pesquisas de polímeros biodegradáveis e bioreabsorvíveis têm recebido grande atenção nesses últimos anos, pois possuem ampla aplicação na área ambiental e na medicina clínica. Os biomateriais têm apresentado uma taxa de crescimento de 12% ao ano, o que demonstra o grande interesse e necessidade por este tipo de produto [1]. Entre os diversos polímeros biodegradáveis destacam-se os poliuretanos que são formados através da reação de poliisocianatos e poliálcoois (figura 1) [2].

2 n H O R OH + n OCN R' NCO R O C N R poliol diisocianato O n poliuretano Figura 1-Reação genérica de formação do poliuretano A cadeia poliuretânica consiste de uma seqüência alternada de segmentos flexíveis e segmentos rígidos. Os segmentos flexíveis se devem ao poliól que confere características elastoméricas ao polímero. Os segmentos rígidos se devem ao diisocianato e conferem propriedades como dureza, resistência e tenacidade [3]. Assim as características de um polímero PU dependem diretamente da natureza do isocianato e do poliól utilizados na síntese, podendo ser preparados para aplicações específicas através da variação de parâmetros como: extensão, distribuição de segmentos flexíveis e rígidos, massa molar e grau de ramificação das cadeias [4]. Estudos feitos com diisocianatos mostram que poliuretanos preparados com diisocianatos linear alifáticos são mais rapidamente degradáveis do que os PUs preparados com diisocianatos aromáticos [5]. As propriedades mecânicas destes polímeros estão diretamente relacionadas à combinação dos constituintes das cadeias poliméricas, tamanho dos segmentos flexíveis, razão molar NCO/OH, tipo de extensor de cadeia e presença ou não de solventes na síntese [6]. As propriedades finais destes polímeros dependem da natureza do álcool utilizado na síntese, influenciando propriedades como flexibilidade e características de processamento. De um modo geral, quanto mais flexíveis são os PUs, mais suscetíveis são à biodegradação, por exemplo [7]. Os polióis usados são basicamente de duas classes, derivados de poliéster e de poliéter. Os poliéteres são usados em maior abrangência devido à disponibilidade de ampla faixa de massa molar e características como viscosidade, composição e funcionalidade. Estes conferem aos produtos finais propriedades como resistência ao corte e ao impacto, resistência a solventes e ácidos e estabilidade à luz. Os poliésteres foram os primeiros polióis usados no desenvolvimento dos poliuretanos [8]. Eles apresentam pequena estabilidade hidrofílica e degradação frente a álcalis, o que torna este tipo de poliól atrativo para uso na síntese de poliuretanos biodegradáveis [9]. Aliado a isto, os poliuretanos utilizados como biomateriais possuem um caráter de biocompatibilidade e características físicas e mecânicas que permitem o seu uso em dispositivos implantáveis como, balão intraórtico, implantes mamários, balões de angioplastia, dispositivos para cateterismo, entre outros [10]. O uso de poliéster policaprolactona (PCL) para a síntese de biopoliuretanos, por exemplo, é uma boa alternativa visto que ele é um poliól biocompatível e apresenta uma lenta degradação hidrolítica e enzimática [11].

3 Este trabalho tem como objetivo a síntese e caracterização de biopoliuretanos PU-PCL (BPU) a partir de hexametileno diisocianato (HDI) e policaprolactona (PCL) e uma avaliação preliminar da citotoxicidade deste polímero com vistas a sua aplicação como biomaterial. Experimental Materiais Os biopoliuretanos (BPU) foram sintetizados utilizando as seguintes matérias-primas: HDI (hexametileno diisocianato, Merck); PCL (policaprolactona, MM= 2000, 1250 e g/mol, Perstorp); 1,4-BD (1,4-butanodiol, MM= 90,12 g/mol Merck); DBTDL (dibutildilaurato de estanho, Miracema-Nuodex Ind.); acetona P.A. (99,5%, Merck); metiletilcetona, MEK (99,0%, Vetec); tetrahidrofurano, THF (99,0%, Vetec), DMPA (ácido dimetilol propiônico, MM= 134,13 g/mol, Perstorp). Síntese dos Poliuretanos As reações de formação de poliuretanos foram realizadas sob atmosfera de N 2 em um reator de vidro com agitação mecânica, controle de temperatura (50 C) e sistema de refluxo. As reações foram feitas por meio de uma única etapa, onde o biopolímero PU-PCL foi obtido pela reação entre o HDI, o PCL e 1,4-BD ou DMPA (razão molar NCO/OH= 1,0 e 1,2) em meio solvente ( ml de MEK) e utilizando DBTDL como catalisador (0,1% em massa). As reações foram acompanhadas através da técnica de titulometria com N-dibutilamina conforme método descrito na literatura [12, 13] e por técnica de infravermelho (IR). Caracterizações As caracterizações dos polímeros PU-PCL obtidos foram feitas por espectroscopia de Infravermelho (IV) utilizando um equipamento Perkin Elmer Instruments Spectrum One FT-IR Spectrometer, no intervalo de 4000 a 650 cm 1. Os poliuretanos foram analisados na forma de filme, onde uma pequena quantidade do BPU foi dissolvida em tetrahidrofurano (THF P.A., Vetec). As análises por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) foram realizadas com HPLC pump-1515 isocrático utilizando detector de índice de refração Waters Intruments 2412 e THF como eluente do HPLC. As amostras foram preparadas através de uma solução do BPU em THF com uma concentração de 7mg/mL. As análises por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) foram feitas utilizando um equipamento TA Instruments modelo Q20, em um intervalo de temperatura de -80 C a 200 C, com uma variação de 10 C/min.

4 A citotoxicidade in vitro dos filmes de BPU em culturas de células de fibroblasto de camundongo NIH-3T3 foram avaliadas através do teste de meio de extração (ME) pelas normas da ISO Todos os testes de citotoxicidade foram avaliados nos períodos de 24, 48 e 72 horas, na concentração de 100% de ME. Para a avaliação citocompatibilidade in vitro, adesão celular,, 1,5x10 4 células de fibroblastos NIH-3T3 foram colocadas em cultura sobre o filme de BPU em meio D-MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos, em atmosfera úmida com 5% de CO 2. Após os períodos, até 72 horas de cultura, as células foram fixadas em metanol e corandas com hematoxilina e eosina (HE) sendo visualizadas com um microscópio ótico AxioLab, marca Zeiss. Resultados e Discussão Para melhor acompanhamento das composições dos BPUs sintetizados segue uma breve descrição abaixo ( tabela 1). Tabela 1 Composição dos BPUs sintetizados BPU Diisocianato Poliol Componente NCO/OH BPU1 HDI PCL ,2 BPU2 HDI PCL-2000/PCL1250 (razão molar =1/1 ) - 1,0 BPU3 HDI PCL-2000 DMPA (5% p/p) 1,0 BPU4 HDI PCL-2000/1,4-BD (razão molar =1/1) BPU5 HDI PCL(10000) - 1,0-1,2 Caracterização por GPC Os polímeros obtidos foram caracterizados por Cromatografia de Permeação em Gel (GPC) para determinação das massas molares. As massas molares, numérica média (M n ), ponderal média (M w ), e o Índice de Polidispersidade (IP) dos polímeros BPU obtidos são apresentadas na tabela 2.

5 Tabela 2 Massa Molar dos BPUs sintetizados Polímero M n (g/mol) M w (g/mol) IP BPU ,5 BPU ,7 BPU ,5 BPU ,1 BPU ,7 Os resultados apresentados na Tabela 2 indicam que o BPU obtido com maior massa molar foi o BPU5 (Mw= g/mol). Este resultado já era esperado, pois se utilizou um poliól com massa molar maior. Além disso, poliuretanos com massa molares grandes possuem maior resistência a degradação por via hidrolítica ou enzimática [11]. Polímeros com massas molares inferiores foram obtidos quando o poliól PCL-2000 estava misturado a outros componentes (por exemplo, BPU2 onde foi reagido uma mistura de PCL-2000/ PCl-1250 e o BPU4 onde utilizou-se uma mistura de PCL-2000/1,4BD). Quando foi utilizado o DMPA (BPU3) obteve-se um polímero com massa molar muito inferior aos demais. Estes resultados podem estar associados à diminuição da reatividade do diisocianato frente às diferentes fontes de dióis. Caracterização por Infravermelho A figura 2 apresenta os espectros de infravermelho dos poliuretanos sintetizados. Número de onda Figura 2 Espectros de infravermelho: a) BPU1, b) BPU2 c) BPU3 d) BPU4 e) BPU5

6 A tabela 3 apresenta as bandas encontradas nos espectros dos BPUs, apresentados na figura 2, e suas respectivas atribuições, estando estas de acordo com o descrito na literatura [7, 14]. Tabela 3 Atribuições das bandas referentes aos espectros dos BPUs sintetizados Número de onda (cm -1 ) Atribuição 3397 ν s NH(uretano) δ CH e ν s CH ν C=O de grupo uretano e éster 1232 ν CO-O (éster) 1532 ν CN + δ NH 1163 ν C-O-C (éster) 1360 δs CH 3 Caracterização por DSC Os BPUs sintetizados foram caracterizados por Calorimetria Exploratória para a determinação das temperaturas de fusão (T f ), transição vítrea (Tg) e do grau de cristalinidade (α c ) calculado através da entalpia de fusão ( H f ) e utilizando como referência a entalpia de fusão para o polímero 100% cristalino igual a 146 J/g, conforme a literatura [15]. Estas características são mostradas na tabela 4. Tabela 4 Temperaturas de Fusão (T f ), transição vítrea (Tg), Entalpia de fusão ( Η f ) e grau de cristalinidade (α c ). Polímero T f ( C) Tg ( C) Η f (J/g) α c BPU1 53,02-57,03 54,47 37,3 BPU2 46,35-52,78 66,43 45,5 BPU3 54,10-49,35 77,87 53,3 BPU4 49,34-56,76 33,53 22,9 BPU5 59,97-7,26 Equação utilizada para o cálculo do grau de cristalinidade αc= ( H f / H f )x100 51,62 35,4 Todos os polímeros apresentam comportamentos térmicos semelhantes (figura 3), sendo que suas temperaturas de fusão ficaram em torno de 50 o C para a maioria dos polímeros, com exceção do polímero BPU5 (59,97 o C). As temperaturas de transição vítrea ficaram em torno de -50 C, com exceção do BPU5 (-7,26 o C). Os maiores valores obtidos de T f e T g para o BPU5 estão associados possivelmente a maior cadeia do poliól utilizado (PCL10000). O poliuretano com maior cristalinidade (53,3%) foi obtido com o PCL2000 e DMPA (BPU3), isto pode estar associado a maior quantidade de segmentos rígidos formados entre HDI e o DMPA gerando um maior número de cristalitos na estrutura do polímero. A seguir é mostrada uma curva de DSC típica dos biopoliuretanos sintetizados.

7 Figura 3 Curva de DSC do polímero BPU4 Caracterização in vitro A figura 4 mostra a adesão das células de fibroblastos sobre a superfície do BPU1 nos períodos de 24, 48 e 72 horas de cultura, coradas com hematoxilina e eosina (HE). A A B B Figura 4.1- Células de fibroblastos sobre filme de PU em 24h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x Figura Células de fibroblastos sobre filme de PU em 48h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x

8 A B Figura Células de fibroblastos sobre filme de PU em 72h de cultura: (A) aumento de 50x e (B) aumento de 100x A B Figura Células de fibroblastos sobre placa de cultura (poliestireno) aumento de 100x Pelas imagens obtidas em MO, pode-se notar que as células apresentam morfologia semelhantes as células do controle positivo (Figura 4.4), homogeneamente distribuídas, apresentando aspecto alongado, com inúmeros prolongamentos citoplasmáticos, interação célulacélula de acordo com outros autores [16, 17]. Pela coloração com HE podemos demonstrar que as células de fibroblasto NIH3T3 aderem e proliferam sobre o filme de BPU. A adesão celular está envolvida na integração com os biomateriais. A biocompatibilidade dos materiais está intimamente relacionada com o comportamento celular, quando em contato com estes, e, particularmente, com a adesão celular à sua superfície. A ligação, a adesão e a proliferação celular na superfície, fazem parte da primeira fase da interação célula-material [18]. Neste estudo não foi quantificada a proliferação celular, mas podemos observar que as células aderidas nos filmes de BPU apresentaram uma tendência crescente de proliferação durante os períodos de cultura. Conclusões Através da síntese em uma etapa foi possível obter poliuretanos com características para aplicação na área médica como um possível biomaterial. As técnicas de espectroscopia no

9 infravermelho, calorimetria diferencial de varredura e GPC mostraram que os polímeros produzidos foram poliuretanos com graus de cristalinidade variados e diferentes massas molares. O ensaio de citotoxicidade in vitro feito com uma superfície de BPU sintetizado mostrou que este biopolímero não é tóxico e que ocorre a adesão e crescimento de células de fibroblastos neste meio. A próxima etapa do trabalho é sintetizar biopoliuretanos com maior massa molar e com porosidade em sua superfície o que caracteriza um material com maior possibilidade de adesão celular e, por conseqüência, melhor crescimento celular. Agradecimentos Ao CNPq pela bolsa de iniciação científica da aluna Natália Andréa de Carvalho, a Faculdade de Química e ao Instituto de Pesquisas Biomédicas da PUCRS. Referências Bibliográficas 1. G.A.Soares. Biomateriais. Fórum de Biotecnologia Biomateriais, Rio de Janeiro, J. Dodge, Polyurethanes and Polyureas. In: Synthetic Methods in Step-Growth Polymers. Rogers, M. E.; Long, T. E. John Wiley & Sons, 197, M. Melchiors, M. Sonntag, C. Kobusch, E. Jürgens, Progress in Organic Coatings. 2000, 40, E. Meyer, G. Beer, A. Lang, M. Manestar, T. Krucker, S. Meier, D. Mihic-Probst, P. Groscurth, Clinical Anatomy, Original Communication, 2007, 20, V. D. Jahno, Tese de Doutorado, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Y. Hori, M. Suzuki, Y. Okeda, T. Imai, M. Sakagushi, Macromolecules, 1992, 25, M. Barikani, M. Mohammadi, Carbohydrate Polymers, 2007, 68, Poliuretanos. Disponível em: <http// Acesso em: 20/01/ S. Grad, L. Kupcsik, K. Gorna, S. Gogolewski, M. Alini, Biomaterials, 2003, 24, X. Jiang, J. Li, M Ding, H. Tan, Q. Ling, Y. Zhong, Q. Fu, European Polymer Journal. 2007, 43, V. D. Jahno, G. B. M. Ribeiro, L. A. Santos, R. Ligabue, S. Einloft, M. R. W. Ferreira, K. F. B. Prado, Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2007, 82, ASTM D Methods of Testing Urethane Foam Isocyanate Raw Materials. Withdrawn, V. M. S de Oliveira, Dissertação, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, N. Vogelsanger; M. C. Formolo; A. P. T. Pezzin; A. L. dos S. Schneider; S. A. Furlan, H. P. Bernardo; S. H. Pezzin;

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