INCORPORAÇÃO E CINÉTICA DE LIBERAÇÃO DE SAIS DE DEXAMETASONA A PARTIR DE POLIURETANO BIODEGRADÁVEL CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE ARGILA

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1 INCORPORAÇÃO E CINÉTICA DE LIBERAÇÃO DE SAIS DE DEXAMETASONA A PARTIR DE POLIURETANO BIODEGRADÁVEL CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE ARGILA Gisele Rodrigues 1, Armando Cunha 1, Eliane Ayres 2, Rodrigo L. Oréfice 2 * 1 Faculdade de Farmácia da UFMG -; 2 Departamento de Engenharia Metalúrgica e de Materiais da UFMG, Rua Espírito Santo 35/206, Belo Horizonte/MG - rorefice@demet.ufmg.br Incorporation and kinetics of release of dexamethasone salts from biodegradable polyurethanes containing clay nanoparticles Controlled deliver of drugs is a major issue in the treatment of ocular diseases, such as in the treatment of uveitis. In this study, dexamethasone salts, an important type of corticoid used in the treatment of some uveitis, was incorporated into a biodegradable polyurethane () containing clay nanoparticles. The biodegradable polyurethane was obtained by preparing a aqueous dispersion having poly(caprolactone) and/or poly(ethylene glycol) as soft segments. The drug was incorporated into the polymer by dissolving it in the aqueous dispersion. FTIR results were useful in showing the presence of the drug in the polymer with its original chemical structure. Electron micrographs showed that the drug was homogeneously distributed throughout the polymer while the nanoparticles were slightly confined to the regions previously filled with the aqueous part of the precursor dispersion. The presence of poly(ethylene glycol) as soft segment did not affect the kinetics of dexamethasone release, while the presence of the nanoparticles increase the rate of drug release. Introdução Poliuretanos podem ser biodegradáveis e a degradação in vivo ocorre principalmente via hidrólise [1]. A velocidade de biodegradação desse tipo de polímero é extremamente dependente de sua estrutura química e por isso pode ser controlada através da natureza dos reagentes escolhidos para sintetizá-lo [2]. Poliuretanos biodegradáveis com propriedades mecânicas mais atraentes são obtidos com poliésteres de alta massa molar. Por outro lado, a velocidade de degradação hidrolítica e enzimática diminui com o aumento do comprimento da cadeia do poliéster. Freqüentemente o poli(etileno glicol) (PEG) é usado como co-monômero na síntese de polímeros degradáveis devido a sua boa biocompatibilidade e biodegradabilidade. Lee et al. [3] sintetizaram poliuretanos com segmentos de PEG. Os segmentos de PEG incorporados ao poliuretano aumentaram a velocidade da hidrólise. Polímeros com propriedades mecânicas elastoméricas, propriedades de biodegradação controláveis e citocompatibilidade são extremamente atrativos para inúmeras aplicações biomédicas. A síntese de poliuretanos com essas características foi reportada por Guan et al. [] que sintetizaram copolímeros tribloco a base de poli(ε-caprolactona) e poli(etileno glicol) (PCL-PEG- PCL), butildiisocianato e putrescina como extensor de cadeia. A fim de investigarem a aplicação potencial do poliuretano contendo um componente ativo, Mahkam et al. [5] estudaram a hidrólise dos polímeros nas condições fisiológicas. A presença de segmentos de poli(etileno glicol) aumentou a hidrofilia e flexibilidade do polímero e fez com que as ligações ficassem mais susceptíveis à

2 hidrólise. Poliuretanos biomédicos que tiram proveito das propriedades mecânicas proporcionadas pelo PCL, e das altas taxas de degradação do PEG, podem ser utilizados em aplicações que demandam materiais flexíveis tais como na engenharia de tecidos macios (pele e vascularização). No exemplo reportado por Yeganeh et al. [6], as curvas de tensão versus deformação mostraram que o PCL, usado como segmento macio, produz um poliuretano com propriedades mecânicas significativamente mais altas, quando comparado com PEG. Esse comportamento foi atribuído a forças intermoleculares mais intensas associadas com grupos polares. A absorção de água, no entanto, foi maior para amostras com teor de PEG mais alto. Para ilustrar a produção de suportes porosos biodegradáveis Guan et al. [7] utilizaram poliuretanos. As células colocadas no suporte produzido com poli(éster-uréia-uretano) cresceram mais lentamente do que aquelas colocadas no suporte produzido com poli(éter-éster-uréia-uretano). O éter (PEG), por ser mais hidrofílico, degradou mais rapidamente e demonstrou um transporte de metabólitos mais eficiente. Inúmeras aplicações podem ser propostas para os poliuretanos biodegradáveis, sendo que uma das mais interessantes está relacionada à possibilidade de torná-los sistemas de liberação controlada de fármacos, a partir da incorporação prévia destes fármacos. Estes sistemas poderiam ser implantados em órgãos ou tecidos específicos, para o tratamento de diferentes doenças. Na oftalmologia, estes sistemas biodegradáveis implantáveis apresentariam grande utilidade, visto que, possibilitariam o tratamento das uveítes, doenças inflamatórias graves que acometem o segmento posterior do olho, já que distribuiriam o fármaco diretamente no local de ação, permitindo a manutenção de níveis terapêuticos eficazes, por um período de tempo prolongado e com risco mínimo de efeitos colaterais. Cabe ressaltar, que o tratamento das uveítes tem sido um problema devido à dificuldade de penetração de fármacos dentro do olho. A administração de colírios, embora seja o método mais empregado, apresenta efeito terapêutico mínimo na região posterior do olho, que geralmente, é mantido com aplicações freqüentes da formulação. A via sistêmica pode ser utilizada com essa finalidade, mas também se observa baixa penetração no olho em virtude da existência de barreiras naturais, que dificultam a entrada dos fármacos por meio da circulação sanguínea. Logo, para que se obtenha uma concentração do fármaco dentro da faixa terapêutica utilizando a via sistêmica, é necessária a administração de concentrações elevadas durante um período prolongado, podendo ocasionar sérios efeitos adversos em outros órgãos do corpo humano. Devido às razões acima

3 descritas, os sistemas de liberação controlada de fármacos dentro do olho apresentam-se como alternativa promissora para o tratamento das uveítes [8, 9]. Considerando a aplicabilidade biomédica dos poliuretanos biodegradáveis derivados de poli(caprolactona diol), nos quais foram inseridas nanopartículas do argilomineral montmorilonita, decidiu-se, neste trabalho, incorporá-los aos sais de dexametasona, fármacos tipicamente usados no tratamento das uveítes. Experimental Materiais Desmodur I (isoforona diisocianato, IPDI), (Bayer), Tone Polyol 2221 e 029 (diol policaprolactona, PCL 1000g/mol e PCL 2000g/mol respectivamente) (Dow Química), Poli(etileno glicol) (MM 1500), Ácido dimetilolpropiônico (DMPA) (99% Fluka,), Liocat 118 (dibutil-dilaurato de estanho) (Miracema Nuodex), Trietilamina (TEA) (98%, Vetec) e Hidrazina (HZ) (6%, Arch Química do Brasil), Fosfato de dexametasona, Acetato de dexametasona (Sigma-Aldrich Co., USA) foram usados conforme recebidos. A argila montmorilonita (MMT) Cloisite Na + foi adquirida da Southern Clay Products (USA) e usada sem qualquer tipo de tratamento ou purificação. Síntese das dispersões aquosas de poliuretano As dispersões aquosas (Tabela I) foram preparadas pelo método convencional de pré-polímero no qual a TEA é adicionada para neutralizar os grupos COOH. PCL 1000 e PCL 2000, DMPA e IPDI (NCO/OH= 2,3) foram adicionados ao reator na presença de DBDLT e a mistura reacional foi aquecida até ºC em ambiente de N 2. Esta temperatura foi mantida até que a quantidade teórica de grupos NCO residual, calculada de modo que todos os grupos hidroxila reajam com os grupos isocianato, fosse atingida. Foi então obtido um pré-polímero com grupos NCO terminais. O prépolímero foi resfriado até 50 ºC e foi adicionada TEA a fim de neutralizar os grupos COOH do DMPA. O pré-polímero neutralizado foi então disperso em água e logo após foi adicionado o extensor de cadeia (HZ). Os filmes de poliuretano foram produzidos por vazamento das dispersões em moldes de Teflon, secagem em temperatura ambiente por 1 semana e pós-cura em estufa à 60 ºC por 2 h. Como descrito na Tabela I, dois tipos de poliuretanos foram produzidos: (1) D5 contendo apenas poli(caprolactona) como segmento flexível e (2) D6 contendo, além da poli(caprolactona), também PEG no segmento flexível.

4 Tabela I Formulação (% em massa) das dispersões aquosas de poliuretano a IPDI PCL 1000 PCL 2000 PEG 1500 DMPA TEA H 2 O HZ D-5 8,58,85 9,09-0,97 0,73 7,70 1,08 D-6 8,58,85 8,36 0,73 0,97 0,73 7,70 1,08 a 0,01 % of DBDLT baseado nas quantidades de IPDI, PEG e DMPA. Incorporação da argila MMT - Cloisite Na + A incorporação de 5% em massa da argila Cloisite Na + foi obtida misturando-se uma dispersão aquosa de argila previamente preparada com as dispersões aquosas de poliuretano. A dispersão aquosa de argila (5 % em massa) foi preparada em temperatura ambiente através de agitação vigorosa por 2 horas. Incorporação dos fármacos Fosfato de dexametasona e acetato de dexametasona foram incorporados nos polímeros através da dissolução destes nas dispersões aquosas de poliuretano (D5 e D6), sob agitação vigorosa por 30 minutos, visando obter concentrações no polímero de 5% em massa. Caracterização Os experimentos de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier foram realizados em um espectrofotômetro Perkin Elmer, modelo Spectrum Os espectros dos filmes foram obtidos usando-se a técnica ATR (Reflexão Total Atenuada) a partir de 32 varreduras com uma resolução de cm -1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) combinada com EDS foi utilizada a partir do equipamento Jeol, modelo JSM LV. As amostras foram previamente fraturadas e as superfícies de fratura foram recobertas com ouro. Os ensaios de liberação foram realizados em solução tampão fosfato 0,1 mol/l, ph 7, (PBS), em incubadora mantida à 37 C. A presença de dexametasona no extrato lixiviado foi quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência. As condições cromatográficas estão descritas na Tabela II [10]. Resultados e Discussão A Figura 1 mostra os espectros de infravermelho para poliuretanos contendo acetato de dexametasona (Figura 1-a), além dos espectros correspondentes ao acetato de dexametasona puro

5 (Figura 1-b) e poliuretano D5 (Figura 1-c). Nos espectros das Figuras 1-a e 1-c, absorções típicas de poliuretanos podem ser observadas, como: 3300cm -1 - vibrações de estiramento do grupamento amina primária; absorções entre cm -1 - estiramento do grupo CH 2 assimétrico e estiramento do grupo CH 2 simétrico; absorções em ~150cm -1 - deformação do grupo CH 3 ; absorções em 1730cm -1 - carbonila. O resultado de uma subtração espectral entre os espectros a e c também está incluído nesta figura (Figura 1-d) para permitir a constatação direta da presença da droga incorporada no polímero. As bandas de absorção em 1659 e 882 cm -1 são observadas tanto nos espectros da droga pura como no espectro do polímero contendo a droga, o que permite não só provar o sucesso do método de incorporação da droga, mas também sugere a manutenção da integridade da droga inserida na matriz polimérica (já que as bandas de absorção dos grupos funcionais permanecem inalteradas). Tabela II Condições cromatográficas para a quantificação do acetato e do fosfato de dexametasona Acetato de dexametasona Fosfato de dexametasona Fase móvel água e acetonitrila (50:50), ph 2,5 água e acetonitrila (65:35), ph 2,5 Fluxo da fase móvel 1 ml/minuto 1 ml/minuto Eluição isocrática isocrática Detecção 25 nm 25 nm Coluna C18 (5 µm 150 x 3,9 mm d.i.) C8 (5 µm 250 x 3 mm d.i.) Temperatura da coluna 30 o C 30 o C O mesmo tipo de resultado é obtido quando a espectroscopia de infravermelho é usada para caracterizar a incorporação do fosfato de dexametasona em D5 (Figura 2). Neste caso, a subtração espectral (Figura 2-d) evidencia bandas de absorção típicas do fosfato de dexametasona: 1661 e 979cm -1. Tais resultados (também observados para as amostras contendo argila e D6) novamente demonstram a capacidade do método usado em incorporar e manter a integridade química dos fármacos. A Figura 3 mostra uma micrografia obtida por Microscopia Eletrônica de Varredura da superfície de fratura de uma amostra de poliuretano D5 contendo nanopartículas de argila e fosfato de dexametasona. Os resultados da análise química puntual (EDS) indicaram que a concentração de fosfato de dexametasona (avaliada através da presença do fósforo) é semelhante ao longo da microestrutura do material. Por outro lado, o aspecto morfológico da superfície permite observar uma diferença de microestrutura que, quando caracterizada por EDS, sugeriu uma variação em relação a composição da argila (investigada através do silício e alumínio). Tal variação se deve

6 provavelmente à uma concentração da argila, durante a secagem das amostras, na regiões inicialmente ocupadas pelo meio aquoso da dispersão de. A Figura ilustra esquematicamente o proposto processo de segregação parcial das nanopartículas de argila durante a secagem das dispersões de. (a) (c) (d) D5 + acetato de dexametasona Acetato de dexametasona D5 Diferença: (a) (c) Absorbância (relativa) (a) 3297 (c) (d) Número de onda (cm -1 ) Figura 1 - Espectros de infravermelho obtidos para poliuretanos D5 contendo acetato de dexametasona. A Figura 5 mostra a curva de cinética de liberação para o acetato de dexametasona incorporado em D5 sem (a) e com nanopartículas de argila. Pode-se perceber que a liberação alcança um valor de 2,7% em 60 dias de ensaio para o sistema sem argila e cerca de 10% para o com argila. Tal aumento na velocidade de liberação pode ser devido a dois fatores: (1) a presença da argila hidrofílica aumenta também a hidrofila de todo o material, o que favorece a absorção de água, lixiviação do fármaco e hidrólise do poliuretano (hidrólise dos segmentos devido ao poliéster poli(caprolactona)); (2) a presença das nanopartículas de argila pode perturbar a microseparação de fase do poliuretano, resultando em um material mais homogêneo e, dessa forma, mais vulnerável à penetração da água e hidrólise do.

7 (a) (c) (d) D5 + fosfato de dexametasona Fosfato de dexametasona D5 Diferença: (a) (c) Absorbância (relativa) (a) (c) (d) Número de onda (cm -1 ) Figura 2 - Espectros de infravermelho obtidos para poliuretanos D5 contendo fosfato de dexametasona. Figura 3 Micrografia obtida por MEV da superfície de fratura de uma amostra de D5 contendo fosfato de dexametasona e nanopartículas de argila. Na parte de baixo da figura: análise EDS de áreas específicas da amostra.

8 Nanopartículas de argila DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO Secagem -H 2 O DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO DexaPO Fosfato de dexametasona Meio aquoso Figura Modelo proposto para a tendência de segregação das nanopartículas de argila durante a secagem das dispersões de. Porcentagem acumulada (a) Liberação de Acetato de Dexametasona D5 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0, Dias Porcentagem acumulada Liberação de Acetato de Dexametasona D5 com MMT 12,00 10,00 8,00 6,00,00 2,00 0, Dias Figura 5 Cinética de liberação do acetato de dexametasona incorporado em matrizes de (a) D5 e de D5 com nanopartículas de argila. A Figura 6 mostra a curva de cinética de liberação para o acetato de dexametasona incorporado em D6 (poliuretano contendo segmentos macios derivados de poli(caprolactona) e poli(etileno glicol)) sem (a) e com nanopartículas de argila. Porcentagem acumulada Liberação de Acetato de Dexametasona D6 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0, Dias Porcentagem Acumulada Liberação Acetato de Dexametasona D6 com MMT Dias Figura 6 Cinética de liberação do acetato de dexametasona incorporado em matrizes de (a) D6 e de D6 com nanopartículas de argila. Os resultados de liberação em 60 dias para o D6 são muito parecidos aos observados na Figura 5 para o acetato de dexametasona em D5. Este fato mostra que a presença do poli(etileno glicol), apesar de aumentar a hidrofilia do, não alterou significativamente as velocidades de liberação.

9 Conclusões Neste trabalho foi demonstrada a possibilidade de incorporação de sais de dexametasona em poliuretano biodegradável contendo nanopartículas de argila através da dissolução dos mesmos na dispersão aquosa do poliuretano. Resultados de FTIR e microscopia eletrônica de varredura mostraram que houve incorporação homogênea do fármaco no polímero. Os ensaios de liberação mostraram que a velocidade de liberação do acetato de dexametasona é profundamente ampliada quando o polímero apresenta nanopartículas de argila. Tal resultado foi associado aos fatos de que a presença da argila aumenta a hidrofilia dos materiais e perturba a separação de microfase do, gerando sistemas mais sensíveis a absorção de água e hidrólise. Este material biodegradável apresenta a potencialidade de se tornar um sistema de liberação controlada de dexametasona para aplicabilidade biomédica. Agradecimentos Os autores agradecem ao CNPq e FAPEMIG pelo suporte financeiro. Referências Bibliográficas 1. J. P. Santerre; K. Woodhouse; G. Laroche; R. S. Labow. Biomaterials 2005, 26, W. Jia; C. Liu; L. Fan; M. Huang; H. Zhang; G. Chao; Z. Qian; B. Kan; A. Huang; K. Lei; C. Y. Gong; J. Zhao; H. Deng; M. Tu; Y Wei. Materials letters 2006, 60, S. I. Lee; S. C. Yu; Y. S. Lee. Polymer Degradation and Stability 2001, 72, J. Guan; M. S. Sacks; E. J. Beckman; W. R. Wagner. Biomaterials 200, 25, M. Mahkam; M. S. Sanjani. Polymer degradation and Stability 2003, 80, H. Yeganeh; M. M. Lakouraj; S. Jamshidi. European Polymer Journal 2005, 1, J. Guan; K. L. Fujimoto; M. S. Sacks;W. R. Wagner. Biomaterials 2005, 26, H. Kimura; Y. Ogura. Ophthalmologia, 2001, 215, M. D. Yasukawa; H. Kimura; Y. Tabata; Y. Ogura. Advanced Drug Delivery Reviews, Amsterdam, 2001, 52, C. V. Garcia; A. R. Breier; M. Steppe; E. E. S. Schapoval; T. P. Oppe. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2003, 31, 597.