2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Lei de Bragg e Espaço Recíproco
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1 2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr Lei de Bragg e Espaço Recíproco 1
2 Cristalografia Etapas para resolução da estrutura 3D de macromoléculas biológicas por cristalografia 3. Interpretação do padrão de difração de raios X 2. Coleta de dados de difração de raios X. 1. Cristalização. 4. Resolução da estrutura. 5. Análise. 2
3 Lei de Bragg Considere um conjunto de planos paralelos de um retículo cristalino, como mostrado na figura ao lado. A distância entre os planos consecutivos do retículo cristalino é chamada distância interplanar (d). Na figura temos um feixe paralelo de raios X de comprimento de onda, incidindo sobre este conjunto de planos paralelos. Podemos analisar a difração de raios X como se fosse resultado da reflexão dos raios X pelos planos. Para que ocorra difração num dado ângulo, é necessário que as ondas difratadas sofram interferência construtiva. Veja bem, a reflexão é uma analogia, fisicamente não ocorre tal reflexão. Raios X incidentes Raios X difratados d 3
4 Lei de Bragg Analisemos a diferença de caminho ótico dos feixes 1 e 2, indicados na figura. O feixe 2 percorre a distância A + B a mais que o feixe 1. Assim, para que as ondas dos feixes 1 e 2 sofram interferência construtiva, a diferença de caminho ótico entre elas deve ser um número inteiro de comprimentos de onda. 1 2 A d B d 1 2 A + B = 2.A = 2 d.sen d d.sen 4
5 Lei de Bragg A diferença de caminho ótico (2 d.sen ) tem que ser um número inteiro de comprimento de ondas (n.), onde n é inteiro, assim temos: d.sen = n. (Lei de Bragg) A d B d d d.sen 5
6 Aplicação da Lei de Bragg Num experimento típico de difração de raios X, temos a fonte de radiação, o cristal e o detector, como mostrado no diagrama esquemático abaixo. Normalmente os ângulos de difração são expressos em relação ao feixe incidente, ou seja, 2. 2 Fonte de raios X Cristal 6
7 Aplicação da Lei de Bragg Ao coletarmos dados de difração de raios X de um cristal, usando-se uma geometria como a mostrada no slide anterior, teremos picos de difração para todos os ângulos 2 que satisfaçam à lei de Bragg. Se elaborarmos o gráfico da intensidade da radiação difratada contra o ângulo de espalhamento (2), teremos um gráfico com o aspecto mostrado ao lado. Toda vez que posicionamos o nosso detector, num ângulo que satisfaz à lei de Bragg, teremos um pico no gráfico. 7
8 Aplicação da Lei de Bragg Equipamentos que medem o padrão de difração de raios X, são chamados de difratômetros. Há uma grande variedade de tipos e formas de difratômetro de raios X, dependendo do tipo de experimento que se deseja realizar. A figura abaixo mostra um difratômetro de pó, usado para amostras policristalinas. 8
9 Filme fotográfico ou placa de imagem Aplicação da Lei de Bragg No caso de colocarmos um filme fotográfico para registrar a imagem de difração de raios X, como mostrado no diagrama abaixo, teremos um padrão de difração de raios X bidimensional, quanto mais distante o ponto de difração de raios X do ponto central da figura (feixe direto) maior o ângulo de espalhamento (2). A foto da direita foi girada 90 º com relação ao diagrama de esquerda. No aparato experimental o filme ou placa de imagem está perpendicular ao plano. Feixe de raios X 2 Feixe direto Cristal Filme fotográfico ou placa de imagem 9
10 Difração da Luz Visível Para entender a difração da luz visível, temos que considerar a luz como formada por ondas eletromagnéticas. Sabemos que as ondas sofrerão interferência construtiva, toda vez que estiverem em fase (picos e vales coincidentes). Assim, temos pontos de difração somente quando as ondas difratadas sofrem interferência construtiva. Ao analisarmos a geometria do diagrama esquemático abaixo, podemos obter relações geométricas similares à lei de Bragg da difração de raios X. Temos um feixe de luz incidente sobre o CD. A luz incide sobre as trilhas consecutivas do CD, que refletem a luz. Teremos interferência construtiva, toda vez que os feixes de luz 1 e 2 refletirem em fase, ou seja, quando a diferença de caminho ótico (x) entre os feixes 1 e 2, for um número inteiro (n) de comprimentos de onda da radiação incidente. 10
11 Difração da Luz Visível Analisando o diagrama da figura abaixo, vemos que os feixes 1 e 2 incidem no CD e ao serem refletidos fazem um ângulo, com relação ao feixe incidente. Para que os feixes refletidos 1 e 2 estejam em fase, é necessário que a diferença de caminho ótico x seja um número inteiro (n) de comprimento de ondas (). Da análise do triângulo retângulo vemos que x = d.sen, assim temos: d.sen = n. (Equação 1) Esta equação é similar à lei de Bragg ( 2d.sen = n.), a razão para a ausência do fator 2 para luz visível é que não temos planos sucessivos, como no cristal. 11
12 Difração da Luz Visível A figura abaixo mostra o arranjo experimental, que usaremos para demonstrar a difração da luz visível. Temos uma fonte de laser, um ponteiro que gera luz vermelha de comprimento de onda de 680 nm (6800 Å). Tal feixe reflete no CD e gera um padrão de pontos de difração. 12
13 Difração da Luz Visível Colocaremos o CD no arranjo experimental, conforme o diagrama da figura abaixo, e seguiremos os seguintes passos. 1) Meça a distância y 1 em cm com a régua. y 1 = cm 2) Meça a distância L com a régua. L = cm 13
14 Difração da Luz Visível A partir da equação 1 determine o valor de d (espaçamento entre as trilhas), sabendo que, sen 1 y 1 L d n.λ senθ senθ 1 9 m 14
15 Índices de Miller Consideremos uma cela unitária, como mostrada na figura ao lado, as conclusões referentes à esta cela unitária, no que tange às propriedades dos índices de Miller, valem para os outros sistemas cristalinos, com exceção do sistema hexagonal, que não discutiremos aqui. Na análise do fenômeno de difração de raios X, uma atenção especial é dada para o conjunto de planos paralelos que difratam. Tal conjunto de planos paralelos, num retículo cristalino, pode ser representado por um conjunto de inteiros, relacionados aos interceptos com os eixos x, y e z. Para simplificar a explicação consideremos os seguintes exemplos. x z y 15
16 Índices de Miller O plano ilustrado ao lado intercepta o eixo x na posição 1, e é paralelo aos eixos y e z. Os índices de Miller deste plano obtémse com o inverso dos interceptos aos eixos x, y e z. Os interceptos são 1,, ; e o inverso é 1, 0, 0, assim o índice de Miller do plano em cinza mostrado ao lado é (100). Na verdade estes índices indicam a família de planos paralelos a ele e que interceptam o eixo x em a, 2, 3, 4,... z (100) y x 1 16
17 Índices de Miller O plano, mostrado na figura ao lado, intercepta o eixo x em 1, o eixo y em 1 e é paralelo ao eixo z. O índice de Miller é (110). z (110) 1 y x 1 17
18 Índices de Miller O plano ao lado intercepta o eixo x em 1, o eixo y em 1 e o eixo z em 1. O índice de Miller é (111). z 1 (111) 1 y x 1 18
19 Índices de Miller O plano ao lado intercepta o eixo x em 1, o eixo z em 1 e é paralelo ao eixo y. O índice de Miller é (101). z 1 (101) 1 y x 1 19
20 Índices de Miller O plano ao lado intercepta o eixo y em 1, o eixo z em 1 e é paralelo ao eixo x. O índice de Miller é (011). z 1 (011) 1 y x 1 20
21 Índices de Miller O plano ao lado intercepta o eixo x em 1/2, o eixo y em 1 e é paralelo ao eixo z. O índice de Miller é (210). z ½ (210) 1 y x 21
22 Índices de Miller O plano ao lado intercepta o eixo x em 1/4, o eixo y em 1 e é paralelo ao eixo z. O índice de Miller é (410). z ¼ (410) 1 y x 22
23 Índices de Miller Ao lado temos a indicação dos planos (100), paralelo ao plano yz, (010) paralelo ao plano xz e (001) paralelo ao plano xy. z (001) (100) (010) y x 23
24 Índices de Miller Na figura ao lado temos um plano interceptando o eixo y em ½ e paralelo ao plano xz, determinamos os índices de Miller invertendo-se o intercepto em y, assim temos (020). z (020) ½ y x 24
25 Índices de Miller Na figura ao lado temos um plano interceptando o eixo y em 1/4 e paralelo ao plano xz, determinamos os índices de Miller invertendo-se o intercepto em y, assim temos (040). z (040) 1/4 y x 25
26 Índices de Miller Toda vez que o plano corta a origem, coordenadas 0,0,0; temos que lembrar que esta representação refere-se a um cristal, onde temos repetição da cela unitária em três dimensões, como mostrado ao lado. z 1 y x O plano equivalente corta o eixo x em 1 e o eixo y em -1, sendo paralelo à z, os índice de Miller são (1-1 0), a notação cristalográfica usa uma barra sobre números negativos: (110) 26
27 Índices de Miller A cela unitária ao lado tem parâmetros de cela unitária a = 4 Å, b = 8 Å e c = 3 Å, consideremos um plano que intercepta a cela unitária em x = 1 Å, y = 4 Å e z = 3 Å. Determinaremos o índices de Miller do plano seguindo-se o seguinte algoritmo. 1) Tomemos os interceptos nos eixo x, y e z: x = 1 Å, y = 4 Å e z = 3 2) Calculemos a fração do eixo de cada intercepto: ¼, 4/8 e 3/3 ou seja, ¼, ½, 1 3) Invertemos essas frações, como segue: 4, 2, 1. Os índices de Miller desse plano são (421) x z 3 Å c = 3 Å 1 Å a = 4 Å 4 Å b = 8 Å y 27
28 Índices de Miller Vetores perpendiculares a planos cristalinos de índice de Miller (hkl) recebem índices da direção [hkl], em notação cristalográfica, qualquer direção, indicada por [hkl] representa a direção de um vetor perpendicular ao plano (hkl). Na cela unitária ao lado temos as direções [100], [010] e [001] indicadas, essas direções são perpendiculares aos planos (100), (010) e (001), respectivamente. z [001] (001) (100) (010) y x [100] [010] 28
29 Espaço Recíproco O espaço recíproco pode ser definido como um conjunto de pontos, onde cada ponto é determinado como segue: considere normais a todos os planos do espaço (hkl), saindo de um ponto O, considerado como origem. Cada normal aos plano (hkl) finaliza em um ponto, a uma distância d hkl* = 1/d hkl, onde d hkl é a distância interplanar dos planos (hkl), este conjunto de pontos (terminações das normais) é que formam o espaço recíproco. Vamos ilustrar em duas dimensões. y O x Ponto do espaço recíproco Ponto do espaço direto (110) 29
30 Espaço Recíproco Consideremos o espaço direto, representado abaixo, vamos determinar alguns pontos do espaço recíproco. Seja o plano (110), representado pela linha vermelha, consideremos uma origem arbitrária, indicada por O. Vamos traçar um vetor de O, perpendicular ao plano (110), o tamanho deste vetor é d 110*, assim temos um ponto do espaço recíproco no final deste vetor. y O x d hkl * Ponto do espaço recíproco Ponto do espaço direto (110) 30
31 Espaço Recíproco Para os planos (120) e (130) temos os pontos indicados. Resumindo, aplicandose sucessivamente este processo, teremos um conjunto de pontos dos espaço recíproco, para cada plano do espaço direto, ou seja, temos uma correspondência entre os potenciais planos refletores e pontos do espaço recíproco. y O x Ponto do espaço recíproco Ponto do espaço direto (130) (110) (120) 31
32 Espaço Recíproco As propriedades geométricas de um retículo recíproco são as inversas do retículo cristalino. Consideremos uma cela unitária com parâmetros relativamente grandes (a, b, c), como o parâmetros de cela unitária de cristais de proteínas. A cela recíproca (a *, b *, c * ) é pequena (propriedade recíproca). c c * z a a * b * b y x 32
33 Espaço Recíproco Agora temos uma cela unitária direta relativamente pequena (a,b,c) a cela recíproca é grande (a *, b *, c * ). c * z c a b * a * b y x 33
34 Espaço Recíproco O espaço recíproco é um artefato matemático criado para auxiliar na interpretação do processo de difração de raios X. O espaço recíproco, determinado pelos eixos recíprocos a *, b *, c * e ângulos *, * e * está relacionado com o espaço direto, representado pelos eixos a, b, c e ângulos, e. A dimensão do espaço recíproco é o inverso do comprimento, consequentemente suas unidades são inversas das unidades de comprimento(m -1, cm -1, Å -1 e outras). As equações abaixo relacionam os eixos diretos com os recíprocos. a * = bc sen V b * = ac sen V c * = ab sen V V = 1/V * = abc(1 cos 2 - cos 2 - cos cos.cos.cos ) 1/2 V * = 1/V = abc(1 cos 2 * - cos 2 * - cos 2 * + 2 cos *.cos *.cos * ) 1/2 34
35 Espaço Recíproco Os ângulos *, *, * e,, são dados pelas seguintes equações. cos * = cos cos - cos sen sen cos = cos * cos * - cos * sen * sen * cos * = cos cos - cos sen sen cos * = cos * cos * - cos * sen * sen * cos * = cos cos - cos sen sen cos * = cos * cos * - cos * sen * sen * 35
36 Esfera de Ewald Podemos interpretar o fenômeno da difração de raios X por um cristal considerando-se uma esfera centrada no cristal, de raio 1/, como mostra a figura, essa esfera é chamada esfera de Ewald. Feixe difratado P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 36
37 Esfera de Ewald Toda vez que um ponto do retículo recíproco cruza a esfera de Ewald, temos a produção de um ponto de difração. Na figura abaixo um ponto do retículo recíproco é representado por intersecção das linhas. Feixe difratado P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 37
38 Esfera de Ewald O ponto P produz um ponto de difração, ao girarmos o cristal giramos o retículo recíproco, trazendo novos pontos em condição de difração, como o ponto P. Feixe difratado P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 38
39 Esfera de Ewald O resultado líquido de girarmos o cristal é que podemos registra diversos pontos de difração. Normalmente, em coleta de dados, que usa a geometria da câmara de oscilação, este recurso é usado para obtenção de diversos pontos por cada imagem medida. Feixe difratado P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 39
40 Esfera de Ewald O módulo de vetor de espalhamento é d (espaçamento interplanar), a partir da análise da figura podemos determinar a relação entre o ângulo, d e o comprimento de onda (), como segue. Feixe difratado P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 40
41 Esfera de Ewald Considere o triângulo APO, pela geometria da figura temos que o ângulo PÂO é, assim temos: Feixe difratado sen = S 2/ P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X A C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 41
42 Esfera de Ewald P é um ponto do espaço recíproco, assim seu comprimento é 1/d hkl, onde hkl são os índices dos planos relacionados com P. Assim temos: Feixe difratado sen = S 2/ = 1/d hkl 2/ P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X A C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 42
43 Esfera de Ewald Ou seja: 2.d sen = Feixe difratado P P Retículo recíproco S (vetor do espaço recíproco) Feixe de raios X A C Cristal O Feixe direto 1/ Esfera de Ewald 43
44 Esfera de Ewald Experimentalmente observamos que os pontos do retículo recíproco apresentam volume, ou seja, eles ficam em condição de difração um certo tempo, durante a rotação do retículo recíproco. Isto deve-se a fatores como a mosaicidade do cristal, ou seja, há uma leve desordem, o que não traz todas as celas unitárias em condição de difração, para um dado ponto do retículo, ao mesmo tempo. Feixe de Raios X Retículo recíproco Esfera de Ewald
45 Esfera de Ewald Podemos pensar no ponto do retículo recíproco como um nódulo, que durante a rotação do retículo recíproco entra em condição de difração (cruza a esfera de Ewald), fica um certo tempo nesta situação, durante a rotação e depois sai de condição de difração. Na animação ao lado temos um nódulo do retículo recíproco que entra em condição de difração, fica um certa tempo, e depois cessa a difração. O detector indica o registro da intensidade difratada por meio da coloração azul. Fonte: 45
46 Esfera de Ewald A câmara de oscilação, ou rotação, é o principal instrumento usado para o registro do padrão de difração de raios X de cristais de macromoléculas biológicas. O diagrama esquemático abaixo ilustra as principais características da câmara de oscilação. Placa de imagem Padrão registrado na placa de imagem Retículo recíproco Fonte de raios X Cristal Cabeça goniométrica 46
47 Esfera de Ewald As reflexões registradas na imagem de difração podem ser interpretadas como resultado da reflexão de um plano de índice hkl, onde hkl são os índices de Miller da família de plano. A distância interplanar é dado pela seguinte equação: Placa de imagem Padrão registrado na placa de imagem Retículo recíproco Fonte de raios X Cristal Cabeça goniométrica 47
48 Esfera de Ewald Uma das características geométricas da família de plano de índice hkl é a distância interplanar (d), que no caso dos sistemas ortorrômbico, tetragonal e cúbico é dada pela seguinte equação: 1 d h k l 2 2 a b c 2 Onde hkl são os índices do plano de reflexão, e a, b e c os parâmetros de cela unitária. Para os outros sistemas cristalinos a equação é a seguinte: d V[ h 2 b 2 c 2 sen 2 k 2 a 2 c 2 sen 2 l 2 a 2 b 2 sen 2 2hlab 2 c(cos.cos cos ) 2hkabc 2 (cos.cos cos ) 2kla 2 bc(cos.cos cos )] 1/ 2 Onde V é o volume da cela unitária. 48
49 Esfera Limite Ao girarmos o cristal, e consequentemente o retículo recíproco, podemos varrer uma ampla região do espaço recíproco. O número total de pontos do retículo recíproco, que podem cruzar a esfera de Ewald, pode ser determinado a partir da esfera limite. Girar o retículo recíproco é equivalente a girarmos a esfera de Ewald, que gera então uma esfera limite de raio 2/. Feixe de Raios X / Retículo recíproco Esfera de Ewald 2/ Esfera limite 49
50 Esfera Limite Os pontos do retículo recíproco dentro do volume da esfera limite podem ser trazidos em condição de difração. A determinação do número total de pontos que podem gerar padrões de difração de raios X é determinado dividindo-se o volume da esfera limite pelo volume da cela unitária recíproca, considerando-se que a cela unitária é primitiva. Feixe de Raios X / Retículo recíproco Esfera de Ewald 2/ Esfera limite 50
51 Esfera Limite Seja N o número de reflexões potencialmente gerados para uma esfera limite de raios 2/. Retículo recíproco N = V esfera limite V * N = 4/3 (2/) 3 V * Sabemos que: V * =1/V cell, onde V cell é o volume da cela unitária, assim temos: Feixe de Raios X Esfera de Ewald 1/ / N = 32 V cell 3 3 Esfera limite 51
52 Número Máximo de Reflexões Consideremos uma cela unitária ortorrômbica de dimensões 40 x 60 x 80 Å, que difrata a 2,5 Å de resolução, o volume da cela unitária é V cell = = Å 3. Usando-se a equação do número de reflexões temos: N = 32 V 3 3 = / 3.(2,5) 3 = reflexões Felizmente, por razões de simetria não é necessário coletar todas essas reflexões, 1/8 dos dados de difração de raios X, ou próximo disso normalmente é suficiente para o grupo espacial ortorrômbico primitivo ou aproximadamente reflexões. 52
53 Lista de Exercícios 1. Num experimento de difração de raios X tivemos 10 picos, registrados nas seguintes posições angulares: =========================== n 2. () () 1 11,0 5,5 2 22,4 11,2 3 33,2 16,6 4 45,2 22,6 5 57,0 28,5 6 70,4 35,2 7 84,6 42, ,6 50, ,0 60, ,4 74,2 =========================== Sabendo-se que o cristal é cúbico, determine o parâmetro de cela unitária médio. O comprimento de onda usado é 1,54 Å. 2. Consideremos um cristal cúbico primitivo com parâmetro de cela unitária a = 4 Å. Determine a posição angular, das 4 primeiras linhas de difração de raios X desse cristal, sabendo-se que o comprimento de onda da radiação incidente é 1,54 Å. 3. Consideremos uma cela unitária ortorrômbica de dimensões 40 x 60 x 80 Å, difratando a 1,54 Å de resolução. Determine o número máximo de reflexões possíveis. Data de entrega: 14/05/
54 Referências Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer- Verlag. Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2 nd ed.san Diego: Academic Press. Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons. 54
2018 Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Lei de Bragg e Espaço Recíproco
2018 Dr. Walter F. de Azevedo Jr. 000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000000 000000000000111111111110001100000000000 000000000001111111111111111111000000001 000000000111111111111111111111111000000
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