UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA

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1 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DOUTORADO EM ODONTOLOGIA Estudo da Rugosidade Superficial do Esmalte e do Sistema Antioxidante Pulpar em Dentes Humanos Submetidos ao Clareamento Dental com um Pincel de Auto-aplicação MÁRIO CEZAR SILVA DE OLIVEIRA Orientadora: Prof.ª Dra. Mariana Ferreira Leite Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia. SÃO PAULO 2014

2 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL O48e Oliveira, Mário Cezar Silva de. Estudo da rugosidade superficial do esmalte e do sistema antioxidante pulpar em dentes humanos submetidos ao clareamento dental com um pincel de auto-aplicação / Mário Cezar Silva de Oliveira. -- São Paulo; SP: [s.n], p. : il. ; 30 cm. Orientadora: Mariana Ferreira Leite. Tese (doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Polpa dentária - Patologia 2. Clareamento dental 3. Esmalte dentário 4. Peróxido de hidrogênio 5. Catalase. I. Leite, Mariana Ferreira. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós- Graduação em Odontologia. III. Título. CDU: (043.2)

3 UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Estudo da Rugosidade Superficial do Esmalte e do Sistema Antioxidante Pulpar em Dentes Humanos Submetidos ao Clareamento Dental com um Pincel de Auto-aplicação MÁRIO CEZAR SILVA DE OLIVEIRA Tese de doutorado defendida e aprovada pela Banca Examinadora em 21/08/2014. BANCA EXAMINADORA: Prof.ª Dra. Mariana Ferreira Leite Universidade Cruzeiro do Sul Presidente Profa. Dra. Michele Baffi Diniz Universidade Cruzeiro do Sul Prof.ª Dra. Rosemari Otton Universidade Cruzeiro do Sul Prof. Dr. Nelson Gnoatto Universidade Federal da Bahia Prof. Dr. Alex Correia Vieira Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia

4 DEDICATÓRIA Dedico esse trabalho à toda minha família, em especial a minha Mãe - eterna incentivadora dos meus sonhos, pelos esforços empreendidos durante todo o processo de minha formação educacional.

5 AGRADECIMENTOS A Deus, Pai eterno, sempre presente em minha vida. À Profª. Drª. Mariana Ferreira Leite, querida orientadora, pelo incentivo e paciência durante todo o trabalho, pelas explicações sempre claras e repletas de exemplos esclarecedores. Agradeço a todos os professores do Programa de Pós-graduação de Doutorado em Odontologia, área de concentração Odontopediatria, da Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL) que, direta ou indiretamente, contribuíram para a minha formação acadêmica. Agradeço a todos os colegas Doutorandos pelo companheirismo e atenção. Ao Professor Dr. Alex Correia Vieira pelo apoio e ajuda, nos procedimentos laboratoriais de rugosidade superficial, fundamentais para a realização do trabalho. Aos pacientes voluntários que se disponibilizaram para a realização deste trabalho. Aos colegas do UEFS, por todo o suporte durante minha ausência para realização do curso. A UEFS pelo suporte financeiro. E por último, a todos os não citados que de alguma forma contribuíram e foram igualmente importantes no processo de minha formação. Agradeço a todos vocês!

6 Oliveira MCS. Estudo da rugosidade superficial do esmalte e do sistema antioxidante pulpar em dentes humanos submetidos ao clareamento dental com um pincel de auto-aplicação [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; RESUMO O clareamento dental através da utilização de peróxidos representa o procedimento estético mais rotineiro na odontologia moderna. A polpa dentária apresenta uma proteção endógena composta por enzimas específicas do sistema antioxidante que degradam o peróxido de hidrogênio. Com o objetivo de avaliar a atividade das enzimas do sistema antioxidante no tecido pulpar após a realização do clareamento dental, foram selecionados 6 pares de pré-molares hígidos, divididos em 2 grupos de tratamento: o grupo 1 (experimental) foi tratado com um pincel clareador (Pola Paint) contendo 8% de peróxido de carbamida e o grupo 2 (controle) foi tratado com um gel a base de água. Após o período de 14 dias, os dentes foram extraídos e as polpas dentárias removidas para a determinação da concentração de proteína total, da atividade das enzimas catalase e glutationa peroxidase. A rugosidade superficial das coroas dentárias foi também analisada em ambos os grupos. A atividade enzimática da catalase e da glutationa peroxidase não apresentaram diferenças significantes no grupo experimental em relação ao controle, a rugosidade superficial também não sofreu alteração significante, porém a concentração de proteína total foi estatisticamente maior no grupo experimental (p 0,05). Conclusão: O clareamento dental com peróxido de carbamida a 8% por 14 dias não interfere na rugosidade superficial do esmalte dental e o tecido pulpar não aumenta a atividade enzimática para neutralizar a ação do agente clareador. Palavras-chave: Polpa dentária, Clareamento dental, Peróxido de hidrogênio, Esmalte dentário, Catalase.

7 Oliveira MCS. Study of surface roughness of the enamel and pulp antioxidant system in human teeth submitted to bleaching with a brush of self-application [tese]. São Paulo: Universidade Cruzeiro do Sul; ABSTRACT Tooth bleaching using peroxide is more aesthetic routine procedure in modern dentistry. The dental pulp has an endogenous protective composed of specific enzymes of the antioxidant system that degrade hydrogen peroxide. In order to evaluate the activity of enzymes of the antioxidant system in the pulp tissue after completion of bleaching were selected 6 pairs of healthy premolars were divided into 2 treatment groups: group 1 (experimental) was treated with a brush whitening (Pola Paint) containing 8% carbamide peroxide and group 2 (control) was treated with a water-based gel. After 14 days, the teeth were extracted and the dental pulp removed for determination of the activity of catalase, glutathione peroxidase. The surface roughness of dental crowns was also analyzed in both groups. The enzymatic activity of catalase and glutathione peroxidase did not differ significantly in the experimental group compared to the control, the surface roughness did not suffer significant changes, but the total protein concentration was statistically higher in the experimental group (p 0.05). Conclusion: The dental bleaching with carbamide peroxide 8% for 14 days does not affect the surface roughness of the enamel and the pulp tissue does not increase the enzymatic activity to counteract the action of the bleaching agent. Key-Words: Dental pulp, Dental bleaching, Hydrogen peroxide, Dental enamel, Catalase.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Gel Clareador Pola Paint Figura 2 Secção transversal coroa/raiz Figura 3 Remoção do tecido pulpar Figura 4 Polpa removida Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Tabela 1 Concentração de proteína total (mg/ml) do tecido pulpar de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8% Atividade enzimática da catalase (µmol/mg de proteína) do tecido pulpar de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8% Atividade enzimática da glutationa peroxidase (mu/mg de proteína) do tecido pulpar de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8% Rugosidade superficial (Ra) da superfície das coroas de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8% Concentração de proteína total total (mg de proteína/ml de homogenado a 5%), atividade enzimática da catalase (µmol/mg de proteína) e da glutationa peroxidase (mu/mg de proteína) do tecido pulpar e rugosidade superficial (Ra) da superfície das coroas de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8%

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CAT GPx H 2 O 2 LEDs OTC Cu Cr Mn Zn Catalase Glutationa peroxidase Peróxido de hidrogênio Luz emitida por diiodos Over-the-counter Cobre Cromo Manganês Zinco 1 O 2, Oxigênio singleto O 2._ Superóxido. NO Óxido nítrico. OH Hidroxila HO 2 ATP ROS DNA RNA SOD GSH GSSG GSH-Rd OH-1 dp mm Hidroperoxila Adenosina tri fosfato Reactive oxigen species Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico Superóxido dismutase Glutationa reduzida Glutationa oxidada Glutationa redutase Heme oxigenase-1 Desvio padrão Milímetro

10 µm Micrômetro Mol Ra mg ph Unidade para quantidade de substância Rugosidade superficial média Miligrama Potencial hidrogeniônico C Graus Celsius NADPH Fosfato dinucleótido de nicotinamida e adenina

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Agentes e Técnicas de Clareamento Dental Mecanismo do Clareamento Dental Riscos e Efeitos adversos Efeitos dos Agentes Clareadores nos Tecidos Mineralizados Efeitos dos Agentes Clareadores na Polpa Dental Radicais Livres Sistema de Defesa Antioxidante Pulpar OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos METODOLOGIA Considerações Éticas Casuística Critérios de Inclusão e Exclusão Composição e instruções de uso do agente clareador Obtenção das Amostras Análises Determinação da Atividade da Catalase Determinação da Atividade da Glutationa Peroxidase (GPx) Determinação da Concentração da Proteína Total Análise da Rugosidade Superficial das Coroas Análise Estatística RESULTADOS... 37

12 6 DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXO... 56

13 13 1 INTRODUÇÃO A crescente busca pela estética nas últimas décadas tornou o clareamento dental um dos procedimentos odontológicos mais difundidos e realizados no mundo (Li Y; GREENWALL, 2013). Atualmente os procedimentos clareadores estão divididos em três categorias: o clareamento de consultório (realizado pelo profissional); o clareamento caseiro (prescrito e supervisionado pelo profissional) e o clareamento caseiro com produtos de auto aplicação (sem supervisão profissional). Dentre esses procedimentos, o clareamento caseiro supervisionado tem sido considerado o método mais seguro e com menor incidência de efeitos adversos (JOINER, 2006; JOINER, 2007; SOARES et al., 2011; LIMA et al., 2013). Independente do método ou técnica clareadora, todos os produtos clareadores atuais são compostos basicamente por peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) ou peróxido de carbamida (JOINER, 2006). Esse composto químico instável tem baixo peso molecular, alto poder oxidativo, e grande capacidade de difusão no esmalte e dentina (FERRARI, 2004; GERLACH et al., 2005). Assim, quando o peróxido de hidrogênio entra em contato com a superfície dental, ele vai se difundir e atuar como um agente oxidante forte, produzindo radicais livres e quebrando ou alterando as ligações moleculares dos pigmentos presentes na dentina. Tais modificações irão alterar as propriedades ópticas da estrutura dentária, criando a percepção de uma cor mais branca. Portanto o clareamento é um processo oxidativo, que altera a absorção e reflexão da luz, tornando os dentes mais claros. (DAHL & PALLESEN, 2003; Li Y; GREENWALL, 2013) Estudos demonstram que o H 2 O 2 penetra através dos tecidos mineralizados (esmalte e dentina) podendo atingir a câmara pulpar (HANKS et al., 1993; CAMARGO et al., 2007, EIMAR et al., 2012; VIEIRA, 2012; ARAÚJO, 2012). A quantidade de H 2 O 2 que pode penetrar na câmara pulpar está diretamente relacionada à concentração do agente clareador, à técnica clareadora e ao tempo de contato do produto com a superfície dentária (BENNETI et al., 2004; CAMARGO et al., 2007; VIEIRA, 2012; ARAÚJO, 2012). O contato de células da polpa com estas

14 14 espécies reativas de oxigênio resulta na geração de um estresse oxidativo devido ao desequilíbrio entre a quantidade de radicais livres e dos antioxidantes endógenos e exógenos (MARKOWITZ, 2010; BONAFÉ et al., 2013). Tal desequilíbrio pode reduzir a viabilidade de células da polpa, provocar danos na membrana e degradação da matriz extracelular, e até mesmo necrose parcial do tecido pulpar (TRINDADE et al., 2009; DE SOUZA COSTA et al., 2010; SOARES et al., 2012; SATO et al., 2013). Embora alguns estudos tenda a sugerir o clareamento como um procedimento relativamente seguro, outras pesquisas continuam a relatar alguns efeitos adversos. Dentre eles, a sensibilidade dentária é o efeito colateral mais frequente (DAHL; PALLESEN, 2003; GOLDBERG; GROOTVELD; LYNCH, 2010). Também não está esclarecido qual a incidência de efeitos adversos na utilização ou abuso de produtos de auto aplicação. De acordo com Costa et al., 2007, a sensibilidade dentária é uma reação pulpar ao clareamento, e a polpa pode até mesmo sofrer necrose após o procedimento. Danos celulares causados pelos peróxidos têm sido bastante estudados e discutidos na literatura, entretanto, pouco se conhece sobre o mecanismo subjacente a este processo e os efeitos citotóxicos e moleculares causados por estes agentes ao tecido pulpar. Diante da necessidade de melhor entendimento desse processo, este estudo se propôs a avaliar a atividade da catalase e da glutationa peroxidase, bem como a rugosidade superficial do esmalte após a utilização de um agente clareador de auto aplicação em dentes humanos hígidos.

15 15 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Agentes e Técnicas de Clareamento Dental Os materiais para clareamento atuais utilizam, quase que exclusivamente, o peróxido de hidrogênio ou carbamida como ingredientes ativos (LI, 2011). Quimicamente, o peróxido de carbamida é um composto cristalino orgânico formado por uréia e peróxido de hidrogênio. Num ambiente hidrofílico esse composto se decompõe em cerca de 3% de peróxido de hidrogênio e 7% de uréia, de forma que, um clareador a base de peróxido de carbamida a 10% fornece cerca de 3 % de H 2 O 2 (DAHL; PALLESEN, 2003). Atualmente, as técnicas clareadoras podem ser divididas em: clareamento de consultório, clareamento caseiro supervisionado e clareamento caseiro não supervisionado. O clareamento de consultório é um procedimento odontológico realizado com géis clareadores de alta concentração de H 2 O 2 (35 a 38%) em sessões de 30 a 45 minutos, permitindo uma cor dental mais clara e clinicamente perceptível até mesmo após a primeira aplicação (JOINER, 2006; BRISO et al., 2010; REIS et al., 2011; HE et al., 2012; BONAFÉ et al., 2013). Já o clareamento caseiro supervisionado utiliza geralmente agentes com baixa concentração de peróxido de carbamida ou de H 2 O 2 (3 a 16%) aplicados aos dentes através de moldeiras individuais por pelo menos 2 semanas durante 4 a 6 horas (BUCHALLA; ATTIN, 2007; LIMA et al., 2013). O cirurgião-dentista deve monitorar o progresso do tratamento clareador e os eventuais efeitos adversos. Os bons resultados clínicos, a facilidade de utilização dos produtos e o baixo custo fizeram surgir o clareamento caseiro não supervisionado, de auto aplicação e sem prescrição, também conhecido como over-the-counter (OTC) (LI Y, 2011). Esses produtos estão disponíveis para os consumidores em várias formas de apresentação incluindo moldeiras, cremes dentais, fitas clareadoras, pincéis clareadores, gomas de mascar e enxaguatórios (LI Y; GREENWALL, 2013). Nos últimos anos têm surgido também os procedimentos clareadores realizados em contextos não odontológicos (stands em shoppings, spas e cruzeiros). Esses procedimentos utilizam usualmente o dióxido de cloro como substância

16 16 clareadora, com a finalidade de evitar legislações e restrições sobre o uso de peróxido de hidrogênio. Contudo, esses produtos a base de dióxido de cloro são prejudiciais, tendo pouca ou nenhuma evidência científica que comprove sua segurança ou eficácia (GREENWALL, 2008). 2.2 Mecanismo do Clareamento Dental O mecanismo geralmente aceito para o clareamento dos dentes é semelhante ao clareamento de produtos têxteis, ou seja, os radicais livres produzidos pelo peróxido de hidrogênio interagem com as moléculas de pigmentos para produzir um efeito clareador (BRISO et al., 2010). É considerada a hipótese de que o H 2 O 2 se decomponha em radicais livres, como moléculas de oxigênio reativo e ânions de peróxido de hidrogênio se difundindo através do esmalte e dentina, quebrando as ligações duplas ou alterando a configuração das cadeias moleculares longas (cromóforos). Tais modificações moleculares estruturais alteram as propriedades ópticas da estrutura dental, criando a percepção de dentes mais brancos. Essa teoria também é plausível para explicar o efeito rebote após o tratamento clareador, que ocorre provavelmente devido à reformulação das ligações duplas desses cromóforos (JOINER, 2006; MINOUX; SERFATY, 2008). A eficácia do tratamento clareador pode ser influenciada por fatores inerentes ao paciente (idade, sexo e cor inicial de dente), pelo material utilizado (tipo e concentração de peróxido) e pela técnica de aplicação (tempo e frequência de contato do clareador com a superfície dentária). Estes fatores não só contribuem para o sucesso do clareamento, mas também afetam a estabilidade posterior após o clareamento (JOINER, 2007; LI, 2011). 2.3 Riscos e Efeitos adversos Com o crescimento exponencial dos procedimentos clareadores, veio também a preocupação com relação aos riscos e aos eventuais efeitos colaterais decorrentes do uso do peróxido de hidrogênio presente nos agentes clareadores (LI; GREENWALL, 2013). Inicialmente, a maior preocupação estava direcionada na conhecida toxicidade do H 2 O 2 e sua capacidade de produzir radicais livres, incluindo os radicais hidroxila.

17 17 Vários estudos indicam que as reações de oxidação dos radicais livres com outras biomoléculas, em especial lipídios e proteínas das membranas e matrizes celulares, podem gerar danos oxidativos capazes de alterar a função celular e/ou tecidual, levando até mesmo à morte celular. Assim, inicialmente a preocupação sobre a utilização do H 2 O 2 foi direcionada para os potenciais efeitos adversos sistêmicos caso o gel clareador fosse ingerido, bem como, para os possíveis efeitos adversos locais devido ao contato do produto clareador com o esmalte e os tecidos moles (WEINER et al., 2000; Li, 2011; LEE et al., 2013; Li; GREENWALL, 2013). Durante os procedimentos clareadores de consultório, os tecidos moles são adequadamente protegidos com a utilização de barreiras e o gel é totalmente removido no final da sessão, portanto não existe risco de ingestão de material. Já os procedimentos clareadores caseiros, por utilizarem baixas concentrações de peróxido, são considerados os métodos mais seguros, com o mínimo de efeitos colaterais (SOARES et al., 2011; SOARES et al., 2012; BOUSHELL et al., 2012). Além disso, o corpo humano é dotado de sistemas antioxidantes de defesa celular para prevenir e reparar possíveis danos celulares. Este mecanismo de defesa pode atuar impedindo a formação e a ação de espécies reativas de oxigênio, bem como, favorecendo o reparo e a reconstituição de estruturas celulares lesadas (DEVASAGAYAM et al., 2004). As enzimas como a catalase, a glutationa peroxidase e o superóxido dismutase existentes nos fluidos e tecidos do corpo, incluindo a saliva, constituem uma forma eficaz de metabolizar H 2 O 2 (LI; GREENWALL, 2013). A peroxidase salivar tem sido considerada a mais importante e eficaz defesa do organismo contra os potenciais efeitos adversos provocados pelo H 2 O 2 proveniente do clareamento (CARLSSON, 1987). Marshall et al afirmaram que os efeitos adversos do H 2 O 2 dos géis clareadores são essencialmente limitados à cavidade oral, sendo praticamente incapazes de alcançar níveis sistêmicos capazes de induzir toxicidade devido aos mecanismos de defesa metabólica. Apesar de várias pesquisas nas últimas décadas evidenciarem a segurança dos procedimentos clareadores a nível sistêmico, inúmeros estudos ainda são direcionados para os potenciais riscos e efeitos adversos locais do clareamento dental (REIS et al., 2011; SA Y et al., 2012; WARD; FELIX, 2012). Portanto,

18 18 qualquer agente clareador pode provocar algumas reações adversas como irritação gengival, hipersensibilidade dentária e alterações morfológicas nos tecidos mineralizados e materiais restauradores (MARKOWITZ, 2010; HE et al., 2012). A severidade dos efeitos colaterais depende da concentração de H 2 O 2, da técnica clareadora utilizada e da resposta do indivíduo ao tratamento (AUSCHILL et al., 2005; ZIEBOLZ et al., 2007; LI; GREENWALL, 2013). A irritação gengival é um dos efeitos colaterais mais comuns durante os procedimentos clareadores (BOUSHELL et al., 2012). Geralmente ocorre simultaneamente com a sensibilidade dentária e o paciente pode não ser capaz de diferenciá-los. O produto pode entrar em contato com o tecido gengival devido ao extravasamento do gel pela moldeira, e em alguns sistemas clareadores (fitas e pincéis) o contato do produto com o tecido mole é praticamente inevitável, levando a uma irritação gengival transitória. Essa irritação é bem tolerada e não constitui uma barreira para a realização do tratamento. Já no clareamento de consultório o contato acidental do H 2 O 2 com os tecidos moles pode provocar queimadura química, resultando em ulceração tecidual (BRISO et al., 2010; LI; GREENWALL, 2013). A sensibilidade dentária é o efeito colateral clínico de maior frequência durante ou após o clareamento de dentes vitais, com uma incidência de até 70% (GOKAY et al., 2004), ocorre durante as primeiras etapas do tratamento, persistindo durante dois a três dias, sendo usualmente moderada e transitória (MARKOWITZ, 2010; BONAFÉ et al., 2013). O pico de hipersensibilidade dentária ocorre geralmente no terceiro dia de tratamento e não parece estar relacionada a fatores como idade, sexo e presença de restaurações defeituosas (COSTA et al., 2007; REIS et al., 2011; HE et al., 2012). Estudos anteriores demonstram ainda que, quanto maior a concentração e o tempo de contato do agente clareador no esmalte, maior a penetração de H 2 O 2 na câmara pulpar e mais intensos são os efeitos adversos para a polpa (SOARES et al., 2012).

19 Efeitos dos Agentes Clareadores nos Tecidos Mineralizados Os danos dos agentes clareadores às estruturas mineralizadas dos dentes têm sido foco de algumas pesquisas, que avaliaram os efeitos do clareamento sobre a estrutura do esmalte e da dentina sob três aspectos: a perda mineral, alterações morfológicas superficiais e alteração na microdureza superficial. A maioria dos estudos foram realizados com metodologias in vitro. Alguns desses trabalhos concluíram que o clareamento pode alterar a integridade superficial e microestrutura dos cristais do esmalte, bem como aumentar a susceptibilidade dentária à desmineralização (KWON et al., 2002; SPALDING et al., 2003; YEH et al., 2005; BASTING et al., 2005; MINOUX, SERFATY, 2008). Outros estudos que investigaram a morfologia da dentina, através de microscopia eletrônica de varredura após o clareamento dental, não encontraram alterações significativas (SULIEMAN et al., 2004; JOINER et al., 2004; COBANKARA, 2004). No entanto, Rotstein et al. em 1996 demonstraram que na dentina tratada com peróxido de hidrogênio a 30% ou peróxido de carbamida a 10 %, por 7 dias consecutivos, evidencia-se mudanças morfológicas na superfície. A composição química da dentina foi avaliada por espectroscopia de micro- Raman, uma técnica que permite avaliar os grupos químicos fosfato, carbonato e amida na estrutura dentinária. Usando esta técnica, verificou-se que as amostras de dentina clareadas tinham o mesmo espectro de Raman que os controles não clareados (DUSCHNER et al., 2006). Um estudo in vitro realizado por Ogura et al. em 2013 avaliou a suscetibilidade de dentes à desmineralização após protocolos de clareamento dental caseiro realizado com peróxido de carbamida a 10%, comparado ao protocolo de clareamento em consultório, com peróxido de hidrogênio a 35%. Os dentes foram avaliados quanto à perda de densidade mineral. Este estudo concluiu que a integridade da superfície dos dentes tratados com o protocolo caseiro sofreu significativamente maior desmineralização que os dentes tratados com o protocolo de consultório. Em outro estudo, Shi et al concluíram que o peróxido de hidrogênio a 35% tem efeito significativo na desmineralização da superfície do esmalte. Esse mecanismo de desmineralização pode ser explicado devido aos íons

20 20 de hidrogênio atacar os cristais de esmalte, liberando os íons de cálcio e de fosfato da superfície do esmalte para o meio. Outro trabalho in vitro comparou o efeito de géis clareadores com concentração de 16% e 10% de peróxido de carbamida sobre a estrutura mineral e morfologia do esmalte dental bovino. Foram avaliados o conteúdo mineral, rugosidade superficial e topografia. Os autores concluíram que ambos os géis base promoveram perda de estrutura mineral do esmalte, resultando numa superfície mais rugosa e porosa. Contudo, o gel com 16% de peróxido de carbamida causou efeitos adversos mais intensos no esmalte dental (SOARES et al., 2013) De maneira geral, a maioria dos estudos indicam que os produtos clareadores que contêm peróxido de hidrogênio ou de carbamida não têm efeitos deletérios significativos sobre a química e morfologia superficial do esmalte e dentina, mesmo se utilizados em maiores concentrações. Os poucos estudos contrastantes têm algumas limitações metodológicas in vitro que não refletem com precisão a situação in vivo (SULIEMAN et al., 2004; JUSTINO et al., 2004; DUSCHNER et al., 2006). Vale ressaltar ainda que a microdureza e a rugosidade superficial são as técnicas mais utilizada na literatura para avaliar os efeitos do peróxido no esmalte e dentina. A maioria dos estudos tem demonstrado que os clareadores a base de peróxido não têm efeitos significativos sobre a microdureza superficial do esmalte e dentina (JOINER et al., 2004; JUSTINO et al., 2004; LEWINSTEIN et al., 2004; SULIEMAN et al., 2004; DUSCHNER et al., 2006). Lewinstein et al observaram uma ligeira redução da microdureza do esmalte humano após o clareamento com peróxido de hidrogênio e de carbamida a 35%, que foi completamente revertida quando os dentes foram tratados com solução de fluoreto de 0,05%. Da mesma forma, Basting et al também observaram uma ligeira redução na microdureza do esmalte humano após o clareamento com peróxido de carbamida a 10% que foi recuperada após 7 dias de imersão em solução de remineralização. Outros estudos observaram redução na microdureza superficial do esmalte após o clareamento com até 35% de peróxido de hidrogênio ou carbamida (PINHEIRO-JÚNIOR et al., 1996; ATTIN et al., 2005; DE OLIVEIRA et al., 2005).

21 21 Estes dados conflitantes podem ser devido a diferenças metodológicas dos estudos in vitro. Para a dentina, não houve mudanças significativas na microdureza superficial na maioria dos estudos com clareadores a base de peróxido de hidrogênio ou carbamida em diferentes concentrações (BASTING et al., 2001; JOINER et al., 2004). Não obstante, uma diminuição transitória na microdureza da dentina foi observada em outros estudos, porém, com recuperação da mesma após tratamento com solução de fluoreto de sódio a 0,05% (DE FREITAS et al., 2004a; DE FREITAS et al., 2004 b; BASTING et al., 2005). Uma recente pesquisa in vivo para investigar o efeito do H 2 O 2 a 35% sobre a atividade de enzimas proteolíticas que degradam colágeno na dentina, concluiu que a utilização de peróxido de hidrogênio a 35% aumentou de maneira estatisticamente significante as atividades proteolíticas enzimáticas na dentina (p <0,05), sugerindo que as respostas biológicas dos tecidos dentais podem ser clinicamente prejudiciais a longo prazo ou recorrentes tratamentos clareadores (SATO et al., 2013). Até o momento, ainda não há nenhuma evidência in vivo que comprove algum efeitos adverso no esmalte e dentina para os clareadores caseiros de auto-aplicação. 2.5 Efeitos dos Agentes Clareadores na Polpa Dental Vários estudos têm defendido que o clareamento dental é um procedimento inócuo aos tecidos dentários mineralizados, porém existe pouca evidência na literatura sobre os efeitos deletérios do clareamento caseiro não supervisionado sobre a polpa dentária (JOINER et al., 2004; JOINER, 2004; CAVIEDES-BUCHELI et al., 2008). O tecido pulpar sadio é composto por células responsáveis por sua manutenção (produzindo dentina ao longo da vida), defesa e reparo. Os odontoblatos localizados na periferia, com prolongamentos no interior dos túbulos dentinários, são células responsáveis pela formação dentinária e defesa pulpar. Além disso, estão envolvidos no controle do fluxo sanguíneo, e no desenvolvimento da inflamação pulpar (BENNETI et al., 2004; TRINDADE et al., 2009).

22 22 Os compostos químicos mais utilizados para o clareamento dental, como foi descrito anteriormente, são a base de peróxido de hidrogênio ou peróxido de carbamida em diferentes concentrações. O H 2 O 2 é um forte agente oxidante, que se dissocia em espécies reativas de oxigénio com baixo peso molecular, com alto poder de difusão no tecidos dentais e capacidade de provocar estresse oxidativo que, consequentemente, pode estimular a diferenciação celular, sobre-expressão de marcadores odontoblásticos e até mesmo a morte celular no tecido pulpar (BENNETI et al., 2004; LEE et al., 2006; MIN et al., 2008; DIAS RIBEIRO et al., 2009; TRINDADE et al., 2009; EIMAR et al., 2012; SATO et al., 2013). A difusão de H 2 O 2 pela dentina depende da concentração do agente clareador e do tempo que o produto estará em contato com a estrutura dental. É a presença dos túbulos dentinários que facilita a difusão dos radicais livres pela estrutura dental até atingir o tecido pulpar e provocar reações adversas na polpa (BOWLES; UGWUNERI, 1987; BENNETI et al., 2004; GÖKAY et al., 2004; CAMARGO et al., 2007; TRINDADE et al., 2009). Trindade et al simularam in vitro o clareamento de dentes vitais com peróxido de hidrogênio a 35%, concluindo que a difusão dos componentes do gel clareador através do esmalte e dentina provocou efeitos tóxicos graves em células cultivadas da polpa dental. Para pesquisar a toxicidade de protocolos de clareamento dental sobre células pulpares, Soares et al avaliaram a morfologia e viabilidade celular imediatamente após procedimentos clareadores. Também foram avaliados o stresse oxidativo e danos na membrana das células. Os autores concluíram que tanto a redução da concentração de peróxido no gel clareador, quanto a redução do tempo de contato do gel com o esmalte dental produziram menor estresse oxidativo e citotoxicidade para as células pulpares. Vale ainda ressaltar que a difusão do peróxido de hidrogênio para o interior da câmara pulpar é o principal responsável pela alta incidência de sensibilidade pós-operatória em pacientes submetidos a terapias clareadoras (GÖKAY et al., 2004; REIS et al., 2011; TAY et al., 2012; HE et al., 2013), indicando que este tipo de procedimento estético pode provocar danos ao tecido pulpar como inflamação

23 23 aguda e necrose parcial, evidenciado em vários trabalhos publicados (DE SOUZA COSTA et al., 2010; REIS et al., 2011; TAY et al., 2012; SATO et al., 2013). 2.6 Radicais Livres Os radicais livres ou, de maneira mais geral, as espécies reativas de oxigênio (ROS), bem como as espécies reativas de nitrogênio (RNS), são produtos do metabolismo celular fisiológico que, quando encontrados em concentrações normais, fornecem uma linha de defesa contra agentes infecciosos (HALLIWELL, 1996; VALKO et al., 2006; VALKO et al., 2007). Os radicais livres podem ser definidos como moléculas ou fragmentos moleculares extremamente reativos que contenham um ou mais elétrons desemparelhados em sua órbita mais externa (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1990; HALLIWELL, 1996). É este elétron não emparelhado que fornece um considerável grau de reatividade ao radical livre. Os radicais livres derivados de oxigênio representam a classe mais importante de radicais gerados em sistemas vivos. O oxigênio molecular tem uma configuração eletrônica única e é por si só um radical. A adição de um elétron formará o ânion superóxido (O -- 2 ), instável por possuir um número ímpar de elétrons na sua última camada. Assim, os radicais livres são formados através de reações de xido-redu o, ou seja, cedem o elétron, oxidandose, ou recebem outro, reduzindo-se. (HALLIWELL, 1996; VALKO et al., 2007). Atualmente, entende-se que a produção de radicais livres ocorre através de um processo fisiológico do metabolismo celular aeróbio, quando o O 2 sofre redução tetravalente, o que resulta na formação de água e energia. Durante esse processo ocorre ainda a geração de intermediários reativos, como os radicais superóxido (O -2 ), hidroxila (OH), hidroxiperoxila e o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). A reatividade desses radicais é neutralizada em organismos saudáveis, através da redução quase total do oxigênio, onde apenas pequenas quantidades dessas moléculas são produzidas (BAUMGARDNER; SULFARO, 2001). As ROS são compostos que contêm oxigênio e têm maior reatividade do que o oxigênio molecular. Incluem-se nesta definição, as moléculas de oxigênio singleto ( 1 O 2 ), ácido hipocloroso (HOCl) o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), o superóxido (O -2 ),

24 24 o óxido nítrico (NO), o radical hidroxila (HO), e o radical hidroperoxila (HO 2 ) (BAUMGARDNER; SULFARO, 2001). A produção de superóxido ocorre principalmente no interior da mitocôndria em uase todas as c lulas aer bicas, sendo a principal fonte de ATP na célula de mamíferos. Durante essa produção de energia, existe a formação do radical superóxido e de oxigênio livre (VALKO et al., 2007). O superóxido é produzido ainda, durante a ativa o m xima de neutr ilos mon citos macr agos e eosin ilos e, devido a sua baixa capacidade reativa, ainda não está totalmente esclarecida a sua capacidade de causar danos significativos nas estruturas celulares (HALLIWELL, 1996; ANDRADE JUNIOR et al., 2005; LIOCHEV, 2013). O radical hidroxila (OH) é a forma neutra do íon hidróxido, considerado o radical mais reativo dos sistemas biológicos, com meia vida muito curta (9 a 10 segundos), tornando-se um radical muito perigoso num organismo vivo (DEVASAGAYAM et al., 2004). Assim, quando produzidos in vivo o OH reage rapidamente perto de seu local de formação com metais ou outros radicais, podendo inativar várias proteínas, bem como, iniciar a oxidação de ácidos graxos polinsaturados das membranas celulares e ainda inibir a função fisiológica do DNA (VALKO et al., 2007). Apesar de não ser propriamente um radical livre, por apresentar ausência de elétrons desemparelhados na última camada, o H 2 O 2 um metabólito do oxigênio, muito reativo e extremamente deletério, porque participa da reação que produz o radical hidroxila (OH). O H 2 O 2 tem ida longa capa de atra essar camadas lipídicas, podendo reagir com as membranas celulares. ssim um radical de elevada capacidade tóxica celular podendo ser aumentada exponencialmente na presença de ferro (SINENSKY et al., 1995; HALLIWELL, 1996; FERREIRA, MATSUBARA, 1997; ANDRADE JÚNIOR et al., 2005). Embora as ROS possam ser mediadoras de alguns processos patológicos, sua formação nem sempre prejudicial ao organismo, como por exemplo, na defesa contra processos infecciosos, quando a atividade bacteriana estimula neutrófilos a produzirem radicais livres com a finalidade de destruir os microrganismos, na apoptose de células defeituosas e até mesmo na destruição de células cancerosas.

25 25 Contudo, se houver estímulo exacerbado na produção dessas espécies, e a ele estiver associada uma falha de defesa do sistema antioxidante poderá ocorrer lesões celulares irreversíveis, que se não forem reparadas, poderão alterar a funcionalidade de células, tecidos e órgãos (HATHERILL et al., 1991; DEVASAGAYAM et al., 2004; VALKO et al., 2007; LIOCHEV, 2013). A origem das ROS podem ser endógenas e/ou exógenas, as endógenas são relativas ao processo celular aeróbico, estando intimamente relacionada ao consumo de oxigênio e a proporção de mitocôndrias nas células. Outros mecanismos fisiológicos como a fagocitose microbiana, a síntese de prostaglandinas, e a oxidação da xantina estão ligados geração endógena das ROS (MERRY et al., 1991; NUSSLER; BILLIAR, 1993). Já em relação aos fatores exógenos pode-se relatar a radiação solar, exposição a agentes químicos, bem como a exposição a metais pesados (VALKO et al., 2007; LIOCHEV, 2013). O efeito deletério potencial dos radicais livres ocorre quando há um desequilíbrio, em sistemas biológicos aeróbicos, entre a produção de ROS e a capacidade reparadora do sistema de defesa antioxidante enzimático e não enzimático, levando a danos biológicos, denominado estresse oxidativo (VALKO et al., 2007). Inúmeras patologias e complicações clinicas têm sido associadas ao aumento dos radicais livres e ao estresse oxidativo. As doenças mais relacionadas aos radicais livres e as ROS são: câncer, artrite, hipertensão, problemas cardiovasculares, diabetes mellitus, doenças neurodegenerativas, envelhecimento celular e aumento da expressão e replicação do HIV (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1990; VALKO et al., 2007). 2.7 Sistema de Defesa Antioxidante Pulpar A exposição aos radicais livres, a partir de uma variedade de fontes, levou ao desenvolvimento de um conjunto de mecanismos de defesa pelo organismo. Os mecanismos de defesa contra o estresse oxidativo induzido por radicais livres envolvem: (a) mecanismos de prevenção (b) mecanismos de reparação, (c) defesas físicas, e (d) o sistema de defesa antioxidante. Esse último pode ser classificado em sistema de defesa antioxidante enzimático, constituído pelas enzimassuperóxido dismutase (SOD), glutationa-peroxidase (GPx), Glutationa reduzida (GSH-Rd) e

26 26 catalase (CAT) e sistema de defesa antioxidante não enzimático, representado pelo ácido ascórbico ( vitamina C ), α- tocoferol (vitamina E), glutationa (GSH), carotenóides, flavonóides e outros antioxidantes (VALKO et al., 2007). Em condições fisiológicas, existe um equilíbrio entre as concentrações de ROS e os níveis intracelulares do sistema de defesa antioxidante, este equilíbrio é essencial para a sobrevivência dos organismos e sua saúde. (HALLIWELL, 1996; DEVASAGAYAM et al., 2004; LIOCHEV, 2013). Assim, para proteger-se, a célula possui um sistema de defesa atuando em duas linhas. Uma delas atua preventivamente antes que o radical livre cause lesão, sendo constituída pela glutationa reduzida (GSH), super xido-dismutase (SOD), catalase, glutationaperoxidase (GSH-Px) e vitamina E. A outra linha de defesa com a função reparadora da lesão ocorrida, sendo constitu da pelo cido asc rbico, pela glutationa-redutase (GSH-Rd) e pela GSH-Px, entre outros. Com exce o da itamina (α- toco erol) ue um antioxidante estrutural da membrana a maior parte dos agentes antioxidantes est no meio intracelular (HALLIWELL, 1996; DEVASAGAYAM et al., 2004; WELCH et al., 2002; HULTBERG; HULTBERG, 2006; PRASAD et al., 2007). Os papéis dos antioxidantes enzimáticos (SOD, catalase, glutationa peroxidase) e antioxidantes não enzimáticos (Vitamina C, vitamina E, carotenóides, ácidos lipóico e outros) na proteção contra o estresse oxidativo pode ser encontrado em vários trabalhos na literatura (SMITH et al., 2004; VALKO et al., 2007; LEITE et al., 2010). lutationa um tripept deo que existe no organismo vivo nas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG). Atuando em muitos processos biol gicos importantes incluindo a s ntese de proteínas, metabolismo e prote o celular. s n eis de glutationa e das enzimas que atuam no seu metabolismo podem ser significativamente alterados devido a doenças correlacionadas ao estresse oxidativo. A alteração entre as formas oxidada e redu ida induzida pela Glutationa Peroxidase (GSH-Px), sendo sua conversão orma reduzida desencadeada pela Glutationa Redutase (GR). ati idade da - x um dos meios para controlar os níveis de er xido de Hidrogênio e idroper xidos lipídicos, proveniente do ataque de ROS (HALLIWELL, 1996; VALKO et al., 2006; VALKO et al., 2007).

27 27 Na literatura existem várias evidências da atividade protetora dos componentes do sistema antioxidante enzimático e não enzimático. O reparo celular p s-isquemia cardíaca, reparos em lesões do rim, fígado e intestino são prevenidas por SOD e catalase. (HATHERILL et al., 1991; HALLIWELL, 1996; FERREIRA; MATSUBARA, 1997; VALKO et al., 2007). A polpa dentária humana é constituída por um tecido conjuntivo composto por odontoblastos, com a função primária de formação da dentina. O complexo de dentino-pulpar é formado por células diferenciadas e não diferenciadas, incluindo células de odontoblastos e odontoblastos semelhantes, bem como de células-tronco (SLOAN; SMITH, 2007). Alterações na polpa dentária durante processos inflamatórios foram bem avaliadas e definidas na literatura nos últimos anos. Diferenças entre a pulpite reversível e irreversível foram comparados através de enzimas e mediadores celulares com controles saudáveis em vários trabalhos (LEE et al., 2006; COSTA et al., 2010; DUNCAN et al., 2012; WU et al., 2013). As células são danificadas por desequilíbrios entre o sistema de defesa antioxidante e as espécies reativas de oxigênio, assim, as ROS podem interagir nas células da polpa com proteínas, lipídios e ácidos nucléicos celulares, provocando danos moleculares severos ou, até mesmo, a morte celular. Além disso, os radicais livre produzidos por agentes clareadores, adesivos dentinários e doenças pulpares podem causar estresse oxidativo nessas células da polpa (MIN et al., 2008). Durante os processos inflamatórios as células liberam agentes de oxidação, como o peróxido de hidrogénio, capazes de destruir tanto os componentes bacterianos como os componentes normais das células circundantes. Para evitar um excesso de destruição tecidual, as células hospedeiras liberam algumas enzimas para degradar estes agentes oxidantes. A catalase uma hemeprote na citoplasm tica envolvida diretamente na remoção de oxigénio ativo catalisando a redu o do 2O 2 em H 2 O e O 2. Por esta razão, é considerada uma enzima de defesa contra os efeitos deletérios de H 2 O 2. encontrada na polpa dental, sangue, medula ssea mucosas rim e gado, com atividade dependente de NADPH

28 28 (SIMON et al., 1981; BOWLES; BURNS, 1992; ESPOSITO et al., 2003a; ESPOSITO et al., 2003b). Conforme citado anteriormente, o clareamento dental ocorre de ido degrada o de per xidos atra s de rea es oxidativas. degra o do per xido de hidrog nio dependente da sua concentra o na ca idade oral e dos n eis de peroxidase salivar. O uso de per xido de hidrog nio em baixas concentra es no clareamento dental acarretará um aumento no tempo de exposi o, e consequentemente aumentará a exposi o s esp cies reati as de oxig nio (SINENSKY et al., 1995 ; SULIEMAN et al., 2004). Como a substância clareadora permanece em contato com o esmalte dental durante todo o período do tratamento o per xido de hidrogênio pode penetrar no esmalte e na dentina e se difundir através destes tecidos atingindo os prolongamentos odontoblásticos e a polpa dental (SEALE et al., 1981; BOWLES; THOMPSON, 1986; SOARES et al., 2014). Assim como o H 2 O 2, durante o processo de irritação e inflamação pulpar, o radical superóxido também atua de maneira decisiva para limitar a produção destas espécies altamente oxidativas. Altas concentrações de ROS são controlados in vivo, por um elaborado sistema de enzimas antioxidantes, dos quais, a superóxido dismutase (SOD) é o componente principal, pois catalisa a dismutação (oxidação e redução simultânea) do radical superóxido para formar H 2 O 2 e oxigénio molecular. Portanto, a superóxido dismutase (SOD), teria a função de controlar a produção desta espécie reativa de oxigênio. (DAVIS et al., 1991; GROSSI et al., 1991; BAUMGARDNER; SULFARO, 2001). super xido dismutase subdividida em duas formas, diferindo entre si pelo s tio e pela locali a o celular. A enzima Cu 2+, Zn 2+ -super xido dismutase (Cu n od) sinteti ada a partir da SOD1, geralmente encontrada no citoplasma e nos fluidos extracelulares (VALKO et al., 2007), e a A Mn3+-superóxido dismutase (MnSod), codificada pelo gene SOD2, com localização mitocondrial. usti icati a da exist ncia de uma OD extracelular est na necessidade de de esa celular contra ontes ex genas de superóxidos. O radical superóxido tem como característica não ser permeável a membranas biológicas, ocorrendo assim à necessidade da

29 29 presença de Sods distintas no citoplasma, mitocôndria e no espaço extracelular das células (GROSSI et al., 1991; BAUMGARDNER; SULFARO, 2001). Portanto, a catalase e a superóxido dismutase são consideradas como o principal mecanismo de defesa enzimático contra os radicais livre e as ROS produzidos durante o metabolismo oxidativo normal, bem como em processos inflamatórios (DAVIS et al., 1991; ALAÇAM et al., 2000). Alguns estudos relatam a presença da catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase e redutase no tecido pulpar, reconhecendo o sistema antioxidante pulpar como um sistema de proteção das agressões sofridas pela polpa (GROSSI et al., 1991; DAVIS et al., 1991; BOWLE; BURNS, 1992; ESPOSITO et al., 2003a; VARVARA et al., 2005; LEITE et al., 2008, 2010). Não obstante, existe um sistema de defesa biológico contra o peróxido de hidrogênio na polpa dental humana (ESPOSITO et al., 2003b). Conforme citado anteriormente, o clareamento dental ocorre de ido degrada o de per xidos atra s de rea es oxidativas. degra o do per xido de hidrog nio dependente da sua concentra o na ca idade oral e dos n eis de peroxidase sali ar. uso de per xido de hidrog nio em baixas concentra es no clareamento dental acarretará um aumento no tempo de exposi o, e consequentemente aumentará a exposi o s esp cies reati as de oxig nio (SINENSKY et al., 1995 ; SULIEMAN et al., 2004). No estudo de Leite et al. 2010, no qual avaliaram as polpas dentárias em ratos diabéticos ficou demonstrado que uma doença sistêmica pode afetar o sistema antioxidante desse tecido através da redução da SOD, catalase e glutationa peroxidase. Contudo, a capacidade de reação do tecido pulpar foi aumentada através da administração de moléculas com alto poder antioxidante, como a astaxantina. Em outro estudo, Lee et al., 2013 concluíram que a buteína tem acentuado poder anti-oxidante e que sua administração de pode prevenir a morte de células pulpares.

30 30 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Este trabalho tem como objetivo avaliar a rugosidade superficial do esmalte dental e a resposta do tecido pulpar de dentes humanos hígidos submetidos ao clareamento dental com um agente de auto-aplicação. 3.2 Objetivos Específicos Avaliar a atividade enzimática da catalase no tecido pulpar de dentes humanos após a realização do clareamento dental com pincéis clareadores de autoaplicação. Avaliar a atividade enzimática da glutationa peroxidase no tecido pulpar de dentes humanos após a realização do clareamento dental com pincéis clareadores de auto-aplicação. Determinar a concentração da proteína total no tecido pulpar de dentes humanos após a realização do clareamento dental com pincéis clareadores de auto-aplicação. Avaliar a rugosidade superficial das coroas de dentes humanos após a realização do clareamento dental com pincéis clareadores de auto-aplicação.

31 31 4 METODOLOGIA 4.1 Considerações Éticas Todo o estudo foi conduzido sem conflitos de interesse e após a aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Cruzeiro do Sul (UNICSUL), protocolo nº 744/ Todos os voluntários foram instruídos sobre a natureza do trabalho e possíveis desconfortos, concordando em contribuir com os dados para esta pesquisa, de acordo com as Diretrizes e Normas Regulamentadoras do Conselho Nacional de Saúde (Resolução 466/2012). 4.2 Casuística Foram selecionados indivíduos entre anos de idade que apresentavam pelo menos um par de pré-molares superiores ou inferiores com indicação de exodontia por razões ortodônticas. A determinação dessa faixa etária foi estabelecida com o objetivo de se selecionar unidades dentárias com características semelhantes quanto a maturação tecidual e fechamento do ápice radicular, bem como semelhanças relativas a organização e capacidade reparativa do complexo dentino-pulpar. Todos as unidades dentárias foram examinadas clínica e radiograficamente. 4.3 Critérios de Inclusão e Exclusão Os critérios para inclusão de voluntários no estudo foram: ausência lesões cariosas e restaurações em ambas as unidades, ausência de envolvimento periodontal ou lesões periapicais em ambas as unidades, além de trincas, fraturas ou qualquer defeito existente na superfície dental. Um total de 12 dentes foram selecionados, os quais receberam tratamentos diferentes previamente à exodontia e foram divididos em dois grupos: Grupo 1 (experimental) contendo 6 dentes que receberam a aplicação de gel clareador (Pola Paint, SDI, Bensenville, IL, USA), figura 1, e Grupo 2 (controle) contendo 6 dentes que receberam a aplicação de um gel a base de água (KY gel, Johnson & Johnson,

32 32 SP, Brasil) acondicionado em um frasco de um produto de marca diferente à do grupo experimental. Todas as unidades dentárias foram extraídas após 14 dias de utilização dos produtos. O desenho do estudo foi de boca dividida e cego, pois os voluntários não sabiam qual era o clareador e o placebo. Figura 1 Gel Clareador Pola Paint. 4.4 Composição e instruções de uso do agente clareador. Pola Paint (SDI, Bensenville, IL, USA) é um gel branqueador de auto-aplicação de baixa viscosidade, composto de peróxido de carbamida a 8%, etanol, glicerol e aditivos, indicado o clareamento de dentes vitais e não vitais, apresentado em forma de pincel com 5,1 gramas, para ser aplicado sobre as superfícies dentárias. As seguintes instruções de uso foram orientadas a todos os participantes para uso do clareador e do placebo: 1. Escovar os dentes e usar o fio dental da forma habitual; 2. Secar a superfície vestibular dos dentes; 3. Retrair os lábios e pincelar uma fina camada de gel na superfície vestibular dos dentes; 4. Após a aplicação, não deixe os lábios tocarem os dentes durante 30 segundos; 5. Deixe o gel por 30 minutos. Não comer ou beber durante esse período; 6. Após os 30 minutos, escovar os dentes para remover o gel;

33 33 7. Utilizar duas vezes ao dia durante 14 dias, pela manhã e pela noite. 4.5 Obtenção das Amostras Todos os pacientes foram submetidos a profilaxia com taça de borracha e pasta profilática em baixa rotação antes de iniciarem a utilização dos produtos. Os dentes do grupo experimental e controle foram submetidos ao protocolo de dentes vitais com produtos auto aplicáveis, seguindo rigorosamente as instruções de utilização fornecidas pelo fabricante. Após a realização dos procedimentos, aguardou-se o período de uma hora e realizou-se exodontias minimamente traumáticas, com anestesia local infiltrativa, utilizando anestésico contendo vasoconstrictor. Em seguida, os dentes foram lavados com soro fisiológico, secos com gaze e imersos em recipiente contendo solução salina e congelados a uma temperatura de -20ºC. Para a remoção da polpa dental, cada dente foi descongelado em gelo para manter a temperatura do tecido pulpar, em seguida foram realizados cortes transversais na junção cemento-esmalte da coroa com broca multilaminada cilíndrica em alta rotação sob refrigeração ar/água abundante, até tornar visível a parede da câmara pulpar (Figura 2). Assim, a coroa era separada manualmente da raiz, e a polpa removida usando limas endodônticas tipo Kerr (Figura 3 e 4). As amostras foram homogeneizadas a 10% em tampão fosfato 0,1 mm de sódio, ph 7,0, rompidas por ultrassom em aparelho Vibra (Connecticut, EUA) e centrifugadas rapidamente. A etapa de centrifugação foi incluída ( rpm durante 10 minutos a 4ºC, a fim de eliminar detritos do homogenato bruto, resultando em precipitado e sobrenadante. Este último era então utilizado para a análise posterior.

34 34 Figura 2 Secção transversal coroa/raiz. Figura 3 Remoção da polpa.

35 35 Figura 4 Polpa removida. 4.6 Análises Determinação da Atividade da Catalase A decomposição do H 2 O 2 pode ser seguido diretamente pela diminuição da absorbância a 240 nm (= ε240 ± L.mM-1cm-1). Uma unidade de catalase é definida como a concentração de enzima necessária para a decomposição de 1 mol de H 2 O 2 por minuto a 25 C. Todas as soluções de ensaio foram preparadas à temperatura ambiente, como descrito por Aebi (1984). O sistema de reação completa para catalase consistiu em tampão fosfato 0,1 mm, ph 7,0 e 10 mm H 2 O 2. A reação foi iniciada pela adição de 10 mm H 2 O 2 e o controle da absorbância do peróxido foi monitorada por 2 minutos a 240 nm Determinação da Atividade da Glutationa Peroxidase (GPx) A atividade da GPx foi estabelecida de acordo com o método descrito por Mannervik (1985). A atividade enzimática foi determinada usando 2,5 U / ml de glutationa redutase (GSH-Rd), 10 mm glutationa reduzida (GSH), 250 mm de azida de sódica (como um inibidor de catalase) e 1,2 mm NADPH na presença de 4,8 mm

36 36 de tert-butil hidroperóxido usado como substrato em um homogeneizado celular. A oxidação do NADPH foi monitorada a 340 nm por 2 minutos em 0,2 M de tampão fosfato (ph 7,0) em um 3000 Ultrospec espectrofotômetro (Pharmacia Biotech) Determinação da Concentração da Proteína Total As atividades enzimáticas específicas foram todas relacionadas com a concentração de proteínas, que foram estimadas pelo método de Bradford (1976) usando soro albumina bovina como padrão Análise da Rugosidade Superficial das Coroas Após serem separadas das raízes as coroas foram armazenadas em solução salina para não sofrerem desidratação até o momento da leitura da rugosidade superficial. Em seguida, cada coroa foi seca com papel absorvente e fixada com cera utilidade na bancada do aparelho, com a superfície vestibular voltada para cima, ou seja, esta superfície que teve contato direto com o agente clareador (grupo experimental) e com o gel a base de água (grupo controle), foi a superfície escolhida para a realização da leitura. Portanto, todas as amostras foram submetidas à leitura em rugosímetro, modelo Surftest SJ-301 (Mitutoyo, Tokyo, Japão), para determinar a rugosidade superficial média. A leitura considerada foi a média aritmética (Ra) entre os picos e vales percorridos pela ponta ativa do aparelho, onde o percurso de medição foi de 0,8 mm. Realizaram-se três leituras na superfície de cada corpo de prova: uma no sentido horizontal, outra perpendicular a primeira e uma no sentido oblíquo. As médias dos valores obtidos foram registradas, tabuladas e submetidas à análise estatística Análise Estatística Os grupos analisados foram comparados pelo teste estatístico bi-caudal T de Student (Two-tailed), com significância de 5% (p 0,05). Os dados foram tabulados e apresentados como média ± desvio padrão (dp).

37 37 5 RESULTADOS Houve diferença estatisticamente significante com uma maior concentração de proteína total no grupo experimental em relação ao grupo controle (Figura 5). Figura 5 Concentração de proteína total (mg de proteína/ml de homogenado a 5%) do tecido pulpar de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8%.(*) Diferença estatisticamente significante comparada ao grupo controle, p 5%. Nas figuras 6 e 7, os resultados mostram que a atividade da catalase e da glutationa peroxidase permaneceram similar em ambos os grupos, sem diferença estatística.

38 38 Figura 6 Atividade enzimática da catalase (µmol/mg de proteína) do tecido pulpar de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8%. Figura 7 Atividade enzimática da glutationa peroxidase (mu/mg de proteína) do tecido pulpar de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8%. Foi analisado também o valor da rugosidade superficial do esmalte, nas superfícies vestibulares das coroas em ambos os grupos. De acordo com a figura 8, o valor da rugosidade superficial média (Ra) do grupo experimental (0,83 µm) não foi significantemente maior que a apresentada pelo grupo controle (0,82 µm).

39 39 Figura 8 Rugosidade superficial (Ra) da superfície das coroas de dentes humanos dos grupos controle e submetido ao clareamento com pincel a base de peróxido de carbamida a 8%. O resumo dos dados das figuras 5-8 está demonstrado na tabela 1 como média ± desvio padrão (dp). A concentração da proteína total, foi estatisticamente significante (p=0,017) maior entre o grupo controle (0,46 ± 0,21) e o grupo experimental (0,82 ± 0,23). Contudo, não houveram diferenças significantes na rugosidade superficial (p=0,801), atividade enzimática da catalase (p=0,988) e atividade da glutationa peroxidase (p=0,152), apesar desta ter apresentado um maior valor absoluto no grupo controle (276,6 ± 73,1) em relação ao grupo experimental (221,4 ± 40,6).