CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN

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1 CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN MENINGOENCEFALITE HERPÉTICA EM BEZERROS: EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO. LONDRINA PARANÁ 2005

2 2 ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN MENINGOENCEFALITE HERPÉTICA EM BEZERROS: EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO. Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciência Animal (Área de concentração: Sanidade Animal) da Universidade Estadual de Londrina para a obtenção de título de Mestre em Ciência Animal. Orientador: Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisbôa Co-orientador: Prof. Dr. Amauri Alcindo Alfieri LONDRINA PARANÁ 2005

3 3 O presente trabalho foi realizado no setor de Grandes Animais do Hospital Veterinário, no Laboratório de Virologia Animal, no Laboratório de Patologia Clínica e no Laboratório de Anatomia Patológica, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal pelo Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, sob orientação do Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisbôa. Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto às agências e órgãos de fomento à pesquisa abaixo relacionados: 1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 3. Fundação ARAUCÁRIA: Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná 4. PROPPG: Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Estadual de Londrina

4 4 Candidato: ALLAN JÜRGEN ISERNHAGEN Título da dissertação: MENINGOENCEFALITE HERPÉTICA EM BEZERROS: EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO. Comissão examinadora: Prof. Dr. Júlio Augusto Naylor Lisbôa Prof. Dr. Rogério Martins Amorim Profa. Dra. Alice Fernandes Alfieri Londrina, 24 de junho de 2005.

5 À minha família, pelo amor e carinho em todos os momentos da minha vida 5

6 6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, por tudo que tem me dado durante toda a minha vida. Aos meus pais Walter e Maria Teresinha por todo carinho, amor e apoio em todos os momentos de minha vida. À minha irmã Allana por estar sempre ao meu lado. A toda minha família que sempre me apoiou pra continuar seguindo em frente. Ao professor e orientador Julio Augusto Naylor Lisbôa, pela amizade e enorme colaboração na minha formação. Ao professor e co-orientador Amauri Alcindo Alfieri pelas orientações e auxílio na realização deste trabalho. Aos professores do Programa de Mestrado em Ciência Animal. Aos professores da graduação e a todos aqueles que passaram pela minha vida. Aos professores Dr. Amauri Alcindo Alfieri, Dra Alice Fernandes Alfieri e Dra Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro Bracarense, membros da banca de qualificação, pelas colaborações neste trabalho. Aos estagiários e amigos Mariana Cosenza, Márcio, Vitor, Romerson e Mariana. Aos Residentes de Grandes Animais pela amizade e ajuda na realização deste trabalho. A professora Mara Regina Stipp Balarin, a professora Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro Bracarense, a Kerlei Cristina Médici e a residente Karina Keller Marques da Costa Flaiban pelo auxílio na realização do trabalho. Aos colegas de mestrado. A todos os meus amigos.

7 7 Aos colegas do Laboratório de Virologia Animal Gustavo, Michele, Glei, Betinha, Marlise e Sheila. Aos funcionários do Hospital Veterinário da UEL. E a todos que de alguma forma contribuíram e fizeram parte deste trabalho e da minha vida, muito obrigado.

8 8 RESUMO ISERNHAGEN, A.J. Meningoencefalite herpética em bezerros: evolução clínica e diagnóstico. Dissertação (Programa de Pós-graduação em Ciência Animal) Centro de Ciências Agrárias Universidade Estadual de Londrina A encefalite causada pelo BoHV-5 acomete bovinos de todas as faixas etárias, principalmente os jovens, e determina baixa morbidade e alta letalidade. No Brasil, surtos da doença têm sido relatados de forma crescente. Alguns aspectos sobre essa enfermidade ainda merecem maior esclarecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a evolução clínica e aspectos do diagnóstico da meningoencefalite herpética em bezerros infectados experimentalmente com o BoHV-5. Sete bezerros machos, sadios, da raça Holandesa com até 60 dias de idade foram infectados por instilação de 0,5mL de inóculo (10 7,42 TCID 50 ) em cada cavidade nasal. A estirpe viral utilizada foi a AA PAR. Durante o período experimental pós-infecção (p.i.) realizaram-se exames físicos duas vezes ao dia e hemogramas a cada 48 horas. Amostras de líquor foram colhidas e analisadas a cada 48 horas a partir do início dos sinais de encefalopatia. Nove subdivisões do encéfalo (córtex anterior, córtex dorso-lateral, córtex ventro-lateral, córtex posterior, diencéfalo, mesencéfalo, ponte, medula oblonga e cerebelo) e os gânglios do nervo trigêmeo foram colhidos após a morte e submetidos ao exame histopatológico. A presença do vírus foi investigada, por meio da reação em cadeia pela polimerase (PCR) e do isolamento em cultivo celular, nas diferentes porções do encéfalo, no líquor e nos gânglios do nervo trigêmeo. Quatro bezerros manifestaram sinais de encefalopatia a partir dos dias 9 (n=2) e 11 p.i. (n=2) e evoluíram para a morte em 12 horas (n=1), 3 dias (n=2) ou 10 dias (n=1). Os demais bezerros (n=3) não manifestaram qualquer evidência de encefalopatia e foram submetidos à eutanásia 30 dias p.i.. Os principais sintomas observados foram: depressão, disfagia, amaurose, manias (atos compulsivos), ataxia, sialorréia, mioclonias na face e convulsões. As freqüências respiratória e cardíaca não variaram significativamente ao longo do tempo, e a temperatura corporal exibiu uma tendência a se elevar entre 9 e 12 dias p.i. As alterações no leucograma foram discretas e inespecíficas coincidindo com o início do quadro. A elevação de células mononucleares no líquor foi a alteração mais importante de auxílio ao diagnóstico ainda em vida, apresentandose tanto nos bezerros sintomáticos quanto nos assintomáticos. O genoma viral foi identificado em várias localizações do encéfalo e nos gânglios dos nervos trigêmeos, assim como, no líquor de dois bezerros que manifestaram encefalopatia. O exame histopatológico confirmou, por fim, que todos os bezerros estudados exibiram processo inflamatório encefálico, indicando que a encefalite causada pelo BoHV-5 pode, eventualmente, ser branda e assintomática. Palavras-chave: Bezerro; BoHV-5; encefalite; sinais clínicos; evolução; diagnóstico

9 9 ABSTRACT ISERNHAGEN, A.J. Herpetic meningoencephalitis in calves: clinical feature and diagnosis. Dissertação (Programa de Pós-graduação em Ciência Animal) Centro de Ciências Agrárias Universidade Estadual de Londrina The encephalitis caused by BoHV-5 affects cattle of all ages, mainly young, and is characterized by low morbidity rate and high case fatality rate. Outbreaks of this disease have increasingly been reported in Brazil. Some aspects of this disease are still unclear. In this study, cases of herpetic meningoencephalitis were experimentally induced in calves to investigate clinical pictures and diagnosis. Seven healthy male Holstein calves, up to 60 days old, were infected with 0,5mL of virus suspension (10 7,42 TCID 50 ) in each nasal cavity. The AA PAR viral strain was used in this experiment. During the experimental postinfection (p.i.) period, physical examinations were conducted twice a day and routine complet blood counts were performed every 48 hours. Cerebrospinal fluid (CSF) analysis was performed in samples collected every 48 hours from the onset of neurological signs on. Nine encephalic portions (anterior cortex, dorsolateral cortex, ventrolateral cortex, posterior cortex, diencephalon, mesencephalon, pons, medulla oblongata and cerebellum) and the trigeminal ganglia were obtained at necropsy and submitted to histopathology. Virus detection was investigated in each encephalic portion, trigeminal ganglia and CSF by means of polimerase chain reaction (PCR) and virus isolation in cells culture. Four calves developed signs of neurologic disease beginning at days 9 (n=2) and 11 p.i. (n=2) and died in 12 hours (n=1), 3 days (n=2) and 10 days (n=1). The other three calves remained asymptomatics and were euthanized 30 days p.i.. Depression, dysphagia, amaurosis, mania (compulsive behavior), ataxia, sialorrhea, facial myoclonia and convulsion were the main signs. No significant changes occurred in the heart and respiratory rates; but the rectal temperature tended to increase between days 9 and 12 p.i..the changes in leukogram were slight and unspecific coinciding with the onset of clinical signs. Increases in CSF mononuclear cell counts occurred in all symptomatic and asymptomatic calves, as the most important diagnostic aid before death. The BoHV-5 genome was detected in several areas of the encephalon and in the trigeminal ganglia; as well as in the CSF of two calves showing neurological signs. Histologically, all calves developed encephalic inflammatory process which confirms that the encephalitis caused by BoHV-5 may, sometimes, be mild and asymptomatic. Key words: Calf; BoHV-5; encephalitis; clinical signs; diagnosis

10 10 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Variação da temperatura retal aferida diariamente à tarde em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro sintomático Gráfico 2 Variação do número total de leucócitos presentes no sangue de bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro Gráfico 3 Variação do número de segmentados presentes no sangue de bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro Gráfico 4 Variação da concentração do fibrinogênio plasmático em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro Gráfico 5 Variação dos leucócitos mononucleares presentes no líquor de bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro LISTA DE FIGURAS Figura 1 Cortes histológicos de sistema nervoso central de bezerros acometidos por meningoencefalite causada pelo BoHV-5, corados por HE. A. Área de malácia no córtex frontal (10x). B. Acentuado infiltrado inflamatório perivascular de células mononucleares (seta) (20x). C. Gliose focal (seta) (20x). D. Acentuado infiltrado inflamatório mononuclear em leptomeninges (seta) (20x)... 60

11 11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Aspectos clínicos individuais da evolução da meningoencefalite herpética induzida experimentalmente em bezerros. Londrina/Paraná, Tabela 2 Valores das funções vitais (x ± s) aferidas diariamente à tarde em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Tabela 3 Valores do eritrograma (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Tabela 4 Valores do leucograma e do fibrinogênio plasmático (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Tabela 5 Valores liquóricos (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Tabela 6 Resultados da presença de DNA viral detectado pela PCR e do isolamento viral em porções do sistema nervoso e em amostras de líquor dos bezerros sintomáticos e assintomáticos inoculados com BoHV Tabela 7 Alterações histológicas das porções do sistema nervoso dos bezerros que desenvolveram quadro de encefalopatia (n=4) e dos que permaneceram assintomáticos (n=3) após inoculação experimental com BoHV

12 12 SUMÁRIO 1 REVISÃO DE LITERATURA ENCEFALITE PELO BoHV-5 REVISÃO DE LITERATURA Introdução Etiologia Epidemiologia Patogenia Sinais clínicos Achados patológicos Diagnóstico Diagnóstico diferencial Profilaxia Referências OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Objetivos específicos ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO BoHV-5 EM BEZERROS: EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO Resumo Abstract Introdução Material e métodos Resultados e discussão Referências CONCLUSÕES APÊNDICE Apêndice A Lista de tabelas... 70

13 1 REVISÃO DE LITERATURA 13

14 14 ENCEFALITE PELO BoHV-5 - REVISÃO DE LITERATURA INTRODUÇÃO A meningoencefalite herpética bovina é uma infecção viral do Sistema Nervoso Central (SNC) causada pelo herpesvírus bovino 5 (BoHV-5), que acomete bovinos de todas as faixas etárias, principalmente os jovens (D ARCE et al., 2002; SALVADOR et al., 1998; SOUZA et al., 2002). A infecção é caracterizada por uma meningoencefalite não purulenta, associada a lesões necróticas do córtex cerebral e inflamatórias nas substâncias branca e cinzenta, sendo geralmente fatal (CARRILO et al., 1983; RIET-CORREA et al., 1989). ETIOLOGIA O BoHV-5 é um membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. É um vírus DNA de fita dupla, com aproximadamente 137 Kilobases (Kb) constituído por uma região única longa (U L ) e uma região única curta (U S ), nucleocapsídeo icosaédrico com 162 capsômeros e envelope glicoprotéico (FAUQUET et al., 2004). Os membros dessa subfamília são reconhecidos pela sua grande variedade de hospedeiros, rápido crescimento em culturas e habilidade em causar lise nas células. Porém, a principal propriedade biológica dessa subfamília é a capacidade de estabelecer latência em neurônios dos gânglios sensoriais após a infecção aguda (ASHBAUGH et al., 1997; CHOWDHURY et al., 2002; SILVA et al., 1998). A reativação do vírus está geralmente associada a fatores de estresse como transporte, parto, desmama ou confinamento e pelo tratamento sistêmico com

15 15 corticosteróides. Ocorre com ou sem sinais clínicos e pode haver liberação de partículas virais infecciosas nas secreções nasais (BELKNAP et al., 1994; COLODEL et al., 2002; HALFEN; VIDOR, 2001; MEYER et al., 2001). O BoHV-1 também pertence à subfamília Alphaherpesvirinae e é responsável por várias enfermidades como a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite/balanopostite infecciosa (IPV), conjuntivite e abortamentos, estando raramente associado a quadros de encefalite (PEREZ et al., 2002; ROELS et al., 2000; SOUZA et al., 2002). Durante o período de latência não é possível o isolamento do vírus e antígenos virais não são demonstrados na célula infectada. Entretanto, técnicas moleculares como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e hibridização in situ são capazes de detectar o DNA viral e identificar os sítios de latência, como o gânglio trigeminal para o BoHV-5 e linfonodos e mucosa nasal para o BoHV-1. Em contraste com a infecção ativa, onde a replicação viral é comumente seguida de lise celular, a infecção latente geralmente não determina a lise da célula infectada e ocorre em células de vida longa, com baixa taxa de replicação e altamente diferenciadas, como os neurônios e células linfóides (ASHBAUGH et al., 1997; CARON et al., 2002; ENGELS; ACKERMANN, 1996). A replicação viral ocorre no núcleo celular. São descritas pelo menos dez glicoproteínas do envelope viral, as quais são importantes para desencadear resposta imune do hospedeiro. A entrada do herpesvírus na célula também é mediada por várias dessas glicoproteínas, que fazem a ligação, a fusão e a penetração do vírus na célula hospedeira e têm importante função na difusão do vírus célula a célula (SCHWYZER; ACKERMANN, 1996; WILD et al., 1998). As três principais glicoproteínas são gb, gc e gd (CHOWDHURY, 1995).

16 16 Os primeiros isolamentos de herpesvírus a partir de animais com sinais de encefalopatia, por carência de métodos adequados para a caracterização viral, foram atribuídos ao BoHV-1, agente etiológico dos quadros de IBR e IPV, devido ao grau de homologia entre estas estirpes (D OFFAY et al., 1993; FRENCH, 1962; RIET-CORREA et al., 1989). Posteriormente, foi denominado BoHV tipo 1, subtipo 3 (BoHV-1.3) e, finalmente, pelas suas características moleculares, epidemiológicas e antigênicas distintas, foi reclassificado como BoHV-5 (COLODEL et al., 2002; TEIXEIRA et al., 1998). Embora tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 sejam vírus neurotrópicos, eles diferem em sua capacidade de causar encefalite (ASHBAUGH et al.,1997; CHOWDHURY et al., 2002). O BoHV-1 pode ocasionalmente ser neuroinvasivo, mas raramente causa encefalite, enquanto o BoHV-5 tem forte neurotropismo, freqüentemente levando a encefalites fatais (PEREZ et al., 2002). A infecção pelo BoHV-1 geralmente determina alta morbidade e baixa mortalidade. Já a infecção pelo BoHV-5 costuma se apresentar com baixa morbidade e alta letalidade (D ARCE et al., 2002; ROEHE et al., 1997; SOUZA et al., 2002). Com relação à composição genômica, o DNA do BoHV-5 apresenta similaridade de 85% com o do BoHV-1. Sugere-se que as diferenças na seqüência de nucleotídeos entre esses dois vírus estejam distribuídas por todo o genoma (CHOWDHURY et al., 2002). Análises com anticorpos monoclonais (MAbs) têm demonstrado diferenças antigênicas entre as principais glicoproteínas (gb, gc e gd) do BoHV-5 e BoHV-1 (CHOWDHURY et al., 1997; COLLINS et al., 1993).

17 17 EPIDEMIOLOGIA Devido à grande similaridade genômica, ocorre uma forte reação sorológica cruzada entre os diferentes BoHV, o que dificulta os levantamentos epidemiológicos geográficos da ocorrência do BoHV-5 (COLODEL et al., 2002; HALFEN et al., 2000). Desta forma é desconhecida a prevalência do BoHV-5 no mundo (ROEHE et al., 1997). Inquéritos sorológicos indicam que o BoHV-1 está disseminado nos rebanhos de todo o país, embora uma parte dos bovinos soropositivos para o BoHV-1 possa estar infectada pelo BoHV-5, já que não existem meios de diferenciar os anticorpos produzidos contra os dois vírus (HALFEN; VIDOR, 2001). Surtos de meningoencefalite herpética têm sido relatados em vários países como Austrália (FRENCH, 1962; GARDINER et al., 1964; HILL et al., 1984), Estados Unidos (BARENFUS et al., 1963), Canadá (GOUGH; JAMES, 1975), Argentina (CARRILO et al., 1983) e Escócia (WATT et al., 1981). No Brasil, encefalites causadas por BoHV-5 têm sido confirmadas de forma crescente nos rebanhos, com casos descritos nos Estados do Rio Grande do Sul (RIET- CORREA et al., 1989; WEIBLEIN et al., 1989), Rio de Janeiro, Minas Gerais (GOMES et al., 2002; SOUZA et al., 2002), Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, São Paulo (COLODEL et al., 2002; SALVADOR et al., 1998) e Paraná (CLAUS, 2002). Embora não existam relatos da infecção em outros Estados, sugere-se que o BoHV-5 seja enzoótico em todo o país (ROEHE et al., 1997). No Rio Grande do Sul, casos de encefalites por BoHV-5 foram a segunda maior causa de encefalites com etiologia definida, sendo a primeira, a raiva (SANCHES et al., 2000). Os surtos não apresentam caráter sazonal, sendo acometidos bovinos de diferentes raças e independente do sexo, afetando principalmente animais jovens, porém

18 18 surtos acometendo animais com mais de 60 meses já foram relatados (ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA., 2004; SALVADOR et al., 1998). PATOGENIA Alguns trabalhos de infecção experimental em coelhos, ovinos e bezerros têm sido realizados na busca do melhor entendimento da patogenia da infecção pelo BoHV-5 (BAGUST; CLARK, 1972; BELTRÃO et al., 2000; MEYER et al., 1996; PEREZ et al., 2002; SILVA et al., 1999; VOGEL et al., 2003). As principais portas de entrada do vírus são as superfícies mucosas do trato respiratório. A transmissão é geralmente associada ao contato íntimo com essas superfícies, mas o vírus também pode ser propagado por meio de aerossóis (HALFEN; VIDOR, 2001). Beltrão et al. (2000), utilizando coelhos como modelos experimentais, mostraram que a inoculação pela via intranasal foi mais eficiente na indução da doença nervosa do que pela via conjuntival. Coelhos sacrificados 24 horas pós-inoculação (p.i.) intranasal demonstraram replicação viral somente na cavidade nasal. Em coelhos sacrificados posteriormente, detectou-se a replicação viral no bulbo olfatório (48h p.i.) e no córtex olfatório (48 a 72h p.i.). Com 72h p.i. o vírus foi detectado também no gânglio do trigêmeo e na ponte, além do córtex cerebral. No quarto dia após a inoculação, a infecção já se encontrava distribuída por várias áreas do SNC. Estes estudos sugerem o sistema olfatório como a principal via de acesso do BoHV-5 ao encéfalo após a inoculação intranasal. Chowdhury et al. (1997) também utilizaram a inoculação intranasal do BoHV-5 em coelhos, associada ao tratamento com dexametasona. Dados de isolamento e identificação viral, histopatológicos, imunoistoquímicos e de hibridização in-situ mostraram que o BoHV-5 foi capaz de invadir e se replicar nas estruturas olfatórias do coelho, sugerindo que o vírus alcance o SNC, predominantemente, pelo bulbo olfatório.

19 19 Perez et al. (2002), para estudar a patogenia da infecção pelo BoHV-5 em bovinos, utilizaram bezerros inoculados pela via intranasal com uma estirpe viral isolada de um bovino com quadro de encefalite na Argentina. Os bezerros foram separados em dois grupos: animais com infecção aguda (grupo 1) e animais com infecção latente (grupo 2). Três meses p.i., os animais do grupo 2 receberam dexametasona por via intravenosa na dose de 0,1 mg/kg/dia, por 5 dias. A excreção do BoHV-5 em secreções nasais e oculares foi evidenciada em 75% dos animais do grupo 1 e em 91% dos animais do grupo 2. Em ambos os grupos, o córtex anterior foi a área mais gravemente afetada. As lesões se desenvolveram simultaneamente no córtex anterior, bulbo, ponte e gânglio do trigêmeo, sugerindo que o BoHV-5 alcance o cérebro por transporte axonal nos neurônios bipolares dos nervos olfatórios para o bulbo olfatório. Vogel et al. (2003), para estudar a distribuição do BoHV-5 no SNC, inocularam 12 bezerros pela via intranasal com uma estirpe viral isolada de um surto de meningoencefalite no sul do Brasil, sendo que outros dois animais permaneceram como controle negativo. Cinqüenta e cinco dias p.i., quatro bezerros inoculados (grupo A) foram submetidos à eutanásia para coleta de amostras do SNC. Os outros oito animais (grupo B) foram tratados com dexametasona por 5 dias a partir do dia 60 pi e submetidos à eutanásia 55 dias após o tratamento com dexametasona. Verificou-se que todos os animais inoculados apresentaram excreção viral por vários dias durante a infecção aguda. Após o tratamento com dexametasona (grupo B), cinco dos oito animais apresentaram excreção viral, porém, por menos dias do que na infecção aguda. Em ambos os grupos, o DNA viral foi detectado em várias porções do SNC, porém a distribuição foi mais ampla nos bezerros do grupo B. Foi demonstrado que o DNA do BoHV-5 está presente em diversas áreas do SNC de bovinos com infecção latente, sendo que após a reativação outras áreas também apresentaram DNA viral.

20 20 SINAIS CLÍNICOS Os principais sintomas observados em casos de meningoencefalite herpética bovina são: isolamento do rebanho, depressão, secreção nasal e ocular, sialorréia, nistagmo, opistótono, amaurose, andar em círculo, ataxia, hipermetria, tremores musculares, flacidez de língua, bruxismo, convulsões, decúbito permanente, coma e morte. O período de evolução da doença é apontado como variável de 1 a 15 dias, sendo mais comum entre 4 e 7 dias (COLODEL et al., 2002; RIET-CORREA et al., 1996; SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000). Os sinais clínicos podem variar de acordo com a área do SNC acometida. Assim, em um mesmo foco, os animais acometidos não necessariamente irão apresentar os mesmos sinais clínicos e na mesma intensidade (LISBÔA et al., 2003). ACHADOS PATOLÓGICOS À necropsia, com freqüência não são evidenciadas lesões significativas (SALVADOR et al., 1998). As principais alterações macroscópicas descritas no encéfalo são áreas de malácia corticais, achatamento das circunvoluções, protrusão cerebelar pelo forâmen magno, congestão e hemorragia (RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; WEIBLEIN et al., 1989). As lesões macroscópicas no SNC aparentemente não têm relação com o tempo de evolução da doença, uma vez que as lesões de malácia do córtex cerebral ocorrem tanto nos bovinos com curso clínico de 2 a 3 dias como naqueles em que a evolução da doença é superior a 7 dias (ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004). Microscopicamente, as principais alterações caracterizam-se por meningoencefalite não supurativa difusa, presença de manguitos perivasculares de células

21 21 mononucleares, satelitose, necrose neuronal, gliose multifocal, meningite e hemorragias. Corpúsculos de inclusão intranucleares, geralmente eosinofílicos, podem ocorrer em neurônios, sendo mais freqüentes nos astrócitos (ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002; SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000). DIAGNÓSTICO O diagnóstico ante-mortem é difícil de ser estabelecido, visto que não existem sintomas patognomônicos da enfermidade, a qual pode se confundir com qualquer outro quadro de encefalopatia. O diagnóstico post-mortem com auxílio de métodos laboratoriais é, portanto, de importância fundamental (HALFEN; VIDOR, 2001). As taxas de morbidade e de letalidade podem ajudar no direcionamento do diagnóstico, bem como excluir outras enfermidades. Testes sorológicos têm valor limitado no diagnóstico, pois não diferenciam animais infectados pelo BoHV-5 dos infectados pelo BoHV-1, devido à intensa reação cruzada entre os vírus (ROEHE et al., 1997; TEIXEIRA et al., 1998). A confirmação do envolvimento do BoHV-5 pode ser realizada pelo isolamento do vírus em cultivo celular e posterior caracterização do isolado por meio de técnicas que empregam anticorpos monoclonais para a identificação de proteínas virais específicas (ROEHE et al., 1997); e/ou por técnicas moleculares (CLAUS, 2002; D OFFAY et al., 1993). Kunrath et al. (2004), utilizando anticorpos monoclonais (AcM) produzidos com uma estirpe brasileira do BoHV-5, padronizaram técnicas rápidas para o diagnóstico de infecções por herpesvírus. A detecção de antígenos virais por imunofluorescência em células descamativas (IFCD) foi comparada com o isolamento viral em secreções nasais de bezerros,

22 22 apresentando uma concordância nos resultados de 89,6%. Testes com AcM também foram utilizados para detectar antígenos do BoHV-5 em impressões frescas do cérebro de bezerros acometidos de enfermidade neurológica e em células de cultivo utilizadas na técnica de soroneutralização, permitindo a obtenção dos resultados em 24 horas. A técnica, denominada de soroneutralização rápida, apresentou sensibilidade de 97,3%, especificidade de 95,5% e precisão de 96,2% em comparação com a soroneutralização tradicional, mostrando que os AcM podem ser úteis para uso em técnicas rápidas para o diagnóstico de infecções suspeitas de BoHV-5. Atualmente, técnicas de biologia molecular como a PCR para a detecção do genoma viral são empregadas com sucesso no diagnóstico da infecção pelo BoHV-5. Além disso, a técnica de PCR não exige a viabilidade da partícula viral e possibilita a utilização de uma ampla variedade de amostras. Esta característica assume grande importância em Medicina Veterinária onde, principalmente em animais de produção, os materiais biológicos colhidos a campo para o diagnóstico muitas vezes são conservados inadequadamente e demandam longo intervalo de tempo para o transporte até o laboratório (ASHBAUGH et al., 1997; CLAUS, 2002). Quanto a este último aspecto a técnica de PCR seria mais vantajosa do que o isolamento em cultivo celular, além de fornecer resultado mais rápido. Trabalhando com a infecção experimental em bezerros, Meyer et al. (2001) puderam demonstrar que as partículas virais não se distribuem uniformemente por todo o encéfalo, gerando resultados de cultivo celular negativos de acordo com a área que originou o fragmento estudado. O sucesso do diagnóstico depende, portanto, da escolha apropriada da(s) amostra(s) a ser(em) encaminhada(s). É ausente na literatura qualquer menção a respeito da possibilidade da utilização de amostras de líquor com fins diagnósticos e das alterações no líquor de animais acometidos de encefalite pelo BoHV-5 sendo, entretanto, a pleiocitose

23 23 mononuclear e/ou aumento na concentração de proteína um achado comum em encefalites herpéticas em outras espécies (CALLAN; VAN METRE, 2004). DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Como os sinais neurológicos presentes nas infecções pelo BoHV-5 podem ser observados em diversas situações onde haja comprometimento das funções do encéfalo, o diagnóstico diferencial é de fundamental importância (CLAUS, 2002). Os principais diagnósticos diferenciais são a raiva, a polioencefalomalácia, algumas intoxicações por plantas, encefalites bacterianas (HALFEN; VIDOR, 2001; SALVADOR et al., 1998) e intoxicação por chumbo (CALLAN; VAN METRE, 2004). Sanches et al. (2000) realizaram um estudo retrospectivo das necropsias de bovinos no Sul do Brasil, onde em cerca de 10% dos casos estavam presentes sinais de distúrbios neurológicos. Dos casos em que foi possível concluir o diagnóstico, cerca de 50% foram diagnosticados como raiva (151 animais) e aproximadamente 5% como meningoencefalite herpética bovina (14 animais). Spilki et al. (2003) descreveram o isolamento de BoHV-5 de um caso confirmado de raiva em um bezerro com sinais de encefalopatia. O diagnóstico de raiva foi confirmado por meio de imunofluorescência direta e inoculação em camundongos. Já o isolamento do BoHV-5 foi realizado em cultivo de células MDBK. Os autores sugerem que este caso de infecção mista pode ter sido causado pela reativação do herpesvírus após a infecção pelo vírus rábico, levando o animal a uma situação de estresse. Porém, não foi possível estimar se o BoHV-5 teve um papel ativo durante o quadro.

24 24 PROFILAXIA As manifestações clínicas da infecção pelo BoHV-5 podem ser controladas e prevenidas por meio de procedimentos adequados de manejo e programas de vacinação (HALFEN; VIDOR, 2001). Devido às similaridades em aspectos biológicos e moleculares entre o BoHV-5 e o BoHV-1, ocorrem significativas reações sorológicas cruzadas entre os dois vírus. Dessa forma, a mesma tecnologia utilizada para a produção de vacinas contra o BoHV-1 é apontada como alternativa para o controle dos surtos de meningoencefalite pelo BoHV-5 (HALFEN et al., 2000). Apesar de não impedir as infecções pelos BoHV-1 e BoHV-5, a vacinação reduz significativamente a incidência da doença (HALFEN; VIDOR, 2001). Vogel et al. (2002) realizaram um estudo para determinar a atividade neutralizante antibohv-5 conferida por três vacinas contendo antígenos do BoHV-1. Bovinos soronegativos foram divididos em três grupos e imunizados três vezes (5mL via intramuscular nos dias 0, 30 e 180) com vacinas que continham antígenos do BoHV-1 (vacina A e B) ou com uma vacina contendo antígenos do BoHV-1 e BoHV-5 (vacina C). O soro coletado no dia 210 foi testado pela técnica de soroneutralização frente ao BoHV-1 e BoHV-5. Nos três grupos, os títulos médios antibohv-1 não diferiram dos títulos antibohv-5. A vacina C resultou no maior número de reagentes contra o BoHV-5 (96,9%), enquanto as vacinas A e B resultaram, respectivamente, em 85,7% e 92,9% de animais sororreagentes. Com isto, a inclusão de antígenos do BoHV-5 em vacinas a serem utilizadas em regiões onde as duas espécies de vírus estão presentes parece ser desejável para ampliar o grau e espectro da resposta imunológica. Para a imunoprofilaxia das herpesviroses no Brasil, são disponíveis dois tipos de vacinas: vacinas com vírus inativados, e vacinas com vírus atenuados termo-sensíveis

25 25 (mutante ts), de uso intramuscular. Essas vacinas são comprovadamente seguras para uso em todas as categorias de animais, inclusive fêmeas gestantes, sendo que na primo vacinação são necessárias duas doses com intervalos de três a quatro semanas (ALFIERI; ALFIERI; MÉDICI, 1998). Animais, filhos de mães vacinadas e que receberam adequadamente o colostro, deverão ser vacinados, com duas doses, entre o quinto e sexto mês de vida. Animais filhos de vacas negativas e não vacinadas poderão receber a primeira dose já a partir de dois a três meses de idade. Para as revacinações, que deverão ocorrer num intervalo máximo de nove meses a um ano, apenas uma dose de vacina é necessária (ALFIERI; ALFIERI; MÉDICI, 1998). Este esquema de vacinação é recomendado para prevenção de infecções pelo BoHV-1, podendo ser utilizado também para profilaxia da meningoencefalite herpética bovina. REFERÊNCIAS ALFIERI, A.A.; ALFIERI, A.F.; MÉDICI, K.C. Conseqüências da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 1 sobre o sistema reprodutivo de bovinos. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v.19, n.1, p.86-93, ASHBAUGH, S.E.; THOMPSON, K.E.; BELKNAP, E.B.; SCHULTHEISS, P.C.; CHOWDHURY, S.; COLLINS, J.K. Specific detection of shedding and latency of bovine herpesvirus 1 and 5 using a nested polymerase chain reaction. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Lawrence, v.9, n.4, p , BAGUST, T.J.; CLARK, L. Pathogenesis of meningo-encephalitis produced in calves by infectious bovine rhinotracheitis herpesvirus. Journal of Comparative Pathology, Edinburgh, v.82, p , BARENFUS, M.; QUADRI, C.A.D.; MCINTYRE, R.W.; SCHROEDER, R.J. Isolation of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus from Calves with Meningoencephalitis. Journal of American Veterinary Medical Association, Chicago, v.143, n.7, p , Oct BELKNAP, E.B.; COLLINS, J.K.; AYERS, V.K., SCHULTHEISS, P.C. Experimental infection of neonatal calves with neurovirulent bovine herpesvirus type 1.3. Veterinary Pathology, Lawrence, v.31, p , 1994.

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27 27 D OFFAY, J.M.; MOCK, R.E.; FULTON, R.W. Isolation and characterization of encephalitic bovine herpesvirus type 1 isolates from cattle in North America. American Journal of Veterinary Research, Chicago, v.54, n.4, p , Apr ELIAS, F.; SCHILD, A.L.; RIET-CORREA, F. Meningoencefalite e encefalomalacia por Herpesvírus bovino-5: distribuição das lesões no sistema nervoso central de bovinos naturalmente infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v.24, n.3, p , jul./set ENGELS, M.; ACKERMANN, M. Pathogenesis of ruminant herpesvirus infections. Veterinary Microbiology, Amsterdan, v.53, n.1,2, p.3-15, Nov FAUQUET, C. M.; MAYO, M. A.; MANILOFF, J.; DESSELBERGER, U.; BALL, L. A. Virus Taxonomy. The eighth report. San Diego: Academic Press, 2004, 1162 p. FRENCH, E.L. A specific virus encephalitis in calves: isolation and characterization of the causal agent. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.38, p , Apr GARDINER, M.R.; NAIRN, M.E.; SIER, A.M. Viral meningoencephalitis of calves in Western Australia. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.40, p , June GOMES, L.I.; ROCHA, M.A.; COSTA, E.A.; LOBATO, Z.I.P.; MENDES, L.C.N.; BORGES, A.S.; LEITE, R.C.; BARBOSA-STANCIOLI, E.F. Detecção de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) em bovinos do Sudeste Brasileiro. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.54, n.2, p , GOUGH, A.; JAMES, D. Isolation of IBR virus from a heifer with meningoencephalitis. Canadian Veterinary Journal, Guelph, v.16, n.10, p , Oct HALFEN, D.C.; VIDOR, T. Infecções por herpesvírus bovino-1 e herpesvírus bovino-5. In: RIET-CORREA,F.; SCHILD, A.L.; MÉNDEZ, M.D.C.; LEMOS, R.A.A. Doenças de ruminantes e eqüinos. 2.ed. São Paulo : Varela, v.2, p HALFEN, D.C.; VIDOR, T.; BRAGA, F.M.; VAN DER LAAN, C.W. Imunogenicidade do herpesvírus bovino tipo 5 (BHV-5) em vacinas inativadas de diferentes formulações. Ciência Rural, Santa Maria, v.30, n.5, p , HILL, B.D.; HILL, M.W.M.; CHUNG, Y.S.; WHITTLE, R.J. Meningoencephalitis in calves due to bovine herpesvirus type 1 infection. Australian Veterinary Journal, Sydney, v.61, n.7, p , July KUNRATH, C.F.; VOGEL, F.S.F.; OLDONI, I.; FLORES, E.F.; WEIBLEN, R.; DEZENGRINI, R.; TORRES, F.D.; PAN, K.A. Soroneutralização e imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais no diagnóstico rápido de infecções pelo herpesvírus bovino tipos 1 e 5 (BHV-1 e BHV-5). Ciência Rural, Santa Maria, v.34, n.6, p , nov.-dez

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30 2 OBJETIVOS 30

31 OBJETIVO GERAL Avaliar aspectos da evolução clínica e do diagnóstico da meningoencefalite herpética em bezerros experimentalmente infectados com o herpesvírus bovino OBJETIVOS ESPECÍFICOS Caracterizar os sintomas e a evolução do quadro de meningoencefalite herpética em bezerros. Identificar as alterações hematológicas e liquóricas ao longo da evolução. Verificar as alterações histológicas em diferentes áreas do encéfalo e no gânglio do nervo trigêmeo. Verificar a presença do vírus em diferentes áreas do encéfalo, no gânglio do nervo trigêmeo e no líquor.

32 3 ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO 32

33 33 INFECÇÃO EXPERIMENTAL PELO BoHV-5 EM BEZERROS: EVOLUÇÃO CLÍNICA E DIAGNÓSTICO RESUMO A encefalite causada pelo BoHV-5 acomete bovinos de todas as faixas etárias, principalmente os jovens, e determina baixa morbidade e alta letalidade. No Brasil, surtos da doença têm sido relatados de forma crescente. Alguns aspectos sobre essa enfermidade ainda merecem maior esclarecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a evolução clínica e aspectos do diagnóstico da meningoencefalite herpética em bezerros infectados experimentalmente com BoHV-5. Sete bezerros machos, sadios, da raça HPB com até 60 dias de idade foram infectados por instilação de 0,5mL de inóculo (10 7,42 TCID 50 ) em cada cavidade nasal. A estirpe viral utilizada foi a AA PAR. Durante o período experimental pós-infecção (p.i.) realizaram-se exames físicos duas vezes ao dia e hemogramas a cada 48 horas. Amostras de líquor foram colhidas e analisadas a cada 48 horas a partir do início dos sinais de encefalopatia. Nove subdivisões do encéfalo (córtex anterior, córtex dorso-lateral, córtex ventro-lateral, córtex posterior, diencéfalo, mesencéfalo, ponte, medula oblonga e cerebelo) e os gânglios do nervo trigêmeo foram colhidos após a morte e submetidos ao exame histopatológico. A presença do vírus foi investigada, por meio da reação em cadeia pela polimerase (PCR) e do isolamento em cultivo celular, nas diferentes porções do encéfalo, no líquor e nos gânglios do nervo trigêmeo. Quatro bezerros manifestaram sinais de encefalopatia a partir dos dias 9 (n=2) e 11 p.i. (n=2) e evoluíram para a morte em 12 horas (n=1), 3 dias (n=2) ou 10 dias (n=1). Os demais bezerros (n=3) não manifestaram qualquer evidência de encefalopatia e foram submetidos à eutanásia 30 dias p.i.. Os principais sintomas observados foram: depressão, disfagia, amaurose, manias (atos compulsivos), ataxia, sialorréia, mioclonias na face e convulsões. As freqüências respiratória e cardíaca não variaram significativamente ao longo do tempo, e a temperatura corporal exibiu uma tendência a se elevar entre 9 e 12 dias p.i. As alterações no leucograma foram discretas e inespecíficas coincidindo com o início do quadro. A elevação de células mononucleares no líquor foi a alteração mais importante de auxílio ao diagnóstico ainda em vida, apresentandose tanto nos bezerros sintomáticos quanto nos assintomáticos. O genoma viral foi identificado em várias localizações do encéfalo e nos gânglios dos nervos trigêmeos, assim como, no líquor de dois bezerros que manifestaram encefalopatia. O exame histopatológico confirmou, por fim, que todos os bezerros estudados exibiram processo inflamatório encefálico, indicando que a encefalite causada pelo BoHV-5 pode, eventualmente, ser branda e assintomática. Palavras-chave: Bezerro; BoHV-5; encefalite; sinais clínicos; evolução; diagnóstico

34 34 BoHV-5 EXPERIMENTAL INFECTION IN CALVES: CLINICAL FEATURE AND DIAGNOSIS ABSTRACT The encephalitis caused by BoHV-5 affects cattle of all ages, mainly young, and is characterized by low morbidity rate and high case fatality rate. Outbreaks of this disease have increasingly been reported in Brazil. Some aspects of this disease are still unclear. In this study, cases of herpetic meningoencephalitis were experimentally induced in calves to investigate clinical pictures and diagnosis. Seven healthy male Holstein calves, up to 60 days old, were infected with 0,5mL of virus suspension (10 7,42 TCID 50 ) in each nasal cavity. The AA PAR viral strain was used in this experiment. During the experimental postinfection (p.i.) period, physical examinations were conducted twice a day and routine complet blood counts were performed every 48 hours. Cerebrospinal fluid (CSF) analysis was performed in samples collected every 48 hours from the onset of neurological signs on. Nine encephalic portions (anterior cortex, dorsolateral cortex, ventrolateral cortex, posterior cortex, diencephalon, mesencephalon, pons, medulla oblongata and cerebellum) and the trigeminal ganglia were obtained at necropsy and submitted to histopathology. Virus detection was investigated in each encephalic portion, trigeminal ganglia and CSF by means of polimerase chain reaction (PCR) and virus isolation in cells culture. Four calves developed signs of neurologic disease beginning at days 9 (n=2) and 11 p.i. (n=2) and died in 12 hours (n=1), 3 days (n=2) and 10 days (n=1). The other three calves remained asymptomatics and were euthanized 30 days p.i.. Depression, dysphagia, amaurosis, mania (compulsive behavior), ataxia, sialorrhea, facial myoclonia and convulsion were the main signs. No significant changes occurred in the heart and respiratory rates; but the rectal temperature tended to increase between days 9 and 12 p.i..the changes in leukogram were slight and unspecific coinciding with the onset of clinical signs. Increases in CSF mononuclear cell counts occurred in all symptomatic and asymptomatic calves, as the most important diagnostic aid before death. The BoHV-5 genome was detected in several areas of the encephalon and in the trigeminal ganglia; as well as in the CSF of two calves showing neurological signs. Histologically, all calves developed encephalic inflammatory process which confirms that the encephalitis caused by BoHV-5 may, sometimes, be mild and asymptomatic. Key words: Calf; BoHV-5; encephalitis; clinical signs; diagnosis

35 35 INTRODUÇÃO O herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) é um vírus DNA de fita dupla, com envelope glicoprotéico, pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, (FAUQUET et al., 2004). O BoHV-5 é o agente etiológico da meningoencefalite herpética dos bovinos, que acomete principalmente animais jovens e apresenta baixa morbidade e alta letalidade (D'ARCE et al., 2002; SALVADOR et al., 1998). O herpesvírus bovino 1 (BoHV- 1) também pertence a essa mesma subfamília, e é responsável por várias enfermidades como a rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), vulvovaginite/balanopostite pustular infecciosa (IPV), conjuntivite e abortamentos (KAHRS, 1977). A principal diferença entre o BoHV-5 e o BoHV-1 é a habilidade de cada um causar doença neurológica. Tanto o BoHV-5 quanto o BoHV-1 são vírus neurotrópicos, mas apenas o BoHV-5 é capaz de se replicar significativamente no sistema nervoso central (SNC) e causar a doença neurológica (ASHBAUGH et al., 1997; BELKNAP et al., 1994; STUDDERT, 1989). Surtos de meningoencefalite pelo BoHV-5 têm sido relatados em vários países do mundo como Austrália (FRENCH, 1962; GARDINER et al., 1964; HILL et al., 1984), Estados Unidos (BARENFUS et al., 1963), Canadá (GOUGH; JAMES, 1975), Argentina (CARRILO et al., 1983) e Escócia (WATT et al., 1981). No Brasil, encefalites causadas pelo BoHV-5 têm sido confirmadas de forma crescente nos rebanhos, com casos descritos no Rio Grande do Sul (RIET-CORREA et al., 1989; WEIBLEN et al., 1989), Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, São Paulo (COLODEL et al., 2002; SALVADOR et al., 1998), Rio de Janeiro, Minas Gerais (GOMES et al., 2002; SOUZA et al., 2002) e Paraná (CLAUS, 2002). No Brasil, casos de meningoencefalite pelo BoHV-5 foram a segunda maior causa de encefalites em bovinos com etiologia definida, sendo a primeira, a raiva (SANCHES et al., 2000).

36 36 Devido à grande similaridade genômica, o BoHV-1 e o BoHV-5 apresentam forte reação sorológica cruzada, e com isso os testes sorológicos têm valor limitado no diagnóstico (ROEHE et al., 1997; TEIXEIRA et al., 1998). O isolamento viral a partir de fragmentos do SNC pode ser utilizado para a confirmação do envolvimento do BoHV-5, porém alguns autores relatam dificuldade para isolar o vírus de tecidos cerebrais de bezerros e coelhos experimentalmente infectados, principalmente após a reativação viral induzida com aplicação de dexametasona (CARON et al., 2002; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003). Técnicas de biologia molecular como a reação em cadeia pela polimerase (PCR) têm sido empregadas com sucesso no diagnóstico da infecção pelo BoHV-5, apresentando a vantagem de não exigir viabilidade viral (ASHBAUGH et al., 1997; CLAUS, 2002). Meyer et al. (2001) demostraram que o vírus não está distribuído uniformemente por todo o encéfalo, sendo então importante a escolha apropriada das amostras a serem encaminhadas para o diagnóstico. Os principais sintomas observados na meningoencefalite herpética são nistagmo, bruxismo, opistótono, amaurose, sialorréia, andar em círculos, ataxia, tremores musculares e convulsões. O período de evolução da doença é apontado como variável de 1 a 15 dias, sendo mais comum entre 4 e 7 dias (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004; SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000). À necropsia, as principais alterações macroscópicas relatadas são áreas de malácia, achatamento das circunvoluções, congestão e hemorragias, porém é freqüente a ausência de lesões (RIET- CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998; WEIBLEN et al., 1989). As principais alterações microscópicas caracterizam-se por meningoencefalite não supurativa difusa, manguitos perivasculares de células mononucleares, satelitose, necrose neuronal, gliose, meningite, hemorragias e corpúsculos de inclusão intranucleares principalmente em astrócitos (ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002; SALVADOR et al., 1998; SANCHES et al., 2000).

37 37 Com o objetivo de estudar a patogenia da doença, alguns trabalhos têm sido realizados por meio da indução experimental da infecção em coelhos (BELTRÃO et al., 2000; CARON et al., 2002; MEYER et al., 1996), em cordeiros (SILVA et al., 1998) e em bezerros (BELKNAP et al., 1994; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003). Alguns pesquisadores sugerem o sistema olfatório como a principal via de acesso ao SNC (BELTRÃO et al., 2000; PEREZ et al., 2002), enquanto outros sugerem que a invasão do SNC seja via gânglio do nervo trigêmeo (BAGUST; CLARK, 1972). Entretanto, muitos fatores relacionados a essa enfermidade ainda necessitam maiores esclarecimentos, tais como os aspectos clínicos e os relacionados ao diagnóstico. Esse trabalho teve por objetivos caracterizar os sintomas e a evolução do quadro de meningoencefalite herpética experimentalmente induzida em bezerros, assim como avaliar aspectos do diagnóstico da doença.

38 38 MATERIAL E MÉTODOS Células e vírus Todos os procedimentos de multiplicação e quantificação do BoHV-5, bem como as tentativas de isolamento viral foram realizados em células da linhagem Madin Darby bovine kidney (MDBK) mantidas em Meio Essencial Mínimo (MEM) (Invitrogen, EUA) suplementado com 8% de soro fetal bovino (Gibco, BRL, EUA), gentamicina (55 µg/ml) e anfotericina-b (2,5 µg/ml). A estirpe viral utilizada foi a AA PAR isolada do cérebro de um bovino apresentando sinais de encefalite e caracterizada como BoHV-5 por meio de imunoperoxidase com anticorpos monoclonais (SOUZA et al., 2002), sendo confirmada como BoHV-5 pela técnica da PCR (CLAUS, 2002). O título viral, expresso em doses infecciosas para cultura de tecidos 50% (DICT 50 ) foi obtido segundo Reed e Muench (1938). Bezerros Foram utilizados sete bezerros machos, clinicamente sadios, da raça Holandesa, entre 20 e 58 dias de idade, procedentes de propriedades rurais de exploração leiteira da região de Londrina/Pr. Selecionaram-se animais frutos de partos eutócicos e que haviam mamado colostro espontaneamente e com vigor. Excluíram-se aqueles que apresentavam anticorpos séricos contra o herpesvírus bovino. Os bezerros foram mantidos em baias individuais durante todo o período do experimento e eram alimentados duas vezes ao dia com um substituto de leite comercial (Bovilac, Nutron), obedecendo-se um volume total de aproximadamente 10% do peso vivo (PV). Recebiam água e feno de Coast-cross à vontade. Ração peletizada era mantida à disposição cuidando-se para que a ingestão diária não ultrapassasse 10% PV.

39 39 Infecção experimental e acompanhamento da evolução Os bezerros foram inoculados com o BoHV-5 pela via intranasal com instilação de 0,5mL do inóculo em cada narina, totalizando uma dose viral de 10 7,42 DICT 50. Após a inoculação, exames físicos com o emprego dos métodos semiológicos clássicos (DIRKSEN; GRÜNDER; STÖBER, 1993) foram realizados duas vezes ao dia avaliando-se as funções vitais, a presença e o tipo de secreção nasal e/ou ocular, bem como a presença de sinais específicos de encefalopatia. Colheita das amostras Amostras de sangue total foram colhidas por venopunção da jugular externa e acondicionadas em frascos contendo anticoagulante EDTA, para posterior realização do hemograma, ou em frascos sem anticoagulante para a posterior obtenção do soro sangüíneo após a retração do coágulo e centrifugação. A primeira colheita antecedeu, imediatamente, o procedimento de infecção experimental. As demais colheitas foram realizadas seqüencialmente, ao longo de todo o período experimental, a cada 48 horas, no caso das amostras com anticoagulante, e a cada 72 horas no caso das amostras sem anticoagulante. As colheitas de líquor foram realizadas por meio de punção no espaço atlanto-occipital (MAYHEW, 1989) utilizando-se o mandril metálico de um cateter intravenoso com calibre 18G e 5,1cm de comprimento (Safty Cateter, Boin Medica). Permitiu-se o gotejamento espontâneo de aproximadamente 6mL e aspirou-se, por fim, 0,5mL com auxílio de uma seringa estéril com capacidade para 1mL. A primeira colheita antecedeu, imediatamente, o procedimento de infecção experimental. A próxima colheita foi realizada no dia em que se iniciaram os sinais de distúrbio neurológico, e repetida a cada 48 horas até a morte. Nos bezerros que permaneceram assintomáticos as colheitas seguintes se fizeram nos dias 21, 23, 26 e 30 pós-infecção (p.i.).

40 40 Após a morte natural ou a eutanásia, realizada aos 30 dias p.i. nos bezerros assintomáticos, procedeu-se imediatamente a necropsia, onde foram registradas as alterações macroscópicas observadas. Dez porções distintas do sistema nervoso foram colhidas separadamente: córtex anterior (frontal), córtex posterior (occipital), córtex dorso-lateral (parietal), córtex ventro-lateral (temporal), diencéfalo, mesencéfalo, ponte, medula oblonga, cerebelo e gânglios dos nervos trigêmeos. Onde era possível, a colheita foi realizada bilateralmente. As amostras foram divididas em duas porções, sendo uma fixada em formol tamponado a 10% para a realização do exame histológico, e outra refrigerada e destinada às técnicas de isolamento viral e da PCR. Determinações laboratoriais As amostras de sangue total, recém-colhidas, foram submetidas aos métodos tradicionalmente empregados em hematologia (COLES, 1984), determinando-se as seguintes variáveis: contagem total de hemácias, volume globular, concentração de hemoglobina e contagem total e diferencial de leucócitos, e calculando-se os índices hematimétricos (volume globular médio e concentração de hemoglobina globular média). O fibrinogênio plasmático foi determinado por refratometria. Com as amostras de líquor, recém-colhidas, avaliaram-se as características físicas (cor, aspecto e coagulação espontânea), as contagens celulares globais e diferenciais, e determinaram-se os valores de proteína, glicose, atividade da aspartato aminotransferase (AST), ph e densidade (COLES, 1984). As amostras de soro sangüíneo obtidas foram conservadas a -20ºC e descongeladas unicamente para a realização do exame de soroneutralização, descrito por Britsch (1978), com a finalidade de verificar a presença de anticorpos contra o herpesvírus bovino.

41 41 Para a tentativa de isolamento viral processaram-se, individualmente, as amostras de líquor frescas aspiradas com a seringa e os diferentes fragmentos do sistema nervoso obtidos. Cada alíquota de 500µL de líquor foi inoculada diretamente em células MDBK mantidas por uma hora a 37 C para adsorção e, em seguida, adicionou-se meio de cultivo (MEM). Os fragmentos do sistema nervoso foram macerados (20% p/v) em MEM, homogeneizados e centrifugados. O sobrenadante foi recolhido, tratado com antibiótico e antifúngico e uma alíquota de 500µL inoculada em células MDBK, com adsorção por uma hora a 37 0 C. O inóculo era então recolhido, as células lavadas com solução salina e adicionado meio de cultivo para sua manutenção. As células foram incubadas a 37 0 C em sistema roller com observação diária por no máximo sete dias para a visualização de possíveis efeitos citopáticos (ECP). As amostras foram consideradas negativas quando não eram observados ECP após três passagens cegas. As amostras onde eram observados ECP compatíveis com o BoHV-5 e as consideradas negativas foram submetidas posteriormente à técnica da PCR para confirmação do resultado. Para a realização da técnica da PCR foram utilizadas amostras de líquor, que permaneceram conservadas a -20ºC, e uma alíquota de 500µL do sobrenadante dos macerados de cada fragmento do SNC. As amostras de líquor foram submetidas à técnica da PCR sem a etapa de extração do DNA. As demais amostras foram submetidas a uma associação das técnicas do fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (THEIL et al., 1981) e da sílica/tiocianato de guanidina (BOOM et al., 1990) com modificações descritas por Alfieri et al. (2004) para a extração do DNA. As amostras extraídas e as de líquor foram submetidas à técnica da PCR de acordo com o descrito por Claus (2002), empregando-se oligonucleotídeos iniciadores desenhados com base na seqüência do gene que codifica a glicoproteína C: B5, específico para o BoHV-5 (5 CGG ACG AGA AGC CCT TGG 3 -NT ); e Bcon, primer consenso [5 AGT GCA CGT ACA GCG GCT CG 3 -nt (BoHV-5)].

42 42 Para o exame histopatológico as amostras do SNC fixadas em formol tamponado a 10%, submetidas à desidratação em soluções crescentes de álcoois, diafanização em xilol, inclusão em parafina, cortadas com 5 µm de espessura e coradas pelo método de hematoxilina-eosina (HE). As alterações encontradas no SNC foram classificadas em discretas, moderadas e acentuadas de acordo com as características de cada lesão. A presença de manguitos perivasculares foi considerada discreta quando apresentava até duas camadas de células inflamatórias, moderada quando apresentava até quatro camadas, e acentuada quando tinha cinco ou mais camadas de células. Métodos estatísticos O comportamento das variáveis quantitativas ao longo do tempo foi avaliado por meio da análise de variâncias de medidas repetidas (SAMPAIO, 1998). Esse método foi aplicado distintamente considerando-se, em separado, os resultados dos bezerros sintomáticos e dos assintomáticos, de tal forma que não se estabeleceram comparações entre os mesmos. Quando a estatística F resultou significativa, empregou-se o teste t de Bonferroni para comparações entre as médias. Admitiu-se uma probabilidade de erro de 5%. Apresentaram-se medidas de tendência central e de dispersão para a descrição dos resultados.

43 43 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os principais aspectos clínicos e da evolução dos quadros induzidos estão apresentados na tabela 1. Quatro dos sete bezerros infectados manifestaram sinais de encefalopatia, os quais se iniciaram nos dias 9 ou 11 p.i. e, em sua maioria, evoluíram para a morte natural. Períodos de incubação semelhantes a esses foram também observados, sob condições de infecção induzida experimentalmente, por Belknap et al. (1994), Meyer et al. (2001) e Perez et al. (2002) em bezerros, e por Beltrão et al. (2000) e Caron et al. (2002) em coelhos. A duração do quadro clínico variou consideravelmente entre os animais (tabela 1). O bezerro 7 apresentou quadro superagudo, levando cerca de 12 horas desde o início dos sinais até a morte, após uma crise convulsiva grave. Os bezerros 6 e 11, por sua vez, exibiram quadros agudos apresentando evolução de três dias com agravamento progressivo. No caso do bezerro 1 o quadro teve curso estacionário e duração mais prolongada, desenvolvendo desidratação como conseqüência da disfagia e da anorexia. Em parte, a sua sobrevivência se prolongou por ter sido alimentado artificialmente (administração de leite e de água por meio de sondagem esofagiana). Realizou-se a eutanásia devido a complicações do seu estado geral no 10º dia de evolução. Observações anteriores em bezerros experimentalmente infectados (BELKNAP et al., 1994; MEYER et al., 2001; PEREZ et al., 2002) ou em casos naturais da doença (LISBÔA et al., 2003; SALVADOR et al., 1998) apontaram igualmente a possibilidade de que se manifestem tais extremos de evolução, isto é, quadros superagudos ou de duração mais prolongada. Os primeiros sintomas consistiram em depressão moderada a acentuada, anorexia, amaurose e disfagia. Os sinais que se seguiram foram hipotonia de língua, sialorréia, bruxismo, ataxia, hipermetria, manias (atos compulsivos), mioclonias na face, convulsões,

44 44 paresia e decúbito (tabela 1), caracterizando sinais de excitação e de deficiência (RADOSTITS; BLOOD; GAY, 1994). Os distúrbios neurológicos manifestados, assim como a intensidade dos mesmos, variaram entre os animais e ao longo da evolução. Sinais clínicos semelhantes também foram verificados em outros experimentos onde se induziu a infecção experimental em bezerros (BELKNAP et al.,1994; MEYER et al., 2001; VOGEL et al., 2003), em cordeiros (SILVA et al., 1998) e em coelhos (MEYER et al., 1996), e também em relatos de infecções naturais pelo BoHV-5 (COLODEL et al., 2002; GOMES et al., 2002; RIET-CORREA et al., 1989; SALVADOR et al., 1998). Tabela 1 Aspectos clínicos individuais da evolução da meningoencefalite herpética induzida experimentalmente em bezerros. Londrina/Paraná, Bez 1 Bez 3 Bez 6 Bez 7 Bez 9 Bez 11 Bez 12 Idade (dias) Quadro de encefalopatia Presença de sinais Início do quadro (dias p.i.) Duração do quadro 10d - 3d 12h - 3d - Morte eutanásia eutanásia natural natural eutanásia natural eutanásia Depressão Manias (atos compulsivos) Amaurose Disfagia Hipotonia da língua Bruxismo Ataxia Hipermetria Sialorréia Mioclonias na face Convulsão tônica Convulsão clônica Paresia e decúbito Outras manifestações Anorexia (dias p.i.) 11 a a a 11 - Secreção nasal serosa (dias p.i.) 7; 11 a 20 7; 9 e 14 3 a a 12 5 a 11 4; 13 e 16 Secreção ocular (dias p.i.) a e 17 Tosse esporádica (dias p.i.) e 7 4 a 8 10 a 27-9 a 13 Desidratação (p.i.) pós-infecção; (+) presente; (-) ausente.

45 45 Exceto o bezerro 7, todos os demais apresentaram secreção nasal serosa em algum momento da evolução (tabela 1), o que demonstra coerência com as citações de Belknap et al. (1994), Perez et al. (2002) e Vogel et al. (2003). Em alguns animais a secreção se manteve por vários dias consecutivos, enquanto que em outros foi intermitente. O volume eliminado era, de forma geral, pequeno. Muito embora alguns bezerros tenham exibido tosse seca e esporádica, essa não coincidiu, na maioria das vezes, com a eliminação de secreção nasal. De fato, nenhum bezerro estudado chegou a desenvolver qualquer tipo de comprometimento das vias aéreas posteriores. Quanto à secreção ocular, somente os bezerros 11 e 12 apresentaram-na em pequeno volume, contrariando as evidências de Perez et al. (2002). A infecção experimental com o BoHV-5 não foi capaz de induzir quadro de encefalopatia em todos os bezerros estudados. Ao longo do período de observação de 30 dias p.i., três animais não exibiram qualquer manifestação de distúrbio neurológico e foram considerados assintomáticos. Esse resultado não é surpreendente e reforça as evidências citadas por outros pesquisadores de que a infecção com esse vírus pode se manter na forma latente e inaparente (ASHBAUGH et al., 1997; BELKNAP et al., 1994; BELTRÃO et al., 2000; CARON et al., 2002; MEYER et al., 2001). Dentre os estudos que infectaram experimentalmente um número maior de bezerros, Meyer et al. (2001) verificaram menor ocorrência da condição de animais assintomáticos (1/8 bezerros). Vogel et al. (2003), por outro lado, não conseguiram provocar, de início, doença aparente em nenhum dos 12 bezerros estudados; e poucos (3/8 casos) desenvolveram sinais de encefalopatia após a reativação da infecção latente induzida pela administração de dexametasona. A permanência silenciosa dos herpesvírus no organismo do hospedeiro é uma condição bem conhecida (ROCK, 1993). A diversidade dos resultados experimentais reflete, possivelmente, as diferenças dos potenciais de patogenicidade entre as estirpes de BoHV-5 utilizadas nos estudos.

46 46 As funções vitais não sofreram variações significativas ao longo da evolução tanto nos bezerros que desenvolveram encefalopatia quanto nos assintomáticos (tabela 2). Apenas a temperatura corporal apresentou uma tendência a assumir valores mais elevados nos dias 8 a 12 p.i. (gráfico 1), o que reforça os achados de Perez et al. (2002). Vogel et al. (2003) também não observaram elevação significativa da temperatura. Apenas Meyer et al. (2001) relataram um discreto aumento da temperatura nos dias 4 a 10 p.i., o que não caracterizou, contudo, hipertermia, pois os valores médios não ultrapassaram 39,5ºC. Nesse mesmo trabalho, os bezerros infectados com o BoHV-1 exibiram, ao contrário, hipertermia marcante nos primeiros dias p.i.. A análise conjunta dos resultados científicos sugere que a infecção com o BoHV-5 não é definitivamente acompanhada por síndrome febre.

47 47 Tabela 2 Valores das funções vitais (x ± s) aferidas diariamente à tarde em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. Dias PI Temperatura Retal a ( C) Freqüência Cardíaca b (bpm) Freqüência Respiratória b (mpm) sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos 0 39,9 ± 0,7 39,5 ± 0,4 75,5 ± 11,7 86,0 ± 7,2 31,0 ± 3,8 32,7 ± 6,4 1 39,6 ± 0,6 39,2 ± 0,5 79,0 ± 15,2 77,3 ± 20,5 25,0 ± 4,8 26,7 ± 5,0 2 39,8 ± 0,7 39,2 ± 0,8 79,5 ± 15,2 87,3 ± 7,6 30,0 ± 6,3 28,7 ± 5,0 3 39,9 ± 0,5 39,0 ± 0,6 78,5 ± 13,7 70,7 ± 12,2 31,5 ± 7,2 25,3 ± 6,1 4 40,0 ± 0,6 39,1 ± 0,7 88,0 ± 8,4 90,0 ± 12,5 30,5 ± 5,7 30,0 ± 2,0 5 39,8 ± 0,3 39,4 ± 0,4 86,0 ± 16,3 80,0 ± 12,0 30,0 ± 7,1 30,0 ± 6,0 6 39,9 ± 0,3 39,5 ± 0,3 81,5 ± 13,3 84,7 ± 16,3 32,5 ± 8,5 33,0 ± 8,2 7 39,9 ± 0,7 39,6 ± 0,4 84,0 ± 13,4 87,3 ± 15,3 29,0 ± 12,3 34,7 ± 2,3 8 40,1 ± 0,8 39,7 ± 0,4 80,0 ± 14,1 92,0 ± 24,3 32,0 ± 14,3 36,0 ± 5,3 9 39,5 ± 0,3 40,1 ± 0,7 81,3 ± 22,0 76,0 ± 6,0 33,3 ± 4,2 32,0 ± 4, ,6 ± 0,2 40,2 ± 0,9 82,0 ± 16,4 83,3 ± 12,1 31,3 ± 12,2 39,3 ± 11, ,4 ± 0,6 39,9 ± 0,9 80,0 ± 17,1 86,0 ± 2,0 33,0 ± 16,3 47,3 ± 18, ,4 ± 0,5 39,7 ± 1,3 99,0 ± 24,0 76,7 ± 13,3 24,0 ± 5,7 37,3 ± 2, ,8 ± 0,0 39,6 ± 0,9 104,0 ± 48,1 82,0 ± 12,2 24,5 ± 3,5 41,0 ± 12, ,5* 39,3 ± 0,9 96* 75,3 ± 3,1 20* 31,3 ± 5, ,2* 39,2 ± 0,8 140* 73,3 ± 14,5 16* 34,3 ± 9, ,3* 39,5 ± 0,9 128* 78,3 ± 11,9 18* 36,0 ± 8, ,5* 39,3 ± 0,3 104* 85,3 ± 4,2 18* 32,0 ± 6, ,9* 39,6 ± 0,4 82* 81,3 ± 13,3 16* 34,7 ± 22, ,5* 38,9 ± 0,8 122* 82,7 ± 6,1 17* 29,3 ± 5, ,4 ± 0,5 98,0 ± 7,2 43,3 ± 15, ,4 ± 0,5 89,3 ± 2,3 41,0 ± 20, ,2 ± 0,2 77,3 ± 6,1 40,0 ± 14, ,3 ± 0,8 79,3 ± 14,2 29,3 ± 8, ,2 ± 1,2 84,7 ± 4,6 33,3 ± 14, ,4 ± 0,9 87,3 ± 11,4 31,7 ± 5, ,3 ± 0,6 89,3 ± 9,2 38,7 ± 9, ,1 ± 0,4 86,7 ± 12,1 32,0 ± 4, ,2 ± 0,2 82,3 ± 9,1 35,7 ± 8, ,9 ± 0,3 85,3 ± 4,6 34,0 ± 5, ,9 ± 0,3 90,0 ± 0,0 34,0 ± 5,7 * valores obtidos em apenas um bezerro a 0,05<p<0,10 b p>0,05

48 48 ºC 40,5 40,0 39,5 39,0 ** *** 38,5 38, sintomáticos assintomáticos dias p.i. Gráfico 1 Variação da temperatura retal aferida diariamente à tarde em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro sintomático. Com relação à avaliação hematológica, como seria de se esperar nenhuma variação significativa foi observada para as variáveis do eritrograma (tabela 3). Mesmo nos bezerros que manifestaram distúrbio neurológico, a disfagia, presente em maior ou menor intensidade em todos os casos, não chegou a ser acompanhada por desidratação devido à rapidez da evolução até a morte em três dos quatro animais. Os resultados do leucograma, por outro lado, caracterizam, nos bezerros com encefalopatia, uma tendência à elevação dos leucócitos acompanhada por elevação significativa dos neutrófilos segmentados circulantes (tabela 4 e gráficos 2 e 3). Tais alterações se estabeleceram a partir do 10º dia p.i. coincidindo com o início da manifestação dos sintomas e não chegam a caracterizar uma condição de leucocitose. Os neutrófilos atingiram valores médios próximos aos dos linfócitos circulantes, o que pode ser interpretado como provável conseqüência de um adrenocorticismo provocado pelo estresse da doença (COLES, 1984; JAIN, 1986). Nos bezerros assintomáticos não se observaram tais variações no leucograma. Quanto à concentração do fibrinogênio plasmático, todos os bezerros que manifestaram sinais de encefalopatia exibiram hiperfibrinogenemia, muito embora não se

49 49 tenha comprovado diferença estatística significativa (tabela 4). Os valores médios exibidos na tabela 4 e no gráfico 4 não refletem o comportamento de elevação dessa proteína. Considerando-se os valores individuais, no entanto, fica evidente que, durante a evolução da doença, concentrações tão elevadas quanto 900 a 1200mg/dL foram alcançadas. O fibrinogênio plasmático é considerado uma proteína de fase aguda que se eleva precocemente durante a evolução de processos inflamatórios em bovinos, podendo anteceder até mesmo as alterações leucocitárias (JAIN, 1986). É coerente, portanto, que o mesmo comportamento dessa variável não tenha sido observado nos bezerros assintomáticos.

50 Tabela 3 Valores do eritrograma (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Dia p.i. Hemácias a (x10 6 /mm 3 ) Hemoglobina a (mg/dl) Volume Globular a (%) VGM a (fl) CHGM a (%) sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos 0 7,43±1,45 5,66±1,11 11,6±2,26 8,9±1,94 35,7±6,39 26,3±4,51 48,2±1,18 46,8±3,69 32,5±1,19 33,9±1,67 2 7,23±1,44 5,88±1,18 11,8±2,03 9,7±1,98 34,7±6,39 27,6±5,03 48,2±1,18 47,3±2,88 34,0±1,81 35,3±4,09 4 7,18±1,57 5,66±1,32 11,8±1,62 9,0±2,12 34,5±7,00 27,3±5,86 48,2±1,19 48,4±1,44 34,6±2,78 32,9±3,07 6 7,07±1,65 5,32±1,75 11,2±2,13 8,7±2,76 34,0±7,39 25,6±8,08 48,2±1,23 48,4±1,35 33,3±4,18 33,8±2,38 8 6,94±1,20 5,08±1,67 10,8±1,83 8,2±2,90 33,2±5,37 24,6±8,02 48,0±1,45 48,6±1,22 32,7±5,06 32,8±2, ,17±1,59 5,16±1,53 11,5±2,20 8,8±2,61 34,6±7,02 25,0±7,21 48,5±1,29 48,5±1,42 33,3±3,86 35,4±1, ,56±1,37 5,30±1,42 10,3±0,14 8,5±2,00 32,0±5,65 25,6±6,66 48,9±1,61 48,5±1,28 32,6±5,33 33,1±1, ,59* 5,44±1,27 12,0* 8,8±1,62 28* 26,3±5,86 50,1* 48,5±1,32 42,8* 33,9±3, ,99* 5,58±1,33 13,0* 8,9±1,71 35* 27,0±6,08 50,1* 48,5±1,29 37,1* 33,2±4, ,99* 5,72±1,09 12,4* 9,2±0,91 35* 27,6±4,72 50,1* 48,5±1,30 35,4* 33,7±3, ,56* 6,02±1,19 12,7* 9,2±1,16 36* 28,6±5,68 47,6* 47,6±0,04 35,3* 32,7±4, ,01±1,05 9,3±1,45 28,6±5,03 47,7±0,13 32,8±3, ,87±0,42 9,7±0,15 28,0±2,00 47,7±0,05 34,8±1, ,97±0,62 9,6±0,26 28,3±2,89 47,5±0,22 34,1±3, ,85±1,54 9,2±1,30 29,0±1,73 43,4±7,36 31,8±2, ,61±1,63 9,0±0,23 28,3±2,31 43,9±6,41 32,0±2,97 * valores obtidos em apenas um bezerro a p>0,05

51 Tabela 4 Valores do leucograma e do fibrinogênio plasmático (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Dia p.i. Leucócitos b (x10 3 /mm 3 ) Linfócitos a (x10 3 /mm 3 ) Segmentados c (x10 3 /mm 3 ) Monócitos a (x10 3 /mm 3 ) Fibrinogênio a (mg/dl) sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos 0 9,70±0,56 8,91±1,93 6,14±1,73 7,16±1,56 3,37±1,17 1,61±0,46 0,12±0,11 0,12±0,10 525± ± ,98±1,01 7,90±3,39 4,82±1,63 6,67±2,91 2,03±1,47 1,07±0,41 0,02±0,04 0,07±0,06 650± ± ,60±2,06 8,43±1,72 5,93±1,91 5,83±1,48 2,37±0,74 2,48±0,20 0,14±0,20 0,08±0,09 450± ± ,43±1,97 9,60±0,43 6,21±1,88 7,99±0,47 2,07±1,36 1,36±0,78 0,10±0,19 0,09±0,16 550± ± ,35±3,32 7,82±2,89 6,17±1,34 6,36±1,92 2,77±2,27 1,33±0,99 0,30±,056 0,10±0,09 450± ± ,9±7,99 6,08±0,84 5,61±1,02 4,18±0,56 5,96±5,48 1,83±0,82 0,80±1,22 0,02±0,04 675± ± ,2±3,89 7,20±1,17 6,33±2,40 5,42±1,33 5,27±5,44 1,66±0,55 0,59±0,84 0,06±0,11 600± ± ,40* 6,08±1,20 8,93* 4,67±0,95 3,47* 1,24±0,49 0* 0,14±0,14 600* 466± ,80* 6,41±1,33 6,37* 5,22±1,29 3,43* 1,12±0,37 0* 0,02±0, * 733± ,65* 7,25±1,06 7,34* 5,61±1,33 5,31* 1,46±0,38 0* 0,11±0, * 633± ,20* 7,75±4,44 6,30* 5,33±0,93 17,89* 2,23±0,76 0,75* 0,10±0, * 666± ,91±0,63 4,40±0,75 2,22±1,20 0,24±0,16 433± ,71±0,99 5,53±1,25 3,10±2,29 0,05±0,09 500± ,33±1,80 4,94±0,36 3,74±1,64 0,41±0,41 433± ,63±0,45 4,71±1,22 1,85±0,93 0,02±0,04 466± ,71±1,68 5,09±1,40 2,30±1,13 0,12±0,05 500±360 * valores obtidos em apenas um bezerro a p>0,05 b 0,05<p<0,10 (somente para os bezerros sintomáticos) c p<0,05 (somente para os bezerros sintomáticos)

52 /mm 3 * * * * dias p.i. sintomáticos assintomáticos Gráfico 2 Variação do número total de leucócitos presentes no sangue de bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro. /mm * * * * sintomáticos assintomáticos dias p.i. Gráfico 3 Variação do número de segmentados presentes no sangue de bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro.

53 53 mg/dl * * * * sintomáticos assintomáticos dias p.i. Gráfico 4 Variação da concentração do fibrinogênio plasmático em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro. Distintamente das alterações discretas e inespecíficas observadas no leucograma, as alterações liquóricas foram consistentes e marcantes, particularmente no que se refere à sua celularidade (tabela 5), comprovando, ainda em vida, a instalação do processo inflamatório encefálico. Nos bezerros com sinais de encefalopatia o quadro foi acompanhado, desde o início de sua evolução, por uma acentuada pleiocitose com predomínio de células mononucleares (gráfico 5) o que é esperado e característico em processos de encefalites virais (MAYHEW, 1989). Com exceção de um caso (bezerro 9), os bezerros que permaneceram assintomáticos exibiram as mesmas alterações celulares observadas naqueles com encefalopatia, indicando que mesmo sem manifestarem distúrbios neurológicos esses animais também desenvolveram encefalite. É interessante observar que houve uma redução do número de células até o término do período de acompanhamento experimental. A hiperproteinorraquia, que pode naturalmente acompanhar a pleiocitose, não foi evidenciada nos bezerros estudados, com exceção do bezerro 1 ao final da evolução de seu quadro (tabela 5). Deve-se destacar esse bezerro como distinto em função do curso prolongado de

54 54 sua doença. Quanto à atividade da AST no líquor verificou-se apenas uma tendência à sua elevação e unicamente nos bezerros sintomáticos. Assim como a concentração de proteína, destacaram-se valores particularmente altos no bezerro 1 ao final da evolução. A interpretação conjunta dos resultados permite afirmar que dentre as variáveis liquóricas as alterações no padrão celular possuem maior importância na caracterização da encefalite que se estabelece na doença estudada, pois se apresenta desde o início do quadro e independe do tempo de duração do mesmo. O líquor se apresentou incolor e límpido na maioria das colheitas realizadas, estando, em alguns casos, levemente xantocrômico e turvo. Os valores de ph e densidade encontravam-se dentro dos parâmetros normais, variando de 7 a 8 e de 1005 a 1010, respectivamente (MAYHEW, 1996; SCOTT, 2004).

55 Tabela 5 Valores liquóricos (x ± s) observados ao longo do tempo em bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV Dia p.i. Células nucleadas c (/mm 3 ) Leucócitos mononucleares c (/mm 3 ) Neutrófilos a (/mm 3 ) Proteínas a (mg/dl) AST b (UI/L) Glicose a (mg/dl) sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos sintomáticos assintomáticos 0 5,7±2,3 9,3±7,0 4,0±3,4 7,7±7,5 0,70±0,5 1,0±1,0 17,5±13,4 14,2±4,6 12,7±10,0 13,9±9,2 35,4±15,6 52,3±2,4 9 81* 79* 2* 12,1* 15,6* 45,5* ±199,3 234±194,4 8,3±5,5 34,5±12,4 20,8±14,2 38,2±29, ±13,4 193±9,2 7,0±4,2 32,2±32,5 76,6±88,6 42,8±2, * 181* 6* 60,4* 132,2* 69,7* * 167* 11* 108,7* 172,3* 80,0* 21 46,0±40,6 44,0±40,6 1,3±1,1 36,3±24,5 26,6±23,6 55,8±14, ±72,8 159±60,8 9,5±12,0 49,6±6,8 22,6±17,2 76,9±4, ,0±59,4 66,0±59,4 1,0±0,0 32,6±27,7 30,4±23,3 43,8±0, ,3±14,2 18,3±15,9 0,7±0,5 22,4±6,7 23,7±14,8 41,9±0,7 * valores obtidos em apenas um bezerro a p>0,05 b 0,05<p<0,10 (somente para os bezerros sintomáticos) c p<0,05

56 56 /mm * * * sintomáticos assintomáticos dias p.i. Gráfico 5 Variação dos leucócitos mononucleares presentes no líquor de bezerros que desenvolveram sinais de encefalopatia (n=4) ou permaneceram assintomáticos (n=3) após a infecção experimental com o BoHV-5. (*) valores obtidos em apenas um bezerro. A soroconversão foi observada em todos os bezerros estudados, entretanto houve variação individual considerável na magnitude do título alcançado assim como no tempo necessário para atingi-lo. Os títulos mais elevados, da ordem de 32 e 64, foram alcançados pelos bezerros assintomáticos aos 21 dias p.i., e isso é coerente com os resultados de Vogel et al. (2003). Perez et al. (2002), pelo contrário, detectaram títulos de anticorpos séricos neutralizantes muito mais elevados em bezerros com infecção latente e mais precocemente, já aos 14 dias p.i.. Porém, distintamente da condição do presente experimento, esses autores induziram a infecção em bezerros muito mais velhos (12 meses de idade), o que talvez possa explicar a diferença. Na tabela 6 são apresentados os resultados da presença do DNA viral obtidos por meio da técnica da PCR e também os resultados das tentativas de isolamento viral das diferentes porções do sistema nervoso e do líquor. Condizendo com evidências anteriores (LISBÔA et al., 2003), a presença do DNA viral se confirmou no líquor de dois bezerros que desenvolveram o quadro de disfunções encefálicas, em ambos os casos em amostras colhidas em momento final da evolução da doença. Esse resultado reforça a hipótese de que amostras

57 57 de líquor poderiam ser utilizadas para a confirmação, ainda em vida, do diagnóstico etiológico dessa enfermidade. O DNA viral foi confirmado, com maior ou menor distribuição, no sistema nervoso de todos os animais estudados. Mesmo nos três bezerros assintomáticos o DNA se distribuiu por 3 a 5 localizações diferentes do sistema nervoso (tabela 6). No caso dos bezerros que manifestaram distúrbios neurológicos o DNA viral foi detectado em maior número de localizações do sistema nervoso, ou seja com distribuição mais ampla. O cerebelo e a medula oblonga foram os locais onde menos freqüentemente se confirmou a presença do vírus. O telencéfalo, o diencéfalo e a ponte foram localizações freqüentes para o vírus em todos os bezerros estudados. Esses resultados são, de forma geral, compatíveis com os de Belknap et al. (1994) e de Meyer et al. (2001) reafirmando não haver uma localização predileta nos casos de encefalopatia evidente. Somam-se às evidências de Vogel et al. (2003) reforçando o conceito de que o BoHV-5 se distribui pelo encéfalo do hospedeiro mesmo na condição de infecção latente. A presença do DNA viral nos gânglios dos nervos trigêmeos de cinco bezerros é coerente com a afirmação de que este é um sítio comum de localização desse vírus (ASHBAUGH et al., 1997). As tentativas para isolar o vírus foram bem sucedidas unicamente em dois bezerros que manifestaram encefalopatia (tabela 6), e coerentemente em porções nas quais o DNA viral estava presente. No caso dos outros dois bezerros sintomáticos a presença do BoHV-5 como causador dos efeitos citopáticos não foi confirmada posteriormente. O isolamento não foi possível em nenhuma das amostras dos bezerros assintomáticos. As dificuldades para isolamento do BoHV-5 são bem documentadas tanto em situação experimental (CARON et al., 2002; PEREZ et al., 2002; VOGEL et al., 2003), quanto em casos de ocorrência natural da doença (CLAUS, 2002; COLODEL et al., 2002; SALVADOR et al. 1998). Quanto aos bezerros assintomáticos, Vogel et al. (2003) obtiveram resultados

58 58 similares, devendo-se atribuir a impossibilidade de isolamento ao fato de o vírus se encontrar na sua forma latente e não apresentar, portanto, o seu potencial de infectividade. O bezerro 6 foi o único que apresentou alterações macroscópicas encefálicas (congestão e área de malácia no córtex anterior). Nos demais animais não se detectou lesão alguma no sistema nervoso ou em outros sistemas orgânicos. Outros autores também verificaram congestão e áreas de malácia em animais experimentalmente infectados (ASHBAUGH et al., 1997; PEREZ et al., 2002) e em casos naturais da doença (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIET-CORREA, 2004). A ausência de lesões significativas à necropsia foi relatada por outros pesquisadores (MEYER et al., 2001; SALVADOR et al., 1998). Microscopicamente, todos os bezerros apresentaram algum tipo de alteração no sistema nervoso, porém com localizações e intensidade diferentes. Em geral, as alterações encontradas estavam distribuídas por todo o encéfalo dos bezerros, e também no gânglio do nervo trigêmeo. Os bezerros 1, 6, 7 e 12 apresentaram acentuadas alterações em várias porções do sistema nervoso, enquanto os bezerros 3, 9 e 11 apresentaram alterações mais discretas (tabela 7). O bezerro 11, apesar de manifestar sinais de encefalopatia, exibiu alterações histológicas discretas. O bezerro 12, apesar de assintomático, apresentou alterações moderadas em várias porções do sistema nervoso. As alterações observadas confirmaram o processo estabelecido de meningoencefalite caracterizando-se por: manguitos perivasculares com infiltrado de células mononucleares, necrose laminar cortical, malácia, gliose e meningite (figura 1), compatíveis com outras citações (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIET- CORREA, 2004; RIET-CORREA et al., 1989; SILVA et al., 1998). Corpúsculos de inclusão intranucleares eosinofílicos, localizados principalmente em astrócitos, são freqüentemente evidenciados em casos naturais da doença (COLODEL et al., 2002; ELIAS; SCHILD; RIET- CORREA, 2004; RIET-CORREA et al., 1989), porém não foram observados nos bezerros

59 59 estudados, o que condiz com outras investigações experimentais (BELKNAP et al., 1994; PEREZ et al., 2002). As evidências histopatológicas confirmam que mesmo os bezerros que se mantiveram assintomáticos desenvolveram processo de inflamação no sistema nervoso, o que explica a pleiocitose observada previamente no líquor desses animais. É possível que a magnitude da meningoencefalite instalada, somada à localização e distribuição das lesões, tenha sido insuficiente para determinar a manifestação da doença. Pode-se admitir que o BoHV-5 tenha determinado infecção, distribuindo-se por localizações diversas no encéfalo, e provocado, contudo, um processo inflamatório menos grave e não progressivo que cursou assintomático. A forma latente da infecção deve ter se estabelecido em seguida a essa fase inicial. Essas hipóteses encontram sustentação nos resultados publicados por Vogel et al. (2003), os quais afirmaram que a forma de apresentação da doença deve-se às propriedades de neuroinvasividade e de neurovirulência particulares da estirpe de BoHV-5 envolvida. Estirpes virais, como a utilizada por esses autores, podem ser altamente neuroinvasivas e pouco neurovirulentas e provocar, por conseqüência, um número elevado de infecções que cursarão de forma inaparente. Se esse é um conceito correto, parece lógico suspeitar-se que os índices de morbidade dessa doença possam ser, na realidade, mais altos do que aparentam. Os índices de letalidade, por outro lado, podem não ser realmente tão elevados. Essas são hipóteses que merecem uma investigação mais detalhada. Em suma, pode-se depreender dos resultados obtidos que a infecção com o BoHV-5 causa encefalite em bezerros, não obrigatoriamente acompanhada pela manifestação de distúrbios neurológicos. Os sinais de encefalopatia e o tempo de evolução do quadro são variáveis e não possuem um padrão característico. A elevação de células mononucleares no líquor é a alteração mais importante de auxílio ao diagnóstico ainda em vida. As alterações do leucograma são discretas e inespecíficas. Não são esperadas lesões macroscópicas e as

60 60 alterações histológicas com infiltrado de células mononucleares e áreas de malácia são características, variam em gravidade e não se distribuem uniformemente pelo encéfalo. O vírus pode se encontrar, com maior ou menor distribuição, em locais diversos do encéfalo, no gânglio do nervo trigêmeo e, eventualmente, no líquor. A B C D Figura 1 Cortes histológicos de sistema nervoso central de bezerros acometidos por meningoencefalite causada pelo BoHV-5, corados por HE. A. Área de malácia no córtex frontal (10x). B. Acentuado infiltrado inflamatório perivascular de células mononucleares (seta) (20x). C. Gliose focal (seta) (20x). D. Acentuado infiltrado inflamatório mononuclear em leptomeninges (seta) (20x).