LÍPIDOS 5. Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas BIOQUÍMICA I 2015/2016. Fátima Ventura - FFULisboa

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1 LÍPIDOS 5 Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas BIOQUÍMICA I 2015/2016 1

2 Sumário : Tema: Destino do acetil-coa: Síntese de corpos cetónicos e sua importância no metabolismo energético 1. Utilização nos tecidos extra-hepáticos 2. Sobreprodução na diabetes e jejum 3. Corpos cetónicos nos defeitos da Beta-oxidação dos ácidos gordos e nos defeitos da cadeia respiratória 4. Regulação da cetogénese Tema: Biosíntese de ácidos gordos e eicosanóides (continuação) 1. Formação do malonil-coa 2. Síntese dos ácidos gordos: Sintase dos ácidos gordos (FAS), Proteína de ligação ao grupo acil- (ACP), ligação dos grupos acetil- e malonil à FAS, formação de butirato C4 (condensação, redução, hidratação e redução ) 3. Síntese dos ácidos gordos: Formação de palmitato C16 4. Síntese dos ácidos gordos: Formação de palmitato C16 5. Síntese dos ácidos gordos: localização sub-celular 6. Síntese de ácidos gordos: transporte de acetil-coa mitocondrial como citrato 7. Síntese de ácidos gordos: regulação 2

3 Destino do acetil-coa: Síntese de Corpos Cetónicos e sua Importância no Metabolismo Energético (cont.) Lehninger, 4ª ed. 3

4 Corpos Cetónicos: Utilização nos Tecidos Extra-hepáticos Utilização nos tecidos Extra-Hepáticos: 4

5 Corpos Cetónicos: Utilização nos Tecidos Extra-hepáticos Utilização nos tecidos Extra-Hepáticos: 1. Oxidação de D--Hidroxibutirato pela D-- Hidroxibutirato desidrogenase originando acetoacetato 2. Activação do acetoacetato a acetoacetil-coa pela transferência de CoA do succinil-coa (intermediário do Ciclo Krebs) catalizada pela Succinil-CoA-acetoacetato transferase ou - Cetoacil-CoA transferase Produção de acetoacetato a partir de acetoacetil-coa situa-se no fígado, Acetoacetato uma vez formado não pode ser reactivado directamente excepto no citosol síntese de colesterol 5

6 Corpos Cetónicos: Utilização nos Tecidos Extra-hepáticos Utilização nos tecidos Extra-Hepáticos: 3. Formação de 2 moléculas de Acetil-CoA pela clivagem tiolítica do acetoacetil-coa na - oxidação pela tiolase Ciclo de Krebs 6

7 Corpos Cetónicos: Sobreprodução na Diabetes e Jejum Produção e Exportação de Corpos cetónicos do fígado: Lehninger, 4ª ed. 7

8 Corpos Cetónicos: Sobreprodução na Diabetes e Jejum Jejum prolongado, fome, dietas hipocalóricas e Diabetes Mellitus não tratada sobreprodução de Corpos cetónicos Gluconeogénese deplecção de intermediários do Ciclo de Krebs (oxaloacetato) Acetil-CoA Cetogénese Diabetes não tratada nível insulina deficiente tecidos extra-hepáticos não conseguem fazer aporte eficiente de glucose malonil-coa não se forma e não inibe a CPT 1 Ácidos Gordos entram na mitocôndria Oxidação a acetil-coa Ciclo Krebs bloqueado por falta de intermediários (gluconeogénese) Acumulação de Acetil-CoA Excesso de Corpos Cetónicos Níveis plasmáticos de acetoacetato e D--hidroxibutirato aumentam CETOSE (cetonémia; urina cetonúria) ou cetoacidose < ph acidémia (urina - acidúria), acidose - D--Hidroxibutirato é o corpo cetónico predominante na urina e no sangue em situação de cetose Indivíduos sob dieta hipocalórica usam gorduras armazenadas como fonte principal de energia controlo apertado dos níveis de corpos cetónicos para evitar cetoacidose 8

9 Corpos Cetónicos: Defeitos da oxidação dos Ácidos Gordos e Cadeia Respiratória Doenças Hereditárias da -Oxidação dos Ácidos Gordos Hipoglicémia mas Hipocetótica (níveis baixos de Corpos Cetónicos) -Oxidação comprometida Não há formação de acetil-coa Não há formação de corpos cetónicos Cérebro fica privado dos seus substratos energéticos Coma e Morte Doenças Hereditárias da Cadeia Respiratória (CR) Acetil-CoA não é convenientemente oxidado no ciclo de Krebs por falha da cadeia respiratória que não reoxida o NADH e FADH 2 formados Corpos Cetónicos Com vista à reoxidação de NAD mitocondrial essencial a várias enzimas Estimulada a conversão de acetoacetato a D-3-Hidroxibutirato 9 Razão 3OHB/Acetoacetato Diagnóstico Deficiência ao nível da CR

10 Corpos cetónicos: Regulação da cetogénese 1. Controlo da mobilização de ácidos gordos livres no tecido adiposo: Cetose: quando há aumento dos níveis de ácidos gordos no sangue por aumento de lipólise ou baixa utilização na produção de ATP Ácidos gordos livres são precursores de corpos cetónicos no fígado Factores que regulam a mobilização dos ácidos gordos livres dos adipócitos controlo da cetogénese 10

11 Corpos cetónicos: Regulação da cetogénese 2. Regulação da actividade da CPT1 no figado: CPT1 determina o fluxo de ácidos gordos que é oxidado e não esterificado Actividade da CPT 1 baixa Estado nutrido (inibição pelo malonil-coa) diminuição da -oxidação Ácidos Gordos esterificados a TAG e transportados para tecidos extra-hepáticos como VLDL diminuição de corpos cetónicos Actividade da CPT 1 elevada jejum (diminuição razão [insulina]/[glucagon]) inibição da acetil-coa carboxilase por acil- CoAs diminuição de malonil-coa estimulação da -oxidação aumento corpos cetónicos 11

12 Corpos cetónicos: Regulação da cetogénese 3. Partição do acetil-coa entre a cetogénese e o ciclo de Krebs: Acetil-CoA formado na -oxidação: oxidado no ciclo de Krebs ou cetogénese Aumento de Ácidos gordos livres aumenta cetogénese e reduz oxidação no ciclo de Krebs Um decréscimo na concentração de oxaloacetato (dentro da mitocôndria) pode dificultar a oxidação de acetil-coa no ciclo de Krebs oxidação dos ácidos gordos diverge para a cetogénese 12

13 Corpos cetónicos: Regulação da cetogénese 3. Partição do acetil-coa entre a cetogénese e o ciclo de Krebs: Aumento da razão [NADH]/[NAD + ] devido a aumento da -oxidação desiquilibrio entre oxaloacetato e malato diminuição oxaloacetato Mas a piruvato carboxilase é activada pela acetil-coa piruvato é convertido a oxaloacetato elevadas concentrações de acetil-coa podem induzir produção de oxaloacetato necessários à reacção de condensação do ciclo de Krebs 13

14 Biossíntese de ácidos gordos e eicosanóides Lehninger, 4ª ed. 14

15 Biossíntese de Ácidos Gordos Oxidação de ácidos gordos Remoção sucessiva de 2 átomos de C através de Acetil- CoA Biossíntese de Ácidos Gordos Adição sucessiva de 2 átomos de C através de Malonil-CoA Via Catabólica e Via Anabólica não são exactamente o inverso uma da outra Não usam as mesmas enzimas Ocorrem em diferentes compartimentos celulares, Mitocôndria e Citosol, respectivamente Diferentes intermediários, Acetil-CoA (C2) e Malonil-CoA (C3), respectivamente 15

16 Formação de Malonil-CoA Formação de Malonil-CoA a partir de Acetil-CoA (reacção irreversível): Reacção catalizada pela Acetil-CoA Carboxilase (ACC) Células animais ACC 3 actividades diferentes num mesmo polipéptido multifuncional 16

17 Formação de Malonil-CoA Formação de Malonil-CoA a partir de Acetil-CoA (reacção irreversível): Reacção catalizada pela Acetil-CoA Carboxilase (ACC) Grupo prostético Biotina ligada covalentemente (ligação amida) à amina lateral de Lys num dos 3 domínios da enzima Reacção de 2 passos semelhante a outras reacções de carboxilação dependentes da Biotina (ex. Piruvato Carboxilase; Propionil-CoA Carboxilase) 17

18 Formação de Malonil-CoA Formação de Malonil-CoA a partir de Acetil-CoA (reacção irreversível): Reacção catalizada pela Acetil-CoA Carboxilase (ACC) Num segundo passo CO 2 é transferido para o acetil-coa Malonil-CoA Grupo carboxílico derivado do ião HCO - 3 transferido inicialmente para a biotina numa reacção ATPdependente Grupo biotinil serve de transportador temporário de CO 2 18

19 Síntese de Ácidos Gordos As cadeias longas dos Ácidos Gordos são construídas através da repetição de uma série de 4 reacções: Todas as reacções do processo de síntese são catalizadas por complexo multienzimático Sintase dos Ácidos Gordos (FAS) 19

20 Síntese de Ácidos Gordos As cadeias longas dos Ácidos Gordos são construídas através da repetição de uma série de 4 reacções: Todas as reacções do processo de síntese são catalizadas por complexo multienzimático Sintase dos Ácidos Gordos (FAS) 20

21 Sintase dos Ácidos Gordos (FAS) Bactérias e plantas 7 actividades da FAS estão em polipéptidos separados e pelo menos 3 outras proteínas Leveduras 7 actividades da FAS estão em 2 polipéptidos separados Vertebrados 7 actividades enzimáticas e actividade hidrolítica que cliva o ácido gordo final do grupo ACP num único polipéptido (MW 240 kda) 21

22 Sintase dos Ácidos Gordos (FAS) Vertebrados 7 actividades enzimáticas e actividade hidrolítica que cliva o ácido gordo final do grupo ACP num único polipéptido (MW 240 kda) Dímero (MW 480 kda) duas subunidades idênticas oligomerizam cabeça com cabeça formando 2 sítios activos na sua interface Extensão da cadeia acil crescente de uma subunidade é catalizada pelos sítios cataliticos da outra subunidade Proteínas actuam juntas para catalizar a formação de ácidos gordos a partir do acetil-coa e malonil-coa Intermediários permanecem ligados covalentemente a um dos 2 grupos SH do complexo: -SH da Cys na -cetoacil-coa sintase & -SH da proteína transportadora de grupos acilo ACP (acyl carrier protein) com o qual o intermediário da síntese dos ácidos gordos forma um tioéster Hidrólise do tioéster ligado ao ACP é exergónica energia libertada torna termodinamicamente favorável a 1ª reacção da síntese de ácidos gordos (condensação) 22

23 Sintase dos Ácidos Gordos Proteína de Ligação ao Acil (ACP) Grupo prostético da ACP braço flexível que ajuda ao elongamento da cadeia acil do ácido gordo na superficie do complexo da FAS, transportando os intermediários da reacção de um sítio activo da enzima para o próximo até obtenção produto final Aumento da eficência da reacção global Vitamina B5 23

24 Síntese de Ácidos Gordos: Ligação de grupos acetil e malonil à FAS 24

25 Síntese de Ácidos Gordos: Ligação de grupos acetil e malonil à FAS 1. Grupo acetil do acetil-coa é transferido para o grupo SH da Cys da -cetoacil-acp sintase (KS) Acetil-CoA-ACP transacetilase (AT) 25

26 Síntese de Ácidos Gordos: Ligação de grupos acetil e malonil à FAS 2. Grupo malonil do malonil-coa é transferido para o grupo SH da ACP Malonil-CoA-ACP transferase (MT) No complexo FAS os grupos acetil e malonil estão muito próximos e são activados pelo processo de elongação da cadeia (4 etapas) 26

27 Síntese de Ácidos Gordos 1. Condensação Grupos acetil e malonil activados = Acetoacil-ACP (acetoacetilo ligado à ACP pelo grupo SH fosfopanteteino) -cetoacil- ACP sintase (KS) Produção CO 2 C originalmente introduzido no malonil-coa do HCO - 3 Grupo acetil é transferido do grupo SH da Cys da enzima para o grupo SH da ACP unidade metilo terminal de 2C do novo grupo acetoacetil Nota: a azul está a enzima que vai funcionar a seguir 27

28 1. Condensação Síntese de Ácidos Gordos Reacção de condensação termodinamicamente favorável envolvimento de grupos malonil activados (em vez de grupos acetil) C metileno (C2) do grupo malonil entre os carbonos carbonilo e carboxilo é um bom nucleofílico Condensação + Descarboxilação do grupo malonil facilita o ataque nucleofilico deste C metileno ao tioéster que liga o grupo acetil à -cetoacil-acp sintase deslocando o grupo SH da enzima A energia extra necessária para que a síntese de ácidos gordos seja favorável é fornecida pelo ATP (síntese de malonil- CoA) 28

29 Síntese de Ácidos Gordos 2. Redução do grupo carbonilo: O acetoacetil-acp (ou ß-cetobutiril-ACP) sofre uma redução do grupo carbonilo na posição C3 para formar o D--hidroxibutiril- ACP -cetoacil-acp reductase e o dador de electrões é o NADPH. D--hidroxibutirilo tem forma estereoisomérica diferente do intermediário L--hidroxiacil na oxidação dos ácidos gordos 29

30 Síntese de Ácidos Gordos 5. Translocação do grupo butirilo: A produção do éster acil-acp saturado de 4 átomos de C completa uma passagem através do complexo FAS O grupo butiril é agora transferido do grupo SH fosfopanteteino da 4. Redução ACP para daodupla grupo ligação: SH da Cys da - Acetoacil-ACP dupla ligaçãosintase do trans- (que 2 - butenoil-acp inicialmente tinha é oreduzida grupo acetil) (fica 3. Desidratação: saturado) para formar butiril-acp Remoção Enoil-ACP de uma reductase moléculatendo de H 2 Oo do NADPH C2 ecomo C3 do dador D--hidroxibutiril- de electrões. ACP para originar uma dupla ligação no produto trans- 2 - butenoil-acp -hidroxiacil-acp desidratase 30

31 Síntese de Ácidos Gordos: Formação de Palmitato 31

32 Síntese de Ácidos Gordos: Formação de Palmitato As cadeias longas dos Ácidos Gordos são construídas através da repetição de uma série de 4 reacções: 1º Acetil-CoA 1º Malonil-CoA 32

33 Síntese de Ácidos Gordos: Formação de Palmitato Elongação do Butiril-ACP: Novo ciclo de 4 reacções que aumenta em comprimento a cadeia acil em mais 2 átomos de C novo grupo malonil liga-se ao sítio -SH do grupo prostético da ACP agora desocupado Produto da 2ª condensação é um grupo acil com 6C ligado covalentemente ao grupo SH do fosfopanteteino Grupo -ceto é reduzido nos 3 próximos passos do ciclo da sintase grupo acil de 6C saturado A biossíntese de ácidos gordos como palmitato necessita de acetil-coa e de energia obtida de 2 formas: quebra de ATP e poder redutor do NADPH. O ATP é necessário para ligar o CO 2 ao acetil-coa e fazer o malonil-coa e o NADPH para reduzir as duplas ligações 33

34 Síntese de Ácidos Gordos: Formação de Palmitato Elongação do Butiril-ACP: São necessários 7 ciclos de condensação e redução para produzir um grupo palmitoil com 16C ainda ligado ao grupo ACP elongação da cadeia pára em C16 palmitato liberta-se da molécula de ACP pela actividade hidrolítica de mais uma enzima do complexo FAS. (1) 7 Acetil-CoA + 7 CO 2 + 7ATP 7 malonil-coa + 7ADP + 7P i 7 ciclos de condensação e redução: (2) Acetil-CoA + 7 malonil-coa + 14 NADPH + 14 H + palmitato + 7CO 2 + 8CoA+ 14NADP + + 6H 2 O A soma das duas reacções parciais: 8 Acetil-CoA + 7 ATP + 14 NADPH + 14 H + palmitato + 8 CoA + 7 ADP + 7 Pi + 14 NADP + 34

35 Síntese de Ácidos Gordos: Acontece no Citosol Nos eucariotas superiores o complexo FAS encontra-se exclusivamente no citosol 35

36 Síntese de Ácidos Gordos: Acontece no Citosol Separação dos processos sintéticos das reacções degradativas (matriz mitocondrial) Separação dos cofactores transportadores de electrões das vias anabólicas (geralmente um processo reductivo) e catabólica (geralmente oxidativo) NADPH é geralmente o dador de electrões nas reacções anabólicas e o NAD + serve de aceitador de electrões nas recações catabólicas. Nos hepatócitos a razão [NADPH]/[NADP + ] é muito elevada no citosol fornecendo o ambiente fortemente redutor para a síntese de AG e outras moléculas Nos hepatócitos e adipócitos, o NADPH citosólico é largamente gerado pela via das pentoses fosfato e pela enzima málica 36

37 Síntese de Ácidos Gordos: Acontece no Citosol O piruvato produzido reentra na mitocôndria. Nas células fotossintéticas das plantas a síntese de ácidos gordos ocorre no estroma do cloroplasto NADPH é produzido nos cloroplastos pelas reacções da fotossíntese Elevada razão NADPH/NADP + fornece o ambiente redutor que favorece os processos anabólicos como a síntese de ácidos gordos 37

38 Síntese de Ácidos Gordos: Transporte de Acetil-CoA mitocondrial como Citrato Nos eucariotas sem fotossíntese acetil-coa usado na síntese de ácidos gordos produzido na mitocôndria oxidação de piruvato e do catabolismo do esqueleto de carbono dos aminoácidos Acetil-CoA da -oxidação não representa uma fonte significativa de acetil-coa para a lipogénese A membrana interna da mitocondria é impermeável ao acetil-coa shuttle de grupos equivalentes a acetil O acetil-coa intramitocondrial + oxaloacetato citrato (ciclo de Krebs) Citrato sintase Citrato citosol transportador da membrana interna de citrato No citosol clivado pela Citrato liase Acetil-CoA (reacção ATP-dependente) Oxaloacetato não pode voltar à mitocôndria porque não há nenhum transportador de oxaloacetato reduzido pela malato desidrogenase citosólica malato transportador de malato-α-cetoglutarado por troca com citrato mitocôndria Na matriz é reoxidado a oxaloacetato para completar o shuttle Alternativamente o malato citosólico é utilizado para gerar NADPH citosólico enzima málica 38

39 Síntese de Ácidos Gordos: Transporte de Acetil-CoA mitocondrial como Citrato 39

40 Síntese de Ácidos Gordos: Regulação Quando uma célula ou organismo tem muito substrato energético disponível que ultrapassa as suas necessidades excesso é geralmente convertido em ácidos gordos armazenado como lípidos (ex. TAG) Reacção catalizada pela acetil-coa Carboxilase (ACC) é o passo limitante da síntese de ácidos gordos porque esta enzima é um importante ponto de regulação. Nos vertebrados o palmitoil-coa - principal produto da síntese de ácidos gordos inibidor por feedback da ACC e o citrato é o seu activador alostérico (aumenta a V max ) 40

41 Síntese de Ácidos Gordos: Regulação O citrato desempenha um papel central na balança do metabolismo celular entre o consumo (oxidação) do substrato energético e o seu armazenamento como ácido gordo Quando há um aumento de acetil-coa mitocondrial e ATP o citrato é transportado para fora da mitocôndria sendo um sinal alostérico para a activação da ACC e torna-se precursor do acetil-coa citosólico Citrato inibe a actividade da fosfofrutocinase-1 reduzindo o fluxo de carbonos através da glicólise 41

42 Síntese de Ácidos Gordos: Regulação A ACC é também regulada por modificações covalentes Na forma activa (desfosforilada) a ACC polimeriza em longos filamentos Fosforilação - desencadeada por hormonas como glucagon e epinefrina - inactiva a enzima desacelerando a síntese de ácidos gordos Fosforilação é acompanhada pela dissociação em subunidades monoméricas e perda de actividade Regulação ao nível da expressão dos genes correspondentes ingestão de uma grande quantidade de certos ácidos gordos polinsaturados é suprimida a expressão de genes que codificam para enzimas lipogénicas no figado. Se a síntese e oxidação de ácidos gordos ocorressem simultâneamente ciclo fútil com perda de energia. Durante a síntese de ácidos gordos o malonil-coa produzido vai bloquear a -oxidação ao nível da carnitina aciltransferase 1 (CPT 1) não havendo assim degradação dos AG que estão a ser sintetizados. Bom motivo para que as vias sintéticas e degradativas aconteçam em compartimentos celulares distintos 42