VALIDAÇÃO DO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO DO ÌON NITRATO A 205 NM

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1 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO DO ÌON NITRATO A 205 NM Maria Anita Scorsafava 1, Arlete de Souza 1, Gisele Letícia Alves 1 1 Núcleo de Águas e Embalagens-Centro de Contaminantes-Instituto Adolfo Lutz São Paulo SP Brasil mscorsaf@gmail.com ABSTRACT The method is based on direct reading of the absorbance of the sample water with addition of hydrochloric acid 1.0 M in the spectrophotometer at 205 nm to determine nitrate. The 205 nm region is subject to the spectral interferences, therefore, this test only applies in waters with low organic matter content (uncontaminated natural waters, public water supplies and water for dialysis). The objective of this study is the method validation. It was used as a sample of public water supply and water for dialysis. 25 ml of sample were transferred to a 25 ml calibrated flask, and added 0.25 ml 1.0 M hydrochloric acid and homogenized, the same procedure was performed for the standard solutions, the reading was carried out at 205 nm. The reagents used had analytical grade and ultrapure water was used for preparation of standards. The linearity validation parameters, selectivity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LQ) were evaluated according to INMETRO DOQ-CGCRE-008. The linearity was evaluated from the resulting data of average of three standard curve, according to linear regression and the ANOVA tailed test is linear between the concentrations: 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 and 6.0 mg NO3- / l. To evaluate the selectivity compared the slopes of the white test calibration curves and the sample matrix by t test for inclines. According to the slopes of the regression results of the two groups are statistically equal, i.e. the matrix does not have a significant effect on the assay result. The accuracy and repeatability were evaluated by the standard addition in the sample use with three levels of concentration of the analyte in the water supply and dialysis water. The percentage recovery and percentage CV are according to AOAC (2012). The values obtained are in accordance with the established criteria, so the method is accurate and precise in conditions considered. RESUMO O método baseia-se na leitura direta da absorbância da amostra de água, com adição de acido clorídrico 1,0 M, em espectrofotômetro a 205 nm, para a determinação de nitrato. A região 205 nm é sujeita as interferências espectrais, sendo assim, este ensaio somente se aplica em águas com baixo conteúdo em matéria orgânica (águas naturais não contaminadas, águas de abastecimento público e água para diálise). O objetivo deste trabalho é a validação do método. Foi utilizada como amostra água de abastecimento publico e água para dialise. Foram transferidos 25 ml da amostra para um balão de 25 ml calibrado e adicionado 0,25 ml de ácido clorídrico 1,0 M e homogeneizada, o mesmo procedimento foi realizado para as soluções padrão, procedeu-se a leitura em 205 nm. Os reagentes utilizados apresentavam grau analítico e foi utilizada água ultrapura para preparação de padrões. Os parâmetros de validação linearidade, seletividade, precisão, exatidão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram avaliados de acordo com INMETRO DOQ-CGCRE-008. A linearidade foi avaliada a partir dos dados resultantes da média de três curva padrões, de acordo com a regressão linear e o teste unilateral de ANOVA é linear entre as concentrações: 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 6,0 mg NO 3 - /L. Para avaliar a seletividade foram comparadas as inclinações das curvas de calibração do branco do ensaio e da amostra matriz pelo teste t para inclinações. De acordo com

2 os resultados as inclinações da regressão dos dois grupos são estatisticamente iguais, isto é, a matriz não tem um efeito significativo sobre o resultado do ensaio. A exatidão e a repetibilidade foram avaliadas pelo uso de adição de padrão na amostra com três níveis de concentração do analito na água de abastecimento e água de dialise. A porcentagem de recuperação e a porcentagem de CV estão de acordo com AOAC (2012). Os valores obtidos estão de acordo com os critérios estabelecidos, portanto, o método é exato e preciso nas condições consideradas. Palavra chave- nitrato, 205 nm, água. INTRODUÇÃO Entre os ânions mais comuns encontrados em água, o nitrato (NO 3 - ) tem importância devido a sua toxicidade. Esse íon pode estar presente nas águas superficiais e nas subterrâneas como consequência da atividade da agricultura, da eliminação de águas residuais e da oxidação de resíduos de produtos nitrogenados em fertilizantes agrícolas, excrementos humanos e animais, incluindo fossas sépticas 1. O nitrato, em conjunto com nitrito, esta associado à indução da metemoglobinemia e a formação potencial de nitrosaminas e nitrosamidas carcinogênicas 2,3. Na água tratada para diálise o nitrato é um dos íons que devem ser monitorados para garantir sua qualidade 4, quando não tratada de maneira adequada, coloca em risco a vida e a segurança de pacientes com insuficiência renal e sob tratamento 5. O método recomendado para determinação de nitrato pelo Standard Method for Examination of Water and Wastewate (APHA, 2012) 6, é o método com detecção UV (220 e 275 nm). O proposto no presente trabalho baseia-se na leitura direta da absorbância da amostra de água, com adição de acido clorídrico 1,0 M, em espectrofotômetro a 205 nm. A região 205 nm é sujeita a interferências espectrais, sendo assim, este ensaio somente é aplicável em águas com baixo conteúdo em matéria orgânica (águas naturais não contaminadas, águas de abastecimento público e água para diálise). O objetivo deste trabalho foi validar um método espectrofotométrico na região do UV (205 nm) para determinação de íon nitrato em águas naturais não contaminadas, água de abastecimento público e água para diálise. MATERIAIS E MÉTODO Materiais Com Solução padrão de nitrato de sódio (grau cromatográfico) 1,002 ± 4 µg.l -1 da marca Inorganic Venture certificada pela IsoGuide 34 7 preparou-se soluções padrão com as seguintes concentrações: 0,10; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 mg/l em água ultrapura (18 m). Os demais reagentes utilizados apresentavam grau analítico e as amostras de água para a realização dos testes foram coletadas da rede de abastecimento público diretamente da torneira do laboratório e a água tratada para diálise coletada pela Vigilância Sanitária do Programa Estadual de Hemodiálise. A água de abastecimento público foi coletada no dia da realização do teste. A amostra foi transferida para um balão volumétrico de 25 ml calibrado até o menisco e adicionados 0,25 ml de ácido clorídrico 1,0 M, e homogeneizados. O mesmo procedimento foi realizado para a água tratada para diálise e soluções padrão. Método Foram realizadas leituras de absorbância nas amostras em 205 nm no especptrofotometro UV/Vis modelo Orion Aquamate 8000 marca Thermo Scientific. Os parâmetros de validação linearidade, seletividade, precisão, exatidão, limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram avaliados de acordo com INMETRO DOQ-CGCRE Os dados foram analisados utilizando a Planilha de Validação versão 1 desenvolvida pelo Núcleo de Análise e Tratamento e Dados do Centro de Materiais de Referência do Instituto Adolfo Lutz. Linearidade e intervalo Foram realizadas três replicatas independentes para sete níveis de concentração (0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 6,0 mgno 3 - /L em água ultrapura). O ajuste da equação matemática de calibração foi realizado pelo método dos mínimos quadrados (MMQ). As concentrações 0,10 e 0,25 mg/l de nitrato não apresentaram boa reprodutibilidade, portanto, foi avaliada a linearidade a partir de 0,5 mgno 3 - /L. Foi verificada a ausência de valores discrepantes pelo teste de Grubs, a homocedasticidade pelo teste de Cochran (99% de confiança). Foi construído o gráfico das concentrações do analito versus a resposta em absorbância e realizado o teste da significância da regressão e o desvio da linearidade pelo teste F e pela análise de variância (ANOVA) univariada. O critério de aceitação considerado foi R 2 0,995; a regressão linear ser significativa (p 0,05) e a falta de ajuste ser não significativa (p > 0,05).

3 Também foi construído o gráfico de resíduos (concentração teórica da curva versus diferença entre a concentração obtida e o valor de concentração estimado pela equação da reta de regressão. Seletividade Para avaliar a seletividade foram comparadas as inclinações das curvas de calibração do branco do ensaio e da amostra branco pelo teste t para inclinações. Foram preparados dois grupos de soluções em triplicatas independentes: Grupo 1: água ultrapura (branco do ensaio) + adição de padrão de analito (0,5; 1,0,2,0; 4,0 e 6,0 mgno 3 - /L) Grupo 2: água de abastecimento (matriz com analito) + adição de padrão de analito (0,5; 1,0,2,0; 4,0 e 6,0 mgno 3 - /L). Para avaliação dos dados foi realizado o teste F para avaliar a homogeneidade das variâncias dos resíduos da regressão com 95% de confiança. A estatística do teste é dada pela equação 1: F calculado = s 2 res1/ s 2 res2 (1) Onde s 2 res1 e s 2 res2 são as variâncias dos resíduos da regressão de cada grupo, com maior variância, respectivamente. Como F calculado (3,261) foi maior que F crítico (2,761) com 5 % de significância, a estatística t foi obtida por meio da equação 2 e o resultado comparado com valor tabelado. Também foi realizada a avaliação da amostra na presença de interferentes, pois nessa faixa espectral a matéria orgânica dissolvida e alguns íons normalmente encontrados em água natural, como cloreto, podem interferir na detecção. Para o estudo da seletividade foram analisados separadamente os interferentes cloreto (Cl 1- ) e ácido húmico que foram adicionados em água de abastecimento. Os resultados (absorbância) da matriz sem (grupo 1) e com adição de interferentes (grupo 2) foram analisados pelo teste F para avaliar a homogeneidade e teste t para avaliar a equivalência das médias dos grupos com 95% de confiança. Se Fcalculado for maior que um valor crítico (Fcrítico), a significância das diferenças das médias dos dois grupos pode ser testada por meio da estatística t (para variâncias estatisticamente iguais). Se t calculado < t tabelado a média das duas populações são estatisticamente iguais, portanto, o interferente adicionado não tem efeito significativo sobre o resultado do ensaio. A análise estatística dos dados foi realizada no software Excel2010. Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ) Foram medidas seis replicatas independentes de água ultrapura (branco) fortificada com 0,5 mg NO 3 - /L. Os limites foram calculados de acordo com a equação 3 e 4: Exatidão A exatidão foi avaliada pelo uso de adição de padrão na amostra com o analito, água de abastecimento e água para diálise foram fortificadas com 3 (três) níveis de concentração de padrão do analito em triplicatas independentes. As concentrações usadas equivalem a 1, 1,5 e 2 vezes o limite mínimo de desempenho do método (0,5 mg NO 3 - /L). O critério de aceitação foi a porcentagem de recuperação que deverá estar na faixa % de acordo com AOAC (2012) 9. Repetividade A repetibilidade foi avaliada pelo uso de adição de padrão nas amostras de água de abastecimento e água para diálise que foram fortificadas com 3 (três) níveis de concentração de padrão do analito em triplicatas independentes. As concentrações usadas equivalem a 1, 1,5 e 2 vezes o limite mínimo de desempenho do método (0,5 mgno 3 - /L). O critério de aceitação foi a porcentagem do coeficiente de variação (equação 5) que deverá ser no máximo 8% de acordo com AOAC (2012) 9.

4 Onde: CV%= RSD= porcentagem do coeficiente de variação=desvio padrão relativo s= desvio padrão x = média RESULTADOS E DISCUSSÕES A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico dos resultados dos ensaios em função da concentração do analito (Figura 1). O critério de aceitação do coeficiente de correlação (R 2 ) que deverá ser maior que 0,995 foi alcançado (Tabela 1). Figura 1. Concetração de nitrato (mg/l) versus a resposta em absorbância Os dados da curva analítica, resultante da média de três curvas padrão, foram ajustados por análise de regressão linear e o teste unilateral de variância (ANOVA) avaliou a qualidade do ajuste do modelo linear (Tabela I). Portanto, a curva concentração de nitrato x absorbância é linear, pois, a regressão é significativa (p 0,05) e a falta de ajuste não significativa (p>0,05). Portanto a faixa de trabalho é 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 6,0 mg NO 3 - /L. Parâmetros Resultados Faixa de linearidade 0,5-6,0 mgno - 3 /L, Equação: y = ax + b y = 0,1481x 0,0198 Intercepto (b) desvio padrão -0,0198 0,0017 Inclinação (a) desvio padrão 0,1481 0,0005 Coeficiente de correlação (R 2 ) 0,998 Valor p regressão 4,12148 x Valor p falta de ajuste 0,6329 Tabela 1. Dados referentes a linearidade do método Foi construído o gráfico de resíduos (concentração teórica da curva versus diferença entre a concentração obtida e o valor de concentração estimado pela equação da reta de regressão) e verificou-se que a distribuição em torno da linha reta (eixo x) foi aleatória, o que indica adequação ao modelo MMQ (Figura 2).

5 Figura 2. Concetração de nitrato (mg/l0 versus resíduo Na Figura 3 encontram-se os resultados do teste de seletividade, como t calculado (1,231) foi menor que o t crítico (2,064) as inclinações da regressão dos dois grupos são estatisticamente iguais, isto é, a matriz não tem um efeito significativo sobre o resultado do ensaio. Figura 3. Concentração de nitrato (mg/l) versus leitura de absorbância para os gripos 1 (água ultrapura e grupo 2 (água de abatecimento) Também foi realizada a avaliação da amostra na presença de interferentes de acordo INMETRO DOQ-CGCRE Observa-se que a partir da adição de 2,0 mg/l de ácido húmico (Tabela 2 e Figura 4) há diferença estatística na leitura de absorbância da amostra (p<05). Adição de ácido Húmico mg/l Média da leitura absorbância PF 1 Pt 2 ER 3 0 0,454 0,1 0,453 0,4643 0,6361 0,2522 0,5 0,455 0,1830 0,4018 0,3487 1,0 0,456 0,2960 0,1959 0,6307 2,0 0,472 0,1847 3,9 x ,320 4,0 0,514 0,4244 8,0 x ,56 6,0 0,574 0,011 4,6 x ,54 Tabela 2. Influência da presença de ácido húmico em água de abastecimento na leitura de absorbância a 205 nm 1 probabilidade de significância teste F da amostra; 2 probabilidade de significância teste t da amostra; 3 porcentagem de erro relativo: valores de p< 0,05 há diferença significativa (95%). ER= (X amostra+ interferente - X amostra)/ X amostra ).100 Onde: X amostra+ interferente = valores obtidos da amostra com interferente; X amostra = média aritmética dos valores obtidos da amostra (valor verdadeiro); ER= porcentagem do erro relativo

6 Figura 4. Influência da presença de ácido húmico na determinação de nitrato Na região do UV (205 nm) em água de abastecimento Quatro níveis de concentração de íons cloreto foram adicionados em água de abastecimento publico em seis replicatas. Pode ser previsto um erro negativo de -9,6385 % na amostra de água de abastecimento com adição de 100 mg/l (Figura 5). Figura 5. Influência da presença de íon cloreto na determinação de nitrato Na região UV (205 nm) em água de abastecimento Foi realizado um levantamento sobre o teor de cloreto em 56 amostras de água para consumo humano analisadas no laboratório durante o ano de Foi observado que o teor de cloreto médio em água de abastecimento foi de 41,75 mg/l, ou seja, aproximadamente metade do valor que pode interferir na amostra. Portanto, conclui-se que para amostra de água de abastecimento o método proposto é seletivo para nitrato. A sensibilidade do método foi analisada através da determinação dos limites de detecção e quantificação, e os valores obtidos para foram de 0,0744 e 0,2479 mg NO 3 - /L, respectivamente (Tabela 3). O limite de quantificação corresponderá ao padrão de calibração de menor concentração (0,5 mg/l NO 3 - ), pois os limites calculados encontram-se abaixo da faixa de trabalho.

7 Tabela 3. Limite de quantificação de nitrato Pelo método espectrofotométrico DP: desvio padrão; DPR %: desvio padrão Relativo de repetibilidade ou % CV De acordo com Codex Alimentarius (2014) 10, guia para estabelecimento de critérios de valores numéricos para métodos analíticos, o limite de quantificação deverá ser 1/5 do valor do limite máximo permitido (VMP) quando esse valor for > 0,1 mg/kg (1/5 x VMP). Considerando-se o valor máximo permitido (VMP) para nitrato de acordo com a Portaria 2914 é de 10 mgn/l (44,4 mgno 3 - /L) e da Resolução 11 é de 2 mgn/l (8,8 mgno 3 - /L), o limite de quantificação atende as necessidades de aplicação do método. Concentração do analito adicionado (mg/l) Tipo de matriz % de Recuperação % CV 0,5 aa 89,3056 2,652 0,5 ah 103,0667 3,922 0,75 aa 97,0455 0,4900 0,75 ah 96,6670 2,855 1,0 aa 94,2175 0,8270 1,0 aa 99,7333 4,67 Tabela 3. Resultados da porcentagem de recuperação e coeficiente de variação da águas fortificadas com três níveis de concentração aa: água de abastecimento; ah: água de hemodiálise; três replicatas. Os valores obtidos das porcentagens de recuperação e CV das amostras fortificadas estão de acordo com os critérios de aceitação em relação a concentração do analito estabelecidos pela AOAC (2002) que são de 85 a 110 % de recuperação e 8 % CV. Conclusões Visto que o presente método atendeu os parâmetros de validação avaliados, considera-se que o mesmo é adequado para determinação de nitrato em água de abastecimento e água de diálise para atender as Portarias Nº 2914/2011 do Ministério da Saúde 11 e Resolução RDC Nº11/2014 da Anvisa 5.

8 Referências 1 World Healt Organization WHO. Guidelines for drinking water quality. 4 th ed. Geneva: World Health Organization; Cemek MC, Akkaya L, Birdane YO, Seyrek K, Bulut S,Konuk M. Nitrate and nitrite levels in fruity and natural mineral waters marketed in western Turkey. J. Food Composition and Analysis. 2007; 20: Bruning-Fann CS, Kaneene JB. The effects of nitrate nitrite and N-nitroso compounds. Vet Hum Toxicol.1993; 35(6): Simões M, Brigido BM, Mazon EMA, Pires MFC. Água de diálise: parâmetros físico-químicos na avaliação do desempenho das membranas de osmose reversa. Rev. Inst. Adolfo Lutz. 2005; 64(2); Brasil. Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Resolução RDC n o 11 de 13/03/2014. D.O.U, Brasília, 14 de março de Dispõe sobre os requisitos de Boas Práticas de Funcionamento para os serviços de Diálise. 6 AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAM WATER WORKS ASSOCIATION, WATER ENVIRONMENT FEDERATION (APHA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 22 th ed. Washington, DC, Requisitos ISO Guia 34 Gerais para a Competência Referência de Produtores de materiais (2009) 2, Internacional Organização de Normalização, Genebra, Suíça 8 INMETRO DOQ-CGCRE Orientação Sobre Validação de Métodos Analíticos, Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL, 19th Edition (2012). Apêndice f. 10 Codex Alimentarius Comission. Procedual Manual. 22 ed. World Health Organization-FAO- Food and Agriculture Organization of United Nation. (2014). 11 Brasil. Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Portaria n o 2914 de 12/12/2011. D.O.U, Brasília, 14 de dezembro de Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.