VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALITICO PARA QUANTIFICAÇÃO DE CEFTIOFUR POR ESPECTROFOTOMETRIA- UV

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1 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALITICO PARA QUANTIFICAÇÃO DE CEFTIOFUR POR ESPECTROFOTOMETRIA- UV Autores : Matheus Iuri FRUHAUF 1, Christofe CARNEIRO 1, Pamela MABONI 1, Suzana JUST 1, Mikaela Sales de LIMA 1, Eduardo Benvenutti MORELLO 1, Leonel Frigo ROSA 1, Mario Lettieri TEIXEIRA 2 1 Discente do Curso de Medicina Veterinária IFC-Campus Concórdia; 2 Orientador IFC-Campus Concórdia Introdução O ceftiofur sódico é um antibacteriano de largo espectro, pertencente à classe das cefalosporinas, possui atividade contra bactérias gram positivas e negativas, com uma boa atuação contra β-lactamases. Atua inibindo a síntese da parede celular bacteriana, semelhante a outras cefalosporinas. É utilizado no tratamento de infecções respiratórias em bovinos, suínos e aves, tratamentos de pododermatites, mastite e outras condições sépticas em bovinos (Souza, 2009). Atualmente, o extenso uso de antibióticos para o gado leiteiro e outras espécies, levanta grandes questões devido à resistência bacteriana dificultando o tratamento de futuras infecções, problemas de qualidade na produção de derivados lácteos e presença de resíduos em produtos de origem animal, envolvendo a saúde pública. Resíduos de antibióticos podem ser transferidos para a população através da carne, leite e seus derivados, podendo ser diretamente tóxicos, ocasionar reações alérgicas em pessoas hipersensíveis e seu consumo continuo e em pequenas quantidades pode ocasionar uma proliferação de microrganismos resistentes a medicamentos em humanos (Xu et al., 2015). Para garantir a qualidade de produtos lácteos e a segurança pública, autoridades reguladoras do mundo todo determinam limites máximos de resíduos nos alimentos (LMR) (Xu et al., 2015). O CODEX ALIMENTARIUS é um fórum internacional de normatização do comércio de alimentos, que engloba regras gerais e específicas relativas à segurança alimentar, visando proteger a saúde dos consumidores. Foi desenvolvido pela Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação (Food and Agriculture Organization, FAO) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) (EUFIC, 2004). Segundo o CODEX ALIMENTARIUS e o MERCOSUL o LMR do ceftiofur no leite é de 100 µg/l.

2 Observando bulas comerciais do ceftiofur nota-se que as mesmas descartam a necessidade de carência para uso em animais de produção. Todavia segundo Smith et al. (2004) quando a droga é utilizada dentro das especificações, ela não ultrapassa os limites toleráveis legais, porém e somente, quando for usada em tratamentos de mastite através infusão intra mamaria, na qual, tal informação não consta na bula. Segundo Cristina et al. (2010), após a administração intramuscular de ceftiofur sódico nas doses de 1 a 2mg/kg, recomendada pelo fabricante, em ordenhas de até 12 horas depois da medicação, os resultados da determinação de resíduos foram superiores a máxima tolerável. Vários métodos analíticos foram desenvolvidos para determinação de resíduos de antibióticos nos alimentos, onde são classificados em inibição microbiana, técnicas cromatográficas, biossensoras e técnicas histoquímicas, porém muitos são caros, ou demorados (Xu et al.,2015). Visto isso, o presente projeto tem o objetivo de validar um método sensível, prático, rápido, específico, de custo benefício satisfatório para determinação quantitativa de ceftiofur, para posterior utilização da técnica para quantificação deste antibiótico em produtos de origem animal. Material e Métodos Obtenção da Curva de Ringbom A curva de Ringbom foi realizada a fim de determinar a faixa de concentração na qual o método espectrofotométrico na região do ultravioleta obedece à linearidade, ou seja, determinar qual a faixa de concentração na qual se comete o menor erro (ANVISA, 2003). Sua determinação foi feita pesando-se o equivalente a 1g de ceftiofur sódico de origem comercial, onde será transferido a um balão volumétrico de 50 ml, na qual será feita a dissolução com água destilada, adquirindo assim uma solução mãe de 10mg/mL. Essa solução foi posteriormente diluída em outros 5 balões volumétricos nas concentrações de 10mg; 5mg; 1mg; 0,5mg e 0,1 mg. As leituras de absorbância no espectrofotômetro serão realizadas na faixa de comprimento de onda de nm, contra um branco com água destilada em cubetas de quartzo de 1cm de espessura (ANVISA, 2003). Obtenção da Curva Padrão

3 Para obtenção e demonstração da linearidade do trabalho foram realizadas curvas padrões, determinação da equação da reta e coeficiente de correlação (r²). Com a finalidade de determinar a curva padrão, foram pesados 1g de ceftiofur sódico e transferidos a um balão volumétrico, onde foram adicionados 20mL de água e agitado até sua completa solubilização. A partir desta solução mãe foram preparadas soluções com as concentrações de 10mg; 5mg; 1mg; 0,5mg e 0,1mg; e analisadas leituras de absorbância com o espectrofotômetro no comprimento de onda obtido a partir da curva de ringbom. Este ensaio será realizado em triplicata (ANVISA, 2003). Precisão Testes intra-dia e inter-dias foram realizados para determinar a precisão do método analítico proposto. Concentrações diferentes de amostras de ceftiofur foram preparadas (0,5; 1,0; 5,0 mg/ml) e analisadas em triplicata em três dias diferentes (ANVISA, 2003). Exatidão A exatidão será determinada por teste de recuperação por meio da adição de uma quantidade determinada do padrão em soluções da amostra (as concentrações escolhidas foram 0,5; 1,0; 5,0 mg/ml). O teste foi realizado em triplicata (ANVISA, 2003). Resultados e discussão Os resultados encontrados estão expostos na Figura 1. Com base nesses dados, o método proposto é de fácil execução e baixo custo. Figura 1. Curva padrão de ceftiofur de acordo com a metodologia proposta para quantificação por ultravioleta.

4 Quando R² é calculado para método analítico e valores acima de 0,96 é encontrado determina-se que a metodologia do trabalho foi adequada, e o mesmo foi realizado de forma correta. O R² no presente trabalho foi calculado em um valor de 0,98; portanto, a metodologia do mesmo está correta, o que possibilita uma continuidade do trabalho, passando de testes in vitro, futuramente para testes in-vivo (ANVISA,2003). A crescente demanda de leite e seus derivados incentiva o desenvolvimento de técnicas e medicamentos que permitam um ritmo crescente de produção. Os fármacos veterinários representam grande importância na manutenção da produção de uma propriedade, sendo a eficácia e tempo de carência destes fundamentais para manter ou alavancar os índices produtivos. Dentre todos os medicamentos utilizados na pecuária leiteira, antibióticos de amplo espectro como a ceftiofur deveriam possuir importância pelo seu controle efetivo de doenças bacterianas, como a mastite, porém, a alta carência do material torna esse princípio ativo inválido em bovinos de leite cujo a produção seja destinada ao consumo humano. Os medicamentos utilizados no sistema de produção têm de apresentar informações precisas relacionadas ao intervalo de carência ocasionado no animal por sua aplicação. O teste de novos medicamentos produzidos, assim como o de medicamentos já circulantes no mercado, é essencial para verificação das informações de carência e possibilita a realização de comparações. Conclusão Com o término do trabalho e todos os dados e resultados obtidos, percebe-se que os objetivos do trabalho foram atingidos, com uma metodologia de baixa complexidade, e essencial para futuras pesquisas in vivo, avalizando a utilização da Ceftiofur na área de tratamento de grandes animais. Referências ANVISA. Resolução RE n 899, de 29 de maio de 2003b. Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Disponível em: < Acesso em: 29.set.2016.

5 CRISTINA, M.; TORRES, R. M.; MENDONÇA, E. P.; COELHO, L. R.; ROSSI, D.A. Uso de ceftiofur em vacas leiteiras e sua excreção no leite. PUBVET, Londrina, EUROPEAN MEDICINE AGENCY, Annex I, Summary of Product Characteristics, Disponível em: < _Product_Information/veterinary/000079/WC pdf >. Acessado em: 22.set SMITH, F. W., GEHRING, R., RIVIERE, J., et al. Elimination kinetics of ceftiofur hydrochloride after intramammary administration in lactating dairy cows. JAVMA. v. 224, p , SOUZA, M. J. E. Development of a Ultraviolet Spectrophotometric Method for the Determination of Ceftiofur Sodium Powder Journal AOAC Int. v. 92, n. 6, p , XU, C.; XU, L; CHEN, Y.; LIU, L.; WU, X.; KUANG, H.; AIKE, L.; WANG, Y. Gold immunochromatographic assay for rapid and 2 simultaneous detection of fifteen β- lactams. Nanoscale, Advance Article, 2015.