INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA
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- Thais Castilho Fialho
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1 INTRODUÇÃO À CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA APLICAÇÃO NO CONTROLE DE QUALIDADE DE FÁRMACOS MÓDULO 07 Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas UnUCET Anápolis 1
2 2 MÓDULO 07 APLICAÇÕES NO CONTROLE DE QUALIDADE DE FÁRMACOS & VALIDAÇÃO ANALÍTICA
3 3 APLICAÇÕES - FÁRMACOS 1) UV/Visível - Líquidos/Soluções 2) Infravermelho Próximo (NIR) e Médio (MID) - Transmitância: Líquidos/Soluções - Refletância Difusa: Sólidos - Transflectância: Líquidos/Soluções e Semi-sólidos 3) Outras técnicas de espectroscopia molecular: - Raman, Espectrofluorimetria (restritas a aplicações acadêmicas)
4 4 ALTERNATIVA ÀS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS ANÁLISES + SIMPLES, RÁPIDAS E DE MENOR CUSTO Separação Física das Espécies X Separação Quimiométrica dos Sinais ÁREAS DE APLICAÇÃO: Controle de Qualidade de Fármacos Análises Clínicas
5 5 PRINCIPAL REQUISITO P/ O USO DE MÉTODOS QUIMIOMÉTRICOS NO SETOR PRODUTIVO RECONHECIMENTO PELOS ÓRGÃOS REGULADORES (FARMACOPÉIAS, AGÊNCIAS, etc.) VALIDAÇÃO ANALÍTICA Pensamento Univariado X Pensamento Multivariado
6 VALIDAÇÃO ANALÍTICA 6 Deve ser feita de acordo com: 1) Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos, Resolução RE n o 899, Brasil, ) International Conference on Harmonization (ICH); Tripartite Guideline Q2A Text on Validation of Analytical Procedures, Fed. Regist., 60 FR 11260, USA, ) ICH; Tripartite Guideline Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology, Fed. Regist., 62 FR 27464, USA, 1997.
7 VALIDAÇÃO ANALÍTICA 7 Figuras de Mérito (exigidas pela ANVISA) Linearidade: Curva do valor referência x valor previsto - r > 0,99 Exatidão: 6 determinações no nível de 100% ou 9 determinações em 3 níveis (3 triplicatas em 80, 100 e 120%) - Recuperação entre 98 e 102 % Repetibilidade: idem exatidão - DPR < 5% Precisão Intermediária: Repetição da análise em pelo menos 2 dias diferentes, variando o analista e/ou o equipamento DPR, 5% Robustez: Assegurar a validade do procedimento sob variação de alguma condição (temperatura, estabilidade da solução analítica, etc.) Especificidade/Seletividade: Grande desafio, pois o conceito univariado não se presta à realidade Multivariada
8 VALIDAÇÃO ANALÍTICA 8 Sinal Analítico Líquido (NAS, Net Analyte Signal) Parte do sinal analítico que é ortogonal ao sinal dos interferentes presentes na amostra NAS é um vetor contendo valores para cada amostra e pode ser relacionado com o vetor de regresão, b, de um modelo de calibração inversa como: NAS = 1 / b
9 VALIDAÇÃO ANALÍTICA 9 Figuras de Mérito (baseadas no NAS) Limite de Detecção: LD = 3 ε / NAS ε = estimativa do ruído instrumental Limite de Quantificação: LQ = 10 ε / NAS Porém, restrito ao menor nível do conjunto de calibração Sensibilidade: SEN = NAS Sensibilidade analítica: γ = SEN / ε (independente da técnica) 1/ γ = diferença de concentração mínima discernível pelo método analítico na ausência de erro experimenta
10 APLICAÇÃO no UV 10 DETERMINAÇÃO DIRETA DE DICLOFENACO EM FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO VITAMINAS DO COMPLEXO B POR MEIO DE ESPECTROFOTOMETRIA NO UV E PLS
11 APLICAÇÃO no UV 11 DICLOFENACO O Cl H N Cl OH DCF TIAMINA (Vitamina B1) PIRIDOXINA (Vitamina B6) H 3 C N NH 2 S OH CH 2 OH N N CH 3 HO CH 2 OH TIA H 3 C N PIR
12 APLICAÇÃO no UV 12 DCF: droga anti-inflamatória não-esteroidal muito usada. Vitaminas B: contribuem p/ diminuir a dosagem e encurtar o tratamento. Não existiam métodos na literatura que fossem capazes de determinar direta e simultaneamente DCF, TIA e PIR.
13 APLICAÇÃO no UV 13 EXPERIMENTAL Solução / Analito Planejamento Experimental DCF ~ TIA ~ PIR ~. Nível (+): DCF e TIA 50,0 µg ml -1, TIA 75,0 µg ml -1. Nível (-): DCF e TIA 10,0 µg ml -1, TIA 15,0 µg ml -1. Nível (~): DCF e TIA 30,0 µg ml -1, TIA 45,0 µg ml -1
14 APLICAÇÃO no UV 14 EXPERIMENTAL Espectrofotômetro de arranjo de diodos Agilent a 360 nm ph entre 3 e 6 Tratamento dos dados: MATLAB, versão 6.1 PLS toolbox, versão 2.1
15 APLICAÇÃO no UV 15 Amostra 1 (cápsulas): 50 mg de DCF sódico 50 mg de hidrocloreto de TIA 50 mg de hidrocloreto de PIR 1 mg de cianocobalamina excipiente q. s. p. (lactose) Amostra 2 (comprimidos): 50 mg de DCF sódico 50 mg de hidrocloreto de TIA 50 mg de hidrocloreto de PIR 1 mg de cianocobalamina talco, estearato de magnésio, lactose, celulose, carboximetilcelulose sódica, dióxido de silício coloidal, Eudragit RL 30D, macrogol, dióxido de titânio, dimeticona, trietilcitrato, metilparabeno, propilparabeno, polividona, corante vermelho FD&C n o 6 Os resultados da determinação das amostras foram verificados por CLAE
16 APLICAÇÃO no UV 16 ESPECTROS NO UV
17 APLICAÇÃO no UV 17 MODELOS - RMESP Analito ph 3.0 ph 4.0 ph 4.5 ph 5.0 ph 6.0 (µmol L -1 ) (µmol L -1 ) (µmol L -1 ) (µmol L -1 ) (µmol L -1 ) DCF 3,44 3,05 1,56 0,80 3,08 TIA 0,69 0,24 0,37 0,38 0,98 PIR 1,42 0,35 0,53 0,70 1,37 Melhor modelo: PLS2 ph 5
18 APLICAÇÃO no UV 18 FIGURAS DE MÉRITO Figuras de mérito Estimativa SEL 0,15 SEN 0, γ (L µmol -1 ) 7,98 LD (µmol L -1 ) 0,376 Precisão média (µmol L -1 ) 0, / γ = 0,13 µmol L -1
19 APLICAÇÃO no UV 19 PREVISÕES PIR e TIA: boas previsões p/ a amostra 1 e resultados não aceitáveis p/ amostra 2 (acima de 10 % em relação ao especificado pelo fabricante). Causa: interferentes não modelados presentes no excipiente da amostra 2. DCF Amostra especificado (mg) Método proposto (mg) a CLAE (mg) a # ,8 ± 0,7 47,2 ± 3,5 # ,2 ± 1,9 51,0 ± 1,0 a média e desvio padrão de três determinações Os resultados dos 2 métodos não diferiram significativamente (teste t, 95 % de confiança)
20 APLICAÇÃO no UV 20 CONCLUSÕES 1) O método proposto foi capaz de determinar DCF na presença de interferentes com sinal fortemente sobreposto, como as vitaminas B. 2) O método é capaz de determinar simultaneamente DCF, PIR e TIA em formulações com excipientes simples (amostra 1). Em uma formulação mais complexa (amostra 2), o método ainda assim foi capaz de determinar DCF com exatidão. 3) Neste caso, foi possível determinar um analito na presença de interferentes não modelados usando um método de primeira ordem, o PLS.
21 APLICAÇÕES no UV 21 1) Este trabalho: J. Pharm. Biomed. Anal. 36:743 (2004) 2) Determinação de Ácido Acetilsalisílico & Ácido Ascórbico: Anal. Chim. Acta 409:159 (2000) 3) Determinação de Ácido Acetilsalisílico, Paracetamol & Cafeína: J. Pharm. Biomed. Anal. 34:27 (2004) 4) Determinação de Paracetamol & Ibuprofeno: Quim. Nova 30:75 (2007)
22 APLICAÇÃO no NIR 22 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MODELO PARA A DETERMINAÇÃO DE DIPIRONA EM SOLUÇÕES ORAIS POR ESPECTROSCOPIA NIR Parceria: IQUEGO Indústria Química do Estado de Goiás
23 APLICAÇÃO no NIR 23 DIP Analgésico e antipirético Banida em alguns países por suspeita de causar agranulocitose A Farmacopéia Brasileira indica a iodimetria para a determinação de DIP Técnica limitada em relação ao tempo de análise e à precisão
24 APLICAÇÃO no NIR 24 ESPECTROSCOPIA NIR Técnica rápida não destrutiva de aplicação universal mínimo pré-tratamento da amostra
25 APLICAÇÃO no NIR 25 TRANSFLECTÂNCIA A radiação interage com a amostra, é refletida por um espelho, passando novamente pela amostra e voltando ao detector através de outras fibras óticas
26 APLICAÇÃO no NIR 26 EXPERIMENTAL Espectrofotômetro FOSS NIR Systems Smart Probe Analyser 4500 Espectros 1100 a 2500 nm passo 2nm 2 mm de caminho ótico 32 varreduras
27 APLICAÇÃO no NIR 27 FORMULAÇÃO ANALISADA composição por ml: 500 mg de DIP 0,1 mg de EDTA 70% 0,1 mg de Na 2 S 2 O mg de sorbitol água deionizada
28 APLICAÇÃO no NIR 28 ESPECTROS: 36 amostras de calibração e 15 de validação
29 APLICAÇÃO no NIR 29 MELHOR MODELO Pré-tratamento Faixa de [DIP] N o de variáveis latentes RMSEC RMSEP Dados centrados na média 60 a 114 % 5 0,08 % 0,13 %
30 APLICAÇÃO no NIR 30 VALIDAÇÃO LINEARIDADE Valores de referência versus valores estimados pelo modelo PLS amostras de calibração (o) e amostras de validação ( )
31 APLICAÇÃO no NIR 31 Precisão: repetibilidade e precisão intermediária a partir de 3 replicatas dos níveis 80, 100 e 114 % DPR rep = 0,13 % e DPR prec_int = 0,23 % Exatidão: P/ os mesmos níveis anteriores Grau de recuperação entre 99,5 e 100,6% Robustez: variação de temperatura entre 20 e 30 o C DPR = 1,15 % Faixa de aplicação: 80 a 114 % (400 a 570 mg DIP/mL) Especificidade: avaliada de maneira da tradicional, estimando-se a correlação dos espectros dos possíveis interferentes com o espectro alvo da formulação (r deve ser < 0,98) e também pela determinação de placebos
32 APLICAÇÃO no NIR 32 CONCLUSÕES O método foi validado segundo a resolução da ANVISA A vantagem sobre a iodimetria é a maior rapidez (aproximadamente 40 s x 40 min) O método deverá ser formalmente submetido àanvisa
33 APLICAÇÕES no NIR 33 1) Este trabalho: MH Ferreira, JFF Gomes e MM Sena, J. Braz. Chem. Soc., submetido (2008) 2) Determinação de Amoxicilina: Resumo apresentado na 31ª Reunião Anual da SBQ, 2008
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