APLICAÇÃO DE CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA NA DETERMINAÇÃO DE AMOXICILINA POR TRANSFLECTÂNCIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO
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1 APLICAÇÃO DE CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA NA DETERMINAÇÃO DE AMOXICILINA POR TRANSFLECTÂNCIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO Maurício A. M. Silva 1 ; Eduardo L. M. Castro ; Marcius P. Castro 3 ; Marcelo M. de Sena 4 1 ex-bolsista PBIC/UEG, mestrando em Ciências Moleculares, UnUCET - UEG. farmacêutico, IQUEGO. 3 Graduando em Química Industrial, UnUCET - UEG. 4 Orientador, docente do Curso de Licenciatura em Química, UnUCET UEG. RESUMO Um método simples, rápido e de relativo baixo custo foi proposto para a determinação direta de amoxicilina em uma formulação farmacêutica, baseado em espectroscopia no infravermelho próximo, medidas de transflectância e calibração multivariada usando PLS (Partial Least Squares). As amostras (suspensões) foram preparadas na faixa de 80,00 a 135,00 % do teor da formulação (de 40,00 a 67,50 mg/ml). Vinte sete amostras foram usadas no conjunto de calibração e doze no conjunto de validação. Os modelos foram construídos com os espectros na faixa de 1100 a 300 nm, usando os pré-tratamentos adequados. O melhor modelo utilizou onze variáveis latentes, fornecendo erros médios quadráticos de calibração e previsão de 0,0 e 1,43 %, respectivamente. O coeficiente de correlação para a reta entre os valores de referência e os valores previstos pelo modelo foi de 0,998. Estes resultados demonstraram a exatidão e a linearidade do método, o qual apresentou como maior vantagem o tempo reduzido gasto na análise, cerca de 1 minuto por amostra. Palavras-Chave: Calibração multivariada, Transflectância, Infravermelho próximo. INTRODUÇÃO A quimiometria é a parte da química que utiliza métodos matemáticos e estatísticos para 1) definir ou selecionar as condições ótimas de medidas e experimentos; ) extrair o máximo de informações a partir da análise de dados químicos (Bruns et al., 006). Com a sofisticação das técnicas instrumentais, impulsionada pela invasão de microprocessadores e microcomputadores no laboratório químico, tornaram-se necessários tratamentos de dados mais complexos do ponto de vista matemático-estatístico, a fim de relacionar intensidades de
2 sinais obtidos com os resultados desejados. Muita ênfase é dada aos sistemas multivariados, nos quais se podem medir muitas variáveis simultaneamente para uma amostra qualquer. Nesses sistemas, a conversão da resposta instrumental no dado químico de interesse requer a utilização de técnicas de estatística multivariada, álgebra linear e análise numérica. Essas técnicas se constituem numa das principais alternativas para a interpretação de dados e para a aquisição do máximo de informações sobre o sistema (Bruns e Faigle, 1985). Neste trabalho será apresentada uma aplicação de calibração multivariada, cujo princípio básico é medir simultaneamente várias variáveis X 1, X,..., X N (ex: valores de absorbância a vários comprimentos de onda) para quantificar alguma outra variável de interesse, y (ex: concentração). Em aplicações de calibração multivariada em química analítica, os métodos quimiométricos permitem determinações diretas. Em situações onde a determinação de um analito é impedida devido à presença de interferentes, ao invés da separação física da espécie (cromatografia, extração, etc.), o uso desse tipo de tratamento dos dados permite a modelagem dos interferentes junto ao analito de interesse. A idéia central é substituir a separação física das espécies pela separação quimiométrica de seus sinais. Esta estratégia apresenta potenciais vantagens para o desenvolvimento de métodos analíticos mais rápidos, de menor custo e que envolvam menor manipulação da amostra (Sena, 004; Sena et al.; 007). A amoxicilina (AMX) é um antibiótico de amplo espectro, que está na lista dos fármacos essenciais da OMS (Bird, 1994). A AMX pode ser determinada em formulações farmacêuticas por métodos titulométricos, cromatográficos ou espectrofotométricos. No entanto, a grande maioria desses métodos não é capaz de determinar diretamente a AMX na presença de interferentes (ex: excipientes e outros princípios ativos). Os métodos cromatográficos, embora sejam reconhecidos por organismos reguladores (USP, 00), podem apresentar desvantagens, tais como custo e tempo de análise relativamente altos. Por outro lado, métodos analíticos baseados em espectroscopia no infravermelho próximo (NIR) são rápidos, não destrutivos e de aplicação quase universal, demandando um mínimo de prétratamento da amostra. Como a natureza desta região espectral é complexa e raramente permite determinações univariadas, a combinação de NIR com métodos quimiométricos de calibração multivariada vem se tornando promissora. Um modo conveniente para medidas de líquidos no NIR é a transflectância, obtida com sondas de reflexão. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um modelo quimiométrico para a determinação do teor de AMX em uma formulação farmacêutica (pó para suspensão), usando a técnica de espectroscopia NIR, o modo de transflectância para a coleta dos espectros
3 e o método de calibração multivariada PLS. A estratégia empregada foi semelhante à empregada em outro projeto desenvolvido dentro do grupo de pesquisa do Prof. Marcelo M. Sena na UEG, visando à determinação de dipirona em solução oral (Ferreira e Sena, 007;008). MATERIAL E MÉTODOS Toda parte experimental foi conduzida no Laboratório de Controle de Qualidade do IQUEGO (Indústria Química do Estado de Goiás S/A), em Goiânia. O equipamento utilizado foi um Espectrofotômetro de infravermelho próximo da marca Foss, modelo 4500, o qual possui acessório para a obtenção de espectros de transflectância (smart probe analyzer). Os espectros foram registrados na faixa entre 1100 e 500 nm (incremento de nm) com um caminho ótico de mm e 3 varreduras. As amostras foram preparadas pela mistura dos componentes da formulação (princípio ativo mais excipientes), seguida de homogeneização e preparação das suspensões. O produto a ser analisado, pó para suspensão oral, Amoxicilina genérico, produzido pela IQUEGO, é apresentado na forma de frascos de vidro âmbar de 80, 150 e 00 ml (contendo 60, 10 e 150 ml após reconstituição, respectivamente). Cada 5 ml de suspensão deve conter 50 mg de AMX. A composição de excipientes é a seguinte: carboximetilcelulose sódica, benzoato de sódio, dióxido de silício coloidal, aroma de cereja, corante vermelho eritrosina, citrato de sódio anidro e sacarose refinada. (IQUEGO, 006). Trinta e nove amostras (suspensões) foram preparadas de acordo com a composição da formulação, a qual contém em torno de 10% em massa do princípio ativo. Os modelos foram construídos em uma faixa de 80,00 a 135,00 % (40,00 a 67,50 mg/ml) da massa do princípio ativo, para abranger a faixa de aceitação para a liberação do fármaco, que está entre, 90,00 e 10,00 % (45,00 a 60,00 mg/ml). Na composição original, o fármaco deve conter 50 mg/ml do princípio ativo, valor correspondente a 100%. Todos os padrões de reagentes foram fornecidos pela IQUEGO e de grau analítico. As soluções foram preparadas, com água deionizada (Ultrapurificador Maxima, Elga). O tratamento dos dados foi feito no programa MATLAB, versão 6.1 (The MathWorks, Natick, EUA), usando o pacote PLS Toolbox, versão.0 (Eigenvector Technologies, Manson, EUA), que contém as rotinas para métodos de calibração multivariada.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO A região final do espectro (300 a 500 nm) apresentou uma banda fortemente saturada, atribuída à ligação OH da água, e foi eliminada do modelo por aumentar os erros de previsão. As amostras representativas usadas para construir o modelo de calibração, são aquelas que possuem os extremos do conjunto, estão entre 80 a 135 % (40,00 e 67,50 mg/ml) do princípio ativo, as amostras que foram usadas para o conjunto de validação, 1 amostras são as amostras restantes, e possuem entre 4,00 e 63,50 mg/ml (84 a 17 %) do princípio ativo (amoxicilina). O melhor modelo PLS foi obtido usando os seguintes pré-tratamentos dos dados: correção de espalhamento multiplicativo (MSC, Multiplicative Scatter Correction), alisamento Savitsky-Golay, 1ª derivada e dados centrados na média. Os espectros obtidos e submetidos aos pré-tratamentos são mostrados na Figura 1. ABSORBÂNCIA Espectros de calibração corrigidos com MSC x (a (b 1(c Comprimento de onda (nm) MSC ABSORBÂNCIA Comprimento de onda (nm) Alisamento 1ª Derivada 1a DERIVADA Comprimento de onda (nm) Figura 1. (a) Espectros de NIR de 39 amostras de AMX. (b) Espectros tratados com Correção de Espalhamento Multiplicativo (MSC). (c) 1ª Derivada dos espectros, após tratamento com MSC e Alisamento Savistsky-Golay. Todos os pré-tratamentos aplicados levaram a uma melhora significativa do modelo, reduzindo os erros médios de previsão. O melhor modelo PLS foi construído usando 11 variáveis latentes e explicou 99,6 % da variância original dos espectros (variáveis independentes, X) e 99,98 % da variância dos valores de concentração (variáveis dependentes, Y). Os erros médios quadráticos de calibração e de previsão (RMSEC, Root Means Squares Errors of e RMSEP, Root Means Squares Errors of Prediction) foram 0,0 e 1,43 %, respectivamente. O valor do coeficiente de correlação para a reta dos valores de referência versus os valores estimados pelo modelo foi 0,998. Esta reta é apresentada na Figura. Os resultados para a previsão das amostras do conjunto de validação são apresentados na Tabela 1, juntamente com os erros de previsão. O maior erro observado foi de,34 %.
5 Os valores da raiz quadrada dos erros médios quadrados de validação cruzada (RMSECV, Root Mean Square Error of Cross Validation) foram estimados pela Equação: RMSECV = ( yr yˆ n p ) 135 LINEARIDADE T e o r d e A M X P re v is to (% ) Teor de AMX de Referência (%) Figura 6. Avaliação da linearidade dos teores de AMX de referência contra os teores previstos pelo modelo. Amostras de calibração ( ) e de validação( + ). Tabela 1. Resultados para a previsão das amostras do conjunto de validação Teor de AMX de referência Teor de AMX previsto pelo modelo Erro de Previsão (%) (%) PLS (%) 84,00 85,44 1,71 9,00 9,33 0,35 96,00 95,05 0,99 99,00 97,7 1,74 10,00 10,5 0,51 106,00 108,39,6 109,00 109,75 0,69 11,00 114,6,34 116,00 116,73 0,63 118,00 117,70 0,6 11,00 119,8 0,98 17,00 15,7 1,36
6 CONCLUSÕES O método proposto para a determinação de AMX em uma formulação farmacêutica teve como maior vantagem a sua rapidez em relação ao método oficial (em torno de 1 min contra 50 min para cada amostra), o qual é baseado em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (USP, 00). O método proposto apresentou ainda linearidade e exatidão compatíveis com a aplicação pretendida (coeficiente de correlação maior do que 0,99 e erros de previsão menores que %) (ANVISA, 003). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos, Resolução RE n o 899, Brasil, 003. Bird, A.E.; Amoxicillin, Brittain, H.G. (ed.); Analytical Profiles of Drug Substances 3:1 (1994). Bruns, R.E.; Faigle, J.F.G.; Quimiometria, Quím. Nova 8:84 (1985). Bruns, R.E.; Neto, B.B.; Scarminio, I.S.; 5 Anos de quimiometria no Brasil, Quím. Nova 9:1401 (006). IQUEGO; Amoxicilina, bula farmacêutica, 006. Ferreira, M.H.; Gomes, J.F.F.; Sena, M.M.; Determinação de Dipirona em Formulação Farmacêutica por Espectroscopia no Infravermelho Próximo e Calibração Multivariada, 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (SBQ), Águas de Lindóia, 007. Ferreira, M.H.; Gomes, J.F.F.; Sena, M.M.; Development and validation of a multivariate calibration model for determination of dipyrone in oral solutions by near infrared spectroscopy, J. Braz. Chem. Soc., artigo submetido. Sena, M. M., Aplicação de métodos quimiométricos de primeira e segunda ordem na determinação direta de fármacos por espectroscopia molecular, Tese de Doutorado, UNICAMP, Campinas, 004. Sena, M. M. ; Freitas, C. B.; Silva, L. C.; Noda Pérez C.; De Paula, Y. O. Determinação Espectrofotométrica Simultânea de Paracetamol e Ibuprofeno em Formulações Farmacêuticas usando Calibração Multivariada. Quim. Nova 30:75 (007). USP, The United States Pharmacopoeia, 5 th rev., U.S.P. Convention: Rockville, 00.
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