Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

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1 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Efeito da fotoestimulação com laser de baixa potência na cicatrização de feridas em ratos portadores de Diabetes induzido. Sylvia Bicalho Rabelo Dissertação de Mestrado apresentada no Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. São José dos Campos, SP 2003

2 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Efeito da fotoestimulação com laser de baixa potência na cicatrização de feridas em ratos portadores de Diabetes induzido. Sylvia Bicalho Rabelo Dissertação de Mestrado apresentada no Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientador: Prof. Dr. Antonio Guillermo Jose Balbin Villaverde. (UNIVAP) Orientador: Prof. Dr. Miguel Castilho Salgado(UNESP) São José dos Campos, SP 2003

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5 DEDICATÓRIA Aos meus filhos Maria Clara Bicalho Rabêlo (in memorian), Thiago Bicalho Rabêlo (in memorian) e Ana Gabriela Bicalho Rabêlo, pelo nosso puro, incondicional e eterno amor. Ao meu marido Renato Cunha Rabêlo, por ter sido o meu companheiro de todos os momentos. A minha mãe-amiga Neiva Lemos Bicalho, por ter me ensinado a ser mãe. Ao meu pai Adezílio Bicalho Filho, por ter estado sempre presente.

6 AGRADECIMENTOS A Deus Pai, por ter me sustentado em todos os momentos; A Deus Filho, por ter me guiado com amor e bondade. Ao Espírito Santo, por ter me dado a sabedoria necessária à realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Antonio Guillermo Jose Balbin Villaverde, pelos ensinamentos no caminho da pesquisa, transmitidos passo-a-passo com paciência e compreensão. Ao Prof. Dr. Miguel Angelo Castilho Salgado, que me acolheu em seu laboratório e me ajudou a compreender os resultados deste trabalho. A todos os professores que ajudaram a construir o conhecimento e a sabedoria necessários ao desenvolvimento desta pesquisa. A amiga e colega Prof a. Milene da Silva Melo, por ter dividido seu conhecimento no tratamento dos pequenos animais de laboratório. A Prof a. Renata Amadei Nicolau que mesmo à distância se dispôs a acompanhar este estudo. Aos meus irmãos Ivan Lemos Bicalho, Guilherme Lemos Bicalho, Marisa Bicalho Becker e Marcelo Lemos Bicalho, que são solidários às minhas dores e alegrias. Aos familiares, colegas e amigos, que sempre estiveram dispostos a ajudar nos momentos difíceis. Pelas palavras de conforto recebidas no decorrer da vida. Ao QuimLab, que desenvolveu as soluções farmacológicas utilizadas neste experimento. A Univap, por ter fornecido a estrutura necessária ao desenvolvimento deste estudo. A FAPESP, por ter dado suporte financeiro a todas as fases de desenvolvimento do trabalho.

7 EPÍGRAFE Feliz quem medita na sabedoria, raciocina com inteligência, reflete no coração sobre as sendas da sabedoria e se aplica em seus segredos. (Sirasides; 14, 20-21)

8 RESUMO O Diabetes Mellitus é uma alteração patológica associada a hiperglicemia, que acarreta uma deficiência na produção de colágeno e anormalidades na micro e macrocirculação sangüínea, proporcionando um atraso do processo de cicatrização de feridas. Um importante efeito da terapia com laser de baixa potência sobre a cicatrização de feridas é o aumento da síntese de colágeno por parte dos fibroblastos. Acredita-se que o Laser de Baixa Potência exerça ação positiva na cicatrização de feridas, acelerando o processo de reparação tecidual. O presente estudo visa observar a foto-bioestimulação com laser de baixa potência na cicatrização de feridas realizadas em tecido epitelial dorsal de ratos Wistar que contraíram o Diabetes Mellitus induzido por uma injeção endovenosa de Streptozotocin (65 mg/kg de peso) através da veia caudal. Trinta ratos machos foram agrupados em 2 grupos de 15 animais cada: grupo tratado e grupo controle. Uma lesão no epitélio do lado direito do dorso do animal foi realizada com um instrumental Punch 8,0mm. O grupo tratado foi exposto à radiação de luz laser He-Ne operando num comprimento de onda de 632,8nm com potência de saída de 15mW. O laser foi posicionado a 1,2m da lesão dorsal no animal, proporcionando uma área irradiada no rato de 0,025cm 2 e uma fluência de 10 J/cm 2 no tempo de exposição igual a 17s. As amostras da pele foram extirpadas na forma de um quadrado, com 5mm de margem de tecido saudável circundante à lesão no 4 o, 7 o e 15 o dias após a realização das feridas (5 animais tratados e 5 controles para cada período). As amostras foram fixadas em formol a 10% e enviadas para análise histopatológica após coloração com Hematoxilina e Eosina. Os resultados sugerem que a irradiação dos ratos diabéticos foi eficaz na cicatrização das lesões. O grupo tratado apresentou melhor qualidade na observação macroscópica das feridas e a análise por microscopia de luz demonstrou melhor evolução da reparação do tecido lesado que o grupo controle. Palavras-chave: Laser de Baixa Potência, Diabetes, Cicatrização.

9 ABSTRACT Diabetes Mellitus is a pathologic condition associated with hyperglycemia that results in an insufficient production of collagen and abnormalities of micro and macrovascular responsiveness to physical agents, and this fact causes a delay in the wound healing process. An important effect of Low Intensity Laser Therapy on wound healing is an increase in the collagen production by fibroblasts. It s suggested that Low Intensity Laser Therapy acts by improving wound healing in normal organisms, accelerating tissue regeneration. The aim of this study is to show the effect of LILT (Low Intensity Laser Therapy) in vivo by biostimulating wound healing in epithelial tissues of the dorsum area in diabetic rats. The Diabetes condition was induced by an injection of Streptozotocin through the caudal vein (65 mg/kg body weight). Thirty male rats were divided into 2 groups of 15 animals each: treated and control. A fullthickness skin wound was aseptically made on the right side of the animal dorsum area, with a round 8.0mm hole-punch. The treated group was exposed to He-Ne laser at the nm wavelength and 15mW output power. The laser was positioned at 1.2 m from the animal dorsal wound, resulting a cm 2 irradiated area over the rat skin and a 10 J/cm 2 fluence for an exposure time of 17 s. Squared full-thickness skin samples, with 5 mm of non injured tissue around the wound, were obtained at the 4 th, 7 th and 15 th days after the wounding procedure (5 treated and 5 control animals each time). Samples were fixed in a 10% buffered formaldehyde and for the histopathologic analysis were haematoxylin-eosin staining. Our results suggest that the irradiation of diabetic rats was efficient on wound healing. The treated group showed a better quality in the wounded tissues by the macroscopic observation than control group. The microscopic analysis demonstrated that treated animals had better histologic evaluation than non treated. Key-Words: Low Intensity Laser Therapy (LILT), Diabetes, Wound Healing.

10 Sumário 1 INTRODUÇÃO 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 O Pâncreas e a insulina 2.2 Diabete Sacarino Definição Etiologia e Classificação Manifestações clínicas Complicações crônicas Fármacos Diabetogênicos 2.3 A pele: Características citológicas da epiderme e da derme Epiderme Derme 2.4 O processo de cicatrização das lesões no organismo vivo Alterações na cicatrização por consequência do diabete sacarino 2.5 Laser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) 2.6 Laser de baixa potência na biomodulação 3 PROPOSIÇÃO 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Animais Indução do diabete Controle da glicemia animal Coleta e análise da urina Procedimento para realização das lesões Grupos de estudo Grupo I 4 dias Grupo II 7 dias Grupo III 15 dias

11 4.1.6 Terapia com laser de baixa potência 4.2 Preparação das lâminas para análise histológica 4.3 Critérios utilizados para análise histológica das amostras e comparação dos resultados RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Monitoramento da Glicemia Sanguínea Valores de glicose medidos na análise de amostras sangüíneas dos ratos 5.2 Análise da urina animal 5.3 Análise macroscópica 5.4 Resultados da análise histológica qualitativa Grupo I (4 dias) Grupo II (7 dias) Grupo III (15 dias) 6 CONCLUSÕES 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 8- APÊNDICE 9 ANEXO 9.1 Certificado de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Univap

12 Lista de Tabelas e Figuras TABELAS: Tabela 1 Critérios para diagnóstico oficial do diabete melito. Tabela 2 - Classificação etiológica do diabete sacarino. Tabela 3 Quadro esquemático dos grupos de estudo. Tabela 4 - Protocolo de irradiação dos espécimes. Tabela 5 - Evolução da glicemia sangüínea no grupo I (4 dias) durante o estudo. Tabela 6 Evolução da glicemia sangüínea no grupo II (7 dias) durante o estudo. Tabela 7 Evolução da glicemia sangüínea no grupo III (15 dias) durante o estudo. Tabela 8 Valores médios dos níveis de glicose, uréia e creatinina encontrados na urina dos animais (mg/dl). Tabela 9 Graus de evolução na cicatrização atribuídos na análise histológica das amostras das lesões dorsais dos espécimes diabéticos. Tabela 10 Valores da taxa de glicose encontrada na urina (mg/dl). Tabela 11 Valores da taxa de uréia encontrados nas amostras de urina (mg/dl). Tabela 12 Valores da taxa de creatinina encontrados na urina (mg/dl). Tabela 13 Valores da taxa de glicose, uréia e creatinina obtidos na análise da urina de espécimes controle não-diabéticos

13 FIGURAS: Figura 1 - Fórmula estrutural do Streptozotocin. Figura 2 - Fotomicrografia do corte histológico da pele da região dorsal de rato. H&E.100x. Figura 3- Diagrama esquemático do Laser de He-Ne mostrando seus componentes básicos. Figura 4 - Gráfico demonstrativo da evolução da glicemia sangüínea no grupo I (4 dias) no decorrer do estudo em função do tempo. Figura 5 - Gráfico demonstrativo da evolução da glicemia sangüínea no grupo II (7 dias) em função do tempo durante o estudo. Figura 6 - Gráfico demonstrativo da evolução da glicemia sangüínea no grupo III (15 dias) em função do tempo no decorrer do estudo. Figura 7 Espécime alojado na gaiola metabólica para coleta da urina no biotério do IP&D. Figura 8 Lesão epitelial dorsal no rato (momento da cirurgia). Figura 9 - Lesão dorsal do espécime controle no período de cicatrização correspondente a 7 dias após a cirurgia. Presença de crosta ressecada. Figura 10 Lesão dorsal do espécime tratado no período de cicatrização correspondente a 7 dias após a cirurgia. Ulceração avermelhada e úmida demonstrando descolamento de crosta ressecada. Figura 11 Ampla lesão epitelial dorsal 15 dias após a cirurgia. Espécime controle. Figura 12 - Lesão epitelial dorsal 15 dias após a cirurgia com reparação quase completa. Espécime tratado. Figura 13 Fotomicrografia da lâmina da lesão na região dorsal de rato diabético. Figura 14 Fotomicrografia da área superficial da lesão em reparação de espécime do grupo tratado no período de cicatrização correspondente a 7 dias. Figura 15 Fotomicrografia de corte histológico da área de reparação superficial de espécime controle

14 LISTA DE ABREVIATURAS cw continuous wave Laser - Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation PM Peso Molecular STZ Streptozotocin Laser de GaAlAs Laser de Arseneto de Gálio e Alumínio TEM 00 Transverse Electromagnetic Mode DE densidade de energia DP densidade de potência Laser de Nd:YAG Laser de Neodímio: Yttrium Aluminum e Garnet bfgf basic fibroblast growth factor COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal IP&D Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento UNIVAP Universidade do Vale do Paraíba H&E Hematoxilina e Eosina

15 1 1 INTRODUÇÃO

16 2 1 INTRODUÇÃO O diabete melito ou diabete sacarino é uma alteração orgânica que tem sido observada há algum tempo. Indivíduos que sofrem do diabete melito apresentam uma série de manifestações clínicas sintomáticas que se originam como complicações de situações que seriam muitas vezes de simples solução para indivíduos que não apresentam a doença, como deficiência na cicatrização de feridas. A prevalência do diabetes mellitus tem aumentado dramaticamente ao redor do mundo nas últimas décadas. Em 2002, aproximadamente 16 milhões de americanos eram portadores de diabete nos Estados Unidos, e dentre estes, 90% eram diagnosticados como portadores de diabete melito tipo II. A cada ano, cerca de novos indivíduos americanos são diagnosticados como portadores do diabete. Muitos outros permanecem em estado pré-diabético ou resistentes à insulina orgânica produzida pelo pâncreas. Indivíduos com histórico familiar de diabete, obesos, com idade acima de 45 anos, hipertensos, com níveis de colesterol HDL (High Density Lipoprotein) maior ou igual a 35 mg/dl ou com níveis de triglicérides maior ou igual a 250 mg/dl, e com história pregressa de diabete gestacional constituem um grupo de risco para o desenvolvimento do diabete tipo II. Atualmente a incidência de adolescentes e crianças que desenvolvem o diabete tem aumentado muito; tal fato indica a necessidade de maior atenção e cuidados a fim de que esta enfermidade possa ser diagnosticada precocemente, controlada e prevenida (BAILES, 2002). Embora muitos pacientes portadores de diabete melito possam alcançar níveis adequados de glicemia sangüínea com uma dieta de ingestão controlada de carboidratos, redução de peso, prática constante de exercícios físicos, medicação oral e insulinoterapia, quando necessária, pesquisadores e especialistas hoje se preocupam em prevenir, postergar e amenizar a sintomatologia clínica dos efeitos proporcionados pelo diabete, principalmente no grupo de pacientes que não conseguem controlar a hiperglicemia sangüínea. Desde que Theodore Maiman produziu o primeiro feixe de laser pulsado de rubi em 1960 e com a subseqüente descoberta dos laseres de He-Ne e de Argônio, estudos têm procurado estabelecer parâmetros que permitam diversas aplicações dos laseres. Atualmente, além de serem utilizados em dispositivos militares, em leitores de códigos de barras nos supermercados e em aparelhos que determinam distâncias,

17 3 em aparelhos tocadores de CD, os laseres têm sido aplicados também como auxiliares de diagnósticos e em terapias na medicina. O Laser ou Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation é uma radiação eletromagnética não ionizante,com algumas propriedades peculiares que a tornam capaz de propiciar efeitos biomoduladores sobre organismos vivos. Dentre estas propriedades encontram-se a coerência espacial e temporal, a monocromaticidade e a direcionalidade. Resultados específicos podem ser obtidos pelo fato das ondas da radiação do feixe de laser se propagarem com coerência de fase no tempo e espaço, por proporcionarem ao operador a opção de selecionar um único comprimento de onda a ser aplicado e por fornecerem alta concentração de energia em uma determinada região. Na fonte de laser, a luz é produzida pela emissão estimulada de radiação, quando um fóton incidente interage com um átomo previamente excitado. Ao atingir um tecido, a radiação laser pode ser refletida, absorvida, transmitida ou espalhada. A absorção da radiação laser é realizada de maneira seletiva pelos tecidos, onde cada comprimento de onda exercerá em efeito particular sobre tecidos variados, atingindo diferentes profundidades de penetração. A terapia com laser tem se mostrado como um recurso promissor de ampla aplicação na clínica médica, melhorando o tratamento de diversas alterações. Suas aplicações são muito divulgadas hoje na oftalmologia, no caso de cirurgias de catarata, miopia e astigmatismo oculares; na dermatologia, para diminuição de pequenas lesões vasculares e remoção de manchas na pele; na odontologia, para diagnóstico e remoção de cáries dentárias; e em muitas outras especialidades. Estudos in vitro e in vivo realizados por MESTER desde inícios dos anos 70, indicam que o laser ao interagir com tecidos biológicos pode proporcionar efeitos adversos. A terapia com a radiação laser favorece um efeito modulatório de processos biológicos sobre tecidos. Enquanto a aplicação de uma densidade de energia elevada exerce efeito térmico e inibitório sobre células, a terapia com laser de baixa potência pode ser estimulante. A aplicação do laser para estimular a cicatrização de ulcerações é recomendada (MESTER et al., 1985). Este trabalho é uma colaboração na busca de especificar os parâmetros mais efetivos na aplicação do laser de baixa potência como fator coadjuvante para a diminuição do tempo de cicatrização de feridas e atenuação da sintomatologia causada por estas lesões em indivíduos portadores de diabete melito.

18 2 REVISÃO DA LITERATURA 4

19 5 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 O Pâncreas e a insulina O pâncreas é uma glândula de secreção dupla; enquanto esta glândula secreta o suco pancreático que será destinado ao duodeno com importante função digestiva, outras substâncias também são secretadas e encaminhadas para o sangue. Estas substâncias, como a insulina e o glucagon, têm no organismo a função hormonal. Esta dupla função do Pâncreas só é possível devido a um conjunto de células localizado entre os ácinos glandulares do pâncreas. Este grupamento celular encontra-se distribuído de maneira difusa por toda a glândula, ocupando aproximadamente 2% do seu peso, recebendo a denominação de Ilhota de Langerhans. As ilhotas de Langerhans contêm diversos tipos de células com funções secretórias distintas: as células α, secretoras do glucagon, as células β, secretoras de insulina, as células δ, secretoras de somatostatina, as células G, secretoras de gastrina e as células ϕ, secretoras de polipeptídeo pancreático. As células β, secretoras de insulina, constituem a maior parte da porção celular e encontram-se localizadas na área central de cada ilhota. As células α, δ, G e ϕ, localizam-se em volta das células β, secretoras de insulina. Cada ilhota possui um rico sistema vascular composto por arteríolas e capilares e uma inervação simpática e para-simpática (CISTERNAS, 1999). A insulina é um hormônio de estrutura polipeptídica resultante de dois precursores, a pré-pró-insulina e a pró-insulina. No organismo normal, a insulina é constantemente secretada. O aumento ou a diminuição da secreção desta substância ocorre segundo alguns estímulos. A glicose, os aminoácidos, alguns hormônios (como o glucagon, a adrenalina e a noradrenalina) e neurotransmissores que se fixam aos receptores das células β pancreáticas (como a Acetilcolina) estimulam a secreção de insulina. A hiperglicemia é o principal fator estimulante da secreção de insulina no organismo. Algumas drogas agem inibindo as células β pancreáticas, tornando-se depressoras da secreção de insulina. É o caso do diazóxido, da clorotiazida, do aloxano e da estreptozotocina. Estas drogas são utilizadas em experimentações animais como diabetogênicas (CISTERNAS, 1999).

20 6 A insulina secretada é degradada em quase todos os tecidos do organismo. O fígado e os rins são responsáveis pela degradação de 80% da insulina secretada. Esta degradação só é possível segundo a atuação de enzimas específicas. Diversos tecidos e células do organismo, como os tecidos muscular, adiposo, hepático, ósseo, a pele, os fibroblastos, os leucócitos, entre outros necessitam da insulina. Sua função principal é atuar como estimulante, podendo-se citar o caso do estímulo ao transporte de glicose através da membrana celular. A insulina aumenta também a oxidação da glicose, a glicogênese e a lipogênese, a síntese de DNA e de RNA. Entretanto, a insulina pode atuar também como um inibidor dos processos de glicogênese e lipogênese. A grande importância da insulina está em sua ação sobre os tecidos adiposo, muscular e hepático. No tecido adiposo, a insulina atua favorecendo a captação de glicose pelas células adiposas, aumentando a síntese de ácidos graxos e triglicérides. Em contrapartida, a insulina inibe a lipólise das gorduras. Desta forma, o organismo sob efeito da insulina é capaz de armazenar maior massa de tecido gorduroso, e de reduzir a taxa de ácidos graxos, triglicerídeos e corpos cetônicos presentes no sangue circulante. No tecido muscular a insulina atua facilitando a passagem da glicose do sangue para o interior das fibras musculares, armazenada sob a forma de glicogênio, atuando também no aumento da glicólise e da oxidação de glicose e piruvirato. Há também o estímulo da síntese protéica e a formação de alguns aminoácidos a partir de carboidratos. No fígado, a insulina não atua na passagem da glicose através da membrana plasmática celular; entretanto, a insulina atua controlando enzimas envolvidas na glicólise hepática, estimulando a mesma. Neste órgão, a insulina age estimulando a síntese do glicogênio e de ácidos graxos. Um outro efeito da insulina no fígado é a estimulação da síntese de colesterol e principalmente a regulação da taxa plasmática de glicose, a qual é monitorada pela insulina (CISTERNAS, 1999). A insulina exerce, portanto, importante papel no controle da glicemia sangüínea, cujos valores médios devem ser mantidos constantes, a fim de que o metabolismo dos tecidos que não dependam diretamente da insulina seja mantido sob quantidade de glicose suficientemente fornecida por difusão.

21 7 2.2 Diabete sacarino Definição O pâncreas endócrino pode ser acometido de dois distúrbios: a hipersecreção de seus hormônios ou a deficiência nesta secreção. Uma deficiência na secreção de insulina pelo pâncreas endócrino originará uma hiperglicemia, ou seja, aumento da taxa de glicose presente no sangue circulante. O diabete melito é uma alteração proveniente da diminuição da secreção de insulina ou mesmo da ausência total da secreção desta substância, ou ainda da diminuição da ação deste hormônio a nível periférico tecidual. Fatores diversos caracterizam o quadro do diabete melito permitindo sua caracterização como uma síndrome (DAVIDSON, 2001). Podem ser observadas alterações no metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas decorrentes da diminuição da secreção da insulina e alterações vasculares que ocorrem em pequenos e grandes vasos, denominadas micro e macroangiopatias, respectivamente. Algumas complicações podem aparecer também no sistema nervoso autônomo e periférico. Uma outra alteração decorrente do diabete que pode ser utilizada para fins de diagnóstico da doença é a hiperglicemia sangüínea. A hiperglicemia sangüínea é um fator presente em todos os casos de diabete e o nível da glicose no sangue pode ser um indicativo da evolução da doença, além da cetoacidose diabética. Como critério para diagnóstico do diabete melito em humanos, utilizam-se os itens descritos na tabela a seguir (DAVIDSON, 2001).

22 8 Tabela 1 Critérios para diagnóstico oficial do diabete melito. 1. Sintomatologia de diabete presente e concentração de glicose plasmática a qualquer momento do dia superior ou igual a 200mg/dl. 2. Glicose plasmática em jejum de 8 horas superior ou igual a 126 mg/dl. 3. Glicose plasmática de 2 horas superior ou igual a 200 mg/dl durante o Teste de Tolerância à glicose oral. Na ausência de hiperglicemia com descompensação metabólica aguda, os critérios acima descritos devem ser confirmados pela repetição do teste em outro dia. Tabela baseada na descrição de Mayer Davidson (2001) Etiologia e Classificação Uma classificação etiológica recentemente proposta pela Organização Mundial de Saúde (in DAVIDSON, 2001) define o diabete como um distúrbio que pode ser congênito, auto-imune e idiopático ou pode ser adquirido ao longo do tempo. A tabela 2 indica uma classificação etiológica do diabete sacarino. Tabela 2 - Classificação etiológica do diabete sacarino. Tipos de Diabete I II Fatores etiológicos a) Destruição primária auto-imune das células β-pancreáticas. b) Idiopática. Devido a resistência à insulina no organismo ou secreção inadequada de insulina. Outros tipos: gestacional, induzido por drogas, devido a defeitos genéticos da função das células β-pancreáticas, devido a defeitos genéticos na ação da insulina, devido a endocrinopatias, a infecções e a doenças do pâncreas exócrino.

23 Manifestações clínicas O diabete tipo I, também denominado diabetes Juvenil pode apresentar-se na forma auto-imune ou na forma idiopática. A acidose pode ser a primeira manifestação clínica desta doença auto-imune que acomete com maior freqüência crianças e jovens. O diabete tipo I tem início rápido, com sintomatologia de perda de peso, poliúria e polidipsia. Estes indivíduos portadores do diabete podem relatar cãibras nas pernas à noite e visão turva. Podem estes também apresentar moderada hiperglicemia no jejum e esta condição pode ser alterada sob situações de estresse ou em caso de infecções, de forma que a hiperglicemia se torne mais severa que a anteriormente apresentada. Os indivíduos portadores do diabete melito tipo I são dependentes de insulinoterapia, pois após ocorrer uma diminuição considerável na secreção de insulina nos seus organismos, decorrente da destruição das células β- pancreáticas, estes indivíduos tornam-se resistentes à insulina. A destruição das células β-pancreáticas é lenta. Acredita-se que neste caso o indivíduo tenha predisposição genética para o desenvolvimento do diabete e este fator pode ser favorecido por condições ambientais, pois a prevalência do diabete tipo I apresenta grande variação geográfica. Os indivíduos incluídos nesta classe da doença em geral são magros e podem apresentar outras síndromes auto-imunes como a doença de Addison e o Vitiligo (BANDEIRA et al, 1998; DAVIDSON, 2001; BAILES, 2002). Uma forma menos comum no diabete tipo I é a de causa idiopática e caráter hereditário. Neste caso, o paciente apresenta a cetoacidose diabética, onde a hiperglicemia é favorecida pelo decréscimo na secreção de insulina e não por resistência orgânica à mesma. O diabete tipo II é uma forma bastante comum do diabete que acomete mais de 7% da população adulta brasileira. Atualmente a incidência de diabete tipo II em crianças e adolescentes têm aumentado muito. Esta forma da doença tem etiologia variada. Acredita-se que indivíduos obesos, com idade acima de 45 anos, portadores de hipertensão (pressão arterial superior ou igual a 140/90 mmhg), com níveis de colesterol de alta densidade HDL maiores ou iguais a 35 mg/dl ou com valores de triglicérides superiores a 250 mg/dl, sedentários e com história familiar da doença tenham maior probabilidade de desenvolver o diabete tipo II que indivíduos que praticam esportes e ingerem menor quantidade de carboidratos. Os países em desenvolvimento nos quais adolescentes e adultos praticam pouca atividade física e

24 10 ingerem calorias em demasia são as regiões mais afetadas por esta forma de diabete.. Sabe-se que no diabete tipo II não ocorre a destruição das células β-pancreáticas e os indivíduos não apresentam causas identificadas para esta doença. Nesta forma da doença ocorre uma secreção insuficiente de insulina quando comparada à necessidade desta substância e associada à resistência do organismo à mesma. Pessoas portadoras de diabete tipo II são obesas em 80 % dos casos relatados, apresentam hiperglicemia e não demonstram um quadro clínico característico do diabete descontrolado, fator este que dificulta o diagnóstico da doença. Neste caso, a doença pode ser controlada por uma dieta com ingestão diminuta de carboidratos, redução de peso e, em alguns casos, administração de fármacos (BANDEIRA et al, 1998; DAVIDSON, 2001; BAILES, 2002). Além das formas anteriormente mencionadas, o diabete pode estar associado à gestação, surdez, à síndrome de Wolfram (caracterizada por diabete insípido, hipogonadismo, atrofia óptica e surdez neural), à idade com predisposição genética, aos processos patológicos que atinjam o pâncreas, às infecções, aos tumores endócrinos e às drogas como a fenitoína e o ácido nicotínico Complicações crônicas A hiperglicemia característica do indivíduo portador do diabete é apenas uma das diversas complicações que esta doença pode trazer. A partir do momento que a glicemia sangüínea esteja controlada por utilização de fármacos, injeção de insulina ou por redução significante da ingestão de carboidratos, as preocupações inerentes aos indivíduos portadores de diabete focalizam o controle e a diminuição das complicações crônicas que esta doença proporciona. Doenças de grandes vasos, de pequenos vasos e o envolvimento do sistema nervoso autônomo e periférico são as três grandes complicações que ocorrem no diabete. Estas três complicações do diabete se manifestam clinicamente como angina, infartos e acidentes vásculocerebrais, retinopatia, nefropatia e neuropatia diabética (GONÇALVES et al, 1996; BANDEIRA et al, 1998; DAVIDSON, 2001). A hipertensão é uma alteração que ocorre em grande parte dos indivíduos diabéticos não dependentes de insulina com freqüência duas vezes maior que na população geral. Nos dependentes de insulina a hipertensão atinge aproximadamente 33% dos indivíduos portadores de diabete tipo I. Na realidade, fatores como a

25 11 obesidade e o sedentarismo associados à hipertensão e à elevação do colesterol, favorecem o desenvolvimento de doenças vasculares como a coronariopatia, insuficiência cardíaca e as doenças cerebrovasculares. A doença microvascular diabética é desenvolvida pelo espessamento das membranas basais, originando um aumento da permeabilidade destas membranas. A microangiopatia diabética origina alterações significantes nos rins e na retina. A prevalência das complicações microvasculares da retinopatia, nefropatia e neuropatia nos indivíduos portadores de diabete tipo II é menor que nos portadores de diabete tipo I (GONÇALVES et al, 1996; DAVIDSON, 2001). O diabete pode causar oftalmopatias, devido à hiperglicemia sangüínea. Para que seja promovido um equilíbrio entre as concentrações de glicose do cristalino e do humor aquoso que o cerca, ocorrem movimentos da água local, causando a alteração da forma do cristalino com conseqüente defeito na visão. Indivíduos com diabete parecem ter também maior probabilidade de formação de catarata no cristalino. As alterações que ocorrem na retina dos indivíduos diabéticos devem-se a distúrbios na circulação local com presença de micro-hemorragias e pequenos aneurismas locais (DAVIDSON, 2001). A neuropatia diabética pode ser autônoma ou periférica. Esta é uma complicação muito comum no diabete e uma das maiores causas de morbidade e mortalidade a longo prazo. A neuropatia autônoma envolve esôfago, estômago, intestino, vesícula biliar e trato gênito-urinário. Tais alterações manifestam-se como náuseas, vômitos, anorexia, refluxo gástrico, diarréia e incontinência fecal, impotência e dificuldade de completo esvaziamento da bexiga ao urinar. A neuropatia periférica é manifestada pela dor, pela neuropatia motora, e precede o aparecimento de úlceras nos pés dos indivíduos diabéticos e de cãibras nas pernas (DAVIDSON, 2001; BANDEIRA et al, 1998). Muitas complicações do diabete estão relacionadas a um defeito generalizado no tecido conjuntivo, proporcionado provavelmente por distúrbios no metabolismo do colágeno. Acredita-se que esta situação ocorra pelo fato do colágeno ser a principal proteína componente do tecido conjuntivo. Dentre estas complicações encontram-se a deficiente cicatrização de feridas, diminuição da massa e formação óssea e alterações na espessura da membrana vascular (SPANHEIMER et al, 1988).

26 Fármacos Diabetogênicos Algumas drogas agem inibindo as células β pancreáticas, tornando-se depressoras da secreção de insulina. É o caso do diazóxido, da clorotiazida, do Aloxano e do Streptozotocin. Estas drogas são utilizadas como diabetogênicas em experimentações animais. Enquanto procuravam por um antibiótico produzido pelo Streptomyces, pesquisadores encontraram uma substância derivada da fermentação do Streptomyces achromogenes, variedade 128 marrom. O nome que a nova substância recebeu foi Streptozotocin (STZ), indicando a origem do Streptomyces e o azo indicando a presença de nitrogênio em sua fórmula. O STZ mostrou inicialmente um significativo potencial antimicrobiano de amplo espectro. Posteriormente, a droga apresentou-se eficaz no combate a tumores. Algum tempo depois, foi descoberto um elevado grau de toxicidade no Streptozotocin, de modo que este já não era mais indicado como droga antimicrobiana. Um efeito como droga indutora de hiperglicemia foi descoberto em estudos de tumores em Murinos (RAKIETEN et al, 1963; EVANS et al, 1965; apud WEISS, 1982). Posteriormente, estudos realizados em macacos Rhesus indicaram o STZ como uma droga de elevado potencial diabetogênico, promovendo o diabete por período indeterminado e com suas manifestações clínicas, inclusive a cetoacidose característica no caso da presença da doença. O STZ demonstrou ainda rápida degranulação das células β pancreáticas com ausência de necrose em estudos histológicos do tecido pancreático em animais. O efeito diabetogênico do STZ não está presente em porcos da Índia e este efeito só ocorre em coelhos se forem administradas altas doses da substância (RAKIETEN et al, 1963; ARISON et al, 1967; CARTER et al, 1971; apud WEISS, 1982). A Figura 1 a seguir indica a fórmula estrutural do Streptozotocin. O peso molecular desta substância é de aproximadamente 265.

27 13 Figura 1 Fórmula estrutural do Streptozotocin. 2.3 A pele: Características citológicas da epiderme e da derme A pele constitui o maior órgão do corpo humano e recobre toda a superfície do corpo. A pele contém uma porção de origem ectodérmica, a epiderme, e uma porção de origem mesodérmica, a derme. Além de proteger o organismo da perda de água por evaporação, a pele contém múltiplas terminações nervosas importantes na transmissão de estímulos vindos do meio ambiente; dentre as funções exercidas pela pele estão também a termoregulação e a proteção contra os raios ultravioletas Epiderme A epiderme é constituída por um epitélio pavimentoso estratificado queratinizado. O epitélio contém células que estão próximas, em íntimo contato, unidas entre si por um complexo juncional e por desmosomas. Além de revestirem toda a superfície externa do corpo, as células do epitélio formam a porção secretora das glândulas cutâneas. O epitélio está separado da derme subjacente por uma camada de espessura variável, constituída de colágeno e proteoglicanas, denominada lâmina basal. Acredita-se que a lâmina basal favoreça a diferenciação e proliferação

28 14 das células epiteliais que estão em contato com ela, além de atuar como barreira seletiva à movimentação de substâncias (ROSS e ROMWELL, 1993). O epitélio que constitui a epiderme é denominado pavimentoso por conter células superficiais achatadas, que possuem a largura e o comprimento com medidas superiores à da altura. Este tecido é ainda formado por camadas ou estratos, daí a denominação de estratificado. A camada basal situa-se imediatamente acima da lâmina basal, constituída de células cúbicas. O núcleo destas células é ovalado, o nucléolo proeminente, e o citoplasma contendo numerosas organelas. As células da camada basal são responsáveis pela produção de queratinócitos. Esta camada contém ainda melanócitos, células de Langerhans e células de Merkel (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999). Acima da camada basal, encontra-se a camada espinhosa. Esta camada é composta por queratinócitos, células escamosas que estão em contato devido a pequenos prolongamentos citoplasmáticos contendo tonofibrilas. As tonofibrilas associadas aos desmossomos mantêm a coesão entre as células da epiderme. A camada espinhosa é a principal responsável pela produção de queratina no epitélio queratinizado (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999). A camada granulosa, situada mais superficialmente na epiderme, é formada por células que apresentam achatamento de suas formas, fato este que pode ser mais evidente à medida que estes células se aproximam da superfície livre da epiderme. As células granulosas possuem em seus citoplasmas grânulos basófilos de queratohialina. À medida que estas células envelhecem, o núcleo sofre processo de necrose e o citoplasma apresenta-se densamente composto por querato-hialina. Outra camada presente na epiderme é a lúcida, composta por células eosinófilas, achatadas, hialinas com ausência de núcleos e organelas citoplasmáticas. Estas duas últimas estruturas sofreram digestão pelos lisossomos das células epiteliais. Estas células são precursoras da queratina que formará a camada mais superficial e acelular do epitélio estratificado, a camada córnea. A camada córnea possui espessura variável composta por células pavimentadas, necróticas e com núcleo ausente, cujos citoplasmas mostram-se repleto de queratina (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999).

29 Derme A derme, tecido situado abaixo da epiderme, é composta por tecido conjuntivo, que possui a função de sustentação e nutrição do epitélio. Na região da derme podem ser observadas também estruturas ectodérmicas anexas como ductos de glândulas. A derme pode ser dividida em derme papilar e derme reticular. A derme papilar está situada abaixo do epitélio apresentando pequenos vasos sanguíneos e terminações nervosas; bem como um tecido conjuntivo frouxo, interposto às formações papilares proeminentes do epitélio sobrejacente. Na porção subjacente à derme papilar, o tecido conjuntivo apresenta um colágeno denso com fibras grossas entremeadas à elastina, ordenadas de forma paralela à superfície da epiderme. Além das fibras colágenas e elásticas, o tecido conjuntivo da derme contém fibras reticulares e uma variedade de células. As células que estão constantemente presentes na derme são os fibroblastos, e alguns histiócitos, mastócitos e plasmócitos. Em algumas situações, como no caso de inflamação, o tecido conjuntivo apresenta um aumento das células móveis, como os histiócitos e mastócitos. Outras células como os neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos também tornam-se presentes. Os fibroblastos são as células responsáveis pela produção de fibras colágenas, elásticas e reticulares, além da substância fundamental amorfa extracelular. No tecido em reparação, o fibroblasto apresenta uma basofilia no seu citoplasma devido ao acúmulo de retículo endoplasmático granular. Apresenta também núcleo ovalado e um grande nucléolo. Quando jovem, esta célula tem morfologia arredondada, sendo que a célula madura apresenta aspecto fusiforme. Uma substância amorfa composta de proteoglicanas e glicosaminoglicanas circunda a porção celular e as fibras na derme. Enquanto a epiderme não tem em vasos sanguíneos, a derme apresenta um sistema vascular desenvolvido. Na região subjacente à derme reticular situa-se o tecido adiposo (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999). Segundo JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1999, a pele apresenta uma rica inervação não mielínica que atua sobre o fluxo vascular e anexos cutâneos, apresenta também um sistema aferente de inervação mista (mielinizada e não mielinizada) e numerosas terminações nervosas, responsável pelas sensações de dor, temperatura, pressão e tato. Dentre estas terminações sensitivas encontram-se os corpúsculos de Pacini e de Meissner.

30 16 A figura 2 apresentada a seguir é a fotomicrografia de um corte da pele da região dorsal de rato. A figura apresenta um epitélio pavimentoso estratificado queratinizado sobre a derme composta de tecido conjuntivo característico contendo fibroblastos e fibras colégenas densamente coradas, orientadas paralelamente à superfície. Estão presentes ductos glândulares, folículos pilosos e alguns vasos sanguíneos. Figura 2 - Fotomicrografia do corte histológico da pele da região dorsal de rato. Observa-se o epitélio pavimentoso estratificado queratinizado ( ) sobrejacente à derme conjuntiva ( ) H.E. 100x.

31 O processo de cicatrização das lesões no organismo vivo. Ao receber estímulos endógenos ou exógenos, o organismo vivo desenvolve uma resposta protetora que promoverá a eliminação do fator irritante. Esta resposta ocorre em nível dos tecidos conjuntivos vascularizados, recebendo a denominação de inflamação. A inflamação, que pode ser aguda ou crônica, está intimamente relacionada à reparação do dano causado pelo agente agressor e a eliminação deste agente (KUMAR, CONTRAN e ROBINS, 1994; BECKER, 1997). A inflamação aguda apresenta início brusco, intensidade máxima e evolução rápida, durando apenas alguns dias. Ao contrário desta, a inflamação crônica possui longa duração (meses ou anos), intensidade moderada e início lento. No processo de reparo, enquanto o agente agressor é destruído, uma seqüência de eventos ocorre no intuito de substituir o tecido lesado através da regeneração de células parenquimatosas nativas ou por proliferação de um tecido cicatricial fibroblástico ou mesmo pela associação destes dois eventos. A inflamação aguda apresenta alterações no calibre vascular, em conseqüência ocorrem variações no fluxo sangüíneo aumentando-o, alterações na estrutura da microvascularização, migração de leucócitos e acúmulo destes no local da lesão, proporcionando então o desenvolvimento dos quatro sinais clássicos da inflamação aguda: tumor, rubor, calor e dor. A vasodilatação causa o rubor visível no local agredido. O aumento do fluxo sangüíneo originado favorece o calor local. Na seqüência destes eventos, com o aumento da permeabilidade vascular ocorre um extravasamento de líquido rico em proteínas (exsudato) e os vasos tornam-se concentrados de hemácias. Os leucócitos exibem nesta fase do processo inflamatório uma tendência a se aderirem ao endotélio das paredes dos vasos. Após a marginação leucocitária, estas células migram para o tecido intersticial por quimiotaxia. Os neutrófilos são os primeiros a migrarem, e nas primeiras quarenta e oito horas, o infiltrado inflamatório é predominantemente composto por estes. Após estas primeiras quarenta e oito horas de duração do estímulo, o infiltrado passa a ser predominantemente composto por monócitos, devido à vida curta dos neutrófilos. Os leucócitos exercem a fagocitose sobre os agentes agressores, promovendo a morte dos microorganismos. Entretanto, muitas vezes, este processo origina a liberação de produtos para o meio extracelular, os quais podem ser causadores de lesões endoteliais e sobre os tecidos locais, aumentando o efeito inflamatório inicial. Neste

32 18 caso, o leucócito torna-se o próprio agressor (KUMAR, CONTRAN e ROBINS, 1994; BECKER, 1997). A inflamação aguda não reparada por persistência do agente agressor ou por qualquer outra interferência no processo de restauração das funções normais, pode originar uma inflamação crônica. Uma inflamação crônica pode ter início por reação a agentes lesivos menos agressivos que aqueles atuantes nos processos agudos. Algumas vezes, em processos de inflamação crônica o organismo estabelece reações imunes contra tecidos do próprio organismo, originando as doenças auto-imunes. As inflamações crônicas se caracterizam por infiltrado inflamatório de células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), destruição tecidual e fibrose. Diferentemente das inflamações agudas, os processos crônicos não provocam tumor ou rubor local, nem calor ou dor. Os processos inflamatórios manifestam-se com presença de febre e leucocitose, ou seja, aumento do número de leucócitos circulantes (KUMAR, CONTRAN e ROBINS, 1994; BECKER, 1997). Após sofrer uma agressão, o organismo inicia um processo de reparo no local da lesão. No reparo por tecido conjuntivo, a migração e a proliferação de fibroblastos e células endoteliais ocorrem precocemente na inflamação durante as primeiras 24 horas. Um tecido especializado, denominado tecido de granulação, é formado, caracterizando a cicatrização. O tecido de granulação apresenta aspectos histológicos característicos: intensa proliferação de pequenos vasos sanguíneos e de fibroblastos bem como síntese de colágeno. Novos vasos sanguíneos são originados por brotamento de vasos preexistentes num processo conhecido por angiogênese ou neovascularização. O tecido de granulação apresenta-se edemaciado devido ao extravasamento de hemácias e proteínas pelo endotélio, que se acumulam nos espaços extravasculares. Células como os macrófagos, os neutrófilos, os eosinófilos, os linfócitos e os mastócitos também se encontram presentes neste tecido. No processo de cicatrização das feridas cirúrgicas, os neutrófilos são as primeiras células a aderirem às bordas da lesão. A epiderme sofre espessamento e as células epiteliais crescem ao longo das bordas secionadas da derme. Desta maneira, forma-se no local um epitélio contínuo e delgado subjacente à crosta superficial formada na fase inicial devido à coagulação sangüínea. Estes eventos ocorrem até quarenta e oito horas após a cirurgia. Os macrófagos substituem os neutrófilos por volta das setenta e duas horas após a cirurgia e o tecido de granulação ocupa o espaço lesado. Por volta de cinco dias após a realização da lesão, o tecido de

33 19 granulação no local é característico e a neovascularização é máxima. Embora não haja evidências concretas, acredita-se que os fatores de crescimento são provavelmente os responsáveis pela angiogênese e pela formação do tecido de granulação (fibroplasia) no local de reparo. As fibras colágenas preenchem a área lesada e a queratinização na superfície do epitélio formado já pode ser observada. Durante a segunda semana, pode-se observar um acúmulo de colágeno e uma proliferação de fibroblastos no local. O infiltrado inflamatório e a vascularização aumentada tendem a desaparecer. Ao final de trinta dias, a cicatriz constitui um tecido conjuntivo recoberto por epiderme normal, com ausência de células inflamatórias (KUMAR, CONTRAN e ROBINS, 1994; CLARK, 1985) Alterações na cicatrização em conseqüência do diabete sacarino Evidências clínicas indicam que indivíduos portadores de diabete apresentam um conjunto de sintomas clínicos e, por esta razão, o diabete é considerado uma síndrome e não uma doença em particular. O grupo de indivíduos portadores de diabete apresenta maior deficiência de cicatrização e amputação de membros inferiores que indivíduos saudáveis. A deficiente cicatrização nos portadores de diabete ocorre tanto em indivíduos que possuem baixa secreção de insulina como nos indivíduos insulino-resistentes. Acredita-se que a administração de insulina melhore a cicatrização em diabéticos que têm baixa secreção desta substância, mas não naqueles que são obesos e possuem resistência à insulina. Para estes indivíduos, acredita-se que o controle de peso seja o mais indicado na melhoria da cicatrização de feridas. Indivíduos portadores de diabete apresentam ainda uma deficiente função leucocitária e uma diminuição na função de fagocitose devido à hiperglicemia, além de diversas anormalidades na microcirculação e na macrocirculação, com alteração na permeabilidade vascular e disfunção endotelial multifatorial. Tais ocorrências justificam a facilidade de disseminação de infecções no organismo portador de diabete e como conseqüência a dificuldade de cicatrização de feridas (GOODSON e HUNT, 1978; 1979; FORTES et al, 1983; 1984; AKBARI e LO GERFO,1999; YOSEF et al, 1999; AIELLO e WONG, 2000). GOODSON e HUNT (1977, 1978, 1979, 1986) realizaram uma seqüência de estudos com ratos diabéticos para verificarem as alterações inerentes a esta síndrome. Este modelo foi selecionado neste trabalho pela semelhança de funcionamento com o

34 20 organismo humano. Em 1978, observaram que a hiperglicemia diabética, com ausência de insulinoterapia, proporciona alteração na cicatrização de feridas. A administração de insulina aos animais numa fase precoce da cicatrização exerceu efeito mais positivo do que numa fase tardia. Em 1979, os mesmos autores associaram a má cicatrização no diabético à deficiência de insulina e à resistência a insulina. A terapia com insulina melhorou a cicatrização em animais que apresentaram deficiência dessa substância, mas tal fato não ocorreu em animais obesos que apresentaram a resistência a ela. Para este grupo foi indicado o controle de peso com o intuito de melhorar a capacidade de cicatrização. O estudo menciona ainda que a propensão ao desenvolvimento de infecções associada ao diabete é favorecida pela deficiência da função leucocitária e de fatores quimiotáticos. Em 1986, estudos ainda realizados por GOODSON e HUNT em ratos demonstraram que existe uma correlação entre a deficiência de cicatrização de feridas por diminuição do acúmulo de colágeno e a obesidade. Animais em idade avançada apresentaram redução da hiperglicemia com dieta pobre em carboidratos e administração de insulina. Entretanto, a cicatrização não foi eficiente nos animais obesos. Embora não tenha sido determinada a causa exata da deficiência da cicatrização no diabético, o estudo sugere que a estrutura do tecido adiposo e o excesso do mesmo eram fatores que também deveriam ser considerados. Estudos realizados por CABALLERO et al (1999) sugerem que indivíduos saudáveis não-diabéticos, mas pertencentes ao grupo de risco para o desenvolvimento do diabete devido ao histórico familiar da doença, apresentaram alterações das funções vasculares na microcirculação cutânea, mesmo num estágio normal de tolerância a glicose. Acreditam, portanto que as alterações vasculares presentes na microcirculação e macrocirculação de indivíduos portadores de diabete tipo II podem, no futuro, ser precocemente diagnosticadas e suas intensidades diminuídas. Atualmente, a microangiopatia cutânea funcional que ocorre em indivíduos portadores de diabete pode ser associada à neuropatia diabética. Acredita-se que a neuropatia diabética seja um fator de risco deflagrador da ulceração característica do pé do diabético (CHABBERT-BUFFET et al, 2003). SPANHEIMER et al (1988) verificaram uma redução significativa na produção de colágeno, em osso parietal e cartilagem articular, de ratos Sprague- Dawley machos, a menos de duas semanas da indução do diabete por injeção de