PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS

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1 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS ANA RUTH SANTIAGO PAOLINETTI DETERMINAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DE CANDIDA SPP DE AMOSTRAS DE HEMOCULTURAS DE PACIENTES ATENDIDOS NO HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO RIBEIRÃO PRETO 2017

2 PROGRAMA DE APRIMORAMENTO PROFISSIONAL SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE COORDENADORIA DE RECURSOS HUMANOS ANA RUTH SANTIAGO PAOLINETTI DETERMINAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE DE CANDIDA SPP DE AMOSTRAS DE HEMOCULTURAS DE PACIENTES ATENDIDOS NO HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP, elaborada no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo USP/ Departamento de Apoio Médico (DAM) Área: Microbiologia médica e controle de infecção hospitalar. Orientador: Prof. Dr. Roberto Martinez. Supervisor Titular: Renata Helena Candido Pocente. RIBEIRÃO PRETO 2017

3 AGRADECIMENTOS Sou grata primeiramente a Deus, pela oportunidade concedida em estar terminando mais um curso que me capacita a seguir meu sonho. Sou grata aos meus pais Marco Aurélio e Marcia, por todo suporte dado, pelo carinho, amor, dedicação e incentivo em buscar um crescimento cada vez maior. Sou grata ao Rodrigo, meu namorado, grande amigo, grande apoiador e incentivador em continuar buscando meus sonhos, sem o seu suporte as coisas seriam mais difíceis. Sou grata ao Programa de Aprimoramento Profissional, pelos supervisores e por todos os aprimorandos do Laboratório de Microbiologia, pelo conhecimento adquirido e pela amizade. Sou grata ao Professor Dr. Roberto Martinez por me orientar neste projeto e colaborar para meu crescimento profissional e para o desenvolvimento da Ciência. Sou grata a Lúcia e a Érika por todo suporte técnico dado para o desenvolvimento deste trabalho, pela paciência e companhia no decorrer de muitas tardes de trabalho.

4 A ciência é a aproximação progressiva do homem com o mundo real Max Planck ( ) 2

5 RESUMO Os fungos podem ser classificados como patogênicos e oportunistas. Um exemplo de oportunista é o gênero Candida spp., cujas principais espécies de interesse médico são: Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida albicans. Elas são grandes causadoras de infecção hospitalar. Existem cinco classes de antifúngicos, são eles os azólicos, as equinocandinas, os poliênicos, os análogos da pirimidina e as alilaminas. Os poliênicos são drogas que atuam na membrana da célula fúngica, um exemplo dessa classe é a Anfotericina B. As equinocandinas atuam inibindo a síntese de β-glucanas, essa classe é composta por três drogas, que são caspofungina, micafungina e anidulafungina. Para a análise de infecções sanguíneas por fungos e seu perfil de sensibilidade, existem métodos laboratoriais como hemocultura, microdiluição em caldo e disco difusão. O presente trabalho buscou determinar o perfil de sensibilidade e a concentração inibitória mínima (CIM) de Candida spp. isoladas de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Para isso foram realizados os métodos de disco difusão e de microdiluição em caldo para cada cepa, testando os antifúngicos Anfotericina B e Anidulafungina. Na microdiluição da Anfotericina B houve uma variação do CIM de 0,06 a 1 µg/ml, com CIM50 de 0,5 µg/ml para todas as espécies e CIM90 de 0,5 µg/ml paras as espécies Candida albicans e Candida parapsilosis, e 1,0 µg/ml para as espécies Candida tropicalis e Candida glabrata. Na microdiluição da Anidulafungina houve uma variação do CIM de 0,007 a 2 µg/ml, com CIM50 de 0,007 µg/ml para as espécies Candida albicans e Candida tropicalis, de 0,03 µg/ml para Candida glabrata e 0,5 µg/ml para Candida parapsilosis. O CIM90 foi de 0,007 µg/ml para Candida albicans, de 0,03 µg/ml para Candida tropicalis, de 0,06 µg/ml para Candida glabrata e de 1,0 µg/ml para Candida parapsilosis. Na disco difusão da Anfotericina B os halos variaram de 12 a 32 mm para Candida albicans, de 15 a 48 mm para Candida tropicalis, de 16 a 29 mm para Candida glabrata e de 15 a 39 mm para Candida parapsilosis. Em vista dos resultados e comparando-os com os pontos de corte do CLSI, conclui-se que todas as cepas se mostraram sensíveis às drogas nas duas metodologias utilizadas. Palavras-chave: Candida spp., Microdiluição em caldo, Disco difusão, Anidulafungina, Anfotericina B. 3

6 ABSTRACT Fungi are organisms that can be classifyed as opportunists or pathogenic, and an example of it is Candida spp., which the main species of medical interest are: Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, and Candida albicans. They are the major causers of hospital infection. There are five groups of antifungals classified as azolics, echinocandins, polyenes, pyrimidine analogs, and allylamines. Amphotericin B is an example of polyenes, which are drugs that act on the fungal cell membrane. The echinocandins act by inhibiting the synthesis of β-glucans, and this class is composed of three drugs called caspofungin, micafungin, and anidulafungin. In order to analyze fungal blood infections and their sensitivity profile, there are laboratory methods such as blood culture, broth microdilution, and disk diffusion. This study aimed to determine the sensitivity profile and the minimum inhibitory concentration (MIC) of Candida spp. isolated from positive blood cultures of patients from the Hospital das Clínicas of the Medical School of Ribeirão Preto. In order to accomplish it, were performed disk diffusion and broth microdilution methods for each strain, testing the antifungal agents Amphotericin B and Anidulafungin. Microdilution of Amphotericin B showed a MIC variation of 0.06 to 1 μg / ml, and a MIC50 of 0.5 μg /ml for all species, MIC90 of 0.5 μg / ml for the species Candida albicans and Candida parapsilosis, and 1.0 μg/ml for the species Candida tropicalis and Candida glabrata. Microdilution of Anidulafungin evidenced a MIC variation between and 2 μg / ml, which MIC50 of μg / ml for the species Candida albicans and Candida tropicalis, 0.03 μg / ml for Candida glabrata, and 0.5 μg/ml for Candida parapsilosis. MIC90 for this antifungal resulted in μg / ml for Candida albicans, 0.03 μg / ml for Candida tropicalis, 0.06 μg / ml for Candida glabrata, and 1.0 μg / ml for Candida parapsilosis. In disk diffusion for Amphotericin B, were formed growth inhibition halos in a range of 12 to 32 mm for Candida albicans, 15 to 48 mm for Candida tropicalis, 16 to 29 mm for Candida glabrata, and 15 to 39 mm for Candida parapsilosis. Given the results and comparing them with the CLSI breakpoints, it is possible to conclude that all strains were sensitive to those tested drugs in both methodologies performed in this study. Key words: Candida spp., Broth microdilution, Disk Diffusion, Anidulafungin, Amphotericin B 4

7 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Tabela 1- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo Tabela 2 Relação entre os 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 3 Relação entre os 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 4 Relação entre os 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão Tabela 5- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo Tabela 6 Relação entre os 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 7 Relação entre os 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 8 Relação entre os 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão Tabela 9- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo Tabela 10 Relação entre os 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo

8 Tabela 11 Relação entre os 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 12 Relação entre os 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão Tabela 13- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 21 isolados de Candida parapsilosis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo Tabela 14 Relação entre os 21 isolados de Candida parapsilosis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 15 Relação entre as diferentes cepas de Candida parapsilosis isoladas de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo Tabela 16 Relação entre os 21 isolados de Candida parapsilosis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão Figura 1- Relação entre as espécies de Candida spp. de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto com a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina Figura 2- Relação entre as espécies de Candida spp. de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto com a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B Figura 3- Comparação entre os métodos de microdiluição em caldo e disco difusão de espécies de Candida spp. de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.39 6

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS µg Micrograma ANVISA ATCC CIM CLSI CRH DMSO EUCAST mg MIC ml mm p/v RPMI SES Agência Nacional de Vigilância Sanitária American Type Culture Collection Concentração Inibitória Mínima The Clinical & Laboratory Standards Institute Coordenadoria de Recursos Humanos Dimetilsulfóxido European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Miligrama Minimum Inhibitory Concentration Mililitro Milímetro Peso/volume Roswell Park Memorial Institute médium Secretaria de Estado da Saúde 7

10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Fungos Candida spp Antifúngicos Poliênicos e Equinocandinas Susceptibilidade do gênero Candida spp Métodos laboratoriais Hemocultura Microdiluição em caldo Disco difusão OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS Amostras de Candida spp Meios de cultura Preparo do inóculo Preparo da Anidulafungina Preparo da Anfotericina B Ensaio de microdiluição em caldo Ensaio de disco difusão Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA

11 1. INTRODUÇÃO 1.1 Fungos Os fungos são microrganismos pertencentes ao Reino Fungi e são classificados como eucariontes por possuírem um núcleo bem delimitado por um envoltório chamado carioteca, dessa forma protegendo o seu material genético. Como característica, possuem parede celular quitinosa e podem ser encontrados como espécies multicelulares, possuindo micélio e hifa, e também como unicelulares, sendo leveduriformes (KHAN et al., 2010). Dividem-se em 4 grandes grupos de importância médica, os quais são os zigomicetos, os ascomicetos, os deuteromicetos e os basidiomicetos (KHAN et al., 2010). São classificados como patogênicos aqueles com potencial de causar doenças em indivíduos imunocompetentes, como por exemplo os gêneros Trichophyton spp., Histoplasma spp., Blastomyces spp., Paracoccidiodes spp., entre outros. Mas existem os classificados como oportunistas por provocarem doenças e infecções generalizadas em indivíduos imunossuprimidos, como exemplo os gêneros Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Fusarium spp. e Candida spp. (CHAKRABARTI, 2005; REEDY et al., 2007). 1.2 Candida spp. O gênero Candida spp. é uma levedura atualmente classificada como um ascomiceto que possui 8 cromossomos, sendo geneticamente diploide. Existem muitas espécies dentro desse gênero, mas as principais que possuem interesse médico são Candida glabrata, Candida dubliniensis, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida tropicalis e Candida albicans, sendo essas grandes causadoras de infecção hospitalar (KHAN et al., 2010; PFALLER and DIEKEMA, 2002). Por ser um fungo oportunista, a Candida spp. pode ser encontrada no organismo dos seres humanos em regiões do corpo como cavidade oral, 9

12 trato gastrointestinal, vagina e pele (SAMARANAYAKE and MACFARLANE, 1990). Dentro do gênero Candida spp., a espécie mais encontrada no corpo é a Candida albicans (ODDS, 1988). Com o avanço da medicina e dos tratamentos de doenças que antigamente eram consideradas fatais às pessoas, aumentaram-se substancialmente os casos de infecções hospitalares causadas por Candida em populações consideradas de risco, como por exemplo pacientes transplantados, pacientes com câncer e aqueles que fazem uso de drogas imunossupressoras (ARENDRUP, 2010). Estudos mostram que infecções sanguíneas causadas por Candida spp. são a quarta causa mais comum nos Estados Unidos e ficam entre as 10 causas mais frequentes na Europa (WISPLINGHOFF et al., 2004; BOUZA and MUÑOZ, 2008). Dentre as espécies deste fungo, a Candida albicans é a mais frequente em causar infecções invasivas, alcançando uma taxa entre 50% a 70% das infecções clinicas (ARENDRUP, 2010), mas isso tem mudado nos últimos anos. Tem sido relatado um aumento das infecções oportunistas causadas por Candida não albicans (DIEKEMA et al., 2002; TRICK et al., 2002; PFALLER et al., 2011). Essa mudança no perfil epidemiológico das candidemias pode ser atribuída por uma seleção de cepas com menor sensibilidade aos tratamentos devido ao uso excessivo dos azólicos, principalmente do fluconazol, tanto para terapêutica quanto para profilaxia (SANGUINETTI et al., 2015). Outros fatores considerados de risco são a utilização de cateteres por tempo prolongado, idade avançada, realização de cirurgias gástricas recentes, utilização de antibióticos e glicocorticoides, diabetes, candidúria e utilização de drogas intravenosas (TORTORANO et al., 2006; TUMBARELLO et al., 2008; PAPPAS, 2006; RODLOFF et al., 2011). A prevalência das espécies de Candida variam, de acordo com estudos de distribuição na população, com a região geográfica. Identificouse que a Candida albicans foi a causadora de infecções sanguíneas mais frequente no norte e centro da Europa e nos Estados Unidos. Já as espécies Candida não albicans foram mais isoladas na Ásia, no sul da Europa e na América do Sul (FALAGAS et al., 2010). 10

13 Dentre as candidemias causadas por não albicans, as espécies que mais se destacam são a Candida glabrata e a Candida parapsilosis, sendo seguida por Candida tropicalis e Candida krusei (CAMPBELL and PALAZZI, 2016). 1.3 Antifúngicos O desenvolvimento de drogas antifúngicas tende a ser mais difícil e complexo em comparação aos outros antimicrobianos devido aos fungos serem eucariotos, assim como as células humanas, e essa semelhança proporcionar maior risco de toxicidade ao indivíduo (ROEMER and KRYSAN, 2014; DENNING and BROMLEY, 2015). Existem cinco classes de antifúngicos os quais atuam em diferentes regiões dos fungos. São eles os azólicos, as equinocandinas, os poliênicos, os análogos da pirimidina e as alilaminas (ROEMER and KRYSAN, 2014; DENNING and BROMLEY, 2015) Poliênicos e Equinocandinas Os poliênicos são drogas que atuam na membrana da célula fúngica causando o rompimento desta. Tratam-se de moléculas orgânicas macrocíclicas que são constituídas de 20 a 40 carbonos em um anel de macrolactona conjugado com um grupo D- micosimina (MAYERS, 2009). Essas moléculas provocam poros na membrana da célula por se ligarem na molécula de ergosterol, provocando sua morte (HOSSAIN and GHANNOUM, 2000; HOSSAIN and GHANNOUM, 2001; ANDES, 2003). Fazem parte dessa classe a Anfotericina B, a Nistatina e a Natamicina. Tratam-se de drogas fungicidas de amplo espectro que são produtos naturais de Streptomyces nodosum, Streptomyces noursei e Streptomyces natalensis, respectivamente (SKLENÁR et al., 2013; LALITHA et al., 2008; FARID et al., 2000). 11

14 A Anfotericina B é uma das drogas recomendadas para o tratamento de infecções causadas por Candida spp., sendo o poliênico mais utilizado para infecções sistêmicas. Por possuir uma má absorção pelo trato gastrointestinal e ser um medicamento hidrofóbico, recomenda-se a administração por via intravenosa. Entretanto causa reações adversas, sendo tóxico aos rins e ao fígado do paciente (ODDS et al., 2003). Isso se deve a uma pequena afinidade entre a droga e a molécula de colesterol no organismo (LEMKE et al.,2005). As equinocandinas atuam inibindo a síntese de β-glucanas, os quais são moléculas constituintes da parede celular fúngica. Essa classe é composta por três drogas, que são caspofungina, micafungina e anidulafungina (SUCHER et al., 2009; MUKHERJEE et al., 2011). São lipopeptídeos semissintéticos derivados de produtos naturais de alguns fungos. A caspofungina é originada da pneumocandina B produzida por Glarea lozoyensis, a micafungina provém da equinocandina B produzida por Aspergillus nidulans variação echinulatus e a anidulafungina é proveniente de uma modificação química de um produto da fermentação de Coleophoma empetri (VAZQUEZ and SOBEL, 2006; ESCHENAUER et al., 2007). Estruturalmente, as equinocandinas são um hexapeptídeo cíclico em que sua atividade antifúngica é determinada pelas diferentes cadeias na posição R5 (VALGUS, 2003; ANDES et al., 2003). São pouco absorvidas pelo trato gastrointestinal por possuíram um alto peso molecular e possuem uma baixa toxicidade por sua ação ser em uma estrutura que não está presente nas células dos seres humanos, não tendo interação medicamentosa (PETRIKKOS and SKIADA, 2007). As três drogas possuem ação fungicida contra Candida spp., sendo a micafungina e a anidulafungina as drogas mais utilizadas para o tratamento de candidíase invasiva. (PAPPAS et al., 2004; AKINS, 2005; ARÉVALO et al., 2003). 12

15 1.4 Susceptibilidade do gênero Candida spp. A susceptibilidade aos antifúngicos varia de acordo com a espécie. Sabe-se que a maioria das cepas das espécies Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis são sensíveis a Anfotericina B, aos azólicos e às equinocandinas (CAMPBELL and PALAZZI, 2016). A espécie Candida glabrata pode ser tratada com Anfotericia B quando se trata de uma candidemia invasiva em criança e muitas cepas dessa espécie são resistentes ao fluconazol. Portanto o tratamento de infecções por C.glabrata com as equinocandinas tem sido amplamente utilizado, mas alguns estudos já mostram que algumas cepas estão resistentes a essa classe de antifúngico (PFALLER et al., 2012; THOMPSON et al.,2008; COSTA-DE- OLIVEIRA et al., 2011; PFEIFFER et al., 2010). A Candida krusei possui resistência intrínseca a fluconazol e demanda altas doses de Anfotericina B por apresentar uma susceptibilidade menor a esta droga (CAMPBELL and PALAZZI, 2016). 1.5 Métodos laboratoriais Hemocultura A hemocultura é um exame microbiológico de fundamental importância para a predição e rastreio de uma infecção sanguínea podendo ser tanto por bactérias quanto por fungos. A presença de microrganismos no sangue pode ocorrer por duas maneiras, uma através da penetração a partir de um foco primário, passando pelo sistema linfático e chegando ao sangue, e a outra através da penetração direta no sangue e isso se dá através de agulhas, cateteres e por outros dispositivos médicos invasivos. 13

16 Para a realização do exame, deve-se coletar de duas a três amostras do paciente quando este estiver apresentando sintomas de fungemia (ou bacteremia) ou sepse. Esta quantidade de amostras é o suficiente para tentar isolar o agente etiológico e para analisar possíveis casos de contaminação de coleta através do número de amostras positivas. O sangue deve ser coletado através de punção venosa um volume de 8 a 10 ml de sangue por frasco, sendo em frascos específicos para aeróbios e se necessário for destinar um frasco para anaeróbios. O processamento das amostras de sangue pode ser feito manualmente, mas essa forma não é a mais indicada por apresentar um maior risco de contaminação. Atualmente, são utilizados sistemas automatizados que diminuem o risco de contaminação e são mais eficientes. Esses sistemas utilizam métodos colorimétricos, fluorescentes ou de pressão. (ANVISA, 2004) Microdiluição em caldo Um teste de sensibilidade deve ser feito para qualquer microrganismo que seja causador de uma infecção, possibilitando a identificação da melhor opção terapêutica. São indicados principalmente para espécies que possam apresentar alguma resistência aos antimicrobianos comumente utilizados (CLSI M27-A3). O método de microdiluição em caldo é um dos Testes de Susceptibilidade ao Antimicrobianos que podem ser realizados nos laboratórios tanto de rotina quanto de pesquisa. É baseado na técnica de diluição seriada do antimicrobiano, mas em uma menor escala, sendo utilizados pequenos volumes. Para sua execução é necessária uma placa de Elisa de 96 poços de fundo chato, para facilitar a observação do crescimento do 14

17 microrganismo. Deve- se incubar a placa, após a inoculação do agente em estudo, em estufa a 35º Celsius por no mínimo 16 horas. A realização da leitura da placa se dá pela identificação da concentração inibitória mínima (CIM) que é feita de maneira visual. Essa metodologia é considera o padrão ouro dentre as técnicas de susceptibilidade de antimicrobianos. Tem como vantagens a economia de reagentes devido a seu menor volume, uma alta reprodutibilidade e o fornecimento de um resultado quantitativo. (ANVISA, 2008) Disco difusão O método de disco difusão é o mais utilizado em laboratórios de rotina. Ele se baseia na difusão do antimicrobiano (antibiótico ou antifúngico) pelo ágar a partir de um disco de papel filtro impregnado com a droga em uma concentração fixa. Para a realização da técnica, deve-se dispensar no máximo 12 discos de drogas diferentes por placa grande (155 mm) ou até 5 discos em placa pequena (90 mm), ambos utilizando como meio o ágar Mueller Hinton, e isso deve ser feito após a semeadura do inóculo. Deve-se incubar em estufa a 35º Celsius por 18 a 24 horas e então as leituras são realizadas. Os resultados são identificados através da medição em milímetros do diâmetro dos halos formados devido ao não crescimento do microrganismo naquela região. Isso se relaciona diretamente ao perfil de sensibilidade do agente e a velocidade de difusão da droga no ágar. São utilizados critérios padronizados para a determinação da sensibilidade do agente testado frente aos antimicrobianos. As padronizações mais utilizadas foram estabelecidas pelo CLSI (The Clinical & Laboratory Standards Institute) e pelo EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) como comitês reguladores. No Brasil é mais comum a utilização dos métodos e critérios do CLSI. 15

18 A partir das referências dos órgãos reguladores é possível determinar quais microrganismos são sensíveis, intermediários ou resistentes a determinados antimicrobianos. A utilização desse método se mostra vantajosa pelos reagentes serem de baixo custo, por possuir uma fácil execução e interpretação dos resultados, por possuir uma flexibilidade ao escolher as drogas a serem testadas, não necessitar de equipamentos especifico e por ser reprodutível. (ANVISA, 2008) 16

19 2. OBJETIVOS O presente trabalho buscou determinar o perfil de sensibilidade e a Concentração Inibitória Mínima (CIM) das diferentes espécies de Candida isoladas das amostras de sangue de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando tratadas com Anidulafungina e Anfotericina B, através de ensaios de disco difusão e microdiluição em caldo. 17

20 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Amostras de Candida spp. Foram avaliadas 102 amostras de sangue positivas para Candida spp. de pacientes internados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto no período de junho de 2014 a fevereiro de As espécies do fungo foram isoladas pelo laboratório de Micologia Médica através do sistema automatizado Bactec e identificadas por técnicas de semeadura em meio cromogênico, cultivo em lâmina para a prova da filamentação, zimograma e auxanograma. A cepa padrão (ATCC) utilizada para o controle dos ensaios foi a Candida parapsilosis Meios de cultura Foram utilizados os meios Ágar Sabouraud Dextrose para a manutenção das cepas, Ágar Mueller-Hinton para o ensaio de disco difusão e o meio RPMI (SIGMA-ALDRICH: RPMI-1640 Medium) para o ensaio de microdiluição em caldo. 3.3 Preparo do inóculo As cepas de Candida foram recebidas do laboratório de Micologia Médica crescidas em ágar Sabouraud Dextrose em tubo. Para a realização dos ensaios, foi realizado um repique de cada fungo, incluindo a ATCC, em ágar Sabouraud Dextrose em tubo sendo em seguida incubado em estufa a 35ºC por 48 horas. Após esse período, foi preparada uma suspensão padrão de cada levedura em solução de 3 ml de salina 0,9% (p/v) estéril. Para isso, foram utilizados tubos de acrílico estéreis, swabs para a manipulação das cepas, um vórtex para a homogeneização das suspensões e um turbidímetro para o ajuste 18

21 de 0,5 na escala de McFarland (ʎ=530 nm) que corresponde a 1x10 6 à 5x10 6 leveduras por ml. Para os ensaios de disco difusão foram utilizadas as suspensões padrão. Em contrapartida, para os ensaios de microdiluição em caldo, as suspensões padrão foram diluídas duas vezes. A primeira diluição foi feita em salina em uma escala de 1:50, sendo chamada de suspensão intermediária e a segunda foi realizada em meio RPMI em uma escala de 1:20, dando origem a solução de trabalho, contendo de 1x10 3 a 5x10 3 leveduras por ml. 3.4 Preparo da Anidulafungina Foi utilizado um frasco ampola que contém 100mg da droga Ecalta Anidulafungina da Pfizer liofilizada, sendo essa reconstituída em água destilada estéril. Em seguida foi calculado o fator de diluição para o preparo da solução estoque. 3.5 Preparo da Anfotericina B Foi utilizado 100 mg de Anfotericina B de Streptomyces spp. da Sigma liofilizada, sendo reconstituída em DMSO para o preparo da solução estoque. 3.6 Ensaio de microdiluição em caldo Para o ensaio de microdiluição em caldo foram preparadas as drogas, as quais, a partir da solução estoque, foram incorporadas em meio RPMI e em seguida foi realizada uma diluição em série de cada uma delas. Em relação a Anfotericina B foram realizadas diluições seriadas de 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06 e 0,03µg/mL, já na Anidulafungina foram de 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015 e 0,007 µg/ml. Foram usadas placas de 96 poços de fundo chato e em cada poço foi colocado um volume final de 200µl. Em cada placa havia um Blank (poço que continha apenas RPMI), o controle positivo de cada cepa (poços que continham 100µl de RPMI e 100µl da solução de trabalho do inóculo), o 19

22 controle negativo (poços que continham 100µl de RPMI e 100µl de RPMI com drogas diluídas) e poços que continham as cepas, incluindo a ATCC (poços que continham 100µl da solução de trabalho do inóculo e 100µl de RPMI com drogas seriadas diluídas). O ensaio clínico da microdiluição em caldo foi realizado de acordo com as normas do CLSI-M27-S Ensaio de disco difusão Primeiramente foram feitas as suspensões padrão do inóculo de cada cepa seguindo os passos anteriormente descritos, em seguida, foram utilizados swabs estéreis para semear essas suspensões em placas de Ágar Mueller-Hinton (dimensões de 90x15mm). A semeadura foi feita de acordo com a técnica Spread-plate, cobrindo 4 campos sobrepostos para que o crescimento dos fungos ocorresse de maneira uniforme por toda a placa. Após essa etapa, foram colocados os discos do antifúngico Anfotericina B e em seguida foram levados a incubação em estufa com 35ºC por 24 horas. Passado esse tempo os halos formados foram lidos através da medição do diâmetro de cada um. O ensaio de disco difusão foi realizado de acordo com as normas do CLSI-M Análise estatística Para determinar os valores de MIC50, MIC90 e média geométrica foi utilizado o Programa Excel 2007 for Windows (Microsoft Corp., Estados Unidos). Para a análise dos dados, foi utilizado o Método Kruskal Wallis nas análises entre as espécies de Candida com o Programa Prism 6, o nível de significância foi fixado em p<0,05. 20

23 4. RESULTADOS Foram utilizados como parâmetros o intervalo dos diferentes MIC dos isolados de cada espécie depois do teste com as duas drogas, sendo 41 isolados de Candida albicans, 22 de Candida tropicalis, 18 de Candida glabrata e 21 de Candida parapsilosis, a média geométrica, o MIC 50 e o MIC 90 para todas as espécies. Primeiramente podemos observar que a espécie Candida albicans se apresentou com um MIC constante de 0,007 µg/ml de Anidulafungina em todas as cepas isoladas dos pacientes (Tabela 1 e 2). Tanto o parâmetro do intervalo do MIC, a média geométrica, o MIC 50 e o MIC 90 apresentaram o mesmo valor em relação a essa droga (Tabela 1). Quanto ao tratamento com Anfotericina B, foi notado um intervalo de 0,06 a 1 µg/ml (Tabela 1 e 3). O parâmetro de média geométrica mostrou um valor de 0,3038 e tanto o MIC 50 quanto o MIC 90 obtiveram o valor de 0,5 µg/ml (Tabela 1). O ensaio de disco difusão mostrou a formação de halos de inibição de crescimento das cepas da espécie Candida albicans frente a ação da Anfotericina B com diâmetros que variam de 12 a 32 milímetros (Tabela 4). Tabela 1- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo. Anfotericina Anidulafungina Intervalo 0,06-1 0,007-0,007 Média Geométrica 0,3038 0,007 MIC 50 0,5 0,007 MIC 90 0,5 0,007 21

24 Tabela 2 Relação entre os 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anidulafungina 1 Candida albicans 0,007 2 Candida albicans 0,007 3 Candida albicans 0,007 4 Candida albicans 0,007 8 Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candica albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0, Candida albicans 0,007 22

25 Tabela 3 Relação entre os 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anfotericina 1 Candida albicans 0,06 2 Candida albicans 0,06 3 Candida albicans 0,06 4 Candida albicans 0,12 8 Candida albicans 0,12 10 Candida albicans 0,12 12 Candida albicans 0,12 13 Candida albicans 0,12 15 Candida albicans 0,25 18 Candida albicans 0,25 19 Candida albicans 0,25 23 Candida albicans 0,25 27 Candida albicans 0,25 29 Candida albicans 0,25 32 Candida albicans 0,25 33 Candida albicans 0,25 38 Candida albicans 0,25 40 Candida albicans 0,25 41 Candida albicans 0,25 43 Candica albicans 0,5 45 Candida albicans 0,5 51 Candida albicans 0,5 53 Candida albicans 0,5 54 Candida albicans 0,5 56 Candida albicans 0,5 58 Candida albicans 0,5 60 Candida albicans 0,5 61 Candida albicans 0,5 67 Candida albicans 0,5 68 Candida albicans 0,5 69 Candida albicans 0,5 74 Candida albicans 0,5 76 Candida albicans 0,5 77 Candida albicans 0,5 78 Candida albicans 0,5 79 Candida albicans 0,5 82 Candida albicans 0,5 85 Candida albicans 0,5 91 Candida albicans 0,5 96 Candida albicans 0,5 97 Candida albicans 1 23

26 Tabela 4 Relação entre os 41 isolados de Candida albicans de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão. Número Isolado DISCO DIFUSÃO Anfotericina 91 Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans 12 1 Candida albicans 13 3 Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans 13 4 Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans 14 2 Candida albicans 15 8 Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candica albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans 32 24

27 Em relação à espécie Candida tropicalis foi observado um intervalo do MIC de 0,007 a 0,06 µg/ml para Anidulafungina em todas as cepas (Tabela 5 e 6). A média geométrica foi de 0,0116, o MIC 50 foi de 0,007 µg/ml e o MIC 90 apresentou o valor de 0,03 µg/ml (Tabela 5). Para a Anfotericina B o intervalo foi de 0,12 a 1 µg/ml (Tabela 5 e 7). Sua média geométrica obteve um valor de 0,5150, o MIC 50 apresentou uma concentração de 0,5 µg/ml e o MIC 90 obteve o valor de 1 µg/ml (Tabela 5). A disco difusão mostrou a formação de halos de inibição das cepas de Candida tropicalis à Anfotericina B com diâmetros que variam de 15 a 48 milímetros (Tabela 8). Tabela 5- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo. Anfotericina Anidulafungina Intervalo 0,12-1 0,007-0,06 Média Geométrica 0,5150 0,0116 MIC 50 0,5 0,007 MIC ,03 25

28 Tabela 6 Relação entre os 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anidulafungina 11 Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0, Candida tropicalis 0,03 83 Candida tropicalis 0,03 86 Candida tropicalis 0,03 34 Candida tropicalis 0,06 26

29 Tabela 7 Relação entre os 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anfotericina 59 Candida tropicalis 0,12 17 Candida tropicalis 0,25 71 Candida tropicalis 0,25 11 Candida tropicalis 0,5 14 Candida tropicalis 0,5 22 Candida tropicalis 0,5 34 Candida tropicalis 0,5 37 Candida tropicalis 0,5 55 Candida tropicalis 0,5 62 Candida tropicalis 0,5 70 Candida tropicalis 0,5 80 Candida tropicalis 0,5 83 Candida tropicalis 0,5 84 Candida tropicalis 0,5 86 Candida tropicalis 0,5 92 Candida tropicalis 0,5 94 Candida tropicalis 0,5 26 Candida tropicalis 1 90 Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis 1 27

30 Tabela 8 Relação entre os 22 isolados de Candida tropicalis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão. Número Isolado DISCO DIFUSÃO Anfotericina 92 Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis Candida tropicalis 48 28

31 Na espécie Candida glabrata o intervalo do MIC variou de 0,007 a 0,06 µg/ml para Anidulafungina em todas as cepas (Tabela 9 e 10). A média geométrica foi de 0,0210, o MIC 50 foi de 0,03 µg/ml e o MIC 90 apresentou o valor de 0,06 µg/ml (Tabela 9). Para Anfotericina B a variação do intervalo foi de 0,06 a 1 µg/ml (Tabela 9 e 11). O parâmetro da média geométrica foi de 0,3792, o MIC 50 apresentou uma concentração de 0,5 µg/ml e o MIC 90 obteve o valor de 1 µg/ml (Tabela 9). A disco difusão mostrou a formação de halos de inibição das cepas de Candida glabrata à Anfotericina B com diâmetros que variam de 16 a 29 milímetros (Tabela 12). Tabela 9- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade de 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo. Anfotericina Anidulafungina Intervalo 0,06-1 0,007-0,06 Média Geométrica 0,3792 0,0210 MIC 50 0,5 0,03 MIC ,06 29

32 Tabela 10 Relação entre os 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo Número Isolado MIC Anidulafungina 6 Candida glabrata 0, Candida glabrata 0, Candida glabrata 0, Candida glabrata 0, Candida glabrata 0, Candida glabrata 0, Candida glabrata 0, Candida glabrata 0,015 7 Candida glabrata 0,03 16 Candida glabrata 0,03 20 Candida glabrata 0,03 21 Candida glabrata 0,03 24 Candida glabrata 0,03 35 Candida glabrata 0,03 48 Candida glabrata 0,03 89 Candida glabrata 0,03 28 Candida glabrata 0,06 88 Candida glabrata 0,06. 30

33 Tabela 11 Relação entre os 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anfotericina 6 Candida glabrata 0,06 7 Candida glabrata 0,06 72 Candida glabrata 0,06 73 Candida glabrata 0,25 75 Candida glabrata 0,25 20 Candida glabrata 0,5 25 Candida glabrata 0,5 35 Candida glabrata 0,5 46 Candida glabrata 0,5 48 Candida glabrata 0,5 50 Candida glabrata 0,5 65 Candida glabrata 0,5 88 Candida glabrata 0,5 89 Candida glabrata 0,5 16 Candida glabrata 1 21 Candida glabrata 1 24 Candida glabrata 1 28 Candida glabrata 1 31

34 Tabela 12 Relação entre os 18 isolados de Candida glabrata de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão. Número Isolado DISCO DIFUSÃO Anfotericina 16 Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata 17 7 Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata 18 6 Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata Candida glabrata 29 32

35 Na espécie Candida parapsilosis o intervalo do MIC mostrou uma variação de 0,015 a 2 µg/ml para Anidulafungina entre as cepas (Tabela 13 e 14). A média geométrica foi de 0,3573, o MIC 50 foi de 0,5 µg/ml e o MIC 90 apresentou o valor de 1 µg/ml (Tabela 9). Na Anfotericina B a variação do intervalo foi de 0,06 a 1 µg/ml (Tabela 13 e 15). O parâmetro da média geométrica foi de 0,3236, o MIC 50 e o MIC 90 apresentaram o valor de 0,5 µg/ml (Tabela 13). A disco difusão mostrou a formação de halos de inibição das cepas de Candida parapsilosis à Anfotericina B com diâmetros que variam de 15 a 39 milímetros (Tabela 16). Tabela 13- Parâmetros utilizados para a análise da susceptibilidade das cepas de Candida parapsilosis isoladas de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando submetidas a tratamento por Anfotericina B e Anidulafungina pela técnica de microdiluição em caldo. Anfotericina Anidulafungina Intervalo 0,06-1 0,015-2 Média Geométrica 0,3236 0,3573 MIC 50 0,5 0,5 MIC 90 0,5 1 33

36 Tabela 14 Relação entre os 21 isolados de Candida parapsilosis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anidulafungina 64 Candida parapsilosis 0, Candida parapsilosis 0,03 57 Candida parapsilosis 0,12 49 Candida parapsilosis 0,25 63 Candida parapsilosis 0,25 81 Candida parapsilosis 0,25 5 Candida parapsilosis 0,5 9 Candida parapsilosis 0,5 30 Candida parapsilosis 0,5 31 Candida parapsilosis 0,5 39 Candida parapsilosis 0,5 42 Candida parapsilosis 0,5 44 Candida parapsilosis 0,5 47 Candida parapsilosis 0,5 52 Candida parapsilosis 0,5 66 Candida parapsilosis 0,5 95 Candida parapsilosis 0,5 100 Candida parapsilosis 0,5 98 Candida parapsilosis 1 99 Candida parapsilosis 1 36 Candida parapsilosis 2 34

37 Tabela 15 Relação entre os 21 isolados de Candida parapsilosis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B através da técnica de microdiluição em caldo. Número Isolado MIC Anfotericina 5 Candida parapsilosis 0,06 57 Candida parapsilosis 0,12 66 Candida parapsilosis 0,12 31 Candida parapsilosis 0,25 36 Candida parapsilosis 0,25 39 Candida parapsilosis 0,25 42 Candida parapsilosis 0,25 47 Candida parapsilosis 0,25 49 Candida parapsilosis 0,25 63 Candida parapsilosis 0,25 9 Candida parapsilosis 0,5 30 Candida parapsilosis 0,5 44 Candida parapsilosis 0,5 52 Candida parapsilosis 0,5 64 Candida parapsilosis 0,5 81 Candida parapsilosis 0,5 98 Candida parapsilosis 0,5 99 Candida parapsilosis 0,5 100 Candida parapsilosis 0,5 101 Candida parapsilosis 0,5 95 Candida parapsilosis 1 35

38 Tabela 16 Relação entre os 21 isolados de Candida parapsilosis de hemoculturas positivas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e o diâmetro dos halos de sensibilidade formados pela ação Anfotericina B sobre os microrganismos através da técnica de disco difusão. Número Isolado DISCO DIFUSÃO Anfotericina 64 Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis 23 5 Candida parapsilosis Candida parapsilosis 25 9 Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis Candida parapsilosis 39 36

39 Na Figura 1 que compara as espécies por MIC da Anidulafungina, foi observado que as espécies Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida albicans se comportam de maneira semelhante, possuindo uma concentração inibitória mínima entre 0,007 e 0,5 µg/ml. Já para a espécie Candida parapsilosis, os isolados estão entre 0,015 e 2 µg/ml. Estes resultados se mostraram estatisticamente significantes obtendo um valor de P<0,0001. Figura 1- Relação entre as espécies de Candida spp. de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto com a concentração inibitória mínima (MIC) de Anidulafungina. Na Figura 2 que compara as espécies por MIC da Anfotericina B, foi notado que três espécies, Candida glabrata, Candida albicans e Candida parapsilosis, se comportam de maneira parecida, com cepas que possuem concentração inibitória mínima desde 0,06 a 1 µg/ml. A espécies Candida 37

40 tropicalis mostrou um MIC médio superior ao das outras espécies, sendo uma diferença estatisticamente significante com um P=0,0108. Figura 2- Relação entre as espécies de Candida spp. de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto com a concentração inibitória mínima (MIC) de Anfotericina B. A Figura 3 mostra que aparentemente não houve correlação entre os resultados dos testes de microdiluição em caldo e da disco difusão quando testada a sensibilidade para Anfotericina B. 38

41 Microdiluição em caldo (CIM - µg/ml) 1,2 Comparações entre Métodos Anfotericina B 1 0,8 0,6 0,4 C.albicans C.tropicalis C.glabrata C.parapsilosis 0, Disco de difusão (mm) Figura 3- Comparação entre os métodos de microdiluição em caldo e disco difusão de espécies de Candida spp. de hemoculturas positivas de pacientes do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto quando testadas com Anfotericina B. 39

42 5. DISCUSSÃO A partir dos ensaios de microdiluição e disco difusão, os resultados obtidos foram comparados com os breakpoints do CLSI, o qual define como susceptível as cepas que obtiverem resultado na microdiluição em caldo igual ou menor a 1 µg/ml quando testadas com Anfotericina B e um resultado igual ou menor a 2 µg/ml quando testadas com equinocandinas, no caso do presente estudo a Anidulafungina. Não há uma padronização dos halos de sensibilidade da disco difusão da Anfotericina B. Todas os isolados de todas as espécies de Candida spp. presentes neste estudo se mostraram sensíveis aos tratamentos com os dois antifúngicos. Entretanto a espécie Candida parapsilosis mostrou um isolado que ao ser submetida à microdiluição para Anidulafungina obteve um resultado de 2 µg/ml, que é um resultado que está no limite do padrão de sensibilidade estipulado pelo CLSI (Figura 1). Esse resultado pode ser proveniente da característica dessa espécie em apresentar polimorfismos intrínsecos do gene FKS1 (SHIELDS et al., 2015; GARCIA-EFFRON et al., 2008). Os genes FKS1, FKS2 e FKS3 atuam na codificação de uma enzima para a produção da parede celular fúngica e essa enzima é o alvo da ação das equinocandinas. O desenvolvimento de resistência frente a essa droga se deve a mutações nesses genes. Uma mutação no gene FKS1 confere resistência a todas as espécies de Candida spp., já uma mutação no gene FKS2 confere resistência apenas na espécie Candida glabrata (ARENDRUP and PERLIN, 2014). Com exceção da espécie Candida parapsilosis, as outras espécies podem desenvolver mutações nesses genes em situação de pressão (ARENDRUP and PERLIN, 2014). Em relação ao comportamento das espécies de Candida spp. quando testadas com a Anfotericina B, todas se mostraram sensíveis, porém todas a espécies possuíram isolados com concentração do MIC de 1 µg/ml, ficando no limite do padrão estipulado (Figura 2). Apesar desse resultado, é raro encontrar resistência à Anfotericina B por parte desses fungos, mas alguns casos foram relatados da espécie 40