CULTURA DE TECIDOS NO MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS- Tópicos especiais

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1 1 CULTURA DE TECIDOS NO MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS- Tópicos especiais Organizado por Leandra Almeida, Telma Alves (alunas do Curso de Licenciatura em Biologia da UEA/CEST- Tefé, AM) e Afonso Celso Candeira Valois (Professor-Orientador) HISTÓRICO DA CULTURA DE TECIDOS Na década de 20 se iniciam as tentativas de cultivo de células a partir do cultivo de tecidos meristemáticos em meio salino com adição de glicose e extrato de carne ou outros compostos nitrogenados. Nas duas décadas seguintes se descobre que a adição de certos elementos em quantidades ínfimas como o cobre, manganês e iodo, de vitaminas e agentes quelantes favorece o desenvolvimento in vitro. As culturas de meristemas apicais são estabelecidas a partir do trabalho de Ball (1946), que descobre o princípio da micro propagação. A descoberta de que é possível cultivar tecidos vegetais com a utilização do ácido indol acético (IAA), uma auxina natural. G.Morel foi pioneiro na micro propagação de orquídeas in vitro e também na eliminação de vírus em culturas de meristemas (Gautheret, 1939; Morel, 1963). Portanto, diz-se que uma célula quando devidamente estimulada por ação dos fitorreguladores exógenos e/ou endógenos torna-se competente para manifestar sua totipotência. Skoog (1957) demonstrou o efeito isolado e combinado desses fitorreguladores em discos foliares de tabaco, portanto, em tecidos diferenciados. A MICRO PROPAGAÇÃO COMO TECNOLOGIA Os tecidos meristemáticos são as principais fontes de explantes usadas na clonagem de plantas in vitro. A desinfestação do explante é feita com detergentes e fungicidas, o qual em seguida, é tratado com soluções à base de cloro e etanol 70% (v/v). Após a fertilização, o tecido meristemático deve sofrer múltipla brotação, normalmente induzida por fitorreguladores. Ainda in vitro, os brotos devem ser tratados para sofrer enraizamento. Nesta etapa, geralmente é feita a retirada do fitorregulador e a concentração do meio basal é reduzida. A próxima etapa é conhecida por aclimatação. As plantas são retiradas do frasco, as raízes devem ficar livres dos resíduos de meio de cultura, por lavagem em água, e as plantas transferidas para a casa de vegetação em suportes contendo substrato autoclavado. CONSERVAÇÃO IN VITRO As alternativas de conservação in vitro são usadas no caso de sementes recalcitrantes, plantas ou propagação vegetativa, de certas espécies arbóreas, para a eliminação de patógenos ou para facilitar o transporte de germoplasma (Grout, 1995).

2 2 A criopreservação é uma técnica que permite manter o germoplasma conservado por vários anos sob temperatura ultra-reduzida, usualmente 196 C. É possível também criopreservar ápices, embriões somáticos encapsulados em alginato de sódio (3 a 5 mm). Esta técnica é conhecida como encapsulação. Espécies terrestres de orquídeas têm sido conservadas no Japão por criopreservação (Ishikawa et al., 1997), a partir de embriões zigóticos cobertos com uma mistura de glicerol e sacarose. REGENERAÇÃO IN VITRO A regeneração de plantas a partir do cultivo in vitro de células de tecidos pode ocorrer pela formação de gemas caulinares ou de embriões somáticos. A organogênese do meristema apical caulinar in vivo nas plantas superiores envolve a participação de grupos de células iniciais apicais e, portanto, a origem é sempre multicelular. A organogênese da parte aérea in vitro também pode ser unicelular ou multicelular. Pode ocorrer também diretamente a partir de células do explante original ou, indiretamente, via formação de calos. ANÁLISES HISTOLÓGICAS DA ORGANOGÊNESE IN VITRO A organogênese in vitro é considerada indireta quando ocorre uma fase intermediária de calo como em Bauhinia forficata e em Stylosanthes guianensis. Nessas duas espécies verifica-se o tamanho das células antes que a atividade meiótica inicie. Em todos os registros da literatura referentes à organogênese direta ou indireta em espécies de leguminosas, a origem das gemas caulinares é sempre superficial e os padrões do desenvolvimento das mesmas muito similares. Em várias espécies, as gemas caulinares formam-se nas camadas superficiais do calo, enquanto a organização das raízes ocorre em áreas meristemáticas diferenciadas em regiões mais internas profundas do calo (Vasil & Hildebrandt, 1996; Detrez et al., 1998; Araújo et al., 1997). O processo organogênico in vitro pode ser assincrônico ou sincrônico. O processo assincrônico pode ser devido à aquisição de competência e determinação pelas células em estádios diferenciados do processo organogênico, seja este direto ou indireto. ANÁLISES ULTRAESTRUTURAIS DA ORGANOGÊNESE IN VITRO Duas características ultraestruturais consideradas associadas à competência embriogênica e verificadas no processo organogênico em Bauhinia forficata e em Glycine max: retículo endoplasmático rugoso (RER) em arranjos concêntricos e plastídios contendo amido, reforçam as observações de que, em ambos os processos de regeneração ocorre uma expressão da alta capacidade de síntese dos tecidos associada à uma reorganização do padrão de crescimento durante a indução da morfogênese somática. Em G. max e em B. forficata, os meristemoides não se originam de células meristemáticas típicas e sim de células altamente vacuolizadas que sofrem divisões desiguais, formando células-filhas de tamanhos distintos.

3 3 ANÁLISES HISTOLÓGICAS DA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA A embriogênese somática in vitro tornou-se um modelo potencial para o estudo de eventos regulatórios e morfogenéticos em embriogênese de plantas (Zimmerman, 1993). A embriogênese somática direta é precedida por células pré-embriogênicas determinadas (PEDC). Por outro lado, o termo célula embriogênica determinada induzida (IEDC) é usado para identificar células capazes de adquirir o potencial embriogênico durante o período de cultivo. Estudos realizados por Liu et al. (1992) indicaram que a origem de embriões somáticos ou tecidos embriogênicos pode ser determinada pela concentração de 2,4-D aplicado ao meio de indução, assim como pelas diferentes fontes doadoras de explantes. CULTURA E RESGATE DE EMBRIÕES ZIGÓTICOS Tem importância na quebra da dormência e esterilidade de sementes, resgate de híbridos oriundos de cruzamentos incompatíveis, produção de haploides e poliploides e no desenvolvimento in vitro de embriões maduros submetidos ao bombardeamento de partículas para fins de transformação. Os procedimentos experimentais da cultura de embriões imaturos estão bem estabelecidos. Desde que se estabeleçam condições para sustentar seu crescimento in vitro, eles são capazes de germinar em meio salino suplementado com uma fonte de carbono. Sistemas de incompatibilidade sexual são classificados em pré e pós zigóticos. As barreiras anteriores à fertilização ocorrem usualmente pela inibição do crescimento do tubo polínico, a qual pode ser superada cortando-se o estigma ou por técnicas de fertilização in vitro. Barreiras pós-zigóticas frequentemente resultam no desenvolvimento incompleto do endosperma, principalmente aqueles oriundos de cruzamento interespecíficos ou intergenéricos, ou levam à produção de toxinas pelo endosperma. CULTURA DE ANTERAS E DE OVÁRIOS Usualmente são realizadas autofecundações sucessivas, acompanhadas da seleção, para fins de obtenção de homozigotos que contêm, em média, 96,8% de seus genes em homozigose, valor esse que varia em função do número de autopolinizações realizado. A geração de plantas haploides in vitro é uma das etapas de obtenção rápida de plantas homozigóticas. A técnica mais usual é via cultura de anteras. O aspecto mais crítico da cultura de antera e de micrósporos é o crescimento das plantas doadoras de explante. O vigor da planta-mãe, por sua vez, é influenciado por fotoperíodo, intensidade e fonte de radiação luminosa e temperatura. Em cevada, as inflorescências são coletadas e conservadas a 4 C por três a quatro semanas, no escuro, e após a retirada das anteras, estas são cultivadas em meio nutritivo.

4 4 VARIAÇÃO SOMACLONAL A prática do cultivo de células, de tecidos e órgãos vegetais em laboratório compreende um conjunto de etapas desde a introdução do explante in vitro até à regeneração de brotos, uma vez definidos os objetivos que se deseja atingir. A prática per se pode ser considerada estressante às células dos tecidos vegetais devido ao acúmulo de gases no frasco de cultura, principalmente o etileno, ao tempo de cultivo, às concentrações elevadas de sais, compostos orgânicos e fitorreguladores. As alterações da cultura in vitro podem levar ao aparecimento de variantes morfológicos, ditos offtype. Lakin & Scowcroft (1981) criaram o termo variação somaclonal para designar a ocorrência de derivados da cultura de células in vitro. A resposta celular a esse estresse vai desde mutações de ponto, amplificação de sequências, ativação de elementos transponíveis, alterações no DNA citoplasmático e total e no número de cópias de sequências repetitivas e até alterações na morfologia e números cromossômicos. APLICAÇÕES NO MELHORAMENTO GENÉTICO A incidência de variação somaclonal é altamente indesejada quando se utiliza a cultura de tecidos na micro propagação, conservação de germoplasma e na obtenção de plantas transgênicas. A geração de variabilidade genética via cultura in vitro tem sido buscada em espécies que apresentam erosão genética ou visando gerar resistência à salinidade, patógenos e pragas, submetendo-se, por exemplo, as culturas à presença de toxinas fúngicas e altas concentrações de sais, íons, alumínios, entre outros. Na década de 90, houve inúmeros relatos envolvendo diversas culturas, sobre mudanças em caracteres quantitativos e qualitativos geradas pela cultura de tecidos. CULTURA E FUSÃO DE PROTOPLASTOS A IMPORTÂNCIA DAS ESPÉCIES SELVAGENS COMO FONTES DE GENES Em meados do século XX, a produtividade de várias espécies cultivadas nos Estados Unidos duplicou, sendo que o incremento em milho chegou a 320%. A contribuição do germoplasma selvagem foi bastante inferior. Por outro lado, outras grandes culturas têm incorporado genes oriundos de espécies silvestres relacionadas. Caracteres do tipo vigor e resistência a doenças adquiridos de espécies não domesticadas tiveram um grande impacto na produção da cana-de- açúcar. Outras culturas, como a do tomate, não estariam sendo cultivadas em escala extensiva não fosse a introdução de genes exóticos de resistência a doenças relacionados à qualidade dos frutos. ESTRATÉGIAS DE HIBRIDAÇÃO As estratégias que têm sido aplicadas para expandir a variabilidade genética a partir da exploração do germoplasma de espécies selvagens são a hibridação sexual (interespecífica ou intergenérica), a engenharia genética (através da tecnologia do DNA recombinante e das metodologias de transformação de planta) e a hibridação somática.

5 5 As demais estratégias incluem procedimentos biotecnológicos e têm obtido sucesso quando inseridas em programas de melhoramento. Avanços recentes em pesquisas sobre culturas de tecidos vegetais, especialmente sobre a regeneração de plantas a partir de protoplastos, têm possibilitado a expansão da variabilidade genética a partir da fusão de células somáticas. ISOLAMENTO E CULTURA DE PROTOPLASTOS DE VEGETAIS A fonte utilizada para isolamento de protoplastos é variável e tem influência na sua produção e também, no processo de regeneração da parede e de divisões celulares que se sucedem após essa regeneração. Protoplastos podem ser isolados do parênquima clorofiliano do mesofilo, do tecido cotiledonar, hipocotiledonar de raízes e também de calos e sucessões celulares. Antes do isolamento, o tecido vegetal é plasmolizado em solução salina. Esta solução e a mistura enzimática devem ser preparadas contendo o estabilizador osmótico à base de açúcares como o manitol e a sacarose, que impedem o rompimento da membrana plasmática ou, inversamente, a saída excessiva de água da célula. O cultivo de protoplastos se faz em meio de cultura rico em componentes orgânicos e inorgânicos suplementados por fitorreguladores e com adequadas concentrações de polissacarídeos, pois estes funcionam como estabilizadores osmóticos. Esse cultivo é feito diretamente em meio líquido ou embebe-se a mistura protoplastos-meio de cultura em agarose ou em outro agente gelificante. Após a regeneração da parede celular, as células derivadas entram em divisão. As primeiras divisões são observadas em frequências que variam, dependendo do genótipo e da espécie que se está trabalhando. Na medida em que se sucedem divisões celulares, pequenas colônias vão se formando. A capacidade de sustentar divisões em cultura é medida por um parâmetro chamado planting efficiency, que é dado pela relação entre o número de colônias formadas e o número inicial de células que entraram em divisão. REGENERAÇÃO DE BROTOS A regeneração ocorre em meio adequado à formação de embriões somáticos ou de parte aérea. As formulações de meio variam muito entre grupos de plantas tais como, mono e dicotiledôneas, gramíneas e leguminosas, e não há como generalizá-las. HIBRIDAÇÃO SOMÁTICA A obtenção de híbridos somáticos assimétricos depende fundamentalmente de mecanismos eficientes que promovem a fusão celular. Em plantas, a fusão pode ser medida por um agente químico, o polietileno glicol (PEG) ou por choques de corrente elétrica. Na fusão química, protoplastos de espécies diferentes são colocados em contato na presença de PEG, que é tóxico à célula.

6 As Figuras a seguir se referem ao isolamento e fusão de protoplastos pelo método químico, efetuado pelo Dr. Afonso Celso Candeira Valois no Laborátorio de Genética de Plantas da Universidade do Estado do Novo México (EUA), em Os protoplastos de cor verde são de tomate (Lycopersicum esculentum), os de cor vermelha são de jurubeba (Solanum paniculatum), enquanto que os alaranjados advêm da fusão de protoplastos das duas espécies. O objetivo desta pesquisa inédita foi a criação de híbridos somáticos (cíbridos) para a obtenção de genótipos com resistência à bactéria Ralstonia solanacearum, causadora da terrível doença denominada murcha bacteriana das solanáceas, condicionante biológico muito comum na Amazônia, que limita tremendamente a produção de tomate em condições naturais na importante região. 6

7 7 A fusão elétrica ocorre em duas etapas. Primeiramente, as células são submetidas a uma corrente do tipo alternada gerando um campo elétrico de alta força e fazendo com que os protoplastos polarizem-se e se encaminhem para o pólo de maior força, fenômeno conhecido como dieletroforese. A fusão não é um evento dirigido, ela pode ocorrer entre protoplastos de uma mesma espécie formando homocários ou entre espécies diferentes dando origem aos heterocários. Alguns procedimentos de seleção de heterocários, anteriores ao cultivo, podem ser adotados: técnica de micromanipulação ou de citometria de fluxo. Para isso, é necessário utilizar marcadores morfológicos que permitam a identificação dos protoplastos oriundos das espécies envolvidas em fusão. Este é o marcador mais usado, o que também permite o cálculo das taxas de fusão nos diversos experimentos. TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS Destacam-se como técnicas de transformação: a)aquela onde se utiliza Agrobacterium, na qual a bactéria atua como vetor, transferindo parte de seu DNA plasmidial às células vegetais. No caso da transformação via Agrobacterium, há necessidade de se transformar células que tenham potencial de regeneração. São duas as espécies de Agrobacterium mais usadas na transformação genética de plantas, isto é, A. tumefaciens usada em dicotiledôneas e A. rhizogenes aplicada para a transformação de monocotiledôneas. b) A eletroporação de protoplastos; No caso de eletroporação, cuja eficiência de transformação per se é alta, há necessidade de se conhecer as condições de cultivo dos protoplastos recém eletroporados, de indução e manutenção de mitoses até haver a formação de mitocôndrias e calos e, por fim, a formação de gemas ou embriões que darão origem a plantas. c) A biobalística; Na transformação por biobalística são usadas diversas fontes de explantes: embriões zigóticos, calos organogênicos e embriogênicos, suspensões celulares que têm se mostrado as mais promissoras. Os procedimentos experimentais de obtenção de plantas transgênicas são bem dominados no Brasil, seja para fins de estudos básicos de biologia celular ou molecular, visando ao cultivo em larga escala ou mesmo para a geração de novos genótipos. CONCEITOS HISTÓRICOS DA BIOTECNOLOGIA No século XX, a investigação científica, principalmente do ponto de vista da genética, permitiu o advento de técnicas e de procedimentos experimentais importantes para o cultivo de plantas em larga escala com produção, produtividade e qualidade elevadas. Assim, três níveis de exploração dos recursos genéticos vegetais podem ser caracterizados. No princípio, a prática foi extrativista, seguindo-se os procedimentos de cultivo doméstico, e,

8 8 finalmente, em anos recentes da história passou-se a praticar o plantio de monoculturas que podem conter milhares de plantas através de cultivos adensados. O melhoramento genético de plantas, animais e de microrganismos é uma prática biotecnológica porque gera produtos comerciais. Assim, sementes melhoradas de soja e a fermentação alcoólica são exemplos de produtos de processos biotecnológicos. INTERFACES DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE E A NOVA BIOTECNOLOGIA: A INDÚSTRIA DO DNA Os primeiros experimentos de clonagem gênica foram descritos em 1973, quando ficaram evidentes as aplicações dessa tecnologia na indústria. A engenharia genética abriu novas perspectivas para aumentar a produção de certos compostos microbianos, como também permitiu forçá-los a produzir modernas substâncias de interesse, principalmente para a indústria farmacêutica e de alimentos. Essa prática já adotada desde 1940, quando se intensificaram estudos sobre genética e melhoramento microbiano permitiu que mutantes do gênero Penicillium fossem selecionados, aumentando a produção de penicilina. Em plantas, os níveis de produtividade alcançada pelo melhoramento genético são surpreendentes em culturas como do milho e da soja. Plantas transgênicas portadoras de genes de resistência a vírus e a pragas foram uma realidade no final do século XX. Outro aspecto importante da biotecnologia diz respeito à produção de vacinas por EG: as vacinas de subunidades, como são chamadas, dependem do isolamento de genes que codificam proteínas virais e de sua expressão em um sistema adequado. Concluindo, pode-se afirmar que o domínio das técnicas de cultivo in vitro tem importância na biotecnologia vegetal, pois estas se constituem em etapas indispensáveis na obtenção de produtos. Da mesma forma, os conhecimentos dos aspectos teóricos que fundamentam essas técnicas orientam o pesquisador no planejamento de sua pesquisa, assegurando-lhe maiores chances de sucesso. REFERÊNCIAS ALVES, A.C. Estudos anatômicos da organogênese in vitro de soja e otimização do processo de transformação via Agrobacterium tumefaciens. Piracicaba: ESALQ/USP, p. (Dissertação, Mestrado). APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B. Aspectos histológicos e ultraestruturais da organogênese somática in vitro de três espécies de leguminosas. Piracicaba: ESALQ/USP, p. (Tese, Livre Docência).