GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

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1 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PPG Biotecnologia Industrial Tese de Doutorado Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Priscila Brasil de Souza Cruz Lorena SP Brasil 2005

2 FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Industrial. Banca Examinadora: Dr. André Luis Ferraz DEBIQ/FAENQUIL Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres DEBIQ/FAENQUIL Dra. Maria Eleonora Andrade de Carvalho DEBIQ/FAENQUIL Dra. Elisa Esposito - UMC Dra. Manuela da Silva FIOCRUZ-RJ Estudante: Priscila Brasil de Souza Cruz Lorena - SP - Brasil 2005

3 FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis Subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) Este exemplar corresponde à versão final da tese de doutorado aprovada pela banca examinadora. Dr. André Ferraz Orientador e Presidente da Banca Examinadora Lorena - SP - Brasil 2005

4 Ficha Catalográfica Elaborada pela Biblioteca Universitária da FAENQUIL Souza-Cruz, Priscila Brasil S89m Morfo-Fisiologia da Biodegradação de Madeiras por Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomycetes) / Priscila Brasil de Souza-Cruz.-- Lorena, f.: il. Tese (doutorado) - Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Biotecnologia. Orientador: André Ferraz. Co-Orientador: Clarice Loguercio- Leite 1. Biotecnologia 2. Biodegradação de madeira 3. Biopolpação 4. Phlebia tremellosa 5. Ceriporiopsis subvermispora 6. Pinus taeda 7. Eucalyptus grandis I. Ferraz, André, orientador. II. Título. CDU : 574.6

5 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeiras moles proposta por Adler 11 Figura 2 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeira dura proposta por K. Nimz 11 Figura 3 Vias de colonização da madeira 13 Figura 4 Ciclo catalítico simplificado de lignina peroxidase (LiP). S representa um substrato aromático não fenólico 17 Figura 5 Ciclo catalítico simplificado de peroxidase dependente de Manganês (MnP). PhOH representa um substrato fenólico 17 Figura 6 Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequeometria do ciclo envolve 4 Cu 2+ ( normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O 2 Figura 7 - Microscopia ótica mostrando o ataque progressivo (erosão) da parede celular de Picea abies por Heterobasidium annosum Note que a célula ao centro apresenta erosões irregulares na parede celular. A escala no canto 18 superior esquerdo da foto indica a magnitude do aumento Figura 8 - Microscopia eletrônica de transmissão mostrando o ataque não erosivo da parede celular de madeira. Notophagus dombeyi degradado por Ganoderma australe. Corte fixado com KMnO4 para contraste da lignina. (A) células intactas, (B) e (C) as setas indicam o avanço do ataque onde as áreas 19 de menor contraste estão livres de lignina. (D) células completamente livres de lamela média. Figura 9 Hifa com clamidosporos (a) intercalar e (b) apical de Ceriporiopsis subvermispora SS3. 28 Figura 10 Classificação visual da quantidade de clamidósporos em (a) muito (++++), (b) médio (+++), (c) pouco (++) e (d) pouquíssimo (+). 46 Figura 11 Perdas de massa de E. grandis após 15 dias de biodegradação por C. subvermispora SS Figura 12 Crescimento fúngico estimado a partir do teor de ergosterol detectado nas amostras de madeira biodegradada (P. taeda e E. grandis) por 50 C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 13 Produção de MnP por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do 52 período de incubação. Figura 14 Produção de lacase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis ao longo do 55 período de incubação. Figura 15 Produção de endoglucanase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis 58 ao longo do período de incubação. Figura 16 Produção de xilanase por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, na biodegradação de P. taeda e E. grandis 59 ao longo do período de incubação. Figura 17 ph do meio fermentado por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ATCC 48745, na biodegradação de P. taeda 61 e E. grandis ao longo do período de incubação. Figura 18 Perda de massa seca da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. 63 tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 19 Perda de glucana da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P

6 tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 20 Perda de polioses da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 21 Perda de lignina da madeira (P. taeda e E. grandis) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa ao longo do período de incubação. Figura 22 Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após polpação kraft de alto rendimento. A polpação foi realizada em amostras de madeira P. taeda após biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa por 28 dias. Figura 23 Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após rampa de aquecimento de 30 minutos e determinados tempos de cozimento a temperatura máxima. A polpação foi realizada em amostras de madeira E.grandis após biodegradação por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa por 28 dias. Figura 24 Rendimento de polpa não classificada em função do número kappa em polpas Kraft obtidas a partir da madeira de P. taeda biotratada durante 28 dias por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa. Figura 25 Hifas de C. subvermispora SS3 em células de (a) P. taeda - traqueídeos e (b) E. grandis elementos de vaso. Figura 26 Curva de crescimento de C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em meio líquido CB (Batata dextrose) tamponado com acetato de sódio 10 mm. Figura 27 Curva de crescimento de C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em meio líquido MS (Milhocina - sacarose). Figura 28 Microscopia óptica de fragmentos de hifas com clamidósporos, após o micélio cultivado para inóculo ser batido por 10 ciclos de 15 segundos

7 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição química das madeiras moles e duras 9 Tabela 2 - Atividade celulolítica total encontrada nos extratos obtidos a partir da biodegradação de P. taeda e E. grandis por C. subvermispora SS3, C. 57 subvermispora CS1 e P. tremellosa, ao longo do período de incubação. Tabela 3 - Taxa de crescimento dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa em meio de cultura ágar-batata- dextrose com diferentes valores 75 de ph inicial. Tabela 4 - Taxa de crescimento dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa em meio de cultura ágar-milhocina com diferentes valores de ph 75 inicial. Tabela 5 Quantidade de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C. subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo do crescimento em 79 meio de cultura líquido BD tamponado (ph 4) Tabela 6 Atividade enzimática de manganês peroxidase (MnP) encontrada nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo de C. subvermispora SS3 sobre P. 82 taeda e E. grandis, com os inóculos convencional e induzido para a produção de clamidósporos. 3

8 ABSTRACT Morpho-physiology of wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Sch rad.:fr.) Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomycetes). Priscila Brasil de Souza Cruz. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. André Luis Ferraz (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP116, , Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dra Clarice Loguercio- Leite (Departamento de botânica, UFSC, CP 476, CEP ). This work involves the study of enzymatic and morphological aspects related to the wood biodegradation by white rot fungi. Wood samples of Pinus taeda L. and Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden were inoculated with Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. (strains SS3 and CS1) and Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (strain ATCC 48745) in solid-state fermentation bioreactors for periods from 7 to 28 days. Enzymes of hydrolytic nature, such as total cellulases, endocelulases and xylanases, along with those of oxidative nature, such as lacase, peroxidase and cellobiose dehydrogenase, were studied in extracts recovered from the cultures. From the colonized wood chips, morphological aspects of the wood colonization were observed under optical microscopy. Biodegraded wood samples analysed for chemical composition and weight and component losses were determined. High-yield kraft pulping of biotreated wood samples was performed to evaluate the effect of different fungal preteatments on bio-kraft pulping. The growth ability of the fungi in low-cost culture media was evaluated aiming to increase growth rates. The capacity of these cultures to produce chlamydospores was also evaluated since these spores are suitable for storage and inoculation on a large scale. The two fungal species used in this study displayed extracellular metabolic activity. In the group of hydrolytic enzymes, xylanases were detected throughout the cultivation period, the maximum being observed after 14 days of biodegradation. In contrast, cellulase levels where very low. Most significant oxidative enzyme was MnP, which showed enzymatic activity in both fungal species, the maximal production being detected after 14 days in all culture conditions. LiP and CDH activities were not detected in any of the cultures evaluated, whilst lacase activity was detected only on initial stages of wood decay and in low quantities. Lignin losses were higher in E. grandis cultures than in P. taeda. The 3 fungal strains tested grew well in simple and low-cost media such as corn steep liquor-sucrose medium and produced chlamydospores without any induction, however osmotic shock was efficient to increase the contents of these spores. 4

9 RESUMO Morfo-fisiologia da biodegradação de madeiras por Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. e Phlebia tremellosa (Sch rad.:fr.) Nakas. & Burds. (Fungi, Basidiomyce tes). Priscila Brasil de Souza Cruz. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. André Luis Ferraz (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP116, , Lorena, SP, Brasil). Co-orientador: Dra Clarice Loguercio- Leite (Departamento de botânica, UFSC, CP 476, CEP ). Este trabalho se propôs a estudar aspectos enzimáticos e morfológicos envolvidos no processo de biodegradação de madeira por fungos causadores de podridão branca. As madeiras de Pinus taeda L. e Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden foram inoculadas com Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv. (cepas SS3 e CS1) e Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds. (cepa ATCC 48745) em biorreatores de fermentação sólida durante períodos que variaram de 7 a 28 dias. A partir dos extratos obtidos das culturas foram investigadas as enzimas de natureza hidrolítica como celulases, endocelulases e xilanases, bem como as de natureza oxidativa, como lacases, peroxidases e celobiose desidrogenase. A partir dos cavacos colonizados foram analisados aspectos morfológicos da colonização da madeira por microscopia óptica. As madeiras biodegradadas também foram analisadas quanto à perda de massa e de componentes. Observaram-se as modificações que essas cepas provocaram na madeira e quais as conseqüências destas sobre a biopolpação. A comparação do crescimento dessas cepas em meios de cultura de baixo custo foi realizada com o intuito de aumentar a velocidade de crescimento e baratear o custo de produção do micélio, tal comportamento foi avaliado através de curvas de crescimento. Paralelamente também foi avaliada a capacidade dessas culturas produzirem clamidósporos, como possibilidade de serem utilizados para a estocagem e inoculação em escala ampliada. As duas espécies utilizadas neste trabalho apresentaram atividade metabólica extracelular. Dentro do grupo das enzimas hidrolíticas a atividade enzimática de xilanase foi detectada em todos os períodos de cultivo, sendo que o máximo de atividade encontrava-se aos 14 dias de cultivo, ao contrário de celulase da qual não foi detectada atividade significativa. No complexo oxidativo a enzima de destaque foi a MnP, que apresentou atividade enzimática em ambas espécies sendo que o máximo foi detectado aos 14 dias em todas as condições de cultivo. As atividades enzimáticas de LiP e CDH não foram detectadas em nenhum dos cultivos testados, já a atividade de lacase foi baixa em todos as condições avaliadas. Quanto à perda de lignina observou-se que, de forma geral, nos cultivos no qual o substrato era E. grandis a perda foi mais extensa do que nos cultivos em P. taeda. Os fungos testados crescem bem em meio simples como milhocina-sacarose que tem um custo baixo e as duas espécies de fungos utilizadas neste trabalho são capazes de produzir clamidósporos sem qualquer indução, mas pode-se aumentar a quantidade de clamidósporos produzidos através de indução por choque osmótico. 5

10 1. INTRODUÇÃO O estudo da biodegradação de madeira apresenta grande importância acadêmica e tecnológica. Do ponto de vista acadêmico, estudar a processo biodegradativo significa contribuir com o entendimento do ciclo natural do carbono que tem início na biossíntese dos componentes da madeira a partir de CO 2 atmosférico e termina com a liberação do mesmo gás, após a mineralização desses componentes em decorrência da decomposição induzida por fungos degradadores de madeira. Do ponto de vista tecnológico, a biodegradação de madeira pode ser utilizada no processo de biopolpação. Este processo consiste em tratar a madeira sob condições controladas com fungos previamente selecionados e posteriormente submeter a madeira biotratada a processos convencionais de polpação destinados a produção de celulose e papel. A combinação de um pré-tratamento fúngico com a polpação mecânica permite reduzir em até 40% o consumo de energia elétrica durante o desfibramento/refinamento mecânico. Além disso, as biopolpas apresentam maior resistência mecânica do que as polpas convencionais. Este processo já vem sendo testado em escala ampliada (degradação de 50 toneladas de cavacos planta piloto na empresa Melhoramentos Ltda., Caieras - SP) e sua implementação industrial depende de otimizações oriundas dos estudos em escala piloto e do licenciamento da tecnologia (AKHTAR et al., 1998). No caso do prétratamento fúngico combinado com a polpação química, os resultados mais promissores indicam reduções expressivas na demanda de álcali ativo em processos de polpação kraft destinados à produção de polpas de alto rendimento, usualmente utilizadas na fabricação de papéis de recobrimento de caixas ou em papéis de embalagem (MENDONÇA et al., 2002). Apesar do processo de biopolpação já se encontrar em vias de 6

11 implementação industrial, pouco se sabe sobre os mecanismos químicos e bioquímicos que poderiam explicar os benefícios observados para o pré-tratamento da madeira com os fungos ligninolíticos. Os fungos estudados atualmente foram selecionados com base na habilidade de crescerem rapidamente, degradarem lignina seletivamente, reduzirem o consumo de energia durante a polpação mecânica e melhorarem a resistência das polpas produzidas a partir da madeira biotratada. Várias espécies têm sido selecionadas por diferentes pesquisadores de forma empírica, no entanto não se sabe exatamente o que difere as espécies avaliadas em termos de metabólitos extracelulares responsáveis pelas transformações que causam os benefícios da biopolpação. Não há, até o momento, estudos sistematizados que verifiquem os tipos de transformações, quais diferentes espécies e cepas de fungos as causam e quais as conseqüências dessas transformações sobre a eficiência da biopolpação. O presente trabalho contribuiu nesse sentido, ao abordar o modo de ação de três cepas de duas espécies de basidiomicetes agindo sobre a madeira de duas espécies arbóreas (Pinus taeda e Eucalyptus grandis). 7

12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA COMENTADA A biodegradação da madeira é um processo natural de reciclagem da matéria orgânica e ocorre em todos os ambientes naturais (terrestres e aquáticos) quando as condições ambientais são favoráveis. A madeira pode ser colonizada rapidamente por vários organismos, os quais através do processo de biodegradação solubilizam os componentes estruturais da madeira (polissacarídeos e lignina) inicialmente a moléculas simples e finalmente a CO 2 e água (DANIEL, 2003). Dentre os vários organismos que podem degradar a madeira, os basidiomicetes causadores de podridão branca despertam grande interesse uma vez que podem ser aplicados a processos biotecnológicos como no caso da biopolpação. Entender melhor os mecanismos biológicos responsáveis pela degradação da madeira e especialmente da lignina é um importante pré-requisito para o desenvolvimento e otimização dos processos de biopolpação (MESSNER, et al., 2003) Composição química e ultraestrutura da madeira A madeira é constituída por celulose, polioses, lignina, pequenas quantidades de extrativos e sais minerais, e apresenta-se como um material complexo que deve ser estudado considerando suas propriedades químicas e morfológicas. Em geral, as madeiras podem ser classificadas em duras "hardwood" ou moles "softwood". As madeiras duras são provenientes de árvores produtoras de folhas e frutos (angiospermas), como, por exemplo, eucalipto, ipê e peroba, já as madeiras moles são extraídas de árvores não produtoras de flores e frutos (gimnospermas), tais como, pinheiro e cipreste (FENGEL E WEGENER, 1989). As características anatômicas e microestruturais da madeira variam entre as diferentes espécies, sendo que as madeiras 8

13 moles tendem a ter uma estrutura mais simples quando comparadas às madeiras duras (DANIEL, 2003). As madeiras duras e moles diferem quanto à proporção de seus componentes, a estrutura química da lignina e das polioses, ao arranjo e tipos de células e quanto à susceptibilidade à biodegradação. Em termos ultraestruturais, as madeiras moles se caracterizam por apresentar de 90 a 95% de traqueídeos, 5 a 10% de células de raio e 0,5 a 1,0% de canais de resina. Outra característica importante das madeiras moles, quando se considera a produção do papel e celulose, é que elas possuem fibras mais longas que as madeiras duras. Essa característica confere boa qualidade aos papéis originados de madeiras moles, mesmo aqueles produzidos com processos mecânicos ou termomecânicos. Já as madeiras duras têm uma estrutura mais complexa que incluem, 36 a 70% de fibras, 20 a 55% de elementos de vaso, 6 a 20% de células de raios e 2% de células parenquimáticas (BIERMANN, 1996; DANIEL, 2003). A composição química das madeiras moles difere das madeiras duras quando comparadas às proporções dos seus diferentes componentes como demonstrado na tabela 1. Tabela 1 - Composição química das madeiras moles e duras (BIERMANN, 1996). Componentes Madeira dura (%) Madeira mole (%) Celulose Galactoglucomanana Xilana Lignina Extrativos A celulose é o principal polímero tanto em madeiras duras quanto em madeiras moles. Trata-se de um polímero linear de anidro-glicose ligado por ligações β-(1-4)-glicosídicas (FENGEL E WEGENER, 1989). 9

14 As polioses são uma classe de polímeros de açúcar incluindo as hexoses (glicose, manose, galactose e ácido metilglucurônico) e as pentoses (xilose e arabinose). As polioses apresentam-se na forma de polímeros ramificados de menor massa molar que a celulose e podem ser homopolímeros (exemplo: xilana, formada por xilose) que tipicamente ocorrem em madeiras duras ou heteropolímeros (exemplo: glucomanana, formada por glicose e manose), que predominam nas madeiras moles. As polioses de madeira mole são compostas por galactoglucomanana, glucomanana, arabinoglucuronoxilana e arabinogalactana e as de madeira dura por glucuronoxilana e glucomanana (HON e SHIRAISHI, 2001). A lignina é uma macromolécula complexa com estrutura tridimensional amorfa composta por unidades de fenilpropano (guaiacil, siringil e ρ-hidroxifenil). Os diferentes tipos de acoplamento entre os precursores dão origem a vários tipos de ligações entre as unidades fenilpropano como β-o-4 e α-o-4 (50-65%), β-1 (9-15%), β-5 (6-15%), 5-5 (2-9%) e β-β (2-5%). A estrutura da lignina é diferente entre os dois tipos de madeira, a lignina de madeiras moles é composta de 90% de unidades guaiacil e a lignina de madeiras duras é composta de quantidades aproximadamente iguais de siringil e guaiacil. A lignina tem um papel significante na proteção natural da madeira, pois grandes quantidades de lignina e a presença de lignina guaiacil promovem uma maior proteção natural do que baixos níveis de lignina e lignina siringil (DANIEL, 2003). Estruturas modelo para lignina de madeiras moles e duras são mostradas nas figuras 1 e 2 (FENGEL E WEGENER, 1989, BIERMANN, 1996). 10

15 H 3 C O C H 2OH H C = O H C H 3 C O H C 1 O β - O - 4 H 3 C O H 2 C O H C H H C O H 2 4 O H 3 C O H 2 C O H C H H C O H 5 6 γ H 2 C O H _ H C _ O β H C O H α H 2 C O H 16 H C O O C H H C O H 2 C H 15 H C O H H 3 C O H 2 C O H H C H C O H H 2 C O H O C H H 3 C O H C O H O C H 2 β H C O C H 3 H C O 13 O H O H O C 14 O O C H 3 O C H 3 H O 9 7 H O C H 2 H 3 C O H C O C = O O C H 3 H C O 3 H O C H 2 H C O 3 H C H C O H H C O 3 H 2 C O H β - 1 C H H C O H 8 O H 2 C O H H C O H C O H O H C C H 2 β - β H C C H H C O C H 2 O O H O - H - H O H 2 C C C = O 10 O C H 3 O C H 3 Figura 1 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeiras moles proposta por Adler (FENGEL e WEGENER, 1989). H 2 COH CH H H COH 2 COH 2 CH CH H C H 2 COH O CO CO HC CH CHO 2 OCH 3 HC CH CH H 2 COH H 2 COH O HC CH H C CH H 3 CO 0.4 OCH 3 H CO O 2 COH HC O H 3 CO OCH 3 HC OCH OCH H 2 COH H CO OCH 3 H 2 COH HC O OH H C O H H 3 CO 3 CO C O CH H 2 COH O CH H 2 COH H 2 COH O CH OCH 3 H C O CH O CH OCH H 3 2C COH OCH 3 COH HC O H OCH 3 CO OCH 3 H O 3 H 3 CO OCH 3 CHO O H 3 CO OCH 3 H 2 COH H 2 COH H 3 OC OCH 3 OCH 3 H 2 C CH OH H 2 COH O CH HC O O HC CH HC O CH CO HOCH 2 CH CO HC CH 2 O C H OCH 3 H 2 COH O CH 2 H 3 CO H 2 COH C O CH H 3 CO OCH 3 H 3 CO OCH O O CH CH HC O 3 OCH HOCH CH CHO 3 OH 2 CO H 2 COH OCH 3 H 3 CO H 2H COH H 2 COH O H C H C CH 3 CO HC O O CH 2H 2 HOCH HC C CH O CH 2 CH CHO HC CH 2 CH 2 H OCH H 3 CO OCH OCH 3 CO H OCH O OH 3 CO 3 OCH OH 3 nach Nimz, H O O 0.5 Angew. Chem. internat. Edit., 13, Figura 2 - Modelo de uma estrutura de lignina de madeira dura proposta por K. Nimz (FENGEL e WEGENER, 1989). 11

16 Existe ainda uma fração menor da madeira, formada basicamente por compostos fenólicos e resinas, que comumente são chamados de extrativos (solúveis em solventes orgânicos e água) e compreendem cerca de 2 a 4% (HIGUCHI, 1985; FENGEL E WEGENER, 1989). É interessante ressaltar que todos os constituintes da madeira estão intimamente associados e/ou ligados quimicamente. A lignina forma um complexo com as polioses encapsulando a celulose, reduzindo a disponibilidade destes dois componentes na parede celular (READING et al., 2003). Na parede celular, a lignina está associada às polioses através de interações físicas e ligações covalentes. O fato de a lignina envolver as células funcionando como uma cola dificulta a biodegradação, protege a árvore contra o ataque de microrganismos e confere coesão à estrutura interna além de resistência ao esforço mecânico (FENGEL E WEGENER, 1989; HOFRICHTER, 2002; READING, et al., 2003) Biodegradação da madeira Embora a madeira possa ser atacada por vários organismos, no ecossistema terrestre os fungos são os principais decompositores. As enzimas extracelulares produzidas pelos fungos degradadores de madeira e o subseqüente processo de decomposição difere entre os vários grupos de fungos, resultando em diferentes tipos de degradação (AKHTAR, et al., 1997). Os fungos degradadores de madeira são agrupados em três categorias. Os fungos de podridão branda ou softrot (Ascomycetes e Deuteromycetes) causam a degradação da lignina e carboidratos, porém em velocidades muito baixas. Já os causadores de podridão castanha ou "brown-rot" (Basidiomycetes) degradam principalmente polissacarídeos. No caso dos de podridão branca ou "white-rot" (Ascomycetes Xylariales e Basidiomycetes) todos os componentes da madeira são degradados (HIGUCHI, 1985; FENGEL E 12

17 WEGENER, 1989; DEACON, 1997). Os fungos causadores de podridão branca são os mais eficientes degradadores de lignina, podendo degradá-la seletivamente ou simultaneamente. Os fungos que pertencem a este grupo são de grande interesse para a indústria de papel e celulose por sua capacidade de degradar lignina, embora muitos destes fungos também possam degradar celulose e polioses (BLANCHETTE, 1991; BLANCHETTE et al., 1992; KIRK E CULLEN, 1998; AKHTAR et al., 1998). Os fungos que degradam a lignina seletivamente podem ter diferentes aplicações biotecnológicas, tais como a deslignificação de materiais ligninocelulósicos (madeira, palha e outros resíduos agrícolas) para processos de biopolpação, o biobranqueamento de polpas, a biorremediação de poluentes aromáticos e a produção de ração animal (BLANCHETTE, 1994; AKHTAR et al., 1998; MESSNER et al., 2003). As primeiras vias de colonização da madeira por todos os tipos de fungos são usualmente as células dos raios que são vias anatômicas de mais fácil acesso e menor resistência (fig. 3). Através das células do raio as hifas têm acesso aos nutrientes de reserva não estruturais de fácil assimilação contidos nas células parenquimáticas (não lignificadas). A partir das células parenquimáticas do raio as hifas se espalham pelo lúmem das fibras e vasos e avançam através das pontoações ( pits ). hifas Figura 3 Vias de colonização da madeira pelas hifas. 13

18 Por meio da ação do complexo enzimático produzido por essas hifas dá-se o processo de decomposição da madeira (KIRK E CULLEN, 1998; MESSNER, et al., 2003; DANIEL, 2003). No entanto, a acessibilidade das enzimas na madeira, e nas fibras é limitado, devido a fatores como adsorção à superfície, baixa porosidade da fibra e pequeno tamanho dos poros das fibras. Além do que, a organização molecular e a associação dos diferentes componentes da parede celular da fibra (celulose, polioses e lignina) formam uma matriz impenetrável que também limita o acesso dos microorganismos e suas enzimas (KUHAD et al., 1997; DANIEL, 2003). Dessa forma, assume-se que o processo de biodegradação de um substrato lignocelulósico, como a madeira, ocorre pela ação combinada de uma variedade de sistemas enzimáticos e alguns agentes não enzimáticos de baixa massa molar como o ácido oxálico, álcool veratrílico, ácido antranílico, ácidos graxos insaturados e agentes redutores de ferro, que são produzidos extracelularmente pelos fungos. Através destes sistemas lignocelulolíticos, os fungos degradam os componentes insolúveis da madeira, transformando-os em componentes menores e solúveis, os quais podem ser incorporados ao seu metabolismo (FENGEL E WEGENER, 1989; TUOR, et al., 1995; SETHURAMAN et al., 1998; MESSNER et al., 2003). A biodegradação da celulose é um tópico bem elucidado do ponto de vista bioquímico. A degradação do polímero é feita pela ação das celulases (endo-1,4-β-glicanases, exo-1,4-β-glicanases e 1,4-βglicosidases). As enzimas atuam de forma cooperativa, causando a hidrólise completa da celulose até glicose (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990; EVANS et al., 1994). A biodegradação das polioses requer um conjunto de enzimas extracelulares mais complexo devido a sua estrutura de heteropolissacarídeo ramificado. As enzimas envolvidas na biodegradação das polioses são hidrolases específicas que clivam determinados tipos de ligações existentes no polímero. Assim, as xilanases rompem ligações 14

19 glicosídicas entre unidades de xilose; as mananases atuam sobre ligações glicosídicas entre moléculas de manose e as glucuronidases sobre ligações de ácidos urônicos com moléculas de açúcares. As hemicelulases são divididas em endo-hemicelulases, exo-hemicelulases e xilosidases e, como as celulases, atuam de forma cooperativa provocando a hidrólise completa das hemiceluloses até seus monomêros (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990). A biodegradação da lignina ainda não foi completamente elucidada devido a sua maior complexidade estrutural, mas supõe-se que um grupo amplo de enzimas esteja relacionado à sua biodegradação. No entanto, existem ainda hoje, controvérsias sobre a real participação de cada grupo de enzimas e a função que cada um deles exerce no processo global de oxidação que leva a lignina até dióxido de carbono e água. Essas enzimas podem ser agrupadas em pelo menos duas classes distintas, as fenoloxidases e as enzimas que produzem peróxido de hidrogênio (HIGUCHI, 1985; ERIKSSON et al., 1990; BLANCHETTE, 1991; RUEL et al., 1994). As fenoloxidases podem ser divididas em dois subgrupos. Um contém as peroxidases, enzimas dependentes de peróxido, que estão envolvidas na biodegradação da lignina como: lignina peroxidase (LiP, EC ) e manganês peroxidase (MnP, EC ). O outro subgrupo contém as lacases (EC , benzenediol:oxigênio oxidoredutase) que são enzimas que não dependem de peróxido para atuarem (HAKALA, et al., 2005). Essas enzimas oxidativas são comumente produzidas por fungos de decomposição branca em diferentes combinações. Existem espécies fúngicas que são eficientes degradadoras de lignina e produzem somente um ou outro tipo de enzima. Cerca de 60% dos fungos causadores de podridão branca estudados até agora secretam MnP e lacase, como combinação mais comum (LI, 2003; HAKALA, et al., 2005). As enzimas que produzem peróxido de hidrogênio são acessórias às peroxidases, gerando peróxido de hidrogênio in situ e possibilitam que as peroxidases atuem (KIRK E CULLEN, 1998). 15

20 A ação dessas enzimas sobre a lignina leva a reações de oxidação que progressivamente decompõem a macromolécula até compostos de baixa massa molar que podem ser susceptíveis ao metabolismo intracelular do fungo. No caso da ação da LiP (fig. 4), a degradação de lignina ocorre através da formação inicial de um radical catiônico nos núcleos aromáticos. A formação do radical catiônico induz à ruptura de ligações, principalmente entre os carbonos α e β e a conseqüente degradação química (pela ação do oxigênio e da água) dos intermediários formados (HIGUCHI, 1985, 1990; FERRAZ E DURÁN, 1995; RODRIGUEZ et al., 1997, KIRK e CULLEN, 1998). Já nos casos da MnP e da lacase (fig. 5 e 6 respectivamente), sabe-se que as enzimas possuem baixo potencial de oxidação e podem abstrair elétrons somente de estruturas fenólicas, não atuando diretamente sobre anéis aromáticos cujos oxigênios da posição 4 estão eterificados (estruturas não fenólicas). Isso limitaria a ação dessas enzimas a uma pequena fração da lignina, já que a macromolécula apresenta somente cerca de 10% dos oxigênios da posição 4 na forma de estruturas fenólicas livres. Alguns resultados recentes (apresentados no item 2.4) mostram que, ao menos a MnP, pode atuar sobre estruturas não fenólicas mediada pela peroxidação de lipídeos insaturados. H 2 O C 0 H 2 O 2 C I S S S + S + C II Figura 4 Ciclo catalítico simplificado de lignina peroxidase (LiP). S representa um substrato aromático não fenólico (FERRAZ, 2004). 16

21 H 2 O C 0 H 2 O 2 C I Mn 3+ Mn 2+ ou Mn 3+ Mn 2+ PhOH PhO. C II Figura 5 Ciclo catalítico simplificado de peroxidase dependente de Manganês (MnP). PhOH representa um substrato fenólico (FERRAZ, 2004). O 2 Lacase (Cu 2+ ) PhO H 2 O Lacase red. (Cu 1+ ) PhOH Figura 6 Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequeometria do ciclo envolve 4 Cu 2+ (normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O 2 (FERRAZ, 2004). A celobiose desidrogenase (CDH) é uma enzima que faz parte do sistema enzimático extracelular dos fungos celulolíticos e degradadores de madeira, sistema no qual a CDH pode estar envolvida tanto na degradação de celulose como de lignina, apesar de ser uma enzima que oxida a celobiose e a manobiose que são respectivamente produtos da degradação de celulose e manana (HENRIKSSON, et al., 2000b; BAMINGER, et al., 1999). O exato papel biológico da CDH não está completamente entendido. Foi sugerido que esta enzima atua de diversas formas: (i) prevenindo a inibição por produto durante a degradação da celulose através da oxidação da celobiose; (ii) produzindo radicais hidroxila através da reação do tipo Fenton que pode ter um papel na degradação dos polissacarídeos e da lignina; (iii) inibindo a polimerização de radicais aromáticos produzidos pela LiP; e 17

22 (iv) disponibilizando manganês (MnII) para MnP através da redução de precipitados de óxido de manganês (MnO 2 ) (HILDÉN, et al., 2000). Esta enzima foi encontrada e purificada em vários basidiomicetes causadores de podridão branca como Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor (L.:Fr.) Pil., e em alguns outros fungos causadores de podridão mole e em bolores (HENRIKSSON, et al., 2000a). Outro aspecto importante a ser considerado na biodegradação de madeira é que apesar dos muitos estudos sobre as enzimas que estariam envolvidas na biodegradação, ainda não se consegue explicar muito bem como estas penetrariam na parede das células componentes da madeira. Desde o ponto de vista microscópico pode-se diferenciar dois modos principais de degradação da célula vegetal por fungos de decomposição branca. O primeiro envolve uma escamação progressiva da parede celular no sentido lúmen-lamela média, levando à diminuição progressiva da espessura da parede celular. Outro modo de degradação que tem sido observado em fungos seletivos para a degradação de lignina, envolve a remoção de lignina e polioses sem a simultânea erosão da parede celular vegetal. Nesses casos, a parede celular, apesar de degradada, mantém sua forma original (AGOSIN et al., 1990, BLANCHETTE et al., 1997, KIRK e CULLEN, 1998). Os mecanismos distintos de degradação envolvidos em cada caso têm sido objeto de muitos estudos e um aspecto a ser considerado é o modo de ação das enzimas extracelulares sobre o complexo lignocelulósico. Figura 7 - Microscopia ótica mostrando o ataque progressivo (erosão) da parede celular de Picea abies por Heterobasidium annosum Note que a célula ao centro apresenta erosões irregulares na parede celular. A escala no canto superior esquerdo da foto indica a magnitude do aumento (FERRAZ, 2004). 18

23 Figura 8 - Microscopia eletrônica de transmissão mostrando o ataque não erosivo da parede celular de madeira. Notophagus dombeyi degradado por Ganoderma australe. Corte fixado com KMnO 4 para contraste da lignina. (A) células intactas, (B) e (C) as setas indicam o avanço do ataque onde as áreas de menor contraste estão livres de lignina. (D) células completamente livres de lamela média (FERRAZ, 2004). Vários trabalhos têm demonstrado que enzimas lignocelulolíticas não penetram na parede celular intacta (GOODELL, et al., 1997; FLOUNOY et al., 1993; SREBOTNIK et al., 1988). Com isso, a degradação enzimática dos componentes da parede celular não poderia justificar o modelo de ataque não erosivo que descrevemos anteriormente. Ou seja, se as enzimas responsáveis pela decomposição dos componentes da madeira não podem penetrar na parede celular vegetal, somente um processo de escamação da parede celular pode ser efetivo na biodegradação. No entanto, para os fungos de decomposição branca que degradam lignina seletivamente, esse modelo não é adequado. Em trabalho bastante esclarecedor, BLANCHETTE et al. (1997) demonstraram que culturas de C. subvermispora (um dos fungos mais seletivos já descritos para a degradação de lignina) causam alterações estruturais significativas na lignina presente na parede celular e na lamela média, mesmo antes da parede celular vegetal ser permeável a proteínas do tamanho da insulina (5730 Da). Dessa forma, vários trabalhos têm proposto que alguns compostos de baixa massa molar poderiam atuar ao menos nos estágios iniciais de biodegradação da lignina (KAPICH et al, 2005). Estes compostos deveriam apresentar 19

24 atividade degradativa, mas teriam que ser suficientemente pequenos para penetrar no complexo celular vegetal, degradar os componentes aí existentes e com isso desestruturar a parede celular a ponto de permitir a penetração de enzimas oxidativas e hidrolíticas (EVANS et al, 1994) Basidiomicetes causadores de podridão branca com potencial para a biopolpação Na biopolpação, a madeira é pré-tratada pelo fungo e posteriormente submetida à polpação mecânica ou química. Os benefícios do pré-tratamento biológico incluem a redução de energia requerida para o desfibramento/refinamento da madeira (no caso de polpas mecânicas) e a redução da demanda por produtos químicos no caso das polpações químicas. Adicionalmente, as biopolpas usualmente possuem melhores qualidades mecânicas que os respectivos controles, o que permite a preparação de papéis de melhor qualidade (AKHTAR et al., 1998). Os fungos causadores de podridão branca que podem ser aplicados na biopolpação foram inicialmente selecionados com base na habilidade de crescerem rapidamente e degradarem lignina seletivamente. Esta seletividade é estimada com base em análises químicas do conteúdo de lignina e açúcares liberados pela hidrólise ácida da madeira biotratada (AKHTAR et al., 1997). Baseado neste tipo de seleção, várias espécies têm sido selecionadas por diferentes pesquisadores, entre elas estão Ceriporiopsis subvermispora (Pil.) Gilbn. & Ryv., Phanerochaete chrysosporium Burds., Phlebia brevispora (Nakas.), Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. & Burds., Phlebia subserialis (Bourd. & Galz.) Donk, Perenniporia medullapanis (Jacq.:Fr.) Donk, Dichomitus squalens (Karst.) Reid, Phellinus pini (Thore.:Fr.) A Ames, Phlebia radiata (Fr), Hyphodontia setulosa (Berkeley & M.A. Curtis) Maas Geesteranus, e Physisporinus rivulosus (Berk. & M.A. 20

25 Curtis) Ryvarden. Dentre as várias espécies de fungos estudadas C. subvermispora foi considerada como uma das mais apropriados para ser utilizada no processo de biopolpação, visto que degrada lignina seletivamente, reduz o consumo de energia durante o desfibramento e melhora a resistência do papel obtido a partir das biopolpas (AKHTAR et al., 1997 E 1998). Entretanto, essa seleção foi feita de forma empírica, uma vez que, não se sabe exatamente no que diferem as espécies indicadas, em termos de produção de metabólitos extracelulares responsáveis pelas transformações químicas que tornam industrialmente atrativo o processo de biopolpação. Tais basidiomicetes importantes para a indústria, considerando o número de espécies existentes na natureza, são estudados em número reduzidíssimo, apesar do óbvio potencial em aplicações biotecnológicas. Identificar e escolher as melhores espécies com tal finalidade, é um problema crítico, que demandará muito tempo e investimento em pesquisa. Através da taxonomia, que é a ciência que permite classificar os organismos, via filogenética, pode-se determinar graus de parentescos entre organismos, selecionando assim organismos parentes, que podem apresentar habilidades similares em produzir metabólitos úteis em processos biotecnológicos. Sabendo que uma espécie de um gênero apresenta características interessantes, como, por exemplo, produzir metabólitos secundários ou enzimas de interesse biotecnológico, poder-se-ia supor que outras espécies do gênero ou de gêneros próximos e relacionados também apresentariam as mesmas características. Desse modo, quando uma característica desejada é encontrada em uma espécie em particular, um procedimento recomendável para encontrar espécies com características similares é fazer uma seleção entre organismos de um mesmo gênero e/ou família (BURDSALL, 1998). Com base nesta hipótese foram selecionadas para o estudo aqui proposto duas cepas de Ceriporiopsis subvermispora (SS-3 e CS-1) e uma de Phlebia tremellosa que é considerada filogeneticamente próxima a Ceriporiopsis (BURDSALL, 1998). 21

26 Ceriporiopsis Dom. é um gênero poróide que pertence à família Coriolaceae ou Polyporaceae (BURDSALL, 1998). C. subvermispora é uma espécie rara, encontrada em regiões temperadas, distribui-se no sul do Canadá, no norte da América do Norte e na Europa Central (GILBERTSON E RYVARDEN, 1986). Na natureza, coloniza basicamente madeiras moles, i. e. gimnospermas (BLANCHETTE et al., 1992). Um consórcio formado por indústrias do setor de celulose e papel, a Universidade de Wisconsin e o USDA - Forest Products Laboratory em Madison, EUA desenvolveu vários estudos que culminaram na seleção de C. subvermispora (AKHTAR et al., 1998). Esta espécie se mostrou excelente para uso em biopolpação, principalmente por degradar a lignina seletivamente e por manter a celulose praticamente intacta, após curtos períodos de degradação (AKHTAR et al., 1998). Resultados, bastante animadores já foram reportados envolvendo a utilização de C. subvermispora no pré-tratamento de madeira anterior a processos mecânicos, termomecânicos (SETLIFF et al., 1992; AKHTAR et al., 1992, 1993; MESSNER E SREBOTNIK, 1994) e de polpação sulfito, organosolv, Kraft e sulfito/antraquinona (SCOTT et al., 1996, FERRAZ et al., 1998, MENDONÇA, et al., 2002, MENDONÇA et al., 2004). Por outro lado, Phlebia Fr. (emend Donk), um gênero da família Meruliaceae (KIRK et al., 2001), tem certas espécies poróides, sendo próximo a Phanerochaete Karsten segundo ERIKSSON e seus colaboradores (1981). Estudos moleculares, que consideram o gênero Phlebia na família Corticiaceae, o localizam dentro de um grupo denominado clado poliporóide, i. e., aparentado tanto a Ceriporiopsis, quanto a Phanerochaete (HIBBETT E THORN, 2001). Phlebia tremellosa (Schrad.:Fr.) Nakas. et Burds. tem sido citada como outra espécie promissora para biopolpação e pré-tratamento de resíduos agrícolas para produção de ração animal, uma vez que degrada lignina seletivamente (VARES et al.,1994). No entanto, existem poucos trabalhos na área de biopolpação com esta espécie e pouco se conhece sobre o seu perfil de produção de enzimas extracelulares. Alguns 22

27 autores caracterizam P. tremellosa como produtora de LiP e lacase (VARES et al., 1994; TUOR et al., 1995). No entanto, HATAKKA (1994) afirma que esta espécie produz todas as enzimas ligninolíticas (LiP, MnP e lacase), o que demonstra que são necessários mais trabalhos para avaliar completamente esta espécie Mecanismo de ação sobre a lignina Apesar da crescente importância de C. subvermispora na aplicação industrial, o sistema enzimático extracelular deste fungo ainda não está completamente esclarecido. Um grande problema a ser elucidado é o diferente comportamento do sistema enzimático frente a cada tipo de substrato. Muitas publicações têm mostrado que o crescimento fúngico em substrato sólido é diferente quando comparado ao meio líquido, e conseqüentemente, os padrões de produção das enzimas e das isoenzimas são diferentes (MACHUCA e FERRAZ, 2001; VICUÑA et al., 1996; URZÚA et al., 1995). SETHURAMAN et al. (1998) acrescentam, ainda, que o padrão de produção das enzimas é extremamente dependente da fonte de carbono utilizada. C. subvermispora degrada lignina de um substrato ligninocelulósico através da ação de manganês peroxidase e lacase. A não produção da lignina peroxidases (LiP) seria crítica, pois essas enzimas apresentam a habilidade de atacar estruturas não fenólicas da lignina (RUTTIMANN-JOHNSON,1993, ENOKI et al., 1999, CÓRDOVA, 1999). No entanto, vários estudos revelaram ser eficiente a degradação de lignina por C. subvermispora mesmo sem a produção de LiP (RUTTIMANN-JOHNSON, 1993; SETHURAMAN, 1998). A produção de LiP não tem sido detectada em cultivos desse fungo mesmo em diversos meios e formas de cultivo (LOBOS et al., 1994). Um fato intrigante nesse aspecto é a não detecção de lacases em condições de cultivo onde o único substrato orgânico é o próprio composto lignocelulósico 23

28 (FERRAZ et al., 2002, SOUZA-CRUZ, 2002). Com isso, a degradação de lignina por esse fungo deveria, a princípio, ser atribuída principalmente a ação de MnP. Outro dado intrigante no modo de ação desse organismo é o fato de que a degradação de lignina ocorre notoriamente em pontos distantes da hifa fúngica, ou seja, o modelo erosivo de degradação da parece celular vegetal não se aplica. Em uma série de trabalhos esclarecedores JENSEN et al.(1996); SREBOTNIK et al. (1997) e KAPICH et al. (1999) demonstraram que o mecanismo químico envolvido na decomposição de lignina por C. subvermispora deve enquadrar-se necessariamente em um modelo onde um elétron é retirado diretamente de estruturas não fenólicas. Ou seja, a retirada do elétron é induzida por uma espécie ativa com elevado potencial de oxidação. Isso tem sido demonstrado pela verificação dos produtos de degradação de um composto modelo de lignina, marcado com carbono 14, ligado a uma cadeia polimérica de polietilenoglicol (PEG). Nesses estudos propõe-se que a degradação estaria relacionada com a peroxidação de lipídeos iniciada por Mn 3+ oriundo da ação de MnP. Essa hipótese poderia, inclusive, explicar a degradação da lignina no interior da parede celular da madeira através de um processo não erosivo, uma vez que este é baseado na ação de um mediador de baixa massa molar. Recentemente, KAPICH et al. (1999) demonstraram que os radicais peroxila oriundos da peroxidação de ácido linoléico por MnP de C. subvermispora podem atuar em modelos de lignina não fenólicos, abstraindo um elétron (e um próton) do carbono alfa, levando a posterior degradação de um composto modelo de lignina Aspectos fisiológicos e morfológicos que interferem no crescimento e na competição dos fungos pelo substrato Quando falamos em fungos, uma exata definição de crescimento 24

29 depende do método utilizado em sua determinação. A maioria dos métodos determina, diretamente ou indiretamente, o aumento em massa de um inóculo após um conhecido tempo de incubação em um meio de cultura completo. O aumento em massa ou o número de células pode dessa forma ser usado como uma definição funcional de crescimento. Em trabalhos experimentais utilizam-se meios sólidos em placas de Petri e/ou meios líquidos, em culturas agitadas ou estáticas (GRIFFIN, 1994). Um meio de cultura completo para o crescimento do fungo deve ter além de água, substâncias orgânicas apropriadas como fonte de carbono (ex. glicose), fonte de nitrogênio (ex. aminoácidos), certos íons inorgânicos (ex. K +, SO 2-4, PO 3-4, íons metálicos) em quantidades necessárias, e certos fatores orgânicos de crescimento (ex. vitaminas) em concentrações baixas. Além da composição do meio, um outro fator que afeta extensamente o desenvolvimento dos fungos na cultura é o ph. A investigação da relação entre ph e crescimento apresenta dificuldades. O problema é que o ph não varia sem alterar outras características do meio de cultura e raramente se mantém constante durante o crescimento, mesmo se o meio de cultura for tamponado (INGOLD E HUDSON, 1993). Há uma lacuna na informação sobre o efeito do ph nos parâmetros de crescimento do fungo, já que suas atividades metabólicas alteram o ph, aumentando-o através da absorção de ânions ou produção de amônia a partir de compostos nitrogenados; ou reduzindo-o pela formação de ácidos orgânicos ou absorção de cátions. Um tampão efetivo é difícil de ser utilizado em cultura, já que estes podem ser assimilados pelo fungo ou serem tóxicos em quantidades necessárias para uma tamponação eficiente. A concentração de íons hidrogênio pode afetar o crescimento tanto indiretamente pelo efeito na disponibilidade de nutrientes como diretamente pela ação nas superfícies celulares e sobre a permeabilidade da membrana. Quando os nutrientes requeridos são satisfatórios, a maioria dos fungos cresce bem sobre uma larga faixa de ph entre 4 e 7. Alguns fungos que produzem ácidos orgânicos são 25

30 capazes de tolerar condições consideravelmente mais ácidas (CARLILE E WATKINSON, 1996). Os sapróbios pertencentes à classe Basidiomycetes são morfologicamente e bioquimicamente adaptados a viver sobre substratos lignocelulósicos. Uma hipótese de sucessão na madeira iniciaria com os mitospóricos comuns (mofos) e com os de tingimento ( staining fungi ), continuando com os causadores de podridão mole e culminaria com a penetração de micélio dos basidiomicetes causadores de podridão parda e/ou branca (RAYNER & TODD, 1982). A colonização de um determinado substrato por uma espécie de fungo depende em parte pela habilidade competitiva saprofítica intrínseca e em parte pelo balanço entre o potencial do próprio inóculo e as espécies competidoras. A habilidade competitiva do fungo é determinada pela velocidade de germinação dos esporos e a taxa de crescimento da hifa jovem na presença de nutrientes solúveis do substrato; na habilidade de produzir enzimas necessárias a decomposição de componentes solúveis e insolúveis da madeira; na capacidade de lançar substâncias antibióticas capazes de inibir o crescimento de outro fungo e bactéria; e na habilidade de tolerar substâncias fungistáticas lançadas pelos outros organismos. Conhecendo a habilidade competitiva sapróbia do fungo no substrato é importante ainda considerar a energia para o crescimento que cada fungo tem quando começa a colonização, isto é chamado potencial de inóculo. Este depende do nível da população de um fungo contaminante (número de esporos e unidades de hifa), idade, presença de nutrientes no substrato e das condições ambientais (EATON E HALE, 1993). Os basidiomicetes, especialmente aqueles que utilizam a madeira como substrato tem um comportamento conhecido por ocupar um nicho economicamente e por muito tempo, ou seja, mantém uma população constante por longos períodos em equilíbrio com seu ambiente, a fim de não esgotar o substrato. Este tipo de comportamento faz com que métodos de competição antagonísticos sejam melhores para repelir uma 26

31 invasão de um substrato que ele já ocupa, do que competir pela colonização de novos substratos. No processo de competição, alguns basidiomicetes produzem antibióticos tais como substâncias fenólicas efetivas contra bactérias Gram + (p. ex Ganoderma australe) e fungos do solo (p. ex. Armillaria mellea), além de substâncias que inibem o crescimento de outros fungos (p. ex. Oudemansiella), porém as pesquisas sobre produção de antibióticos são ainda muito recentes (STAMETS, 2002). Outro tipo de inibição, a interferência hifal, é mais freqüentemente estudada em basidiomicetes do que a antibiose. Esta ocorre somente quando existe um contato físico entre as hifas. (CARLILE E WATKINSON, 1996; GERBER et al., 2000). O fungo que utiliza a madeira como única fonte de nutrientes mostra consideráveis adaptações tanto na sua morfologia como na sua bioquímica. A hifa de uma única espécie pode diferir consideravelmente em diâmetro, dependendo das condições ambientais e da sua posição na colônia. Existem também claras diferenças entre as espécies. Durante um determinado período de tempo de vida de uma colônia de basidiomicetes, há muitas vezes diferenças consideráveis entre as hifas. Inicialmente estas diferenças são simples como a taxa de crescimento, ângulos de ramificação e largura, mais tarde diferem em espessura e composição da parede, septações, conteúdo, habilidade de se agregar e fundir com outras, translocar nutrientes e água e em perceber e reagir a estímulos como a luz e a gravidade (CARLILE E WATKINSON, 1996) Produção de inóculo A palavra esporo define usualmente uma estrutura de reprodução microscópica com vários atributos e funções. As suas funções mais importantes são dispersão e sobrevivência, no entanto um mesmo tipo de esporo normalmente não concilia estas duas funções, geralmente os esporos dos basidiomicetes (basidiósporos) formados por reprodução 27

32 sexuada são melhores adaptados à dispersão do que a sobrevivência. Os esporos cuja função primária é a dispersão, apresentam paredes celulares finas e são pequenos em tamanho, estas características prejudicam a sobrevivência destes por longos períodos quando as condições ambientais não são favoráveis para o desenvolvimento de novas gerações. Já os esporos cuja função primária é garantir a sobrevivência da espécie durante períodos desfavoráveis para o crescimento, tendem a ser maiores em tamanho e possuir uma considerável reserva nutricional. As paredes celulares deste tipo de esporos são grossas e dependem geralmente de algum fator ambiental externo favorável para quebrar a condição de dormência (KRAMER, 1982). Ceriporiopsis subvermispora e Phlebia tremellosa não produzem esporos (basidiósporos) na fase miceliana dicarióptica. No entanto, têm a capacidade de produzir assexuadamente esporos de resistência (parede celular espessa), chamados clamidósporos (figura 9), quando crescem em condições de estresse ambiental e/ou nutricional. O fato destes fungos não produzirem basidiósporos na fase miceliana dicarióptica, apesar de interessante do ponto de vista da aplicação do fungo em ambientes abertos, pois não criaria problemas no que diz respeito à dispersão de esporos e conseqüente interferência no ecossistema local, gera alguns problemas para as etapas de preparação, estocagem e transporte do inóculo. a b Figura 9 Hifa com clamidosporos (a) terminal e (b) intercalar de Ceriporiopsis subvermispora SS3. 28

33 A capacidade de o fungo produzir clamidósporos, através de indução (provocando estresse ao fungo), pode minimizar problemas na produção de inóculo e estocagem como demonstrado por SAXENA e seus colaboradores (2001), onde os clamidósporos foram separados do micélio, estocados por longos períodos como um pó seco, à temperatura ambiente, mantendo-se viáveis. Os clamidósporos se desenvolvem de um único compartimento hifal, podendo ser intercalares ou terminais e são bastante resistentes a condições severas do ambiente. (ALEXOPOULOS et al., 1996). SAXENA e seus colaboradores (2001) induziram a formação de clamidósporos em C. subvermispora, através da manipulação de diferentes parâmetros como estresse nutricional e osmótico. Dentre os diferentes meios de estresse testados o mais eficiente (CaCl 2 1%) produziu cerca de 308 x 10 4 esporos/ml em 60 horas. Os clamidósporos foram separados do micélio por tratamento enzimático, liofilizados e estocados por até 6 meses à temperatura ambiente depois de empacotados. 29

34 3. OBJETIVOS O objetivo deste trabalho foi estudar o metabolismo extracelular de Ceriporiopsis subvermispora (Pilát) Gilbn. e Ryv. e Phlebia tremellosa (Fr.) Nakasone e Burdsall) evolutivamente aparentadas agindo sobre duas espécies vegetais Pinus taeda L. e Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden representantes de tipos diferentes de madeira para verificar se as madeiras biotratadas apresentam respostas diferenciadas frente ao processo de biopolpação. As espécies fúngicas em estudo foram, ainda, comparadas quanto a capacidade para crescer em meios de culturas simples e produzir clamidósporos, com o intuito de facilitar a produção e armazenamento de inóculo em larga escala. 3.1 Objetivos específicos: Definir padrões de degradação provocados pelas duas espécies fúngicas sobre madeira das duas espécies vegetais selecionadas, em três períodos de tempo pré-definidos, com adição ou não de cosubstrato. Extrair e determinar as atividades enzimáticas extracelulares hidrolíticas e oxidativas produzidas durante o processo de biodegradação. Caracterizar quimicamente a madeira biodegradada e verificar a resposta desta à polpação Kraft de alto rendimento. Avaliar o crescimento das espécies estudadas em meios de cultura simples e em ph diferentes. Induzir a produção de clamidósporos nas espécies estudadas e testar a viabilidade e eficiência na colonização das espécies vegetais. Analisar morfologicamente a colonização da madeira através de microscopia óptica Identificar o gênero dos contaminantes mais freqüentes presentes nas pilhas de cavacos processados em uma planta piloto de biopolpação. Realização de ensaios in vitro de competição antagonística entre Ceriporiopsis subvermispora e Phlebia e os fungos contaminantes isolados. 30

35 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Fungos utilizados e manutenção das culturas Duas espécies foram utilizadas correspondendo a 3 cepas, duas delas de Ceriporiopsis subvermispora, uma delas (CS1) cedida pela Universidad de la República, Montevideo, UY (Prof. M. Speranza), a outra (SS3) enviada por Forest Products Laboratory, Madison, USA (Dr. Masood Akhtar). A terceira cepa (ATCC 48745), refere-se a Phlebia tremellosa e foi adquirida da American Type Culture Colection As cepas foram mantidas a 4±2ºC, sem iluminação, em tubos de ensaio com meio ágar extrato de malte (2% de extrato de malte, 0,7% de extrato de levedura e 2% de ágar). Todo o processo de repicagem e inoculação foi realizado em câmara de fluxo laminar Meios de cultura Foram utilizados os seguintes meios de cultura, os quais foram previamente esterilizados a 121 o C por 15 minutos. Sólidos ou agarizados; AEML - Ágar extrato de malte (2% de extrato de malte, 0,7% de extrato de levedura e 2% de ágar). ABDL - Ágar batata (2,4% de extrato de batata dextrose, 0,7% de extrato de levedura e 2% de ágar). AM ágar-milhocina (3% ágar e 4% milhocina) Líquidos CBL - Caldo batata (2,4% de extrato de batata dextrose e 0,7% de extrato de levedura). MS - milhocina (3,2%) e sacarose (2%). 31

36 Solução de milhocina (5 g em base seca suspensa em 100 ml de água) 4.3. Preparação das madeiras para a biodegradação As madeiras tiveram diferente origem, a de Pinus taeda proveio de uma única tora oriunda do Parque Estadual de Campos do Jordão (Campos do Jordão, SP) com aproximadamente 28 anos. Por outro lado, árvores de cerca de 7-8 anos de Eucalyptus grandis, fornecidas pela empresa Melhoramentos Ltda. (Caieiras SP), foram as fontes desta madeira. Cavacos dessas madeiras medindo cerca de 3,0 X 1,2 X 0,2 cm foram secos ao ar e estocados em condições isentas de umidade. Previamente aos experimentos de biodegradação, os cavacos foram imersos em água por um período de 16 horas O excesso de água foi então drenado e os cavacos foram esterilizados no interior de Erlenmeyers de 2L a 1 atm de pressão, 121 o C por 15 minutos Preparação dos inóculos Em placas de Petri (10 cm de diâmetro) foram adicionados cerca de 15 ml de meio ABD. Estas placas foram inoculadas com pequenos fragmentos provenientes de cultivos estoque e incubadas a 27±2 o C. O crescimento do micélio foi monitorado diariamente até que este atingisse a borda da placa (de 7 a 10 dias), de onde foram extraídos discos de ±8 mm de diâmetro. Em 200 ml de meio CB foram introduzidos 20 discos obtidos do cultivo do micélio em meio sólido. Os frascos permaneceram em incubação estática por 10 dias em estufa a 27±2 o C. O micélio que foi obtido do cultivo em meio líquido (CB) foi filtrado em funil de Buchner estéril e lavado com 300 ml de água 32

37 esterilizada. Em um liquidificador com copo de alumínio (estéril) de 500 ml foram batidos 3 vezes, por 15 segundos (com intervalos para evitar o aquecimento), 100 ml de água destilada e a massa miceliana obtida após a filtração. Uma alíquota desta suspensão foi utilizada para inocular os cavacos nos Erlenmeyers. Para calcular a quantidade de micélio na suspensão, foi feita a determinação da massa seca de fungo presente numa alíquota dessa suspensão. Para determinar a massa seca, 25 ml da suspensão foi filtrada, em papel filtro previamente seco e tarado. O material retido no filtro, juntamente com o papel, foram secos, inicialmente a 60 C e posteriormente a 105 C, até atingir massa constante. Este procedimento foi realizado para cada cepa utilizada Experimentos de biodegradação de madeira Cada espécie de madeira foi inoculada com os inóculos fúngicos e cada experimento de biodegradação foi monitorado em três diferentes períodos de tempo (7, 14 e 28 dias). Para cada cepa o experimento foi realizado com a ausência ou presença de milhocina (0,5 g de milhocina/100 g de madeira, ambos em base seca). A carga de inóculo variou de acordo com a presença ou ausência de milhocina. Para Eucalyptus grandis foi utilizado 5 mg de micélio/kg de madeira na presença de milhocina, e 500 mg/kg na ausência do co-substrato; já para Pinus taeda a carga de inóculo foi de 5 mg/kg na presença de milhocina e 100 mg/kg na ausência do co-substrato (SOUZA-CRUZ, 2002; FERRAZ e AKHTAR, dados não publicados). Erlenmeyers de 2L foram carregados com 50 g de cavacos (base seca) e inoculados com uma suspensão de micélio em razões prédefinidas conforme descrito anteriormente. Nos cultivos onde houve a adição de milhocina, um volume de 5 ml de solução de milhocina (5 g em base seca suspensa em 100 ml de água) foi adicionado em cada frasco. Nos cultivos sem a adição de milhocina, cada Erlenmeyer 33

38 recebeu 5 ml de água. Os cultivos amostrados no 7º dia foram mantidos em sala termostatizada a 27±2 o C. Os cultivos que foram incubados por períodos superiores a 7 dias ficaram acondicionados em câmaras de crescimento (27±2 o C) com saturação de umidade do ar para prevenir a perda de água da madeira. Os ensaios foram feitos com 6 repetições que foram amostradas da seguinte maneira: 3 cultivos para extração e determinação de enzimas (SOUZA-CRUZ, 2002); 2 cultivos para determinação de biomassa fúngica e 1 cultivo para determinação do ph Determinação de Ph Para cada condição e tempo de cultivo, 1 Erlenmeyer foi reservado para a determinação do ph. O ph da madeira biodegradada foi medido na água resultante da imersão das 50 g de cavacos em 300 ml de água bidestilada (ph 7,0) por 48 horas a uma temperatura média de 25 C. O controle para a verificação da alteração do ph após a biodegradação, foi feito com 50 g de madeira que passaram pelo mesmo processo de imersão em água e esterilização anterior, mas não sofreram o processo de inoculação do fungo e posterior biodegradação (BROWNING,1967) Extração das enzimas A extração das enzimas foi conduzida com tampão acetato de sódio 50 mm, ph 5,5, adicionado de 0,01% de Tween 60 (MACHUCA E FERRAZ, 2001; SOUZA-CRUZ, 2002). Ao término de cada período de incubação foram adicionados 200 ml de solução de extração aos Erlenmeyers. Foi realizada uma extração de 5 horas, sob agitação (120 rpm) a 14±1 o C. Foi utilizado o período de 34

39 5 horas de extração com base no estudo realizado por SOUZA-CRUZ e colaboradores (2004) que demonstraram que cerca de 50% da atividade enzimática de manganês-peroxidase contida no cultivo é extraída nesse período. Os extratos enzimáticos foram recuperados por filtração através de filtros de vidro sinterizado, de porosidade n o 4, seguida de uma segunda filtração a vácuo utilizando um filtro de acetato de celulose, com poros de 0,47 μm, para que o extrato ficasse totalmente translúcido. As atividades enzimáticas relacionadas à degradação dos principais componentes da madeira (celulose, hemicelulose e lignina) foram determinadas em cada extrato enzimático e expressas como unidades internacionais (UI) por quilograma de madeira inicial. Atividades enzimáticas relacionadas à degradação de celulose. a) Celulase total: a atividade celulolítica total do extrato enzimático foi determinada utilizando-se papel de filtro Whatman N o 1 como substrato, seguindo o método padrão descrito por MANDELS et al. (1976). Foram incubados em um tubo de ensaio, 0,5 ml de extrato enzimático, 1,0 ml de tampão citrato de sódio 50 mm (ph 4,8) e uma tira de papel filtro correspondente a aproximadamente 50 mg. A mistura foi incubada a 50ºC por 1 hora. Os açúcares redutores liberados do papel de filtro pela ação do complexo celulolítico, foram determinados pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) segundo MILLER (1959) e expressos como μmoles de glicose, com base em uma curva de calibração feita com o mesmo açúcar. Para isso, à solução anterior, foram adicionados 3 ml de reagente DNS e a mistura foi mantida por 5 minutos em banhomaria a 100 C. Após resfriamento, foi feita a leitura da absorbância em 540 nm em um aparelho de UV-visível (GBC-CINTRA 20). Um controle foi obtido pela incubação do papel de filtro em tampão citrato de sódio 35

40 50 mm (ph 4,8), substituindo os 0,5 ml de extrato enzimático por água. Um segundo controle foi obtido para contabilizar os açúcares redutores presentes no caldo de cultivo. Nesse caso se omitiu o substrato do meio reacional. b) endoglucanase: esta atividade foi determinada pela liberação de açúcares redutores a partir de carboximetilcelulose (CMC) seguindo o método padrão descrito por TANAKA et al. (1981). Os açúcares redutores liberados foram determinados pelo método do DNS e expressos como μmoles de glicose, com base em uma curva de calibração feita com o mesmo açúcar. Para este ensaio foi utilizado como substrato uma solução de CMC 0,44 % (p/v) dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mm, ph 5,5. Em um tubo de ensaio foram adicionados, 0,1 ml de extrato enzimático e 0,9 ml de solução de CMC. A mistura foi incubada a 50ºC por 60 min. Após esse período, foram adicionados 1,5 ml de DNS ao tubo de ensaio e este foi mantido em banho-maria a 100 C por 5 minutos. Após o resfriamento, a leitura da absorbância foi feita no comprimento de onda de 540 nm. A reação controle dessa determinação foi realizada substituindo os 0,1 ml de extrato enzimático por água. Um segundo controle foi preparado substituindo-se o substrato do meio reacional por água Atividades enzimáticas relacionadas à degradação de hemicelulose Xilanase total: esta atividade foi determinada pela liberação de açúcares redutores a partir de xilana de bétula seguindo o método padrão descrito por BAILEY et al. (1992). Os açúcares redutores liberados foram determinados pelo método do DNS e expressos como μmoles de xilose, com base em uma curva de calibração feita com o mesmo açúcar. Para este ensaio foi utilizado como substrato uma 36

41 solução de xilana 1% (p/v) ( birchwood xylan - SIGMA X-0502) dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mm, ph 5,5. Em um tubo de ensaio, foram colocados 0,1 ml de extrato enzimático e 0,9 ml de solução de xilana. A mistura foi incubada a 50ºC por 5 min. Após esse período, foram adicionados 1,5 ml de DNS ao tubo de ensaio e este foi mantido em banho-maria a 100 C por 5 min. Após o resfriamento, a leitura da absorbância foi feita no comprimento de onda de 540 nm. A reação controle dessa determinação foi realizada substituindo os 0,1 ml de extrato enzimático por água. Um segundo controle foi preparado substituindo-se o substrato do meio reacional por água Atividades enzimáticas relacionadas à degradação de lignina a) Lacase: a atividade foi determinada utilizando-se como substrato solução etanólica de siringaldazina em concentração de 1 mm. A reação de oxidação foi conduzida pela mistura de 0,3 ml de tampão citratofosfato 50 mm (ph 5,0), 0,1 ml de água, 0,5 ml de extrato e 0,1 ml solução de siringaldazina 1 mm. A reação foi monitorada entre 10 s e 5 min através da leitura da absorbância em 525 nm. A atividade enzimática foi calculada com base na absortividade molar da siringaldazina oxidada (ε 525 = M -1.cm -1 ) segundo SZKLARZ et al. (1989). Também foi utilizado como substrato para determinar a atividade de lacase uma solução de ABTS 1mM (2,2'-azinobis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), utilizando as mesmas condições de reação descritas anteriormente para siringaldazina. As reações foram monitoradas em 420 nm para o produto de oxidação do ABTS (ε 420 = M -1.cm -1 ). Nesse caso, um controle foi obtido para descontar a absorção do extrato enzimático em 420 nm. O controle foi feito substituindo-se o substrato por água. 37

42 b) Mn-peroxidase (MnP): foi determinada pela oxidação de vermelho de fenol 0,1% (a dissolução do vermelho de fenol em água foi feita pelo ajuste continuado do ph em 7,4). A reação foi conduzida em tubos de ensaio que continham 1,5 ml de tampão succinato de sódio 20mM (ph 4,5), 1,5 ml de lactato de sódio 50 mm, 0,5 ml de extrato, 0,5 ml de vermelho de fenol 0,1%, 0,5 ml de MnSO 4 1 mm, 0,25 ml de albumina bovina 2 mm e 0,25 ml de peróxido de hidrogênio 2 mm (LUNDELL et al.,1990). Em intervalos de tempo definidos entre 1 e 10 minutos, 1 ml da solução contida no tubo de ensaio foi removida e a esse volume foram adicionados 30 μl de hidróxido de sódio 6,5 M para interromper a reação e realizar a leitura no espectrofotômetro. A cinética da reação foi avaliada medindo-se a absorbância do produto de reação em 610 nm. A atividade de MnP foi calculada com base na absortividade molar do vermelho de fenol oxidado ( M -1.cm -1 ) (KHINDARIA et al., 1994). c) Lignina peroxidase (LiP): a atividade foi determinada pela oxidação de Azure B. A reação foi feita com 0,25 ml de Azure B 320 μm, 1,25 ml de tampão tartarato de sódio 50 mm (ph 4,5), 0,5 ml de extrato e 0,5 ml de H 2 O 2 2 mm. A leitura da absorbância foi feita em 651 nm, onde um extrato ativo induz ao decréscimo de absorção nesse comprimento de onda (ARCHIBALD, 1992). O controle dessa reação continha substrato e substituição do extrato enzimático por água. Como o controle da reação apresenta absorbância em 651 nm, o espectrofotômetro é zerado com água destilada Atividade enzimática relacionada à degradação de celulose e lignina Celobiose desidrogenase (CDH): a atividade foi determinada espectrofotometricamente pela diminuição da absorbância do diclorofenol-indofenol (DCPIP) a 520 nm (ε 520 = 6800 M -1 cm -1 ), ph 4,0 38

43 e 37 o C. A mistura reacional continha 0,2 ml de DCPIP 3 mm, 0,2 ml de lactose 300 mm, 0,2 ml de fluoreto de sódio 40 mm, 0,4 ml de extrato enzimático e 1 ml de tampão acetato de sódio 100 mm (ph 4,0) (BAMINGER et al., 1999) Determinação da biomassa fúngica através da quantificação de ergosterol Amostras de madeiras biodegradadas por 28 dias foram secas e moídas para a determinação do teor de ergosterol de acordo com metodologia descrita por MONTGOMERY et al. (2000). Em tubos de ensaio foram adicionados 250 mg de madeira moída, 2 ml de metanol e 1 ml de NaOH 1 M. Os tubos foram vedados e colocados dentro de um forno de microondas doméstico operando a 2450 MHz e 900 W. O forno foi ligado em potência média e o material foi irradiado por 18 s. Após o resfriamento (aproximadamente 15 min), o material foi novamente irradiado por mais 17 s em potência média. Após resfriamento, os tubos foram abertos e a suspensão resultante foi neutralizada com 1 ml de HCl 1 M e adicionada de mais 2 ml de metanol. A suspensão foi então extraída com pentano em agitador Vortex (3 extrações com 2 ml de pentano em cada uma). Os extratos de pentano foram combinados, filtrados em filtro com membrana de 0,45 μm (Acrodisc Gelman) e evaporados sob fluxo de gás nitrogênio. O resíduo foi diluído em 2 ml de metanol e analisado por cromatografia líquida de alta eficiência. A análise por cromatografia utilizou uma coluna de fase reversa C18 eluída com metanol a um fluxo de 1 ml/min. Foi utilizado um detector de UV operando em um comprimento de onda de 282 nm. A concentração de ergosterol presente na amostra foi determinada através de uma curva de calibração construída com solução padrão de ergosterol em metanol. 39

44 4.13. Análise morfológica da colonização da madeira por microscopia óptica. As amostras de madeira foram cortadas manualmente nos sentidos paralelo e transversal às fibras com o auxílio de uma lâmina de barbear. Uma preparação, que requer duas colorações, foi utilizada para corar os cortes de madeira dos ensaios de biodegradação facilitando as observações ao microscópio óptico. Inicialmente foi utilizado o corante verde malaquita (solução aquosa 0,5% (p/v)) no qual os cortes ficaram embebidos por 5 minutos, em seguida os cortes foram imersos em água para retirar o excesso de corante. Após este passo, os cortes ficaram embebidos em floxina (solução aquosa 1% (p/v)) e posteriormente foram posicionados entre lâmina e lamínula, para visualização. Os cortes foram observados em aumentos que variaram de 40X a 1000X. As microestruturas fúngicas encontradas foram medidas com o auxílio de uma lente ocular com disco micrometrado. No procedimento de coloração dos cortes utilizou-se o verde malaquita (coloração verde) que tem afinidade por células de madeira e a floxina (coloração rosa) que a apresenta com hifas do fungo, aumentando assim o contraste nas observações (GILBERTSON E RYVARDEN, 1986). As amostras analisadas representaram dois cavacos colonizados provenientes dos mesmos cultivos utilizados para a determinação de ergosterol para os diferentes períodos de cultivo Determinação da perda de massa seca da madeira Após a extração dos cavacos com tampão acetato (extração de enzimas), os mesmos foram lavados com água destilada e secos ao ar. A umidade desses cavacos foi determinada em balança aquecida com infravermelho (OHAUS) e a perda de massa foi calculada como massa seca inicial menos massa seca final dividida pela massa seca inicial. 40

45 4.15. Determinação da composiç ão química em amostras de madeira Os cavacos foram previamente moídos em um moinho de facas até passarem por uma malha com perfurações de 0,75 mm e extraídos por 6 h em Soxhlet com etanol 95%. O teor de componentes (glucana, polioses e lignina,) foi determinado a partir da hidrólise do material com H 2 SO 4 72% (FERRAZ et al., 2000b). Cerca de 300 mg de amostra seca ao ar foram tratados com 3 ml de H 2 SO 4 72% (peso/peso) por uma hora a 30 o C. Em seguida, o conteúdo do tubo de ensaio foi transferido quantitativamente para um Erlenmeyer de 250 ml com o auxílio de 79 ml de água. A mistura foi autoclavada a 121 o C/60 min, resfriada e filtrada em filtros de vidro sinterizado de porosidade número 3, previamente secos a 105 o C e pesados. O material retido foi lavado com 2 porções de 5 ml de água e seco até massa constante. Esse resíduo corresponde à lignina insolúvel em ácido (Klason). O filtrado foi avolumado a 100 ml e analisado quanto aos teores de açúcares em um sistema de cromatografia líquida. A análise cromatográfica foi feita em um cromatógrafo líquido de alta eficiência utilizando uma coluna BIORAD HPX-87H, aquecida a 45ºC e H 2 SO 4 5 mm a 0,6 ml/min como eluente e um detector de índice de refração (SHIMADZU). A concentração de açúcares foi determinada através de curvas de calibrações preparadas com padrões de grau analítico, secos sob sílica e vácuo. O teor de lignina solúvel em ácido foi determinado através da leitura em 205 nm de uma diluição (usualmente 2:10) do hidrolisado, tomando-se como padrão uma absortividade de 105 L/g.cm neste comprimento de onda. 41

46 Determinação da perda de componentes durante a biodegradação O cálculo da perda de componentes (glucana, polioses e lignina) foi feito como segue: Pc(%) = [(mci mcf)/mci] x 100 Onde: Pc mci mcf : perda de componentes : % de componente na madeira controle x massa de madeira inicial : % de componente na madeira biodegradada x massa de madeira final Verificação da resposta das amostras biodegradadas frente à polpação Kraft de alto rendimento Essa etapa avaliou o comportamento das amostras biotratadas frente a um processo químico de polpação de alto rendimento. As reações de polpação pelo processo Kraft foram feitas em condições pré-otimizadas a fim de preparar polpas com números kappa entre 40 e 120 (MENDONÇA et al., 2002). A reação foi realizada em ampolas de aço inox 316 de 80 ml, as quais foram carregadas com 10 g de madeira (base seca) e 60 ml de licor contendo 22,5% de álcali ativo (como NaOH) e 25% de sulfidez no caso de P. taeda (BIERMANN, 1993) e 17% de álcali ativo (como NaOH) e 25% de sulfidez no caso de E. grandis. As ampolas foram seladas e imersas num banho de silicone, que foi aquecido progressivamente, a fim de permitir um tempo de 30 min de aquecimento até atingir a temperatura de cozimento de 170º C para P. taeda e 150 C para E. grandis. Para cada amostra biotratada foram realizadas 4 ou 5 polpações simultâneas variando o tempo de cozimento. Em P. taeda os tempos de cozimento foram 60, 80, 100 e 120 minutos, já em E. grandis os tempos de cozimento foram 40, 60, 80, 100 e 140 minutos. Após as reações, o material residual da digestão 42

47 (polpa mais rejeitos) foi lavado com água para eliminação de resíduos de álcali e lignina solúvel. O material lavado foi seco a 105ºC até massa constante. O rendimento de polpa não classificada foi determinado com base nas massas iniciais e finais secas. Todo o material seco foi então moído e submetido à caracterização química para determinar os teores de lignina (item 3. 16) Comportamento das cepas em meios agarizados ou não, sem presença da madeira Avaliação do crescimento dos basidiomicetes em meio agarizado com diferentes phs. Esta avaliação foi realizada com o intuito de verificar qual seria o melhor ph para obter um crescimento mais rápido de cada basidiomicete. O crescimento dos fungos foi monitorado em placas de Petri contendo os meios de cultura ABD e AM com ph previamente ajustados entre 3 e 6. O ph foi corrigido com HCl 1 M. As placas inoculadas foram mantidas em estufa a 27 o C e o diâmetro das colônias foi monitorado diariamente até que chegasse à borda da placa de Petri Curva de crescimento dos basidiomicetes em meio líquido O crescimento das 3 cepas estudadas foi avaliado em meios de cultivo simples e de baixo custo, com a finalidade de verificar a capacidade de cada cepa produzir inóculo em escala ampliada. Foram determinadas as curvas de crescimento de cada cepa sobre meios de cultura líquidos como CB e MS mantendo a mesma relação C/N do meio anterior (16 eqc/ 1eqN). O meio líquido CB foi tamponado com acetato de sódio 10 mm (2,4% de extrato de batata e 0,7% de extrato de levedura, 0,048% (v/v) de ácido acético glacial, 0,0207% (p/v) de acetato de sódio) e seu ph inicial foi corrigido para 4,0 com HCl 1 M. Em Erlenmeyers de 250 ml com 20 ml de meio de cultura, foram 43

48 introduzidos 2 discos de inóculo, obtidos em placas com meio de cultura CB. Os frascos permaneceram em incubação estática a 27±1 o C por períodos definidos entre 2 e 22 dias. O micélio obtido do cultivo em meio líquido foi filtrado em papel de filtro (previamente seco e tarado). Do micélio retido no papel filtro foi retirada uma pequena amostra para observação em microscópio óptico. Em seguida a massa seca de fungo foi determinada secando-a inicialmente a 60 C e posteriormente a 105 C até atingir massa constante. O consumo de açúcares redutores totais durante o crescimento do fungo foi monitorado pelo método do DNS (item 3.9) Análise morfol ógica do micélio por microscopia óptica. Para as culturas em meio líquido ou sólido, um fragmento do micélio retirado do cultivo foi colocado sobre um preparado que continha uma gota de solução aquosa de hidróxido de sódio 5% (p/v) e uma gota de solução aquosa de floxina 1% (p/v) segundo GILBERTSON E RYVARDEN (1986). Outro fragmento do micélio foi colocado sobre uma gota de reagente de Melzer (SINGER, 1975). Os fragmentos foram observados em aumentos que variaram de 40X a 1000X Isolamento de espécies contaminantes Fungos contaminantes encontrados sobre os cavacos oriundos de uma planta piloto de biopolpação localizada na empresa Melhoramentos Ltda.,Caieiras SP, foram isolados e identificados. O isolamento iniciouse com a retirada de um pouco de micélio do contaminante existente no cavaco e foi seguido pela inoculação deste em placas de Petri com meio AEM. As placas inoculadas foram mantidas em estufa a 27±2 o C e o crescimento do micélio foi monitorado diariamente até que este 44

49 atingisse a borda da placa (de 7 a 10 dias). Após o período de crescimento, as placas que não apresentaram mais de uma cultura tiveram seu micélio repicado novamente e essas culturas foram observadas ao microscópio para identificação, através de características morfológicas do micélio, tais como as estruturas de reprodução Confronto de espécies Os isolados de contaminantes descritos no item 3.20 foram confrontados com C. subvermispora (cepas SS3 e CS1) e P. tremellosa (ATCC 48745). Este confronto foi realizado em placa de Petri em meio de cultura CB. Em placas de Petri colocaram -se, em bordas opostas, um inóculo de cada contaminante e um inóculo de cada uma das três cepas (SS3, CS1 e ATCC 48745). As placas inoculadas foram mantidas em estufa a 27±2 o C, sem iluminação, sendo o crescimento dos micélios monitorado diariamente até que houvesse o encontro de cada par de micélios confrontado Indução à formação de clamidósporos nas espécies estudadas C. subvermispora (SS3 e CS1) e P. tremellosa (ATCC 48745) foram inicialmente cultivados por 12 dias em CB. Após este período, foi adicionado ao meio CaCl 2 1% (p/v) (concentração final) estéril, para provocar estresse osmótico e induzir a formação de clamidósporos no micélio. Este foi analisado em microscópio óptico a cada 24 horas para verificação de presença de clamidósporos. A observação foi realizada em lâminas preparadas com soluções aquosas de hidróxido de sódio 5% e de floxina 1% (GILBERTSON e RYVARDEN, 1986). Uma estimativa da 45

50 quantidade de clamidósporos formados foi feita pela classificação visual (figura 10) entre muito (++++), médio (+++), pouco (++), pouquíssimo (+) e ausência (-). a b c d Figura 10 Classificação visual da quantidade de clamidósporos em (a) muito (++++), (b) médio (+++), (c) pouco (++) e (d) pouquíssimo (+) Viabilidade dos clamidósporos na colonização da madeira. Com os cultivos em que houve a indução da formação de clamidósporos, foi realizado um teste onde o micélio foi batido em liquidificador em ciclos subseqüentes de 15 segundos, a fim de verificar se as hifas presentes no micélio seriam danificadas e os clamidósporos permaneceriam intactos. Após cada ciclo de 15 segundos, o micélio foi observado ao microscópio óptico para estabelecer quantos ciclos não interfeririam na morfologia, mantendo os clamidósporos intactos, i. e., visualmente sem rompimentos ou quebras. O padrão estabelecido foi de 46

51 10 ciclos de 15s. Com o micélio batido no padrão estabelecido acima foi realizado um novo experimento de biodegradação de madeira (em triplicata) para cada uma das espécies. Os cultivos foram de 14 dias de incubação e não continham milhocina. As cargas de inóculo utilizadas foram 500 mg de fungo /kg de madeira para Eucalyptus grandis e de 100 mg de fungo /kg de madeira para Pinus taeda. A atividade enzimática de MnP, produzida nesses cultivos foi determinada como descrito no item

52 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. ENSAIOS DE BIODEGRADAÇÃO DE MADEIRA Foram realizados ensaios de biodegradação de madeira utilizando as cepas de fungo de podridão branca, C. subvermispora (SS3 e CS1) e P. tremellosa (ATCC 48745). Em cada ensaio foram utilizadas duas espécies de madeira: P. taeda (Gimnosperma madeira dura) e E. grandis (Angiosperma - madeira mole) e para cada uma avaliaram-se as condições de cultivo onde houve ou não a adição de co-substrato (milhocina). A milhocina minimiza a demanda por uma elevada carga inicial de inóculo permitindo um expressivo crescimento de micélio fúngico a partir da sua metabolização inicial, já que este co-substrato é de fácil assimilação (AKHTAR et al., 1998). No caso dos ensaios de biodegradação com adição de milhocina, a carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/ Kg de madeira para ambas as espécies de madeira, enquanto que nos ensaios sem adição de co-substrato as cargas de inóculo utilizadas em cada cultivo foram de 100 mg de fungo/ Kg de madeira para P.taeda (20 vezes maior) e de 500 mg de fungo/ Kg de madeira para E. grandis (100 vezes maior), independente da cepa de fungo utilizada. Está amplamente descrito na literatura que cada espécie de vegetal apresenta uma resistência própria à biodegradação. De forma geral, diferenças anatômicas e estruturais dos componentes da madeira são a causa dessa variabilidade (KIRK E CULLEN, 1998). Outro aspecto relevante é a presença de compostos inibidores do metabolismo fúngico em algumas espécies de madeira que a tornam mais resistente à biodegradação e, com isso, um certo grau de degradação somente pode ser atingido a partir de determinada carga de inóculo fúngico inicial. Em estudos prévios foi demosntrado que C. subvermispora é capaz de degradar P. taeda eficientemente a partir de uma carga de inóculo de 48

53 100 mg/kg de madeira (ambos em base seca) (SOUZA-CRUZ, 2002). No caso de E. grandis essa carga é maior, situando-se entre 400 e 500 mg de fungo/kg de madeira (André Ferraz, dados não publicados, Figura 11). 2,5 Perda de peso (%) 2,0 1,5 1,0 0,5 0, Carga de inóculo (mg/kg de madeira) Figura 11 Perdas de massa de E. grandis após 15 dias de biodegradação por C. subvermispora SS-3. O crescimento fúngico foi avaliado com base no teor de ergosterol encontrado nas amostras de madeira biodegradada nas diferentes condições de cultivo, já que o ergosterol está diretamente correlacionado com a membrana fúngica (MONTGOMERY et al., 2000). Utilizando este parâmetro avaliou-se a possibilidade de reduzir as cargas de inóculo nos experimentos de biodegradação de madeira através da adição de milhocina como co-substrato. Na figura 12 estão apresentados os teores de ergosterol encontrado em função do tempo de cultivo na madeira biodegradada. 49

54 40 Pt/SM 40 Pt/CM Ergosterol (mg/kg de madeira) Eg/SM Eg/CM Período de experimentação da biodegradação (dias) Figura 12 Crescimento fúngico estimado a partir do teor de ergosterol detectado nas amostras de madeira biodegradada (P. taeda Pt e E. grandis - Eg) por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Comparando os teores de ergosterol obtidos nos cultivos sem e com a adição de milhocina na figura 12, pode-se afirmar que a adição de milhocina efetivamente permite um crescimento eficiente mesmo com cargas de inóculo tão baixas quanto 5 mg/kg de madeira e que nos cultivos onde a milhocina não foi adicionada como co-substrato, as cargas de inóculo requeridas foram expressivamente maiores como 100 mg/kg de madeira (20 vezes) e 500 mg/kg (100 vezes) de madeira, quando os substratos eram P. taeda e E. grandis, respectivamente. Estes dados confirmam que em ensaios de biopolpação pode-se reduzir a carga de inóculo adicionando um co-substrato de fácil assimilação, como demonstraram AKTHAR et al. (1998), mantendo a eficiência na biopolpação semelhante tanto para cargas de inóculo de 3 g de micélio/kg de madeira sem adição de co-substrato quanto para 5 mg de 50

55 micélio/kg de madeira com adição de 0,5% de milhocina Produção de enzimas extracelulares e compostos de baixa massa molar Nesse trabalho, as atividades de enzimas oxidativas e hidrolíticas vinculadas à decomposição de lignina, bem como a de celobiose desidrogenase (CDH) relacionada tanto com a degradação de celulose como de lignina, apresentaram padrões diferentes entre as espécies estudadas. Cada uma delas será abordada e discutida nos itens a seguir, comparando os dados obtidos Atividade enzimática de manganês peroxidase Na figura 13 estão apresentadas as atividades enzimáticas de manganês peroxidase detectadas nos extratos obtidos a partir dos ensaios de biodegradação utilizando C. subvermispora SS3, CS1 e P. tremellosa (ATCC 48745) e as madeiras de P. taeda e E. grandis, em cultivos com e sem a adição de milhocina. 51

56 Atividade enzimática UI/Kg Pt/SM Pt/CM Eg/SM Eg/CM Período de experimentação da biodegradação (dias) Figura 13 Produção de MnP por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). As atividades de MnP apresentaram um pico de atividade enzimática aos 14 dias de cultivo em ambas as espécies de madeira na maioria das cepas fúngicas estudadas (fig. 13). No cultivo com a adição de milhocina sobre E. grandis, C. subvermispora CS1 foi à única cepa a apresentar uma atividade crescente após 14 dias de cultivo. Quando comparamos as atividades de MnP entre os cultivos com e sem a adição de milhocina, nota-se claramente que, para as três cepas, a adição de milhocina provocou um aumento expressivo e significativo da quantidade de enzima detectada no meio. Nos cultivos onde não houve adição de co-substrato, a produção de MnP seguiu a seguinte seqüência: C. subvermispora SS3 > C. subvermispora CS1 e P. tremellosa em ambas as espécies de madeira estudadas, sendo que em E. grandis a quantidade de enzima produzida pelas diferentes cepas foi maior do que em P. taeda. C. subvermispora CS1 e P. tremellosa 52

57 produziram níveis de atividade de MnP semelhantes entre si tanto nos cultivos em E. grandis como em P. taeda sem adição de milhocina. Nos cultivos com adição de milhocina, a produção de MnP foi maior e diferenciada entre as cepas. C. subvermispora SS3 aparece como a produtora dos maiores níveis de enzima nos cultivos em ambas madeiras. No cultivo sobre P. taeda, C. subvermispora CS1 apresentou maior atividade enzimática que P. tremellosa, o mesmo ocorreu no cultivo sobre E. grandis, com exceção da atividade de MnP encontrada aos 14 dias de cultivo, onde Phlebia tremellosa produziu mais enzima que C. subvermispora CS Atividade enzimática de lignina peroxidase A atividade de LiP foi ensaiada, utilizando como substrato Azure B (ARCHIBALD, 1992), em todos os extratos enzimáticos obtidos a partir de todas as condições de biodegradação. Esse substrato revela atividade da enzima pela diminuição da absorção do corante na região do espectro visível, ficando livre das interferências causadas pelos compostos que absorvem na região do ultravioleta como os fenóis e as quinonas. O método Azure B, pode ser mais vantajoso para detectar LiP em fermentação em meio de sólido de compostos lignocelulósicos onde os extratos enzimáticos são escuros (ARORA E GILL, 2001). Mesmo utilizando este substrato ( Azure B ), em nenhum extrato produzido pelas cepas estudadas, sob nenhuma condição de experimentação, foi detectada atividade de LiP. SOUZA-CRUZ e colaboradores (2004) também não detectaram atividade de LiP em cultivos de C. subvermispora sobre P. taeda, por períodos de até 90 dias de incubação. Segundo LOBOS et al. (1994), LiP não tem sido detectada em culturas de C. subvermispora e isso, provavelmente ocorre porque esta enzima realmente não é produzida ou sua detecção é dificultada pela forte adsorção ao substrato ou ainda pela presença de 53

58 substâncias interferentes nos extratos enzimáticos (principalmente em substratos como a madeira). A possibilidade de que a LiP seja produzida em pequenas quantidades e/ou seja de difícil detecção existe, uma vez que, segundo RAJAKUMAR et al. (1996), C. subvermispora possui genes semelhantes aos responsáveis pela expressão de LiP em outros fungos ligninolíticos. Existem artigos que apresentam diferentes espécies de Phlebia (P. radiata, P. brevispora, P. tremellosa) como produtoras de LiP e outros que afirmam que estas mesmas espécies não produzem esta enzima. As condições de cultivo descritas nesses trabalhos são bastante distintas, os métodos de determinação da atividade enzimática são variáveis e utilizam diferentes substratos de reação, isso dificulta a comparação entre os resultados obtidos (VARES et al., 1994; TUOR et al., 1995). HATAKKA (1994) afirma que P. tremellosa tem a capacidade de produzir LiP (álcool veratrílico como substrato da reação) em culturas submersas sob agitação em biorreatores. Nessas condições foram encontradas várias isoenzimas de LiP produzidas por diferentes cepas de P. tremellosa (VARES et al., 1994). No presente trabalho, no entanto, pudemos demonstrar que durante a experimentação de biodegradação com P. taeda e E. grandis, com e sem adição de milhocina, P. tremellosa não produziu quantidades detectáveis de LiP. Outras espécies de Phlebia também apresentam divergências no que diz respeito à detecção de atividade enzimática de LiP. Em um trabalho recente, KAPICH e colaboradores (2005) não detectaram atividade de LiP (com álcool veratrílico como substrato da reação) em P. radiata quando cultivada em meio contendo palha de trigo. No entanto, ARORA e colaboradores (2002) afirmam que várias espécies de Phlebia (P. fascicularia, P. floridensis e P. radiata) produziram LiP em cultivos que também continham palha de trigo. Neste último trabalho, os ensaios enzimáticos foram realizados usando Azure B como substrato. Aparentemente a produção de LiP é característica das espécies de 54

59 Phlebia e as dificuldades de detecção da atividade são provavelmente relacionadas às diferenças nas condições de cultivo e aos diferentes substratos utilizados para quantificar esta enzima Atividade enzimática de lacase As atividades enzimáticas de lacase detectadas (figura 14) apresentam-se relativamente baixas em todos os cultivos avaliados. Enquanto os níveis de MnP chegaram a 1556 UI/Kg de madeira, os níveis de lacase não ultrapassaram 55 UI/Kg de madeira Pt/SM Pt/CM Atividade enzimática UI/Kg Eg/SM 60 Eg/CM Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 14 Produção de lacase por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Na figura 14 nota-se que o pico de atividade enzimática de lacase, ocorre no 7 O dia. Os níveis de atividade de lacase detectados para as três cepas quando o substrato utilizado no ensaio de biodegradação era 55

60 P. taeda, foram semelhantes não ultrapassando 20 UI/kg de madeira. Já nos ensaios com E. grandis, P. tremellosa destacou-se como maior produtora de lacase principalmente no 7 O dia de cultivo, enquanto que as duas cepas de C. subvermispora produziram níveis de lacase parecidos entre sí, além de 3 a 4 vezes menores do que os detectados para P. tremellosa. Nos cultivos com adição de milhocina, as atividades de lacase praticamente dobraram quando comparadas às atividades encontradas nos cultivos sem a adição de co-substrato. ENOKI et al. (1999) e HAKALA et al.(2005) afirmam que C. subvermispora produz está enzima nos estágios iniciais de biodegradação da madeira e geralmente isso ocorre quando o cultivo recebe adição de um cosubstrato como a milhocina ou glicose. VARES e colaboradores (1994) também observaram que em várias espécies do gênero Phlebia o pico de atividade da lacase aparece nos períodos iniciais de biodegradação e diminui rapidamente. Com base nos dados das atividades enzimáticas oxidativas detectadas nos extratos obtidos a partir de cada condição de cultivo, pode-se concluir que dentro do complexo enzimático degradador de lignina, as MnP, são claramente as principais enzimas produzidas pelas três cepas em estudo Atividades enzimáticas de celulases totais Dentro do complexo hidrolítico foram determinadas às atividades de celulase total, endoglucanase e xilanase total, utilizando como substratos papel de filtro (Whatman n o 1), carboximetilcelulose e xilana de bétula, respectivamente (MANDELS, et al., 1976; TANAKA et al.,1981; BAILEY, et al, 1992). A atividade celulolítica total foi pouco expressiva em todas as condições de cultivo, pois baixas concentrações de açúcares redutores foram detectadas a partir do tratamento de papel 56

61 de filtro com os extratos enzimáticos (Tabela 2). Tabela 2 - Atividade celulolítica total (UI/Kg de madeira) encontrada nos extratos obtidos a partir da biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) por C. subvermispora SS3, C. subvermispora CS1 e P. tremellosa, ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM). Condição de cultivo Tempo biodegradação C. subvermispora CS1 C. subvermispora SS3 P. tremellosa 7 11,8±0,3 15±4 57±5 Pt/Sm 14 16±2 28±6 57± ±3 31±2 42±4 7 23±2 19±5 71±7 Pt/Cm 14 19±5 45±3 66± ±4 35±1 47±4 7 20±3 21±2 30±3 Eg/Sm 14 36±3 40±4 55± ±5 36±4 42±2 7 21±3 26±3 35±7 Eg/Cm 14 33±9 54±8 67± ±7 48±2 42±3 WOOD E BHAT (1984) reportaram que a atividade celulolítica total medida a partir da hidrólise de papel de filtro representa a ação do complexo celulolítico completo somente quando a conversão do substrato atinge níveis de no mínimo 4%. A partir desse nível de hidrólise, não somente a celulose amorfa, mas também parte significante da celulose cristalina já sofreu degradação enzimática. As atividades enzimáticas encontradas em nosso estudo foram inferiores a 2% de conversão do substrato em todas as condições de cultivo estudadas. Sabendo-se que C. subvermispora produz pequenas quantidades de exoglucanases e quantidades mais expressivas de endoglucanases (SETHURAMAN et al., 1998), optou-se então por determinar a atividade de endoglucanase dos extratos produzidos pelos basidiomicetes aqui estudados. 57

62 Atividade enzimá tica de endoglucanase As atividades de endoglucanase, detectadas nos extratos obtidos a partir dos cultivos em estudo, estão apresentadas na figura Pt/SM Pt/CM Atividade enzimática UI/Kg Eg/SM Eg/CM Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 15 Produção de endoglucanase por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). A figura 15 mostra que as diferentes cepas utilizadas neste estudo apresentaram um comportamento parecido apesar das diferentes condições de cultivo. Nos cultivos onde não houve adição de cosubstrato, as atividades de endoglucanases permaneceram praticamente no mesmo nível desde o 7 o até o 28 o dia de cultivo, exceção feita a C. subvermispora SS3, que aos 28 dias de cultivo sobre E. grandis apresentou um decréscimo acentuado, quando comparado ao 7 o dia, nos níveis de endoglucanases. Nos ensaios com adição de 58

63 milhocina notou-se um aumento na atividade de endoglucanase, principalmente em C. subvermispora SS3; já C. subvermispora CS1 e P. tremellosa mantiveram os níveis de produção semelhantes aos encontrados nos cultivos sem à adição do co-substrato. Independente das diferentes condições de cultivo, a produção de endoglucanase obedeceu a seguinte seqüência: C. subvermispora SS3 > C. subvermispora CS1 > P. tremellosa Atividade enzimática de xilanase As atividades de xilanase detectadas nos extratos obtidos a partir dos cultivos em estudo estão apresentadas na figura Pt/SM Pt/CM Atividade enzimática UI/Kg Eg/SM Eg/CM Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 16 Produção de xilanase por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). 59

64 Observando a figura 16 pode-se notar que C. subvermispora SS3 e CS1 produziram níveis parecidos de xilanase total em todas as condições de cultivo, não ultrapassando 2000 UI/Kg de madeira. Já P. tremellosa produziu os maiores níveis de xilanases com um pico de produção aos 14 dias de cultivo em todas as condições de cultivo. Para todas as cepas em estudo, a produção desta enzima praticamente duplicou na presença de co-substrato quando comparada aos níveis enzimáticos detectados nos cultivos sem adição de milhocina. A atividade enzimática de xilanase foi muito mais expressiva do que a de endoglucanase em todas as condições de cultivo (10 a 20 vezes maior). Pode-se afirmar que há uma efetiva diferença na capacidade dessas cepas produzirem cada tipo de enzima e fica claro que dentro do complexo hidrolítico predominam as xilanases. (CDH) Atividades enzimática s de celobiose desidrogenase A celobiose desidrogenase é uma enzima extracelular envolvida na biodegradação de lignina e celulose (BAMINGER et al., 1999). P. tremellosa e P. radiata foram reportadas como possíveis produtoras de CDH (HENRIKSSON et al., 2000; CAMERON E AUST, 2001), no entanto, neste estudo não foi detectada atividade de CDH em nenhum dos ensaios de biodegradação onde P. tremellosa (ATCC 48745) era o agente degradador. C. subvermispora (CS1 e SS3) também não apresentou nenhuma atividade enzimática de CDH, sob as diferentes condições de cultivo estudadas nesta tese. 60

65 ph da madeira biodegradada O ph das culturas (madeira biodegradada + micélio fúngico) estudadas está mostrado na figura ,5 Pt/SM 6 5,5 Pt/CM 5 5 4,5 4, ,5 3, ph 6 5,5 Eg/SM 6 5,5 Eg/CM 5 5 4,5 4, ,5 3, Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 17 ph do meio fermentado por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa ATCC (- -), na biodegradação de P. taeda (Pt) e E. grandis (Eg) ao longo do período de incubação. A carga de inóculo usada foi de 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). As três cepas aqui estudadas apresentam atividade metabólica diferenciada quanto à produção de ácidos orgânicos. A acidificação do meio (madeira impregnada com água) é mais rápida nos cultivos com C. subvermispora SS3 e P. tremellosa ATCC do que nos cultivos com C. subvermispora CS1, tanto em E. grandis como em P. taeda. Por outro lado, no 28 0 dia de cultivo o ph praticamente se iguala em todas as condições de cultivo nas três cepas. A adição de milhocina aos cultivos não afetou o ph dos meios ao longo dos períodos de cultivo. 61

66 Conclusão parcial dos ensaios de biodegradação Com base em ensaios de biodegradação descritos anteriormente foi possível avaliar o crescimento fúngico através do teor de ergosterol e a produção de enzimas extracelulares. Sobre madeira de P. taeda, o crescimento miceliano foi semelhante quando se compara as três cepas estudadas, enquanto que em E. grandis, P. tremellosa se destacou ao produzir mais biomassa que as outras cepas. Nos cultivos com adição de milhocina a biomassa encontrada para cada cepa foi maior que a encontrada nos ensaios sem a adição de co-substrato. Fica claro que a adição de milhocina efetivamente permite um crescimento eficiente mesmo com cargas de inóculo tão baixas quanto 5 mg/kg de madeira. As três cepas estudadas apresentaram um mesmo perfil enzimático produzindo MnP, lacase, endoglucanases e xilanases. Dentro do complexo oxidativo, a enzima que apresentou os maiores níveis de atividade enzimática foi a manganês peroxidase. O pico de atividade desta enzima foi aos 14 dias constatando-se que nos cultivos com adição de milhocina, a atividade encontrada foi maior do que aquela dos cultivos sem adição do co-substrato. Em todas as condições de cultivo C. subvermispora SS3 apresentou maior atividade enzimática que as demais espécies. Apesar disto à atividade de lacase foi comparativamente baixa e apresentou um pico aos 7 dias de cultivo. As atividades enzimáticas encontradas para as duas espécies de fungos nos ensaios sobre P. taeda foram semelhantes, enquanto que com E. grandis, P. tremellosa foi a que apresentou maior atividade enzimática. Nenhuma espécie estudada produziu lignina peroxidase e celobiose desidrogenase em níveis detectáveis nas variadas condições de ensaio testadas. A xilanase foi a principal enzima detectada dentro do complexo hidrolítico. P. tremellosa apresentou maior atividade enzimática de xilanase que as demais espécies em todas as condições 62

67 de cultivo. O pico de atividade desta enzima foi aos 14 dias de cultivo e a atividade enzimática encontrada nos ensaios com adição de milhocina foi maior do que naqueles sem adição CARACTERIZAÇÃO DA MADEIRA BIODEGRADADA Perda de massa seca da madeira A extensão da degradação da madeira pode ser medida como perda de massa seca. A perda de massa da madeira representa a mineralização completa (até dióxido de carbono e água) dos seus componentes, ou a conversão desses componentes a produtos solúveis em água. Na figura 18 estão apresentadas as perdas de massa da madeira (P. taeda e E. grandis) causadas pela ação biodegradativa de C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa ATCC nos cultivos, com e sem a adição de milhocina. 15, 0 12, 0 Pt/SM 15, 0 12, 0 Pt/CM 9,0 9,0 Perda de massa seca (%) 6,0 3,0 0,0 15, 0 12, 0 9,0 6, Eg/SM 6,0 3,0 0,0 15, 0 12, 0 9,0 6, Eg/CM 3,0 3,0 0, , Período de experimentação biodegradação (dias) Figura 18 Perda de massa seca da madeira (P. taeda Pt e E. grandis - Eg) devido 63

68 a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Comparando os cultivos, com e sem adição de milhocina, na mesma espécie de madeira, pode-se notar que o comportamento em relação à perda de massa foi semelhante até os 14 dias de cultivo, sendo que aos 28 dias de biodegradação nos ensaios com adição de milhocina, a perda de massa seca foi ligeiramente maior do que nos cultivos onde o co-substrato não foi adicionado. Comparando as perdas de massa provocadas pelas diferentes cepas agindo sobre P. taeda e E. grandis, pode-se afirmar que a maior perda de massa ocorreu em E. grandis. Essas perdas de massa parecem estar relacionadas ao crescimento fúngico, pois comparando as figuras 12 e 18 nota-se um comportamento semelhante entre esses dois parâmetros, como por exemplo, nos cultivos de biodegradação usando E. grandis como substrato, C. subvermispora CS1 apresentou um crescimento fúngico menor e também uma perda de massa menor que as demais espécies de fungo estudadas. A comparação entre as perdas de massa mostra ainda que P. tremellosa e as duas cepas de C. subvermispora se equivalem em termos de crescimento fúngico e extensão de degradação da madeira de P. taeda. Já no caso da madeira de E. grandis, a cepa CS1 de C. subvermispora claramente se mostra menos efetiva em crescer e promover a perda de massa. Do ponto de vista da aplicação tecnológica, nota-se que a cepa CS1 é menos adequada já que apresenta uma maior especificidade por substrato e seria mais apropriada somente para o tratamento de madeiras moles como Pinus Perda de componentes A degradação dos componentes da madeira se dá inicialmente 64

69 através da atuação dos complexos enzimáticos e de outros metabólitos de baixa massa molar que promovem a despolimerização de glucanas, polioses e lignina, sendo que os produtos desta despolimerização são posteriormente mineralizados. Na figura 19 estão apresentadas às perdas de glucana observadas nos experimentos de biodegradação desta tese. As perdas de glucana foram baixas, porém crescentes ao longo do período de cultivo avaliado. P. tremellosa foi a espécie que promoveu uma maior perda desse componente, principalmente nos cultivos com a adição de milhocina, em ambas as espécies de madeira. Em geral, a perda de glucana foi maior nos cultivos com a adição de milhocina. A menor perda de glucana foi promovida pela cepa CS1 de C. subvermispora que praticamente não causou perdas até 14 dias para todas as condições de cultivo, com exceção do ensaio sobre E. grandis com a adição de milhocina (3% e 6% de perda aos 14 dias e 28 dias de cultivo, respectivamente) Pt/SM Pt/CM Perda de glucana (%) Eg/SM Eg/CM Período de experimentação biodegradação (dias) Figura 19 Perda de glucana da madeira (P. taeda Pt e E. grandis - Eg) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de 65

70 fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Na figura 20 estão apresentadas as perdas de polioses observadas nos mesmos experimentos Pt/SM Pt/CM Perda de polioses (%) Eg/SM Eg/CM Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 20 Perda de polioses da madeira (P. taeda Pt e E. grandis - Eg) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). As perdas de polioses provocadas pelas duas cepas de C. subvermispora (SS3 e CS1) foram baixas até o 14 0 dia de cultivo, aumentando (em torno de 10%) no 28 0 dia em todas as condições de cultivo. Em todas as condições estudadas, P. tremellosa provocou as maiores perdas de polioses e glucana. A figura 21 apresenta as perdas de lignina causadas pela ação de C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa ATCC sobre P. taeda e E. grandis. Quando comparamos os cultivos sobre P. taeda, nota-se que perda de lignina produzida pelas cepas em estudo foi muito 66

71 semelhante tanto nos cultivos com a adição de milhocina como nos cultivos sem o co-substrato. Nos ensaios com E. grandis, nota-se que as perdas de lignina foram, de modo geral, maior que as perdas encontradas em P. taeda, o que é amplamente conhecido na literatura, visto que as madeiras moles são menos susceptíveis à biodegradação devido as características anatômicas da madeira e as características estruturais da lignina (KIRK E CULLEN, 1998). Vale ressaltar que nos cultivos onde E. grandis era o substrato, as atividades enzimáticas de MnP detectadas foram maiores. Perda de lignina (%) Pt/SM Eg/SM Pt/CM Eg/CM Período de experimentação de biodegradação (dias) Figura 21 Perda de lignina da madeira (P. taeda Pt e E. grandis - Eg) devido a biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) ao longo do período de incubação. Como inóculo utilizou-se 5 mg de fungo/kg de ambas espécies de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de P. taeda ou 500 mg de fungo /Kg de E. grandis na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Ainda comparando os cultivos sobre E. grandis, nota-se que C. subvermispora SS3 e P. tremellosa ATCC provocaram perdas de lignina maiores que C. subvermispora CS1. Sendo assim pode-se afirmar que há uma relação entre o pico de atividade de MnP aos 14 67

72 dias e a conseqüente maior degradação de lignina, isto é, mineralização ou mesmo formação de produtos solúveis em água. Apesar de os níveis de MnP diminuírem após 14 dias de cultivo, as perdas de lignina permaneceram crescentes. Isto ocorre porque a degradação de lignina parece ser precedida por um máximo na produção de enzima que a partir daquele momento inicia as reações de despolimerização que culminarão na mineralização da lignina após a absorção e metabolização intracelular dos fragmentos gerados pela MnP (MACHUCA E FERRAZ, 2000; SOUZA-CRUZ et al, 2004; KIRK E CULLEN, 1998; GUERRA et al, 2002; GUERRA et al, 2004) Resposta à polpação Kraft das madeiras biotratadas A polpação Kraft foi realizada com o intuito de avaliar o comportamento das amostras biotratadas frente a um processo químico de polpação de alto rendimento. As amostras controle e biotratadas em ensaios com e sem adição de milhocina, após 28 dias de cultivo foram selecionadas para este estudo. Quando se comparam as amostras biotratadas com seus respectivos controles esterilizados (fig. 22 e 23), pode-se observar que, um menor número Kappa é obtido nas amostras biotratadas num tempo fixo de polpação ou ainda que um menor tempo de reação é necessário para preparar polpas com um determinado número Kappa. Esses dois benefícios oriundos do biotratamento da madeira confirmam dados da literatura obtidos a partir de processos de polpação iguais (Kraft) ao usados em nosso trabalho (MENDONÇA et al., 2002), bem como de outros processos químicos de polpação como o sulfitoalcalino/antraquinona (MENDONÇA et al., 2004). Na figura 22 a comparação das curvas obtidas para a polpação de P. taeda biodegradado pelas diferentes cepas mostra que as duas espécies proporcionaram benefícios bastante semelhantes, inclusive 68

73 entre os cultivos com e sem a adição de milhocina. Em geral, para se obter um número Kappa de 80 levou-se cerca 80 minutos de cozimento das amostras biotratadas, contra um tempo aproximado de 110 minutos para o controle autoclavado. Kappa Pt/Sm Pt/Cm Tempo de cozimento a temperatura máxima (min) Lignina (%) Figura 22 Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após polpação kraft de alto rendimento. A polpação foi realizada em amostras de madeira P. taeda (Pt) após biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) por 28 dias. (-*-) Madeira controle. A carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/kg de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de madeira na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Condições de cozimento: tempo de aquecimento até temperatura máxima = 30 min, temperatura máxima =170 o C, 25% de sulfidez e 22,5% de álcali ativo (expressos como NaOH em g/100 g de madeira, base seca). A figura 23 compara as curvas obtidas para a polpação de E. grandis biotratado pelas diferentes cepas estudadas neste trabalho. A polpação de E. grandis biodegradado por C. subvermispora SS3 e P. tremellosa ATCC apresentou benefícios bastante semelhantes entre os cultivos com e sem a adição de milhocina, já a polpação da amostra biodegradada por C. subvermispora CS1 com adição de milhocina apresentou um benefício maior frente à polpação do que a amostra biodegradada por esta mesma cepa sem adição de milhocina. Na condição de ensaio sem milhocina, após 100 minutos de cozimento a temperatura máxima, apenas a amostra biodegradada por P. tremellosa se aproximou de um número kappa 100 e na condição com adição de milhocina as amostras biotratadas por P. tremellosa e C. subvermispora CS1 levaram cerca de 100 minutos de cozimento para alcançar número 69

74 kappa em torno de 90. Kappa Eg/Sm Eg/Cm Tempo de cozimento a temperatura máxima (min) Lignina (%) Figura 23 Conteúdo de lignina residual nas polpas Kraft obtidas após rampa de aquecimento de 30 minutos e determinados tempos de cozimento a temperatura máxima. A polpação foi realizada em amostras de madeira E.grandis (Eg) após biodegradação por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) por 28 dias. (-*-) Madeira controle. A carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/kg de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 500 mg de fungo/kg de madeira na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Condições de cozimento: temperatura máxima =150 o C, 25% de sulfidez e 17% de álcali ativo. A figura 24 mostra a relação entre rendimento de polpação e o número kappa das polpas Kraft de P. taeda. Esse tipo de gráfico permite avaliar a seletividade do processo de polpação, sendo que quanto mais elevada à curva nesse gráfico, maior a seletividade da polpação. Rendimento (%) Pt/SM Pt/CM Kappa Figura 24 Rendimento de polpa não classificada em função do número kappa em polpas Kraft obtidas a partir da madeira de P. taeda (Pt) biotratada durante 28 dias por C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -). (- 70

75 *-) Madeira controle. A carga de inóculo foi de 5 mg de fungo/kg de madeira na presença de 0,5% de milhocina (CM - símbolos cheios) e 100 mg de fungo/kg de madeira na ausência de milhocina (SM - símbolos vazios). Condições de cozimento: tempo de aquecimento até temperatura máxima = 30 min, temperatura máxima =170 o C, 25% de sulfidez e 22,5% de álcali ativo (expressos como NaOH em g/100 g de madeira, base seca). Na figura 24 pode-se observar que a seletividade no processo de polpação de P. taeda foi semelhante para a amostra controle e as amostras biodegradadas, com exceção da amostra biotratada por P. tremellosa na presença de milhocina. Esse resultado é bastante relevante, pois indica que o biotratamento com C. subvermispora (ambas as cepas) proporciona o benefício de amenizar a polpação Kraft posterior (no caso específico em estudo, permite reduzir o tempo de polpação) sem resultar em perda significativa de rendimento de polpa Kraft. No caso da biodegradação com P. tremellosa, a amostra que proporcionou menores rendimentos de polpa foi exatamente aquela que sofreu maior perda de celulose e polioses durante o biotratamento. A maior perda de polissacarídeos durante o biotratamento deve ser um reflexo da maior atividade hidrolítica das culturas de P. tremellosa e é possível inferir que também os polissacarídeos residuais da madeira biotratada apresentem menor grau de polimerização do que aquele observado na madeira controle. Por outro lado, sabe-se que durante a polpação kraft, a diminuição do rendimento reflete a solubilização de polissacarídeos devido a reações de peeling e que essas reações são mais extensivas quando o grau de polimerização dos polissacarídeos é menor (BIERMANN, 1993). Dessa forma, pode-se concluir que a ação hidrolítica extensiva de P. tremellosa aos 28 dias de cultivo (com milhocina) gerou uma madeira biotratada menos adequada a um processo de polpação kraft, visto que os rendimentos de polpa foram mais baixos que os do controle para um mesmo grau de deslignificação (mesmo número kappa). 71

76 Conclusões parciais sobre a caracterização da madeira biodegradada Para caracterizar a madeira biodegradada foram avaliadas as perdas de massa seca, certos componentes (glucana, polioses e lignina) e a resposta à polpação Kraft. As perdas de massa seca e componentes foram crescentes ao longo do período de biodegradação apesar dos picos de atividade enzimática de MnP e xilanase serem aos 14 dias. Isto ocorre porque a perda efetiva de massa seca ou de um componente está relacionada a mineralização e este fato ocorre após a ação da enzima. A perda de massa seca provocada por C. subvermispora SS3 e CS1 e P. tremellosa sobre P. taeda foi semelhante ao longo de todo o período de biodegradação, sendo mais expressiva aos 28 dias. Na madeira de E. grandis, C. subvermispora SS3 e P. tremellosa causaram perdas de massa seca maiores do que C. subvermispora CS1. Dentre as três cepas P. tremellosa foi a responsável por provocar a maior perda de polissacarídeos em todas as condições de cultivo, já as perdas de lignina foram semelhantes nas espécies para todas as condições de cultivo, com exceção da condição sem adição de co-substrato sobre madeira de E. grandis. A polpação das amostras de P. taeda biotratadas pelas duas espécies de fungos mostrou que as três cepas proporcionaram benefícios bastante semelhantes, inclusive entre os cultivos com e sem a adição de milhocina e a seletividade foi semelhante para as amostras biotratadas e controle, com exceção da amostra biotratada por P. tremellosa na presença de milhocina que apresentou rendimentos de polpa menores. Em E. grandis as amostras biodegradadas por C. subvermispora SS3 e P. tremellosa apresentaram benefícios semelhantes nos cultivos com e sem adição de milhocina, no entanto, no ensaio com adição de milhocina a polpação da amostra biodegradada por C. subvermispora CS1 apresentou um benefício maior do que a amostra biodegradada por esta mesma cepa sem adição de milhocina. 72

77 5.3. Estudos relacionados à colonização da madeira e crescimento fúngico Análise morfológica da colonização da madeira por microscopia óptica As observações ao microscópio óptico de cortes radiais da madeira, mostraram que a colonização com todas as cepas utilizadas seguem um mesmo padrão. Em P. taeda (fig 25a), foi possível visualizar uma colonização crescente dos traqueídeos e raios da madeira ao longo dos períodos de cultivo (7, 14 e 28 dias). Nos cultivos em E. grandis visualizou-se uma colonização crescente nos elementos de vaso durante os diferentes períodos de biodegradação (fig 25b), já nas outras células como fibras e traqueídeos nota-se uma menor colonização. A média de espessura das hifas ficou entre 0,1 e 0,2 μm em todos os cultivos, nos diferentes substratos, com as diferentes cepas em todos períodos de biodegradação. Em pouquíssimos cultivos foi possível observar a presença de clamidósporos (cultivos em P. taeda da cepa SS3, com e sem adição de milhocina, aos 7 e 14 dias de incubação e na cepa CS1, sem adição de milhocina aos 28 dias de biodegradação). Nos cultivos com P. tremellosa, não foram encontrados clamidósporos nos cortes avaliados. Nos cultivos de 7 dias foi possível observar a presença de gotas de óleo dentro das hifas em todas as cepas. Essas gotas lipídicas têm função primária de armazenar gordura, sendo particularmente apropriadas como reserva de energia, pois tem o maior conteúdo calórico que qualquer outro constituinte fúngico (GRIFFIN, 1994). 73

78 a Figura 25 Hifas de C. subvermispora SS3 em células de (a) P. taeda - traqueídeos e (b) E. grandis elementos de vaso. Aumento de 400X. b Cultivos em meio de cultura com diferentes phs Na produção de inóculo fúngico o ph pode ser um importante parâmetro para acelerar o crescimento celular. O controle de ph é provavelmente o parâmetro mais fácil de ser manipulado e controlado em ampliações de escala (JONES, 1998). Foram realizados experimentos com culturas em meios de sólido, com phs definidos inicialmente (phs variaram entre 3.0 e 5.5), a fim de verificar se era possível otimizar o tempo de crescimento das três cepas utilizadas em placas de Petri sobre ágar batata e ágar-milhocina. É importante otimizar esta variável já que todos os experimentos de biodegradação dependem da produção de inóculo. A tabela 3 apresenta as taxas de crescimento (diâmetro) em milímetros/dia sobre meio de cultura ágar batata dextrose. 74

79 Tabela 3 - Taxa de crescimento (diâmetro das colônias) dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e Phlebia tremellosa em meio de cultura ágar-batata- dextrose com diferentes valores de ph inicial. Taxa de crescimento (mm/dia) ph C. subvermispora SS3 C. subvermispora CS1 Phlebia tremellosa 3,0 17,6 ± 0,1 19,8 ± 1,3 14 ± 3 4,5 20,2 ± 0,3 22,5 ± 0,1 18,4 ± 0,4 4,0 20,3 ± 0,8 22,5 ± 0,1 16,6 ± 0,3 4,5 16 ± 3 22,5 ± 0,1 14 ± 3 5,0 19,5 ± 0,8 20,5 ± 0,9 16,8 ± 0,5 5,5 14,9 ± 0,1 16,8 ± 0,7 12,7 ± 0,5 Ceriporiopsis subvermispora SS3 apresentou a maior taxa de crescimento nos phs 3.5 e 4.0, enquanto a cepa CS1 cresceu mais rapidamente entre os phs entre 3.5 e 4.5. Phlebia tremellosa cresce mais lentamente que C. subvermispora e os phs em que se observou um crescimento mais rápido foi 3.5. Na tabela 4 estão mostradas as taxas de crescimento (diâmetro) em milímetros/dia sobre meio de cultura ágar-milhocina. Tabela 4 - Taxa de crescimento (diâmetro da colônia) dos fungos C. subvermispora SS3 e CS1 e Phlebia tremellosa em meio de cultura ágar milhocina com diferentes valores de ph inicial. Taxa de crescimento (mm/dia) ph C. subvermispora SS3 C. subvermispora CS1 Phlebia tremellosa 4 30±1 32,1±0,1 22±1 4,5 28±1 33±2 25,1±0,5 5 26,1±0,7 29±1 19,3±0,3 6 10±1 8±2 12,1±0,6 No meio ágar milhocina as maiores taxas de crescimento foram encontradas entre os phs 4 e 4,5 para as três cepas estudadas. Comparando as taxas encontradas entre os dois meios de cultura podemos afirmar que as 3 cepas cresceram mais rapidamente em meio 75

80 ágar-milhocina do que em ágar-batata. Este fato é interessante do ponto de vista econômico, já que o custo do caldo de batata dextrose é bastante elevado quando comparado ao da milhocina. Se levarmos em consideração a ampliação de escala, este seria um item importante na redução de custos na produção de inóculo. Um fato bastante intrigante despertado neste estudo foi o de avaliar se no caso da biopolpação o ph ótimo encontrado para o crescimento em meio de cultura pode ser o mesmo utilizado para o crescimento em madeira e se haveria um aumento na taxa de crescimento nos cultivos em biorreatores com madeira com ph ajustado para os valores mais adequados para o crescimento mais rápido em meio de cultura Cultivos submersos O crescimento das várias espécies estudadas foi avaliado em diferentes meios de cultivo líquidos, com a finalidade de verificar a capacidade de cada cepa produzir inóculo miceliano em escala ampliada. Foram determinadas as curvas de crescimento de C. subvermispora (SS3 e CS1) e P. tremellosa para cultivos em meios como batata dextrose - CB tamponado com acetato de sódio 10 mm, e sacarose - milhocina - MS (ph inicial 4,0). Nas figuras 26 e 27 estão apresentadas as quantidades de biomassa seca obtidas durante os cultivos de até 18 dias e as concentrações de açúcares redutores restantes nos meios de cultura. O ph inicial foi corrigido para 4, pois no estudo em placas com meio sólido este foi o ph em que foi encontrada a maior taxa de crescimento. 76

81 Açúcar redutor (g/l) 30 Consumo de açúcar Massa seca (mg) Período de cultivo (dias) 180 Massa seca Figura 26 Curva de crescimento de C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) em meio CB (Batata dextrose) tamponado com acetato de sódio 10 mm. Açúcar redutor (g/l) Consumo de açúcar Massa seca (mg) Massa seca Período de cultivo (dias) Figura 27 Curva de crescimento de C. subvermispora SS3 (- -), C. subvermispora CS1 (- -) e P. tremellosa (- -) em meio líquido MS (Milhocina - sacarose). O consumo de açúcares é crescente ao longo do tempo em ambos os meios de cultura. No meio CB (fig. 20), P. tremellosa consumiu os açúcares rapidamente até 9 dias; no entanto seu crescimento é semelhante aos das outras cepas estudadas. C. subvermispora CS1 produziu mais massa seca do que C. subvermispora SS3 e P. tremellosa ATCC em meio CB. Este mesmo comportamento foi observado até 10 dias de cultivo no meio MS (fig. 27), porém, após esse período C. subvermispora SS3 produziu mais massa do que C. subvermispora CS1. A produção máxima de biomassa seca foi maior nos cultivos realizados no meio MS quando comparado com o meio CB. Este fato é interessante do ponto de vista econômico, pois o custo do meio MS 77

82 pode ser menor do que o de batata dextrose. O micélio de cada período de cultivo das três cepas estudadas neste item foram observados ao microscópio óptico, a largura das hifas e dos clamidósporos foram medidos (μm) e a quantidade de clamidósporos foi classificada em muito (++++), médio (+++), pouco (++), pouquíssimo (+) e ausência (-). A tabela 5 apresenta a quantidade de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C. subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo da curva de crescimento em meio de cultura líquido tamponado (ph 4). Neste estudo pode-se verificar que as hifas do micélio de C. subvermispora SS3 e CS1 são um pouco mais largas que as hifas de P. tremellosa em todos os períodos de cultivo. Ao longo dos cultivos as hifas de C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ficaram um pouco mais finas. Inicialmente as hifas de C. subvermispora tinham uma espessura ao redor de 0,38μm e aos 18 dias chegaram à cerca de 0,25μm, o mesmo ocorreu em P. tremellosa: a largura inicial era de 0,31 μm e chegou após 18 dias de cultivo a 0,24 μm. Aos 3 dias de cultivo, clamidósporos foram encontrados em pouquíssima quantidade nas culturas de P. tremellosa e ao longo do período de cultivo as culturas apresentaram poucos clamidósporos em seu micélio (tabela 5). C. subvermispora CS1 apresentou clamidósporos também aos 3 dias de cultivo, no entanto, a quantidade destes ao longo do período de incubação foi maior do que a encontrada em P. tremellosa. Em C. subvermispora SS3 os clamidósporos foram encontrados após 6 dias de cultivo já em média quantidade e após 9 dias haviam muitos destes esporos de resistência na cultura até o final dos 18 dias de cultivo. Dentre as três culturas, C. subvermispora SS3 foi quem produziu mais clamidósporos nestas condições de estudo. 78

83 Tabela 5 Produção de clamidósporos observadas em P. tremellosa e C. subvermispora SS3 e CS1 ao microscópio óptico ao longo do crescimento em meio de cultura líquido BD tamponado (ph 4) Espécies Período de cultivo (dias) C. subvermispora SS3 C. subvermispora CS1 P. tremellosa Em P. tremellosa os clamidósporos formados tinham em média um menor tamanho (0,96 μm no início) do que os encontrados em C. subvermispora SS3 e CS1 (1,45 μm no início). Nos períodos iniciais de cultivo os clamidósporos são menores e ao longo do tempo se tornam maiores com paredes mais espessas Isolamento de espécies contaminantes e confronto com os basidiomicetes em estudo Os contaminantes isolados a partir de cavacos da planta piloto pertencem aos fungos anamórficos e foram identificados como Aspergillus spp. e Penicillium spp., através da visualização em microscópio dos conidióforos (estruturas de reprodução assexuada). Estas duas espécies de contaminantes foram confrontados com C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC em meio de cultura sólido ABD. Em extremidades opostas de uma placa de Petri foram inoculadas uma espécie de fungo degradador de madeira e um dos contaminantes. Todas as combinações foram avaliadas. Em todos os casos não houve antibiose, ou seja, os dois fungos cresceram e entraram em contato. Inicialmente os fungos causadores de podridão branca cresciam mais lentamente e o contaminante dominava a placa, no entanto, mantendo o cultivo em estufa, pode-se observar que após 79

84 algum tempo os basidiomicetes reagiam à colonização do contaminante e ocupavam a placa, crescendo inclusive sobre o contaminante. O mesmo fato ocorre em biorreatores com madeira nos experimentos de biodegradação; inicialmente os contaminantes crescem mais rapidamente, porém ao longo do período de cultivo os basidiomicetes aqui estudados voltam a ser os principais colonizadores do substrato. Estes organismos ( Deuteromicetes = anamorfos/mitospóricos) tem uma estratégia que consta de instalação e crescimento rápidos em um dado substrato, com produção imediata de conídios (DIX & WEBSTER, 1995). Acredita-se que nos casos dos biorreatores, a colonização rápida dos contaminantes está relacionada aos nutrientes de fácil assimilação que estão disponíveis no inicio dos experimentos (adição de cosubstrato) e que assim que estes são consumidos, os contaminantes não têm mais capacidade de manter o crescimento Conclusões parciais sobre os estudos relacionados à colonização da madeira e crescimento fúngico A colonização da madeira observada em todas as condições de cultivo para as duas espécies foi crescente e mais visível dentro dos traqueídeos em madeiras moles e nos elementos de vaso em madeiras duras. Poucos clamidósporos foram encontrados nos cortes de madeira observados nas diferentes condições e períodos de cultivo. No crescimento em ph diferentes, pode-se verificar que o ph do meio ABD que é por volta de 5,5 não foi o melhor ph de crescimento para as três cepas testadas. A melhor faixa de crescimento para todas cepas ficou ente 3,5 e 4,5 para os meios ágar-milhocina e ABD. Em meio ABD, C. subvermispora (SS3 e CS1), e P. tremellosa (ATCC 48745) mostraram-se eficientes na competição contra os contaminantes Aspergillus e Penicillium, após uma fase inicial de crescimento. 80

85 5.4. Indução à formação de clamidósporos em C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC produzem clamidósporos sem indução em cultivos em laboratório. Apesar deste fato foi realizada a indução para verificar se poderíamos reduzir o tempo de cultivo e aumentar a quantidade de clamidósporos produzidos. Para provocar a produção destes esporos de resistência foi utilizado como fator de indução estresse osmótico (SAXENA et al.,2001). Após cultivar o micélio por 12 dias em meio de cultura BD a formação de clamidósporos foi induzida pela adição de CaCl 2 1% (concentração final). Pode-se observar que a produção de clamidósporos no micélio era crescente a cada 24 horas e que após 72 horas de indução a quantidade de clamidósporos encontrado nas culturas já não variava muito. Sendo assim, estabeleceu-se como padrão 72 horas de indução. Apesar das cepas de C. subvermispora não apresentarem grande variação na produção de clamidósporos após 72 horas, a cepa CS1 apresentava um pouco menos de clamidósporos do que SS3. Já a produção de clamidósporos em P. tremellosa foi bastante menor do que a encontrada em C. subvermispora Teste de viabilidade do inóculo para produção de clamidósporos em C. subvermispora CS1 e SS3 e P. tremellosa ATCC O teste de viabilidade foi realizado utilizando como inóculo o micélio/clamidósporos batido por 10 ciclos de 15 segundos (maioria das hifas destruídas fig. 28). 81

86 Figura 28 Microscopia óptica de fragmentos de hifas com clamidósporos, após o micélio cultivado para inóculo ser batido por 10 ciclos de 15 segundos. Hifa (seta vermelha) e clamidósporos (seta preta). Aumento 400X. Como parâmetro para comparar a eficiência do inóculo utilizou-se a atividade enzimática de MnP, pois além de apresentar o pico de atividade enzimática aos 14 dias foi a principal enzima oxidativa produzida pelas três espécies de fungos estudadas. Na tabela 6 estão apresentadas as atividades de MnP encontradas nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo com o dois tipos de inóculo, o induzido (micélio cultivado por 12 dias, induzido a produzir clamidósporos, batido por 10 ciclos de 15 s) e o convencional utilizado nos experimentos de biodegradação anteriores (micélio cultivado por 10 dias e batido por 3 ciclos de 15 s) (item 4.23). Tabela 6 Atividade enzimática de manganês peroxidase (MnP) encontrada nos extratos obtidos após 14 dias de cultivo de C. subvermispora SS3 sobre P. taeda e E. grandis, com os inóculos convencional e induzido para a produção de clamidósporos. Tipo de inóculo Substrato Tradicional* Induzido** P. taeda 564± ±21 E. grandis 1050±46 204±14 *Convencional= micélio cultivado por 10 dias e batido por 3 ciclos de 15 s. **Induzido= micélio cultivado por 12 dias, induzido a produzir clamidósporos, batido por 10 ciclos de 15 s. Nos extratos dos cultivos com micélio induzido de C. subvermispora CS1 e P. tremellosa não houve detecção de MnP. Isto provavelmente ocorreu porque a quantidade de clamidósporos 82