- Lacase usada na funcionalização de fibras (seminário)

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1 Enzimas em conversão de biomassa - Enzimas oxidativas envolvidas na degradação de lignina: estrutura, função, como determinar e aplicações no branqueamento de polpas - Lacase usada na funcionalização de fibras (seminário) André Ferraz Departamento de Biotecnologia Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo Lorena, SP

2 Outline - LiP, MnP e VP (peroxidases) - Lacases - Determinação experimental - Aplicações em branqueamento de polpas - Aplicação de lacases na funcionalização de fibras (artigo para discussão no terço final da aula) Ref. básicas: 1. T Teerii and G Henriksson Enzymes degrading wood components. In: In: Pulp and Paper Chemistry and Technology Volume 1, Wood Chemistry and Wood Biotechnology Edited by Monica Ek, Göran Gellerstedt, Gunnar Henriksson cap. 11, pp Kenneth E Hammel and Dan Cullen, Role of fungal peroxidases in biological ligninolysis. Current Opinion in Plant Biology 11: seminário: Jordi Garcia-Ubasart, Josep F. Colom, Carlos Vila, Nuria Gómez Hernández, M. Blanca Roncero, Teresa Vidal A new procedure for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic phenolic compound. Bioresource Technology 112:

3 Revisando sobre o modo de ação dos organismos degradadores de lignina A hifa do fungo habita o lúmen da célula; a degradação ocorre no interior da parede celular

4 Enzimas envolvidas na degradação de lignina princípio do modo de ação

5 Lógica de fragmentação, independente da ação enzimática, dos radicais inicialmente gerados por envolvidas oxidativas

6 Quem são as enzimas envolvidas na degradação de lignina?? grupo 1: Lacases Enzimas oxidativas (lacases) (EC ) (AA1_1) O 2 Lacase (Cu 2+ ) PhO H 2 O Lacase red. (Cu 1+ ) PhOH Cupro-proteínas que recebem elétrons dos fenóis a partir da redução do Cu 2+ a Cu 1+. A Lac-Cu 1+ é então oxidada por O 2 que é reduzido à água

7 Lacases de Trametes versicolor 52J listada no CAZy (white-rot fungi)

8 Visão geral dos 4 íons Cobre. Os íons denominados T1 realizam a oxidação do substrato; T2/T3 reduzem o O 2

9 A estequeometria da reação envolve mais de 1 molécula fenólica por O 2 reduzido, pois há 4 cobres na molécula de lacase Cada O-H fenólico perde 1 e -, gerando um radical fenoxila que se decompõe, por várias vias, conforme mostrado anteriormente A enzima atua somente sobre compostos com hidroxilas fenólicas (de fato, também pode atuar sobre aminas aromáticas), pois a capacidade oxidativa é baixa

10 Potencial redox do Cu 2+ (T1) varia de acordo com o tipo de lacase O. V. Morozova, G. P. Shumakovich, M. A. Gorbacheva, S. V. Shleev, and A. I. Yaropolov (2007) Blue Laccases. Biochemistry (Moscow) 72:

11 A capacidade oxidativa pode ser aumentada se a ação é inicialmente realizada sobre mediadores sintéticos (ABTS ou HBT). Nestes casos a oxidação pode ocorrer mesmo em substratos não fenólicos de lignina 11 Fonte: Reproduzido de Bourbonnais et al. (1999).

12 Oxidação de ABTS em dois estágios, que podem ser iniciados por lacase

13 Mediadores naturais já descritos para lacases

14 Quem são as enzimas envolvidas na degradação de lignina?? a) Fenoloxidases b) Enzimas que produzem peróxido de hidrogênio Enzimas oxidativas (peroxidases) - visão simplista C 0 H 2 O H 2 O H 2 O 2 H 2 O 2 C I C 0 C I S S Mn 3+ Mn 2+ ou S + C II S + Mn 3+ Mn 2+ PhOH PhO. C II LiP (EC ) (AA 2) MnP (EC ) (AA2)

15 Lip e MnP de Phanerochaete chrysosporium (white-rot fungi). Estruturas similares em todas as peroxidases (grupo heme é o sítio ativo). No caso da MnP, há um sítio de ligação de Mn 2+ que funciona como um co-fator para a ação da enzima

16 Ciclo de oxi-redução no sítio catalítico das peroxidases Forma nativa da enzima Forma oxidada da enzima oxidação do substrato oxidação do substrato. Se for uma MnP: Mn 2+ >>Mn 3+

17 Ação de MnP, mediada por ácidos graxos insaturados, sobre modelos não fenólicos de lignina COOH.. O O O 2 Mn 3+ ou. OH COOH COOH Abstração de H de um doador Mn 2+ ou H 2 O. COOH (etapa de iniciação) COOH. (etapa de propagação) COOH Peroxidação de ácido graxo iniciada por Mn 3+ O OH COOH HO O OH OCH 3 OC 2 H 5 OH. O + OCH 3 B OH HO O OCH 3 OCH 3 OC 2 H 5. ROO ROOH HO. OH O OCH 3 A HO. OO O OCH 3 OC 2 H 5 HOO. OH O OH O OCH 3 OCH 3 Degradação de modelo não fenólico por ROO gerado por MnP B OCH 3 OC 2 H 5 OCH 3 OC 2 H 5 O 2 OCH 3 OC 2 H 5 Fonte: Reproduzido com modificações 3+ de Kapich et al. (1999).

18 Degradação in vitro de lignina contida em um material lignocelulósico pelo sistema MnP/ácido linoleico G.G.S. Cunha et al. / Enzyme and Microbial Technology 46 (2010)

19 Enzimas oxidativas (Peroxidase versátil - VP) (EC ) (AA2) Híbrido estrutural de LiP e MnP. Combina as propriedades catalíticas das 2 enzimas, oxidando substratos de LiP e MnP.

20 Versátil Peroxidase de Pleurotus eryngii VPL has the three acidic amino acid residues required for Mn2+ binding, and a catalytic efficiency (kcat/km) for Mn2+ oxidation in the general range exhibited by typical MnPs. In addition, VPL has a tryptophan residue, trp164, analogous to the LiPA trp171 that participates in electron transfer from aromatic donors and consequently enables the enzyme to oxidize nonphenolic ligninrelated structures The catalytic efficiency of P. eryngii VPL on veratryl alcohol is relatively low the same reaction catalyzed by P. chrysosporium LiP

21 Celobiose desidrogenase (EC ) (AA3) Oxida polissacarídeos, reduzindo Fe 3+, O 2 ou mesmo coopera com o ciclo catalítico das LPMOs (AA9)

22 Enzimas que produzem peróxido (são acessórias às peroxidases) glicose oxidase (EC ) (AA3) (intracelular) glioxal oxidase (AA5_1) (extracelular) aril-álcool oxidase (EC ) (AA3) (extracelular)

23 Enzimas que produzem peróxido Também MnP pode gerar H 2 O 2 a partir da oxidação de ácidos orgânicos como o malônico e oxálico. HO-(C=O)-(C=O)-OH Mn 3+ Mn 2+ O=C=O + H + + HO-C. =O O=O H-O-O. + CO 2 Doador de H H 2 O 2

24 Biobranqueamento com o sistema Lacase/mediador Exemplo do efeito da ação do sistema lacase/hbt sobre polpa kraft não branqueada Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997) 24

25 Lacase/HBT em linha piloto de biobranqueamento Figura 8. Linha de branqueamento piloto composta das etapas L-E-Q-P Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997). Incluindo a etapa final de branqueamento (QP), polpa atingiu 76.5% ISO de alvura. Figura 9. Número kappa e alvura das polpas tratadas em planta piloto após os tratamentos com lacase/mediador (L) e lacase/mediador seguido de extração alcalina (L-E). Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997). Fonte: Reproduzido de Call e Muncke (1997) 25

26 Mediadores alternativos ao HBT AS HBT Figura 13. Estrutura de mediadores alternativos testados no sistema lacase/me mediador de referência foi o HBT, mostrado na figura L. Fonte: reproduzido de Camarero et al. (2007). Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007) 26

27 Mediadores alternativos ao HBT HBT AS Fonte: Reproduzido de Camarero et al. (2007) 27

28 Biobranqueamento com o sistema MnP/mediador Eficiência da MnP em função do tipo de ácido graxo insaturado presente no meio reacional Kappa inicial = 8,5 Alvura inicial = 39,3% 28 Fonte: Reproduzido de Bermeck et al. (2002)

29 Lacase usada na funcionalização de fibras (seminário) Garcia-Ubasart et al., A new procedure for the hydrophobization of cellulose fibre using laccase and a hydrophobic phenolic compound. Bioresource Technology 112: