UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA MARCOS PAULO VICENTIM

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA MARCOS PAULO VICENTIM Secreção diferenciada de enzimas lignocelulolíticas durante a biodegradação de madeira por C. subvermispora e resposta da madeira biotratada frente a processos posteriores de polpação LORENA 2007

2 1 MARCOS PAULO VICENTIM Secreção diferenciada de enzimas lignocelulolíticas durante a biodegradação de madeira por C. subvermispora e resposta da madeira biotratada frente a processos posteriores de polpação Tese apresentada à Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Biotecnologia Industrial Área de concentração: Conversão de Biomassa Orientador: Dr. André Luis Ferraz LORENA 2007

3 2 AGRADECIMENTOS Aos meus pais, as pessoas mais valiosas na minha vida. Ao Prof. Dr. André Ferraz, pela brilhante orientação, apoio e paciência durante todo o desenvolvimento do projeto de doutorado. À Melhoramentos Papéis, pela disponibilização dos equipamentos de preparação e análises de polpa celulósica e papel. Àos professores, funcionários e colegas do Laboratório de Recursos Renovables da Universidad de Concepción, no Chile, por ter possibilitado a realização de experimentos. Aos amigos Zé Cobrinha, Zé Gambira e Jussara Canilha, pela assistência técnica e companheirismo. Aos alunos do Departamento de Biotcnologia da EEL/USP, pela amizade e momentos de descontração. Aos demais funcionários do Departamento de Biotecnologia À FAPESP pela bolsa de estudos e demais apoios financeiros.

4 3 RESUMO VICENTIM, M.P. Secreção diferenciada de enzimas lignocelulolíticas durante a biodegradação de madeira por Ceriporiopsis subvermispora e resposta da madeira biotratada frente a processos posteriores de polpação f. Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Este trabalho tem como tema central a biopolpação, que consiste do biotratamento de madeira por fungos degradadores de lignina como etapa prévia à produção de polpa celulósica. As madeiras biotratadas facilitam os processos posteriores de polpação além de dar origem a papéis com maior resistência mecânica. Entretanto, os mecanismos químicos e enzimáticos que explicam esses benefícios não estão totalmente esclarecidos até o momento. Para contribuir neste sentido, este trabalho avaliou o biotratamento de cavacos de madeira de Eucalyptus grandis e Pinus taeda por Ceriporiopsis subvermispora em condições de cultivo que promovessem níveis diferenciados de crescimento fúngico e metabolismo extracelular. Foi então analisado como níveis metabólitos diferenciados afetam a degradação da madeira e como essas madeiras biotratadas respondem aos processos de polpação quimiotermomecânica (CTMP) e kraft de alto rendimento. Dos suplementos avaliados (glicose, milhocina e Mn 2+ ), a milhocina promoveu grande estímulo ao crescimento fúngico, e consequentemente à secreção de metabólitos. A condição suplementada com glicose e milhocina elevou a atividade de manganês-peroxidase (MnP) de 230 para 1317 UI/kg. Nesses cultivos a quebra de ligações β- O-4 nas ligninas residuais das madeiras biotratadas foi intensa, assim como o acúmulo de substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico, indicativas de reações de peroxidação de lipídeos iniciadas pela MnP. A análise multivariada dos dados referentes aos cultivos diferentemente suplementados indicou que durante a biodegradação de madeira não há um único fator responsável pela degradação ou transformação da lignina. De fato, os resultados sugeriram que há um compromisso entre os níveis de enzimas extracelulares, bem como de Mn 2+ adicionado externamente, que levam a maior degradação da macromolécula. Três condições de cultivo foram selecionadas para estudos subseqüentes envolvendo o biotratamento de P. taeda e também para a ampliação de escala e preparação de polpas celulósicas: condição 1 (madeira não-suplementada) que promoveu baixos níveis metabólicos e degradativos; condição 5 (madeira suplementada com milhocina) que promoveu elevados níveis de degradação de lignina; e condição 7 (madeira suplementada com glicose e milhocina) que promoveu os mais elevados níveis metabólicos. Nos cultivos com madeira de P. taeda, a suplementação promoveu resultados semelhantes aos anteriormente observados com E. grandis. Frente à polpação kraft, os cavacos biotratados nas condições 1 e 5 reduziram em até 2,3 pontos percentuais a carga de álcali ativo necessária para a preparação de polpa com Kappa 80. O refino dos cavacos de madeira em um processo CTMP foi facilitado com todas as amostras biotratadas, especialmente sob a condição 7. Em alguns casos as biopolpas deram origem a papéis mais resistentes à tração (28% de melhora no papel produzido a partir da biopolpa CTMP de E. grandis biotratado na condição 7). Uma análise integrada de todos os resultados indicou que a extensão da degradação de lignina não foi um fator determinante para a maximização dos benefícios na biopolpação. Por outro lado, cultivos que levaram a secreção intensificada de todos os metabólitos extracelulares, também promoveram maiores benefícios aos processos subseqüentes de polpação CTMP. PALAVRAS CHAVE: Ceriporiopsis subvermispora. Biopolpação. Celulose e papel. Biodegradação de madeira.

5 4 ABSTRACT VICENTIM, M.P. Varied secretion of ligninolytic enzymes during wood biodegradation by Ceriporiopsis subvermispora and the response of biotreated samples to pulping processes f. Thesis (Doctor in Industrial Biotechnology) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, The main subject of this work concerns the biopulping process, which consists of the fungal pretreatment of wood chips for preparation of chemical or mechanical pulps. Biotreated wood chips turn easier conventional pulping processes and give rise to stronger paper-sheets. However, the enzymatic and chemical mechanisms that drive these benefits are not totally understood. The present work assesses this question by evaluating the biotreatment of Eucalyptus grandis and Pinus taeda wood chips with Ceriporiopsis subvermispora under culturing conditions that could provide varied fungal growth and extracellular fungal metabolism. It was evaluated how varied extracellular metabolite levels affect wood biodegradation and how biotreated samples responds to chemithermomechanical (CTMP) and high-yield kraft pulping processes. From the evaluated culture conditions (biotreatment medium supplemented with glucose, corn steep liquor (CSL) and Mn 2+ ), CSL improved fungal growth and consequently the metabolite secretion. The combination of glucose and CSL increased manganese-peroxidase (MnP) activity from 230 to 1317 IU/kg. β-o-4 cleavage was very intense in the residual lignins of biotreated wood samples. The highest lignin breakdown levels were observed in the same cultures that accumulated high contents of thiobarbituric acid reactive substances, suggesting that lipid peroxidation reactions could explain lignin degradation in these experiments. Multivariate analysis of the data regarding the differently supplemented cultures indicated that there is not a unique factor responsible for the lignin degradation or its structural changes during the biotreatment step. In fact, data suggested that there is a compromise between the extracellular enzyme levels and Mn 2+ concentration for the macromolecule degradation. Three of the culture conditions were chosen for subsequent studies involving P. taeda biotreatment and also for scale-up trials for pulping experiments: condition 1 (unsupplemented wood), that provided low metabolic and degradative levels; condition 5 (wood supplemented with CSL), that provided high lignin degradation levels; and condition 7 (wood supplemented with CSL and glucose), that provided the highest metabolic levels. In cultures performed with P. taeda wood, supplementation caused similar results as those observed with E. grandis. For kraft pulping, the wood chips biotreated under conditions 1 and 5 required up to 2.3 percent points less active alkali for preparation of Kappa-80 pulps. For CTMP, all biotreated wood samples provided a facilitated refining process, especially the condition 7. In some cases, biopulps gave rise to paper-sheets with increased tensile resistance (28% of improvement on the paper prepared form CTMP biopulp from E. grandis biotreated under condition 7). An evaluation of the complete data set indicated that lignin biodegradation was not the determining factor for maximizing the biopulping benefits. On the other hand, culture conditions that induced higher extracellular metabolite secretion also provided the best benefits for CTMP process. KEY WORDS: Ceriporiopsis subvermispora. Biopulping. Pulp and paper. Wood biodegradation.

6 5 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Ciclo catalítico da MnP Figura 2: Degradação de lignina não-fenólica por radicais peroxila...21 Figura 3: Ciclo catalítico de lacase Figura 4: Atividade de MnP e crescimento fúngico nos cultivos de 14 dias de C. subvermispora sobre cavacos de E. grandis...54 Figura 5: Perfil de produção enzimática ao longo de 14 dias de biotratamento de cavacos de E. grandis...62 Figura 6: Perfil metabólico de C. subvermispora ao longo de 14 dias de cultivo em meio líquido composto de 2,0% de extrato de malte e 0,7% de extrato de levedura Figura 7: Reações ocorridas durante os procedimentos de DFRC, mostrando a quebra da ligação éter e produzindo os monômeros quantificáveis...66 Figura 8: Relação entre a atividade de MnP e a degradação de lignina...68 Figura 9: Relação entre a quantidade de TBARS e a degradação de lignina...70 Figura 10: Rendimento de DFRC em função da perda de lignina em cultivos de C. subvermispora sobre E. grandis Figura 11: Liberação de açúcares redutores a partir da ação do extrato enzimático de C. subvermispora sobre papel de filtro Figura 12: Espectros de NIR das madeiras controle e biodegradada...79 Figura 13: Análise multivariada dos espectros de NIR das amostras de E. grandis biotratadas sob diferentes formas de cultivo...79 Figura 14: Teor de monômeros de DFRC previstos pelo modelo PCR construído a partir da análise multivariada dos espectros de NIR...80 Figura 15: Espectros de IR das amostras de E. grandis controle e biodegradada...82 Figura 16: Análise multivariada dos espectros de MIR das amostras de E. grandis biotratadas sob diferentes formas de cultivo...84 Figura 17: Loadings dos 3 primeiros PCs, mostrando a importância de cada região do espectro de MIR no cálculo dos scores de cada amostra Figura 18: Correlação entre monômeros de DFRC e os scores de PC3 obtido a partir de análise multivariada dos espectros de MIR das amostras de E. grandis controle e biodegradadas sob diferentes condições de cultivo...85 Figura 19: Perfil de deslignificação dos cavacos em função da concentração de álcali ativo durante polpação kraft de E. grandis...90 Figura 20: Números Kappa de polpas kraft de E. grandis obtidos a partir da aplicação de diferentes cargas de álcali ativo para o cozimento da madeira...91 Figura 21: Rendimento das polpas kraft de E. grandis em função do teor de lignina residual Figura 22: Correlação entre a diminuição do número Kappa de biopolpas kraft de E. grandis com a atividade de MnP, perda de lignina e rendimento de DFRC...93 Figura 23: Perfil de deslignificação dos cavacos em função da concentração de álcali ativo durante polpação kraft de P.taeda...95 Figura 24: Números Kappa de polpas kraft de P. taeda obtidos a partir da aplicação de diferentes cargas de álcali ativo...96 Figura 25: Rendimento das polpas kraft de P. taeda em função do teor de lignina residual Figura 26: Correlação entre a diminuição do número Kappa de biopolpas kraft de P. taeda com a atividade de MnP e perda de lignina...97

7 Figura 27: Perfil de refinamento das polpas kraft de alto rendimento produzidas a partir de cavacos de E. grandis biotratados e controle Figura 28: Resistência à tração das folhas formadas a partir de polpas controle e biotratadas kraft de alto rendimento de E. grandis, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 29: Resistência ao rasgo das folhas formadas a partir de polpas controle e biotratadas kraft de alto rendimento de E. grandis, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 30: Contraposição dos índices de resistência ao rasgo e à tração das folhas formadas a partir das polpas controle e biotratadas kraft de alto rendimento de E. grandis Figura 31: Perfil de refinamento das polpas kraft de alto rendimento produzidas a partir de cavacos de P. taeda biotratados e controle Figura 32: Resistência à tração das folhas formadas a partir de polpas controle e biotratadas kraft de alto rendimento de P. taeda, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 33: Resistência ao rasgo das folhas formadas a partir de polpas controle e biotratadas kraft de alto rendimento de P. taeda, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 34: Contraposição dos índices de resistência ao rasgo e à tração das folhas formadas a partir das polpas controle e biotratadas kraft de alto rendimento de P. taeda Figura 35: Perfil de refinamento de polpas CTMP de E. grandis biotratadas e controle, em função do tempo Figura 36: Resistência à tração das folhas formadas a partir das biopolpas e polpa controle CTMP de E. grandis, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 37: Resistência ao rasgo das folhas formadas a partir das biopolpas e polpa controle CTMP de E. grandis, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 38: Contraposição dos índices de resistência ao rasgo e à tração das folhas formadas a partir das biopolpas e da polpa controle CTMP de E. grandis Figura 39: Correlação entre a atividade de MnP detectada nos cultivos e concentração de ácido oxálico esterificado à madeira biotratada com o grau de fibrilação das biopolpas de E. grandis refinadas por 90 minutos Figura 40: Perfil de refinamento das polpas CTMP de P. taeda Figura 41: Correlação entre a atividade de MnP detectada nos cultivos e concentração de ácido oxálico esterificado à madeira biotratada com o grau de fibrilação das biopolpas de P. taeda refinadas por 220 minutos Figura 42: Resistência à tração das folhas formadas a partir das biopolpas e polpas CTMP de P. taeda, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 43: Resistência ao rasgo das folhas formadas a partir das biopolpas e polpas CTMP de P. taeda, em função do grau de refino e do tempo de refinamento Figura 44: Contraposição dos índices de resistência ao rasgo e à tração das folhas formadas a partir das polpas CTMP de P. taeda

8 7 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Propriedades mecânicas e óticas de polpas termomecânicas (TMP) de Pinus taeda biotratado por Ceriporiopsis subvermispora...14 Tabela 2: Condições de cultivo de C. subvermispora sobre E. grandis...30 Tabela 3: Efeito da suplementação dos meios de cultivo sobre o crescimento fúngico e produção de MnP e xilanases durante o biotratamento de E. grandis por C. subvermispora durante 14 dias...53 Tabela 4: Produção de ácido oxálico e alteração do ph da madeira em função do biotratamento de E. grandis sob as diversas formas de suplementação...58 Tabela 5: Efeito das diversas formas de suplementação dos cavacos de E. grandis sobre as reações de peroxidação de lipídeos, estimada pela quantificação de TBARS...60 Tabela 6: Efeito das diferentes condições de suplementação do meio de cultivo sobre a biodegradação da madeira de E. grandis por C. subvermispora...67 Tabela 7: Atividades enzimáticas durante a biodegradação de P. taeda por C. subvermispora Tabela 8: Produção de ácido oxálico e alteração do ph da madeira durante o biotratamento de P. taeda por C. subvermispora Tabela 9: Perda de massa e de lignina dos cavacos de P. taeda biotratados por C. subvermispora Tabela 10: Intensidades das bandas de MIR nas amostras biotratadas e controle de E. grandis...83 Tabela 11: Biotratamento de E. grandis em escala ampliada: perfil metabólico do fungo e parâmetros de degradação da madeira...87 Tabela 12: Biotratamento de P. taeda em escala ampliada: perfil metabólico do fungo e parâmetros de degradação da madeira...87 Tabela 13: Rendimento e alvura das biopolpas kraft de alto rendimento produzidas a partir de madeira de E. grandis Tabela 14: Rendimento e alvura das biopolpas kraft de alto rendimento produzidas a partir de madeira de P. taeda Tabela 15: Características do processo de polpação CTMP de E. grandis: rendimento da etapa química, teor de palitos e alvura das folhas Tabela 16: Propriedades da polpação CTMP de P. taeda: rendimento da etapa química, teor de palitos e alvura das folhas...115

9 8 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Biopolpação Mecanismos envolvidos no processo de biodegradação da madeira Modo de ação dos fungos em termos microscópicos Aspectos químicos e bioquímicos da biodegradação de madeira Ceriporiopsis subvermispora: enzimas extracelulares e seu modo de ação Indução da produção de enzimas ligninolíticas extracelulares OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS Fungo e preparo do inóculo Madeiras utilizadas Experimentos de biodegradação Avaliação do metabolismo fúngico ao longo de 14 dias de cultivo Experimentos de biodegradação em escala ampliada Extração e quantificação das enzimas produzidas durante a biodegradação da madeira Extração e determinação de ácido oxálico e do ph da madeira biotratada Determinação do crescimento fúngico Determinação de TBARS Determinação da perda de massa da madeira biotratada Determinação da composição química de madeira Determinação da concentração de metais na madeira Caracterização in situ das ligninas residuais por DFRC Análise da madeira por espectroscopia de infravermelho Infravermelho Médio (MIR) Infravermelho Próximo (NIR) Análise multivariada Regressão de Componentes Principais (PCR) Prepraração de polpas kraft de alto rendimento Determinação do perfil de deslignificação da madeira em função da carga de álcali ativo Preparação de polpas kraft de alto rendimento em reatores de 800 ml... 47

10 Preparação de polpas CTMP Determinação do grau de fibrilação das polpas Formação de folhas a partir das polpas kraft e CTMP e análise de suas propriedades ópticomecânicas RESULTADOS E DISCUSSÃO Efeito da adição de suplementos aos ensaios de biodegradação de E. grandis por C. subvermispora Crescimento fúngico e produção de enzimas Secreção de ácido oxálico e alteração do ph da madeira Reações de peroxidação de lipídeos Produção de enzimas ao longo de 14 dias de cultivo Biodegradação da madeira de E. grandis Metabolismo fúngico durante o biotratamento de P. taeda Biodegradação da madeira de P. taeda Caracterização das madeiras biotratadas por espectroscopia de infravermelho Biodegradação das madeiras de E. grandis e P. taeda em escala ampliada Preparação de polpas kraft de alto rendimento a partir da madeira biotratada Efeito do biotratamento dos cavacos de E. grandis sobre a carga de álcali ativo requerida para a polpação kraft Efeito do biotratamento dos cavacos de P. taeda sobre a carga de álcali ativo requerida para a polpação kraft Refino e propriedades óptico-mecânicas das polpas kraft de E. grandis Refino e propriedades óptico-mecânicas das Polpas Kraft de P. taeda Polpação CTMP de madeira de E. grandis Polpação CTMP de madeira de P. taeda CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXO A...137

11 10 1 INTRODUÇÃO O estudo da biodegradação de madeira possui importância tanto acadêmica quanto tecnológica, uma vez que a decomposição de materiais lignocelulósicos constitui um dos ciclos do carbono na natureza de maior importância e o entendimento deste processo representa uma contribuição significativa às ciências naturais. Além disso, a biodegradação de madeira é a base do processo de biopolpação que tem demonstrado grande êxito, principalmente quando associado à produção de polpas mecânicas. Esta combinação tem sido denominada de polpação biomecânica e a aplicação do biotratamento permite reduzir em até 40% o consumo de energia elétrica no refinamento mecânico posterior. As biopolpas também apresentam maior resistência mecânica do que as polpas convencionais. Este processo já foi testado em escala ampliada (degradação de 50 toneladas de cavacos) e está em vias de implementação industrial em vários paises, inclusive no Brasil. Embora o processo de biopolpação já se encontre bastante desenvolvido, os mecanismos químicos e bioquímicos envolvidos na biodegradação da madeira ainda são pouco conhecidos e restritos ao que está estabelecido para um pequeno número de fungos decompositores de madeira. O entendimento destes mecanismos certamente poderá contribuir com a otimização deste processo biotecnológico. Nesse contexto, a tese aqui apresentada pretende dar um passo adicional no sentido de entender a relevância de alguns metabólitos extracelulares nas etapas iniciais da biodegradação da madeira. A abordagem experimental utilizada buscou condições de cultivo que levassem a níveis diferenciados de secreção de um ou outro grupo de metabólitos extracelulares, tentando verificar como as alterações desses níveis poderiam afetar a eficiência na biopolpação.

12 11 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA De uma forma geral, a vasta literatura sobre a biodegradação da madeira pode ser dividida em 2 tópicos: um relativo ao que está estabelecido quanto à aplicabilidade da biodegradação da madeira nos processos de biopolpação (abordado de forma resumida no item 2.1), e outro tópico referente ao modo de ação dos fungos decompositores de madeira, em especial ao que está estabelecido para o fungo utilizado neste trabalho, Ceriporiopsis subvermispora (abordado no item 2.2). De fato, hoje há modelos que podem explicar a decomposição da madeira como resultado da ação de enzimas extracelulares e de metabólitos de baixa massa molar, também extracelulares. No entanto, pouco se sabe sobre quais alterações provocadas pelos fungos à matriz lignocelulósica são de fato relevantes para a promoção dos benefícios na biopolpação, e também quais são exatamente os agentes causadores dessas alterações. Essas questões têm origem na difícil abordagem experimental necessária para o estudo da biodegradação de madeira. Muito do que está estabelecido atualmente sobre a biodegradação da lignina tem origem em resultados obtidos em sistemas modelos, muitos deles referentes ao cultivo de fungos em meio líquido atuando sobre compostos modelos de lignina. Adicionalmente, boa parte do que está estabelecido quanto à decomposição de polissacarídeos provém de resultados experimentais obtidos com Ascomicetos que não são os principais organismos envolvidos na decomposição natural da madeira, nem os que têm encontrado aplicação tecnológica para o processo. Nessa revisão abordaremos inicialmente os processos de biopolpação a fim de ilustrar brevemente a relevância tecnológica do tema em estudo e posteriormente será dada ênfase aos aspectos químicos e bioquímicos envolvidos no processo biodegradativo.

13 Biopolpação Partindo do princípio de que várias espécies de fungo podem degradar lignina, surgiu a idéia inicial da biopolpação. O conceito está baseado no fato de que fungos que degradam lignina seletivamente, isto é, removem lignina preservando a celulose, podem ser aplicados sobre cavacos de madeira e depois de um determinado tempo de biodegradação dar origem a um resíduo biodegradado rico em celulose e com baixo teor de lignina (polpa) (AKHTAR et al., 1998). Uma reformulação no conceito de biopolpação foi necessária para que esta tecnologia obtivesse êxito em escala ampliada e com tempos de biodegradação mais compatíveis com processos industriais. Na reformulação deste conceito foi considerada a possibilidade de aplicar a biodegradação de madeira como uma etapa prévia à polpação química ou mecânica. Mesmo com períodos mais curtos de biodegradação (15 a 30 dias), a madeira biodegradada já apresenta um amolecimento característico que permite maior facilidade de desfibramento mecânico ou no caso da polpação química, maior facilidade de penetração dos reagentes, bem como maior susceptibilidade da lignina parcialmente degradada à solubilização pelos licores de polpação. Este pré-tratamento biológico permite então uma redução de até 40% no consumo de energia para o desfibramento e refinamento mecânico, ou no caso da polpação química, diminuição no tempo, na temperatura de reação ou mesmo na carga de reagentes químicos utilizados. Esta amenização nas condições necessárias para a produção de polpas celulósicas ainda proporciona a obtenção de polpas com melhor resistência mecânica (AKHTAR et al., 1998; FERRAZ; CHRISTOV; AKHTAR, 1998; FERRAZ 2001; MESSNER, 1998). Atualmente, a biopolpação prévia ao tratamento mecânico da madeira atingiu um grau de desenvolvimento que permitiu a ampliação de escala do processo para nível piloto e semi-industrial (AKHTAR et al., 2000; GUERRA; MENDONÇA; FERRAZ, 2005).

14 13 O processo de polpação mecânica responde por aproximadamente 20-25% da produção de polpa celulósica mundial. Por ser de alto rendimento (90-98%) e geralmente não aplicar agentes a base de cloro na etapa de branqueamento (como na polpação química convencional), tem ganho bastante espaço nos últimos anos. Além disto, os custos de instalação de uma planta de polpação mecânica são muito menores que aqueles requeridos por uma indústria de polpação química (BIERMANN, 1993). Apesar da simplicidade da instalação, o processo mecânico caracteriza-se por requerer um grande consumo de energia elétrica. Além disto, o papel produzido apresenta baixa resistência mecânica e é difícil de ser branqueado, servindo apenas para a produção de jornais, catálogos, papelão e, em misturas com polpas de melhor qualidade, para papéis sanitários e absorventes (BIERMANN, 1993; FENGEL; WEGENER, 1989). A polpação biomecânica, em que os cavacos biotratados são submetidos à polpação mecânica por refinamento (RMP), é aquela que tem apresentado os resultados mais promissores (AKHTAR et al., 1992, 1993, 1998; AKHTAR; KIRK; BLANCHETTE, 1997; LEATHAM; MYERS; WEGNER, 1990a, b). A combinação do biotratamento com processos termomecânicos (TMP) também tem sido avaliada, e um exemplo dos resultados obtidos com madeira de Pinus taeda tratada para produzir polpas com elevado nível de fibrilação é mostrado na Tabela 1. Neste exemplo, nota-se que o processo bio-tmp produz polpas cerca de 2 vezes mais resistentes com um consumo de energia elétrica 38% menor que o processamento TMP convencional (AKHTAR; FERRAZ, 1998). Uma característica negativa da biopolpação refere-se à produção de polpas com menor alvura que as convencionais, como pode ser observado no exemplo da Tabela 1. Por outro lado, estudos recentes de nosso grupo de pesquisa mostraram que uma etapa de extração alcalina pôde remover grande parte dos cromóforos contidos nas biopolpas, e que as biopolpas podem ser branqueadas a níveis

15 14 similares de alvura aos obtidos com polpas convencionais (GUERRA; PAVAN, FERRAZ, 2006). Tabela 1: Propriedades mecânicas e óticas de polpas termomecânicas (TMP) de Pinus taeda biotratado por Ceriporiopsis subvermispora. Biotratamento de 15 dias em fermentação em meio sólido com 0,5% (p/p) de milhocina como co-substrato (AKHTAR e FERRAZ, 1998). Propriedades da polpa/característica do processo Madeira Madeira biotratada controle Energia demandada para atingir 100 ml de "freeness" (W.h/kg) Grau freeness (ml) / Schopper-Riegler ( o SR) 113/65 100/66 Índice de resistência ao estouro (kn.g -1 ) 0,59 1,16 Índice de resistência ao rasgo (mn.m 2.g -1 ) 2,85 5,15 Índice de resistência à tração (N.m.g -1 ) 15,6 24,6 Alvura (% ISO) 51,4 39,1 A madeira biotratada também tem sido avaliada quanto ao posterior processo de polpação quimiotermomecânico (CTMP). Este processo constitui uma melhoria do TMP, produzindo polpas cerca de 3 vezes mais resistentes que o anterior. Guerra, Mendonça e Ferraz (2005) demonstraram que o biotratamento de cavacos de E. grandis por C. subvermispora proporcionou redução de até 45 minutos nos tempos de refinamento das biopolpas, além de leve aumento de suas propriedades mecânicas, principalmente quanto à resistência à tração. No processamento CTMP de cavacos de E. grandis biotratados em escala piloto, foi verificada economia de até 27% do total de energia requerido para as etapas de desfibramento e refinamento, tendo as polpas apresentado propriedades ópticas e mecânicas semelhantes às convencionais (PAVAN, P.C., exame de qualificação de doutorado - Programa de PG em biotecnologia industrial, ELL-USP). O uso de cavacos biotratados para preparação de polpa química tem recebido menor atenção quando comparado aos processos de polpação biomecânica. A maioria dos trabalhos publicados está relacionada ao uso de processos bioquímicos desenhados para a preparação de polpas de baixo número kappa e susceptíveis ao branqueamento. Nestes casos, sempre é necessário o emprego de um processo de polpação severo, realizado a altas temperaturas e

16 15 com elevadas cargas de reagentes. Em tais condições, o pré-tratamento fúngico pode levar a uma diminuição na carga de álcali requerida no cozimento da ordem de 1-2 pontos percentuais (pp) (processo kraft) para a produção de polpas com propriedades similares às obtidas a partir de madeira não biodegradada. O biotratamento da madeira pode também reduzir o teor de lignina residual na biopolpa, quando empregada na madeira biotratada a mesma carga de álcali utilizada em madeira convencional. Por outro lado, alguns trabalhos têm demonstrado que o máximo benefício do pré-tratamento fúngico somente é obtido quando o processo posterior de polpação química é realizado em condições mais amenas de reação (FERRAZ; CHRISTOV; AKHTAR, 1998; FERRAZ et al. 2000a, b; MENDONÇA; GUERRA; FERRAZ, 2002). No trabalho de Mendonça, Guerra e Ferraz (2002), por exemplo, o biotratamento de P. taeda por C. subvermispora por períodos entre 15 e 60 dias permitiu a redução de até 4,1 pp no teor de álcali ativo para a produção de polpa kraft com Kappa 80, e os rendimentos de polpação a partir da madeira biotratada foram levemente superiores aos obtidos a partir de madeira não-biotratada. As polpas preparadas sob condições de reação mais amenas, apresentam teor de lignina residual elevado e por isso possuem uma aplicação mais restrita na preparação de papéis. Estas polpas, denominadas de polpas de alto rendimento, geralmente são utilizadas na preparação de papéis de recobrimento de embalagens e usualmente não são branqueadas (BIERMANN, 1993). 2.2 Mecanismos envolvidos no processo de biodegradação da madeira Modo de ação dos fungos em termos microscópicos A degradação natural de materiais lignocelulósicos é, em grande parte, causada por fungos pertencentes à divisão Basidiomycota. Tais fungos podem ser classificados como causadores de decomposição branca (white-rot fungi) ou parda (brown-rot fungi) de acordo com o aspecto visual da madeira biodegradada. Alguns organismos da divisão Ascomycota e

17 16 Deuteromycota são normalmente classificados como causadores de decomposição branda (soft-rot fungi). Os fungos causadores de decomposição parda degradam principalmente os polissacarídeos, enquanto os demais são capzes de degradar todos os componentes da madeira, sendo os causadores de decomposição branca mais rápidos neste processo que os de decomposição branda (KIRK; CULLEN, 1998). Para o processo de biopolpação, o emprego de fungos causadores de decomposição branca é o mais apropriado, especialmente as espécies mais seletivas à degradação de lignina. As hifas dos fungos penetram na celula vegetal através do lúmen, onde secretam uma série de metabólitos que por sua vez atuam sobre os componentes da madeira. Estes metabólitos são constituídos por enzimas e compostos químicos de baixa massa molar que podem atuar independentemente ou em conjunto (HOFRICHTER, 2002). Os componentes da madeira são inicialmente despolimerizados e convertidos em móléculas solúveis, susceptíveis ao metabolismo intacelular que culmina na geração de energia para a célula, CO 2 e água (mineralização) (KIRK e CULLEN, 1998). As enzimas extracelulares são fundamentais no processo degradativo da madeira, contudo, elas não são capazes de penetrar a parede celular vegetal intacta, sendo impedidas de agir sobre os componentes da madeira distante do lúmen nos estágios iniciais de biodegradação (FLOUNOY et al., 1993; GOODELL et al., 1997; AKHTAR et al., 1992, 1993, 1998; AKHTAR; KIRK; BLANCHETTE, 1997). No entanto, é conhecido que fungos causadores de decomposição branca seletivos à degradação de lignina, como Ceriporiopsis subvermispora, são capazes de causar alterações estruturais significativas na lignina presente na parede celular e na lamela média, mesmo antes da parede celular vegetal ser permeável a proteínas do tamanho da insulina (5730 Da.) (BLANCHETE et al., 1997). A degradação nestas regiões é explicada pela ação de compostos químicos de baixa massa molar, produzidos pelo fungo, capazes de atuar como mediadores das enzimas. O reduzido volume

18 17 de tais compostos permite seu livre deslocamento através da parede celular vegetal, atuando em regiões nas quais as enzimas não podem penetrar nos estágios iniciais de degradação da madeira (KIRK e CULLEN, 1998) Aspectos químicos e bioquímicos da biodegradação de madeira Como mencionado anteriormente, a madeira é biodegradada pela ação de uma grande variedade de enzimas extracelulares e de metabólitos de baixa massa molar que atuam como auxiliares (mediadores) dessas enzimas. As enzimas responsáveis pela degradação da celulose e das polioses são hidrolases que apresentam uma especificidade muito grande pelo respectivo substrato (KIRK; CULLEN, 1998). Dessa forma, as enzimas hidrolíticas (celulases e hemicelulases) somente atuam a partir do contato direto com seus respectivos substratos (celulose e hemicelulose). A degradação da celulose, que é um polímero linear composto de unidades de anidroglicose interligadas por ligações β-1-4, é feita pela ação de três grupos de enzimas que atuam de forma seqüencial e sinérgica, causando a hidrólise completa da celulose até glicose. Estes grupos de enzimas são compreendidos por: - endo-1,4-β-glicanases: hidrolizam a molécula de celulose a partir de suas regiões amorfas, gerando fragmentos ainda com grande grau de polimerização; - exo-1,4-β-glicanases: também denominadas celobiohidrolases, este grupo de enzimas é capaz de agir somente nas pontas dos oligômeros de celulose. De sua ação, são gerados principalmente dímeros de glicose (celobiose); - 1,4-β-glicosidases: este terceiro e último grupo de enzimas age nos dímeros gerados pelas celobiohidrolases, gerando glicose (ERIKSSON; BLANCHETTE; ANDER, 1990; EVANS et al. 1994; HIGUCHI, 1985). A biodegradação das polioses requer um conjunto de enzimas extracelulares mais

19 18 complexo, uma vez que esta fração pode conter homopolímeros ramificados como as xilanas de madeiras de folhosas com ramificações de grupos arabinosil, acetil e ácido metilglucurônicos ou ainda hetero-polissacarídeos como as glicomananas de madeiras de coníferas com ramificações de grupos galactosil e acetil. O conjunto de enzimas que atua sobre as polioses também são hidrolases, específicas para os diferentes tipos de ligação existentes no polímero, e agem de forma semelhante às que atuam sobre a celulsoe. Destas enzimas, as xilanases rompem ligações glicosídicas entre moléculas de anidroxilose, as manannases entre moléculas de anidromanose e as glucuronidases atuam sobre ligações de ácidos urônicos com moléculas de açúcares. As hemicelulases também são divididas em 3 grupos que atuam de forma consecutiva e sinérgica: endo-hemicelulases, que hidrolisam o polímero ao acaso liberando fragmentos de menor massa molar; exo-hemicelulases, que hidrolisam os fragmentos gerados pelas endo-hemicelulases gerando principalmente dímeros, e xilosidases que hidrolisam dímeros a açúcares monoméricos (ERIKSSON; BLANCHETTE; ANDER, 1990; HIGUCHI, 1985). A degradação da lignina, que é uma macromolécula amorfa formada por sub-unidades derivadas do fenil-propano, pode ser induzida por um vasto grupo de enzimas que atuam de forma oxidativa. Destas, as mais amplamente estudas são: LiP (lignina-peroxidase), MnP (manganês-peroxidase) e Lacase. As LiPs são heme-proteínas que apresentam potencial de oxidação suficientemente elevado para abstrair elétrons de estruturas aromáticas nãofenólicas, dando origem a radicais catiônicos. As MnPs também são heme-proteínas, porém apresentam potencial de oxidação suficiente somente para abstrair elétrons de estruturas fenólicas. As lacases são cupro-proteínas, também com potencial de oxidação suficente para abstrair elétrons de estruturas fenólicas (KIRK; CULLEN, 1998). O ciclo catalítico da MnP (Figura 1), principal enzima ligninolítica produzida por C. subvermispora, é iniciado pelo acoplamento de H 2 O 2 (ou um peróxido orgânico, ROOH) ao

20 19 Fe 3+ de sua estrutura, ocorrendo uma seqüência de reações internas que dão origem à MnP- Composto I, que se trata de um oxo-complexo radical (Fe 4+ =O ), sendo expelida 1 molécula de H 2 O se a ativação da enzima se deu por H 2 O 2, ou uma molécula de um álcool (ROH) se ativada por um peróxido orgânico. A redução da enzima a seu estado nativo ocorre em duas etapas. Na primeira etapa, a MnP-Composto I é reduzida a MnP-Composto II, que consiste do complexo não-radical Fe 4+ =O. A redução é realizada pela doação de 1 elétron de um íon Mn 2+ monoquelado, sendo este oxidado à Mn 3+. Nesta etapa, o elétron também pode ser doado por um composto fenólico ou pelo ferrocianeto. Na segunda etapa, a MnP-Composto II é reduzida à MnP férrica (estado nativo), à custa de 1 elétron proveniente necessariamente de um íon Mn 2+ (há outros substratos que também podem promover esta reação, porém de maneira muito lenta), sendo expelida mais 1 molécula de H 2 O (proveniente da redução do oxigênio que estava complexado ao Fe 4+ ) (CONESA et al., 2002; HOFRICHTER, 2002; KIRK e CULLEN, 1998; LOBOS et al., 2001). Altas concentrações de H 2 O 2 promovem a inativação reversível da enzima, pela formação de um composto III. A formação da MnP-Composto III se dá a partir da oxidação da MnP-Composto II, causado pela adição de excesso de H 2 O 2, mas também pode ser formado a partir da oxidação da enzima no estado nativo, causado por adição de O 2 (WARIISHI et al., 1988). Os íons Mn 3+ formados ficam presos a um sítio específico na enzima. Fungos causadores de decomposição branca produzem ácidos orgânicos, cujo principal é o oxálico, que quelam Mn 3+, retirando-o deste sítio, permitindo que a enzima continue seu ciclo. O complexo de baixa massa molar Mn 3+ -quelante também atua como um mediador natural da enzima na degradação de lignina. Esse complexo possui estabilidade suficiente para se difundir através dos poros da parede celular do lignocelulósico e oxidar porções fenólicas da macromolécula em regiões distantes da hifa fúngica, onde as enzimas não podem penetrar nos

21 20 estágios iniciais de degradação. Outros ácidos orgânicos produzidos pelos fungos (em menor quantidade) também capazes quelar Mn 3+ são o malônico, málico, tartárico e lático (CONESA et al., 2002; HAMMEL et al., 2002; HOFRICHTER, 2002; KIRK e CULLEN, 1998; LOBOS et al., 2001; AGUIAR; SOUZA-CRUZ; FERRAZ, 2006). ou Figura 1: Ciclo catalítico da MnP. RH = substrato fenólico; R-OOH = peróxido orgânico qualquer; R-OH = álcool qualquer (reproduzido com modificações de HOFRICHTER, 2002). Sob as condições fisiológicas de cultivos de fungos sobre madeira, a MnP consegue oxidar apenas grupos fenólicos da lignina, que representam uma minoria dos oxigênios ligados aos anéis aromáticos, uma vez que a função éter predomina na macromolécula (KIRK e CULLEN, 1998). Além disso, a degradação de sub-estrtuturas fenólicas por MnP gera radicais fenóxi que tendem a repolimerizar em vez de se estabilizarem por clivagem de ligações aril-éter (KIRK and CULLEN, 1998; FERRAZ, 2003). A partir de uma série de estudos, o grupo de K.E. Hammel (HAMMEL et al., 2002; JENSEN et al., 1996; KAPICH; JENSEN; HAMMEL, 1999; SREBOTNIK et al., 1997) demonstrou que a MnP pode atuar como iniciadora de reações de peroxidação de lipídeos da seguinte forma: o Mn 3+ gerado pela MnP abstrai 1 elétron de uma ligação C H do carbono alílico em um ácido graxo diinsaturado (Figura 2); o radical de carbono formado reage rapidamente com O 2, dando origem

22 21 a um radical peroxila orgânico que possui potencial de oxidação maior que o do Mn 3+ ; o radical peroxila formado no ácido graxo insaturado é capaz de abstrair 1 elétron em ligações C H do carbono α em estruturas não fenólicas de compostos modelo de lignina. Esse radical gerado na lignina reage então com O 2 e, na seqüência, leva a ruptura de uma ligação β-o-4 (Figura 2). Enoki et al., (1999; 2000) demonstraram que o ácido graxo insaturado sujeito a peroxidação pode ser proveniente da madeira ou ainda secretado pelo fungo durante o processo de biodegradação. Figura 2: Degradação de lignina não-fenólica por radicais peroxila (adaptado de KAPICH; JENSEN; HAMMEL, 1999; KIRK e CULLEN, 1998; LI, 2003). As lacases são cupro-proteínas que atuam diretamente sobre estruturas fenólicas através da oxidação dos fenóis pela abstração de 1 elétron mediada pela redução de Cu 2+ a Cu +, que por sua vez, reduz O 2 a H 2 O, permitindo que a enzima atue de forma cíclica (Figura 3). Um sistema lacase/mediador adequado, envolvendo principalmente um substrato fenólico como o ácido 4-hidroxiantranílico (ou um fragmento de lignina) e íons Mn 2+ também tem sido reportado como capaz de degradar compostos aromáticos não-fenólicos (EGGERT et al., 1996; KAWAI et al., 1999; SREBOTNIK; BOISSON, 2005). Este sistema poderia ainda atuar como difusor de baixa massa molar para degradação de lignina em regiões da parede celular vegetal distante da hifa fúngica.

23 22 O 2 Lacase (Cu +2 ) PhO H 2 O Lacase red. (Cu + ) PhOH Figura 3: Ciclo catalítico de lacase. PhOH representa um substrato fenólico. A estequiometria do ciclo envolve 4 Cu 2+ (normalmente ligados a uma única proteína ou a 2 cadeias protéicas acopladas), 4 substratos fenólicos, 4 prótons e 1 molécula de O 2 (reproduzido com modificações de FERRAZ, 2003). As enzimas que produzem peróxido são acessórias às peroxidases (MnP e LiP). Estas enzimas geram peróxido de hidrogênio in situ e possibilitam que as peroxidases atuem. As principais enzimas produtoras de peróxido envolvidas na biodegradação de lignina são glicose oxidase e metanol oxidase (intracelulares) que utilizam glicose e metanol como substratos, respectivamente (KIRK; CULLEN, 1998; KUHAD; SINGH; ERIKSSON, 1997). A glicose é originária da biodegradação da celulose e das polioses que contêm glicose. O metanol é produzido durante a biodegradação da própria lignina através da remoção de metoxílas ligadas aos anéis aromáticos. A produção de H 2 O 2 por enzimas extracelulares também tem sido descrita em alguns fungos de decomposição branca. Entre elas estão a glioxal oxidase (KERSTEN e KIRK, 1987) e a aril-álcool-oxidase (ANDER; MARZULLO, 1997; DE JONG; FIELD; DE BOND, 1994). Recentemente, foi demonstrado que também MnP pode gerar H 2 O 2 a partir da oxidação de ácidos orgânicos como o malônico e o oxálico (URZÚA; KERSTEN; VICUÑA, 1998). O ácido oxálico, além de auxiliar no ciclo catalítco da MnP, pode também atuar fomentando a reação de Fenton (Fe 2+ + H 2 O 2 + H + Fe 3+ + H 2 O + OH ), quando presente em concentrações adequadas. O radical OH gerado na reação de Fenton pode atuar indistintamente na degradação de polissacarídeos e de lignina e tem sido sugerido como o principal agente iniciador dos processos de decomposição parda, mas também pode ser relevante nos estágios iniciais de biodegradação induzida por fungos de decomposição branca (FERRAZ, 2003). O fomento da reação de Fenton por ácido oxálico ocorreria em função de

24 23 sua capacidade quelante, uma vez que este ácido pode se ligar a íons Fe 3+, os quais no ph da madeira (~ 5) são insolúveis (formando Fe 2 O 3 e Fe 2 (OH) 3 ). Como o complexo Fe 3+ -oxalato é solúvel em phs ácidos, os íons Fe 3+ podem ser difundidos através da parede celular vegetal até serem reduzidos (por agentes como catecóis) à espécie solúvel Fe 2+, a qual participa da reação de Fenton (GREEN, et al., 1991; PINSON et al., 2004; SHIMADA et al., 1997; VARELA; TIEN, 2003). Tem sido reportado o surgimento de cristais de oxalato de cálcio durante o biotratamento da madeira, que podem ser provenientes da retirada de íons Ca 2+ da mesma em função da capacidade quelante do ácido oxálico (AKHTAR et al., 1998). Em concentrações bastante elevadas, este ácido poderia ainda causar certo grau de hidrólise à hemicelulose (PINSON et al., 2004). Tanto a retirada de Ca 2+ quanto a hidrólise de hemicelulose (cujas maiores concentrações são encontradas nas regiões entre as subcamadas da parede celular vegetal) podem causar desestruturação da parede celular, tornando a madeira mais susceptível ao processo de refinamento mecânico (PINSON et al., 2004). Segundo Hunt et al. (2004), o ácido oxálico teria também a capacidade de se ligar à madeira, durante a etapa de biotratamento, o que ocorreria através de esterificação, provavelmente à celulose. A ligação do ácido facilitaria o processo de desfibramento da madeira e refinamento da biopolpa em função do aumento do ponto de saturação das fibras com água. Em outras palavras, as fibras passam a conter maior quantidade de moléculas de água em função da maior quantidade de pontes de hidrogênio que podem ser formadas com a carboxila do ácido oxálico não esterificado à fibra. Este fato torna as fibras mais flexíveis, o que além da facilitação dos processos de desfibramento e refinamento (que gera economia de tempo e/ou energia elétrica), também diminui a danificação das mesmas, proporcionando a produção de papéis com melhores propriedades mecânicas (KATZ; LIEBERGOTT; SCALLAN, 1981; PILON et al., 1982).

25 Ceriporiopsis subvermispora: enzimas extracelulares e seu modo de ação. Há um grande número de estudos de avaliação de fungos agindo sobre madeira buscando a seleção dos mais eficientes em degradar lignina. Dentre eles, C. subvermispora tem sido reportado como um dos mais seletivos à degradação de lignina tendo ainda apresentado os melhores resultados quanto à biopolpação (AKHTAR et al., 1998). Os fungos do gênero Ceriporiopsis Dom. são causadores de decomposição branca à madeira, pertencentes à família Polyporaceae (HAROLD, 1998) e conhecidos por sua grande seletividade para a degradação de lignina, seja em madeiras duras ou em madeira moles (AKTHAR et al., 1998), além de sua extrema agressividade para a colonização da madeira. Das enzimas extracelulares produzidas, as oxidativas são compreendidas pelas lacases (massas moleculares de aproximadamente 79 kda, SALAS et al., 1995) e as MnPs (entre 52,5 e 62,5 kda, HOFRICHTER, 2002). Das hemicelulases, foi encontrada ao menos uma isoenzima de mananase (156 kda), 2 de xilanases (33 e 80 kda), e a produção de β-xilosidases é bastante baixa (HEIDORNE et al., 2006; MAGALHÃES, 2005). Do complexo celulolítico, as celobioidrolases são produzidas em pequenas quantidades, e as endo-celulases e β- glicosidases (duas iso-enzimas de β-glicosidase foram caracterizadas, uma de 53 e outra de 110 kda, HEIDORNE et al., 2006) são produzidas em quantidades comparáveis às reportadas para outros basidiomicetos de decomposição branca (SETHURAMANN; AKIN; ERIKSSON, 1998; SOUZA-CRUZ, 2002). A atividade de LiP não tem sido detectada em cultivos deste fungo (LOBOS et al., 1994; SOUZA-CRUZ, 2002). Embora cópias dos genes lip tenham sido identificados no seu genoma, a expressão destes genes, investigada por RT-PCR, também não foi comprovada em nenhuma condição de cultivo testada (RAJAKUMAR et al., 1996). Com isto, a degradação de lignina por este fungo deveria, a princípio, ser atribuída à ação de MnP e seus sistemas mediadores. A grande capacidade de degradar lignina por esse fungo deve-se principalmente ao

26 25 sistema de mediadores da MnP, uma vez que tem sido reportada a degradação de lignina por C. subvermispora em pontos distantes da hifa fúngica nos estágios iniciais de biotratamento, quando a porosidade da parede celular vegetal impede a penetração das enzimas (BLANCHETTE et al., 1997; MENDONÇA et al., 2004). 2.4 Indução da produção de enzimas ligninolíticas extracelulares. A produção de enzimas oxidativas ligninolíticas pode ser induzida ou mesmo reprimida por agentes externos adicionados ao meio de cultivo dos fungos de decomposição branca. Há uma vasta literatura abordando o efeito de diferentes agentes (incluindo metais, fontes e níveis diferenciados de nitrogênio e carbono e indutores orgânicos específicos) na produção das enzimas oxidativas de interesse desse trabalho, lacase e MnP (BONNARME et al., 1993; Fu et al., 1997; MESTER; FIELD, 1997; NUSKE et al., 2002). A seguir serão abordados alguns trabalhos de especial relevância que forneceram as bases para a proposta metodológica de indução e repressão de lacases e MnP nos cultivos de C. subvermispora sobre madeira em condições de fermentação em estado sólido. Em C. subvermispora, a adição de Mn 2+ aos cultivos claramente induz níveis elevados de MnP secretada pelo fungo. Rüttimann-Johnsson et al. (1993) determinaram que níveis elevados de MnP foram obtidos quando a concentração de Mn 2+ no meio foi da ordem de 11 mg/l. Concentrações superiores levaram a uma produção levemente maior de MnP, porém a mineralização de lignina (completa degradação, até formação de CO 2 e H 2 O 2 ) não acompanha o aumento na produção de MnP. Cultivos em que há grande disponibilidade de uma fonte de carbono de fácil assimilação, como glicose 1%, e de uma fonte de nitrogênio (amônio ou aminoácidos 10 mm) também resultam na indução de níveis elevados de MnP e demonstram que a enzima é expressa durante o metabolismo primário desse fungo (RUTTIMANN- JOHNSSON et al., 1993). No entanto, cultivos em meio líquido, contendo lignina sintética