RESBCAL REVISTA DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CIÊNCIA EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO. Volume 5 - Número São Paulo - SP. Publicação Semestral

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1 RESBCAL REVISTA DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CIÊNCIA EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO Volume 5 - Número São Paulo - SP Publicação Semestral ISSN RESBCAL São Paulo v. 5 n. 2 p Jun. 2017

2 2012 Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório Publicação semestral/ Published two times to the year Tiragem/Print-run: 100 Impresso no Brasil/Printed in Brazil Projeto Gráfico e Normalização: PoloPrinter Produção Gráfica e Impressão: PoloPrinter A RESBCAL Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório é uma publicação científica tri- mestral voltada à Promover a educação e a atualização de profissionais que atuam na área da ciência de animais de laboratório. Divulga artigos de autores nacionais e estran- geiros, selecionados com base em critérios de originalidade e qualidade, em um processo de Double blind review. Direito Autoral As matérias assinadas são de total e exclusiva responsabilidade dos autores. Por meio do documento Declaração de Originalidade e Cessão de Direitos autorais, firmado quando da publicação de artigo, os autores declaram ser responsáveis por seu conteúdo, citações, referências e de- mais elementos que o compõem, bem como não existir impedimento algum, de qualquer natureza, para a sua di- vulgação. Declaram ser ele original, inédito e de sua auto- ria e autorizam sua reprodução, divulgação, distribuição, impressão, publicação e disponibilização, por parte da RESBCAL, em mídias impressa e eletrônica ou em qualquer forma ou meio que exista ou venha a existir, nos termos da legislação vigente. A cessão de direitos autorais é feita a título não exclusivo e gratuito, abrangendo a totalidade do artigo, válida em quaisquer países, em língua portuguesa ou outra ou tradução, a critério da RESBCAL. Permissão de Utilização É permitida a publicação de trechos e artigos, desde que citada a fonte. Todos os direitos desta edição são reservados a Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório SBCAL. Esta permissão de utilização inclui o direito de ler, copiar, distribuir, imprimir, pesquisar e estabelecer referências aos textos integrais da Revista. Filiação A RESBCAL é uma publicação da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Endereço Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório Rua Três de Maio, 100 Biotério do INFAR UNI- FESP Vila Clementino São Paulo/SP Brasil Telefone: s: resbcal2011@gmail.com; sbcal2010.sbcal2011@gmail.com ISSN CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO Elaborada por Maria Cláudia Pestana CRB-8/6233 Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório / Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. v. 5, n. 2 (2017)-. - São Paulo : SBCAL, Semestral ISSN: Animais de laboratório. 2. Ciência dos animais de laboratório. I. Sociedade brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. CDD RESBCAL, São Paulo, v.5 n.1, pg. 5, 2016

3 Desde 2012 a Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório, continuamente, busca promover através da suas publicações um meio de difusão, discussão e intercâmbio de experiência entre os pesquisadores da área de ciência de animais de laboratório. Ultrapassamos o número de 100 artigos publicados dentre eles, artigos com resultados originais, revisões bibliográficas, experiência em gestão de biotérios e resumos de congressos e eventos relacionados a uso de animais de laboratório. EDITORIAL A idealização e implantação da RESBCAL pelas Dras Valderez Lapchik, Vania Mattaraia e Gui MiKo, até o presente momento, permanece com a mesmo compromisso e missão: possibilitar o desenvolvimento da ciência de animais de laboratório em caráter multidisciplinar e incentivar a alunos, técnicos, pesquisadores a descreverem e divulgarem seus resultados e experiências para que possamos juntos elevar o conhecimento sobre o uso dos nossos animais e consequentemente realizar desse uso uma ciência com caráter de excelência em nosso País. Gabriel Oliveira RESBCAL, São Paulo, v.5 n.1, pg. 5,

4 Nesse número estão contidos os resumos apresentados no II Seminário de Ciência e Tecnologia em Biomodelos promovido pela Coordenação do Mestrado Profissional em Ciência de Animais de Laboratório do Instituto de Ciência e Tecnologia em Biomodelos (ICTB/FIOCRUZ) com o apoio da Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Gabriel Oliveira 102 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.1, pg. 5, 2016

5 ARTIGO DE REVISÃO ANALGESIA E ANESTESIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS Brenda Diniz Rodrigues, Camila Fernanda Antunes Castanho Cavaleiro de Macedo Loureiro, Luane Cristine Batista Cunha, Richard Franco da Silva Moraes, Rosa Helena de Figueiredo Chaves Soares SUMÁRIO ARTIGOS ORIGINAIS ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Gabriel de Moraes Leal, Victor Cavalcante Basílio, Janice Biazzi Pires, Carlos Alberto Soares Raimundo, Andréa Moreira Paulino PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE RATOS WISTAR PROVENIENTES DO BIOTÉRIO DA PUC GOIÁS Florencia Camila Gonçalves, Claudio Quintino de Lima Junior, Clayson Moura Gomes, Graziela Torres Blanch, Sérgio Henrique Nascente Costa, Karlla Greick Batista Dias Penna FECAL SCORE AND CECUM PROFILE OF WISTAR RATS FED A NOVEL YACON BASED PRODUCT SOURCE OF FRUCTOOLIGOSSACHARIDES/INULIN Hudsara Aparecida de Almeida Paula, Hércia Stampini Duarte Martino, Edimar Aparecida Filomeno Fontes, Tânia Toledo de Oliveira, Mário Jefferson Quirino Louzada, Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira RESUMOS RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg. 103,

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9 ARTIGO DE REVISÃO ISSN ANALGESIA E ANESTESIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS Brenda Diniz Rodrigues¹, Camila Fernanda Antunes Castanho Cavaleiro De Macedo Loureiro¹, Luane Cristine Batista Cunha¹, Richard Franco da Silva Moraes², Rosa Helena de Figueiredo Chaves Soares³ 1. Mestranda do programa em Cirurgia e Pesquisa Experimental (CIPE), Universidade do Estado do Pará (UEPA), Belém-PA, Brasil; 2. Graduando em medicina, Faculdade Metropolitana da Amazônia (FAMAZ), Belém- PA, Brasil. 3. Doutoranda, Universidade Federal Rural da Amazônia (UFRA), Belém-PA, Brasil. DATA RECEBIMENTO: 09/11/2017 ACEITO PARA A PUBLICAÇÃO: 01/12/2017 AUTOR PARA CORRESPONDÊNCIA: Luane Cristine Batista Cunha luanecunha@hotmail.com O presente artigo tem como objetivo demonstrar a responsabilidade de zelar pelo bem- -estar dos espécimes utilizados como modelos experimentais. Sabe-se hoje que os animais mais usados para os fins de experimentação são roedores, suínos, caninos e ovinos que são seres sensientes, isto é, mesmo não sendo dotados de autoconsciência, são capazes de sentir dor e prazer. Tendo isso em vista, é necessário a responsabilidade de zelar pelo bem-estar dos espécimes utilizados. A técnica de analgesia e anestesia propõe auxiliar o pesquisador a eliminar todo e qualquer sofrimento evitável desses animais com auxílio da técnica anestésica e da analgesia bem conduzidas, contribuindo tanto para a ciência, para o pesquisador quanto para segurança, bem- -estar e recuperação do animal. Palavras-chave: Modelos Animais, Analgesia, Anestesia. RESUMO INTRODUÇÃO A pesquisa envolvendo animais de experimentação, atrelada ao propósito de alavancar os avanços científicos presentes em seus objetivos, carrega consigo a responsabilidade de zelar pelo bem-estar dos espécimes nela utilizados. Sabe-se hoje que os animais mais usados para este fim (roedores, suínos, caninos e ovinos) são seres sensientes, isto é, mesmo não sendo dotados de autoconsciência, são capazes de sentir dor e prazer. É obrigação do pesquisador eliminar todo e qualquer sofrimento evitável por parte desta população com auxílio da técnica anestésica e da analgesia bem conduzidas, e estes propósitos devem ser considerados tão importantes quanto a obtenção dos resultados do experimento. 1 É importante observar o animal em sua integralidade, isto é, nos âmbitos físico e psicológico, e em todos os momentos relativos ao procedimento proposto (antes, durante e depois). A aplicação racional de protocolos de anestesia e analgesia é fundamental para uma condução mais eficiente e padronizada, com a menor interferência possível no experimento realizado e, consequentemente, sem alteração nos dados que estiverem sendo registrados. Seus objetivos são: permitir a contenção humanitária do animal, promover um grau razoável de relaxamento muscular para facilitar a cirurgia e produzir analgesia suficiente a fim de que o animal não sofra. 2 A seleção criteriosa do agente anestésico deve levar em consideração tipo de droga, dose e via de administração. São priorizados anestésicos que possuem efeitos consistentes, reprodutíveis e que oferecem margem de segurança tanto para o animal quanto para o operador. No caso de um estudo em que o animal tenha que se recuperar da anestesia, este deve retornar à sua normalidade fisiológica tão rapidamente quanto possível. Se após o procedimento anestésico o animal sofrer de dor, RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

10 ANALGESIA E ANESTESIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS medo, inapetência, desconforto, hipotermia, hipóxia ou acidose respiratória, estes são indicativos de uma anestesia mal-conduzida. 1 Cuidados pré-operatórios: 1) Planejamento: Antes da definição da técnica e do agente anestésico, é conveniente responder aos seguintes questionamentos, conforme sugerido por Neves: Qual a duração e a profundidade da anestesia desejada? Qual é o grau de analgesia produzido? A qualidade da analgesia é satisfatória? Há interações específicas com o protocolo experimental? Existem requisitos legais e/ou regulamento para o uso de narcóticos? É uma técnica de fácil realização? É confiável e reprodutível? É reversível? O operador está familiarizado com a técnica? Qual é o custo do procedimento? Todos os agentes químicos relacionados com a técnica estão disponíveis? Figura 1 - Questionamento para seleção de técnicas anestésicas. Fonte: Neves, et al. (2013) 1 Sempre que se for anestesiar ou aplicar agentes analgésicos em um animal, o pesquisador deve considerar os seguintes fatores: a) Relacionados ao animal: idade, sexo, espécie, temperamento, linhagem, status sanitário. É importante avaliar a resposta individual de cada espécime aos agentes administrados. b) Relacionados ao procedimento: técnica selecionada, duração do procedimento, grau de dor e/ou desconforto que o procedimento possa causar ao animal, treinamento das pessoas envolvidas, manuseio cuidadoso do espécime. 3 c) Relacionados ao laboratório: avaliar se o ambiente e os materiais disponíveis são adequados à realização do procedimento proposto. d) Relacionados ao período pós-procedimento: em caso de procedimento não-terminal, avaliar os efeitos do anestésico no pós-operatório. 1 Os animais deverão ser submetidos a exame clínico meticuloso antes de serem anestesiados. Um animal saudável e livre de infecções (clínicas ou subclínicas), sobretudo do trato respiratório, terá menos problemas durante a anestesia. Pesar o animal antes da intervenção é importante tanto para o cálculo da dose adequada de todos os fármacos como para o acompanhamento da evolução pós-operatória em caso de procedimentos não terminais se houver perda ponderal maior que 10 a 15% nos primeiros dias de pós-operatório é indicada a eutanásia. 4 Não é necessário jejum prévio em coelhos e roedores antes da anestesia pois esses animais não vomitam; além disso, os roedores se tornam hipoglicêmicos muito rapidamente quando em jejum. A restrição alimentar deve ocorrer somente quando for estritamente necessária e estiver especificada no protocolo de pesquisa aprovado na CEUA da Instituição. Caso seja necessário estômago completamente vazio para a intervenção (cirurgia gastrointestinal superior, por exemplo), além da restrição à dieta, deve-se lançar mão de estratégias que evitem a coprofagia, muito frequente em roedores. A restrição de água, quando necessária, deve ser feita somente 60 minutos antes do procedimento. 1 2) Medicações pré-anestésicas: Considera-se medicação pré-anestésica todo fármaco aplicado antes da anestesia propriamente dita, e que tenha por finalidade aumentar a qualidade e a segurança do ato anestésico. Sua utilização é mais frequente em espécies de grande porte. Estes 108 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

11 Brenda Diniz Rodrigues, Camila Fernanda Antunes Castanho Cavaleiro De Macedo Loureiro, Luane Cristine Batista Cunha, Richard Franco da Silva Moraes, Rosa Helena de Figueiredo Chaves Soares efeitos são alcançados por mecanismos distintos: diminuição do medo e da apreensão, obtendo-se indução anestésica livre de estresse; Redução do volume de outros anestésicos necessários à indução anestésica, reduzindo-se efeitos colaterais indesejáveis; Melhor recuperação anestésica; Redução da salivação e das secreções brônquicas; Bloqueio do reflexo vaso vagal, do qual deriva a bradicardia decorrente da intubação endotraqueal e do manejo das vísceras; Redução da dor pós-operatória. No caso de procedimentos menos invasivos, pode-se lançar mão exclusivamente destas drogas, não sendo necessária a utilização de anestesia geral propriamente dita. 5 Os grupos farmacológicos mais utilizados na pré-anestesia são: a) Fármacos anticolinérgicos: reduzem a secreção traqueal, aumentam a frequência cardíaca. Exemplo: Atropina. b) Fármacos hipnóticos: induzem ao sono; pequena ação analgésica. Exemplos: Hidratos de cloral, etomidato. c) Fármacos hipnoanalgésicos: ação analgésica forte, depressão do sistema nervoso central, elevação do limiar de dor. Exemplos: morfina, tramadol. d) Fármacos tranquilizantes: causam a perda ou a redução da consciência, acalmando o animal sem, no entanto, levar a uma sedação real. Possuem ação analgésica leve. Exemplos: Benzodiazepínicos (diazepam), fenotiazinas (acepromazina), butirofenonas (dromperidol). e) Fármacos alfa-2-agonistas: ação sedativa, promovendo o relaxamento muscular e a analgesia visceral. Exemplo: Xilazina (geralmente associada ao anestésico cetamina em animais de experimentação). Analgesia: Kitchell (1987) definiu a dor em animais como uma experiência emocional e sensorial aversiva que tem associação com lesões reais ou potenciais. Gera, portanto, ações de fuga e alterações do padrão de comportamento espécie-específico. 6 No campo da pesquisa envolvendo animais, é proveitoso garantir o alívio da dor tanto para a adequação aos parâmetros éticos vigentes como para evitar alterações fisiopatológicas causadas pela dor que influenciem os resultados dos experimentos. A redução ou alívio da dor é considerada por Flecknell (1996) como um aprimoramento no cuidado dos animais. 7 Analgésicos são medicamentos que diminuem ou interrompem as vias de transmissão nervosa, reduzindo a percepção de dor. Já analgesia é o ato de abolir a sensibilidade à dor com integridade de consciência, sem suprimir outras propriedades sensitivas. 8 Frente à impossibilidade do relato verbal, a avaliação da dor nos animais é realizada indiretamente, observando suas atitudes e respostas fisiológicas. Portanto, o manejo da dor em animais requer o conhecimento do comportamento de cada espécie em condições normais e em situações dolorosas. 9 As respostas à dor variam não só entre as espécies animais, mas também entre indivíduos da mesma espécie. Diante disso, modelos e escores para quantificar a dor têm sido propostos na literatura mundial. Na proposta de Wolfenhson e Lloyd (1994) 10 são considerados parâmetros para a avaliação da dor: aparência, consumo de água e alimento, sintomas clínicos, comportamento normal e comportamento provocado. 1,10 Soma (1987) 11, por sua vez, se utiliza da observação de sintomas clínicos e comportamentais para diferenciar dor aguda e crônica. Postura de guarda, gritos, mutilação, inquietação, sudorese e posições anormais estariam associados com acometimento agudo. 1,11 Em contrapartida, redução da atividade, perda do apetite, alterações da personalidade, esconder-se, recusa à movimentação, alterações na urina, alterações na consistência das fezes seriam indicativos de acometimento crônico. 2 Há uma ampla gama de analgésicos disponíveis para uso em animais de experimentação. A utilização dessas medicações antes e após o procedimento é recomendável sempre que não interfira no resultado das pesquisas. Segundo a literatura, as classes mais utilizadas são os opióides e os RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

12 ANALGESIA E ANESTESIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), que garantem boa analgesia visceral e somática. 12 Em ratos, camundongos e hamsters, os agentes analgésicos mais indicados são: buprenorfina, butorfanol, meperidina, morfina, ácido acetilsalicílico, caprofeno, ibuprofeno, acetaminofeno, cetoprofeno. Em coelhos, pode-se adicionar o uso de piroxican e meloxican. 13 Particularidades anatômicas e fisiológicas importantes na anestesia: A maioria das particularidades nos pequenos roedores está relacionada ao baixo peso e pequena área corporal, que faz com que esses animais tenham baixo volume de sangue circulante, alto metabolismo e alto consumo de oxigênio. Conse- Fármaco Via de administração Intervalo de administração Acetaminofen IP, VO 12 h Aspirina SC, IP 04 h Buprenorfina SC, IV, IP 12 h Butorfanol SC 4h Carprofen SC 24h Diclofenaco IP 12h Flunixinmeglumine IV, SC 12h Ibuprofen VO 24h Ketoprofen SC 24h Morfina SC 4h Tramadol IP 12h Figura 2 - Fármacos analgésicos utilizados em Camundongos e Hamsters. Fonte: Adaptado de Hrapkiewicz; Medina, Fármaco Via de administração Intervalo de administração Acetaminofen IP, VO 12 h Aspirina SC, IP 04 h Buprenorfina SC, IV, IP 12 h Butorfanol SC 4h Carprofen SC 24h Diclofenaco IP 12h Flunixinmeglumine SC 12h Ibuprofen VO 24h Dipirona SC, IP, IV 06h Morfina SC 4h Ketoprofen SC, IV 24h Figura 3 - Fármacos analgésicos utilizados em Ratos. Fonte: Adaptado de Hrapkiewicz; Medina, RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

13 Brenda Diniz Rodrigues, Camila Fernanda Antunes Castanho Cavaleiro De Macedo Loureiro, Luane Cristine Batista Cunha, Richard Franco da Silva Moraes, Rosa Helena de Figueiredo Chaves Soares Fármaco Via de administração Intervalo de administração Buprenorfina SC, IV 12 h Butorfanol IV 4h Carprofen SC 24h Flunixinmeglumine IM 12h Morfina SC 4h Meloxican SC 24h Piroxican VO 06h Meperidina SC 04h Figura 4 - Fármacos analgésicos utilizados em Coelhos. Fonte: Adaptado de Hrapkiewicz ; Medina, quentemente, são pouco tolerantes a hipoxemia, muito susceptíveis a desidratação e hipotermia, e muito sensíveis a perdas sanguíneas, por menores que estas sejam. 14 Devido a também possuírem poucas glândulas sudoríparas e não conseguirem arfar, eliminam o excesso de calor através das orelhas, da cauda e da salivação, tendo controle térmico difícil. 15 Nos roedores, o acesso às vias áreas é complexo por conta de sua cavidade oral longa e estreita, apresentando na base da língua o tórus lingual. A laringe dos roedores localiza-se na porção caudal da região cervical devido à extensão da língua desses animais, ficando apenas cerca de 20% do comprimento total desta na cavidade oral. Somando-se esta particularidade anatômica à abertura restrita da cavidade oral, a introdução das sondas inalatórias é difícil nesta população de animais. 14 Os roedores têm grandes necessidades de O2 devido seu metabolismo rápido. Sua anatomia e fisiologia, portanto, são voltadas para a facilitação das trocas gasosas: vias aéreas mais curtas, mais alvéolos de pequeno diâmetro, taxas respiratórias elevadas. Também possuem grande flexibilidade da parede torácica, elevada capacidade vital e baixa capacidade residual dos pulmões, permitindo- -lhes uma boa expansão pulmonar. 15 Com relação ao sistema cardiovascular, o volume total de sangue dos roedores varia entre os 60 e os 78 ml/kg. Em hamsters e ratazanas, o coração está em contato com a parede torácica esquerda, sendo possível usar o espaço entre a 3ª e a 5ª costela para injeções intracardíacas em caso de emergência. 14,15,16 Equipamentos anestésicos e suporte dos animais durante a cirurgia: A segurança do procedimento cirúrgico-anestésico depende também da disponibilidade e da boa utilização de instrumentos e equipamentos de monitorização. Dentre estes, se destacam: a) Vaporizador do agente volátil: permite regular a quantidade ofertada de anestésico, consequentemente, a profundidade da anestesia; 14,15 b) Máscara de oxigênio: alternativa à intubação endotraqueal. Permite, em simultâneo, a suplementação de O2 e, em caso de insuficiência respiratória, fazer ventilação assistida; 14,15 c) Tubos endotraqueais: permitem o mesmo que a máscara de oxigênio, mas com menor perda volátil. 14,15 d) Estetoscópio pediátrico: pode ser usado para auscultar o coração e os pulmões. Alternativamente, o Doppler pode ser usado para produzir um som cardíaco mais audível. 14,15 e) Eletrocardiograma: pode ser usado nas espécies maiores, visto que a maioria das máquinas não regista os impulsos eléctricos dos roedores. 14,15 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

14 ANALGESIA E ANESTESIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS f) Oxímetro de pulso: pode ser colocado nas orelhas e língua de porquinhos-da-índia e chinchilas, ou nas patas da maioria dos roedores; contudo, mais uma vez, pode não registar o pulso dos animais menores. 14,15 g) Termômetros digitais. 15 h) Equipamentos de aquecimento suplementar: atentar para queimaduras no caso de contato direto com o animal. 15 Vias de administração de fluidos e fármacos: 1) Via injetável: As vias de administração utilizadas nos procedimentos de anestesia injetável em pequenos roedores são: intraperitoneal (IP), intramuscular (IM), intravenosa (IV) e subcutânea (SC). 17 A via de administração intraperitoneal é a mais comumente utilizada, devido à fácil execução, à possibilidade de se infundir grandes volumes e ao caráter irritativo de algumas substâncias quando administradas pelas vias intramuscular e subcutânea. O local correto para se realizar a punção é no quadrante abdominal inferior esquerdo e o posicionamento do animal em decúbito dorsal, devendo-se atentar para erros frequentes como punção intravisceral, subcutânea ou no tecido adiposo. 18 As agulhas recomendadas para os ratos e os camundongos são as de calibre 22-26G, sendo importante avaliar se o comprimento da agulha é suficiente para se atravessar toda espessura da parede abdominal e penetrar efetivamente na cavidade. 18 A via intramuscular pode causar lesões nervosas e atrofia da já exígua massa muscular dos roedores após injeções, devendo ser evitada sempre que possível. Quando indicada, os locais comumente utilizados para aplicação são os músculos posteriores da coxa e a musculatura paravertebral. Recomenda-se o uso de agulhas de pequeno calibre (26 a 30G). Substâncias irritantes devem ser diluídas em solução fisiológica 0,9% na proporção 1:1 ou 1: A via subcutânea é normalmente empregada para reposição lenta de fluidos e para administração de analgésicos e anti-inflamatórios. Em pequenos roedores é de fácil execução pois, devido ao excesso de pele, observa-se naturalmente a formação de pregas na região da nuca e na região lombossacra quando estes são corretamente contidos, facilitando a injeção da droga. O local de eleição nestes casos é o dorso do animal. As agulhas recomendadas variam de 26G a 30G para camundongos e 23G a 26G para ratos. 17 2) Anestesia Inalatória: Quando comparada com a via injetável, tem como vantagens: mínimo metabolismo hepático e renal e um despertar rápido e tranquilo da anestesia. 14 Como desvantagens, há a necessidade de equipamento específico, monitoramento do plano anestésico constante, exaustão adequada da sala de anestesia e de pessoal habilitado. Os anestésicos inalatórios mais utilizados são líquidos voláteis como halotano, enflurano, isoflurano, desflurano e sevoflurano, além de um único gás, o óxido nitroso. 15 A oferta inalatória de anestésicos em roedores pode ser feita através de dois métodos câmara de inalação (coloca-se um algodão embebido em anestésico dentro de uma câmara de inalação transparente) e máscara facial/câmara de indução (câmara conectada a um vaporizador calibrado, onde a quantidade de anestésico administrado é conhecida). O primeiro método tem a desvantagem de não se conhecer e de não ser possível controlar a dose real de anestésico ofertada, devendo a análise do plano anestésico ser baseada na inspeção do animal, enquanto o segundo método oferece ao pesquisador maior controle sobre o procedimento anestésico. Em ambos os métodos, deve-se atentar sempre para a exaustão da sala operatória. 17 A intubação orotraqueal não é rotineiramente empregada em procedimentos cirúrgicos envolvendo pequenos roedores, somente em casos específicos como em cirurgias intratorácicas. 17 3) Anestesia Local: Os fármacos com ação anestésica local reduzem a percepção dolorosa no sítio (bloqueio local) ou na região (bloqueio regional) da intervenção cirúrgica. Em pequenos roedores, sua utilização é 112 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

15 Brenda Diniz Rodrigues, Camila Fernanda Antunes Castanho Cavaleiro De Macedo Loureiro, Luane Cristine Batista Cunha, Richard Franco da Silva Moraes, Rosa Helena de Figueiredo Chaves Soares associada aos fármacos que promovam anestesia geral ou sedação intensa. O uso de anestésico local reduz a dose do anestésico geral, diminuindo o risco de óbito cirúrgico e melhorando o controle da dor no trans e pós-operatório. 16,17 4) Anestesia endovenosa: O uso de agentes injetáveis em anestesia experimental pode ser aplicado para a anestesia como um todo ou somente para a indução anestésica, sendo o animal mantido em plano com anestesia volátil (anestesia geral balanceada). As vantagens da anestesia injetável são a acessibilidade à cabeça e ao pescoço durante a anestesia, a não contaminação ambiental com os agentes voláteis e o baixo custo com equipamento, pois não há a necessidade de se utilizar de vaporizadores (embora seja aconselhável suplementar todos animais anestesiados com O2). 20,22 As desvantagens são a dificuldade de administração, dor durante a administração e/ou necrose dos tecidos onde administrados, a resposta variável de cada indivíduo à dosagem e a incapacidade de alterar a profundidade anestésica rapidamente. 20 A ketamina é um anestésico dissociativo que quando usado sozinho em pequenos mamíferos produz imobilização de curto prazo com pouco relaxamento muscular. Normalmente são necessárias grandes doses para produzir imobilidade prolongada e anestesia cirúrgica. Quando combinada ou com xilazina ou com medetomidina, produz uma anestesia cirúrgica bastante eficaz. 20,22 Tanto a xilazina como a medetomidina têm propriedades analgésicas e sedativas e têm a vantagem adicional de poderem ser revertidas por administração de antagonistas específicos. A combinação ketamina/xilazina ou ketamina/medetomidina produz planos médios de anestesia cirúrgica na maioria dos animais, porém um número expressivo de roedores não perde o reflexo podal e podem responder a estímulos cirúrgicos. 7,22 O uso de combinações com a ketamina causa depressão respiratória moderada e é aconselhável administrar oxigenio via máscara para prevenir hipóxia. Quando administrada em combinação com xilazina, medetomidina ou com outros sedativos ocorre hipotensão, pois estes causam depressão do sistema cardiovascular. 7,22 Em roedores a melhor via para a administração da ketamina é a IP, tendo em vista que a injeção IM pode causar lesão muscular. O início da anestesia cerca de 5 minutos, sendo a anestesia cirúrgica completa alcançada minutos após a injeção. 7 Devido à ação da ketamina que faz com que os olhos se mantenham abertos, é necessária a aplicação de gotas oculares protetoras em gel, por exemplo o Lacryvisc (Alcon), ou como alternativa soro fisiológico, imediatamente após sedação profunda ou à indução anestésica. 7 Outra droga importante em anestesia geral é o propofol, um agente hipnótico, de duração curta e rápida, não acumulativo. Pode ser usado na indução ou na manutenção da anestesia, seja em infusão IV contínua ou em bolus. O propofol produz depressão cardio-pulmonar dose-dependente por conta da combinação de dilatação arterial e venosa, juntamente com a diminuição da contratilidade do miocárdio, por fim levando à hipotensão. Também pode causar apneia relacionada à dose, taxa de administração e uso concomitante de outros fármacos. 21,22 Etomidato e medetomidato são hipnóticos de ação curta que produzem efeitos mínimos no sistema cardiovascular. Têm pouca ação analgésica quando usados isoladamente, tendo sido reportada supressão da função adrenocortical após infusão prolongada de etomidato. A administração SC combinada de metomidato e fentanil é uma mistura anestésica efetiva em pequenos roedores. 21,22 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

16 ANALGESIA E ANESTESIA EM MODELOS EXPERIMENTAIS ANALGESIA AND ANESTHESIA IN EXPERIMENTAL MODELS - REVIEW ARTICLE ABSTRACT The present article aims to demonstrate the responsibility of ensuring the welfare of the specimens used as experimental models. It is known today that the animals most used for the purposes of experimentation are rodents, swine, canines and sheep that are sentient beings, that is, even if they are not endowed with self-consciousness, they are capable of feeling pain and pleasure. With this in mind, it is necessary to take care of the welfare of the specimens used. The technique of analgesia and anesthesia proposes to help the researcher to eliminate any avoidable suffering of these animals with the aid of well-conducted anesthetic technique and analgesia, contributing both to science, to the researcher and to the animal welfare, safety and recovery. Keywords: Animal model, Analgesia, Anesthesia REFERÊNCIAS 1. Neves SMP, Ong FMP, Rodrigues LD, Santos RA, Fontes RS, Santana RO. Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratório do Biotério e Experimentação da FCF-IQ/USP. 1 ed. São Paulo; p Andrade A, Pinto SC, Oliveira RS. Animais de Laboratório: criação e experimentação Disponível em: < Acesso em agosto de p. ISBN: Lapchik VBV, Mattaraia VGM, Ko GM. Cuidados e Manejos de Animais de Laboratório. São Paulo: Atheneu, p Ullman-Culleré MH, Foltz CJ. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Lab Animal Sci, Massachusetts. 1999;49 (3): Rivera EAB. Anestesia em animais de laboratório. In: Andrade A, Pinto SC, Oliveira RS. Animais de laboratório: criação e experimentação. Rio de Janeiro: Fiocruz, p Kitchell R. Problems in defining pain and peripheral mechanisms of pain. Journal American Veterinary Medical Association. 1987; 191 (1): Flecknell PA. Anaesthesia and analgesia for rodents and rabbits. In: Handbook of Rodent and Rabbit Medicine, Laber-Laird K, Swindle MM and Flecknell PA. Pergammon Press, Butterworth- Heineman, Newton, MA. 1996; p Rhoden EL, Rhoden CR. In: Princípios e Técnicas em Experimentação Animal. Porto Alegre: UFRGS Editora p Lee-Parritz D. Analgesia for rodent experimental surgery. Israel Journal of Veterinary Medicine, Israel. 2007; 62(1): Wolfenhson S, Lloyd M. Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare. Oxford: Oxford University Press, Soma LR. Assessment of animal pain in experimental animals. Laboratory Animals Science. 1987; 37: McCleane G. Topical analgesics. Anesthesiol Clin, 2007; 25: Hrapkiewicz K, Medina L. Clinical Laboratory Animal Medicine Introduction. Iowa Blackwell Publishing. 2007; p Donnelly T. Introduction to small mammals in O Malley B. (Ed.), Clinical Anatomy and Physiology of exotic species: Structure and function of mammals, birds, reptiles and amphibians, Saunders, p Longley L. Rodent anaesthesia - Anesthesia of exotic pets, Saunders, 2008.p Bivin WSMP Crawford, Brewer NR. Rodent anaesthesia in Longley L (Ed.), Anesthesia of exotic pets, Saunders p Flecknell, PA. The relief of pain in laboratory animals. Laboratory Animal. 1984; 18(2): RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

17 Brenda Diniz Rodrigues, Camila Fernanda Antunes Castanho Cavaleiro De Macedo Loureiro, Luane Cristine Batista Cunha, Richard Franco da Silva Moraes, Rosa Helena de Figueiredo Chaves Soares 18. Flecknell PA, Liles JH. Assessment of analgesic action of opioid agonistantagonists in the rabbit. J. Assoc Veterinary Anaesthesia, 1990; 17: Thurmon, JC, Tranquilli WJ, Benso JG. Veterinary Anesthesia: Anesthesia of wild, exotic, and laboratory animals, Baltimore, Williams & Wilkins, p. 20. Johnson & Simpson Rodent anaesthesia in Longley L (Ed.), Anesthesia of exotic pets, Saunders. 2008; Antognini J F, Barter L, Carstens E. Anaesthetic Management in Flecknell P(Ed.), Laboratory Animal Anaesthesia, 3ª Ed, Saunders. 2009; Miller, RD; Prado JMC. Bases da anestesia. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, REFERÊNCIAS RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

18 ARTIGO ORIGINAL ISSN ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL Cláudia Andréa de Araújo Lopes 1, Gabriel de Moraes Leal 1, Victor Cavalcante Basílio 1, Janice Biazzi Pires 1, Carlos Alberto Soares Raimundo 1, Andréa Moreira Paulino 1 RESUMO Complicações reprodutivas de primatas não humanos (PNH) têm sido detectadas em criações animais, tornando-se comumente necessário separar o filhote da mãe. Este trabalho descreve incidência, origem e perfil de casos de macacos rhesus (Macaca mulatta) lactentes mantidos em berçário em um criatório científico, visando enfatizar a importância dos cuidados neonatais, e de como o manejo reflete sobre o desenvolvimento saudável dos animais e o sucesso da reintrodução destes em grupos familiares. Foi realizado um estudo retrospectivo, no período de 2008 a 2017, de 25 macacos rhesus lactentes que receberam cuidados neonatais. As informações foram obtidas em um banco de registros da criação. No período de nove anos, foram recebidos no berçário 25 filhotes de M. mulatta, sendo 52% de machos (13/25) e 48% de fêmeas (12/25), e desses, 28% (7/25) vieram a óbito, enquanto 72% (18/25) dos animais sobreviveram. Todos os filhotes sobreviventes foram reintroduzidos ao convívio social. As análises do trabalho demonstraram que em um criatório de PNH, diversos fatores podem comprometer a convivência da mãe e filhote, resultando na necessidade de um ambiente preparado com equipamento, material e mão de obra especializada para atendimento dos lactentes afastados de suas mães. Além disso, o planejamento adequado da reaproximação do filhote ao grupo familiar deve ser realizado objetivando minimizar as alterações comportamentais e sucesso no convívio social. Palavras-chave: Macaca mulata; Neonato; Berçário. 1. Serviço de Criação de Primatas Não humanos (SCPrim), Instituto de Ciências e Tecnologia em Biomodelos (ICTB), Fundação Oswaldo Cruz/Fiocruz, Rio de Janeiro. DATA RECEBIMENTO: 21/05/2017 ACEITO PARA A PUBLICAÇÃO: 14/11/2017 AUTOR PARA CORRESPONDÊNCIA: Cláudia Andréa de Araújo Lopes caal@fiocruz.br INTRODUÇÃO Complicações reprodutivas de primatas não humanos (PNH) têm sido detectadas no decorrer do período gestacional, parto e pós-parto, tais como: sangramentos vaginais, abortos, partos prematuros, estresse e rejeição materna de lactentes, traumas sofridos pela fêmea durante a gestação, distocias, obesidade materna, infecção por agentes bacterianos (ex: Listeria spp., Yersinia spp., Salmonella spp., etc), ausência de produção de leite, inexperiência de fêmeas primíparas, roubo de filhotes por outras fêmeas, morte materna e/ou fetal, entre outros 1,2,3,4,5. Frequentemente fêmeas primíparas apresentam dificuldade em cuidar de seus filhotes recém-nascidos devido a desordens perinatais 116 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

19 Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Gabriel de Moraes Leal, Victor Cavalcante Basílio, Janice Biazzi Pires, Carlos Alberto Soares Raimundo, Andréa Moreira Paulino multifatoriais. Este problema é mais prevalente do que em outras ordens de mamíferos, tornando- -se necessário separar o filhote da mãe, para que o neonato receba os cuidados adequados à sua sobrevivência 6. No que diz respeito às complicações relacionadas aos filhotes, existem relatos quanto à doença prolongada, acarretando a incapacidade de desenvolvimento do lactente, agressão sofrida por mãe, pai ou outros membros familiares, prematuros ou de baixo e anormalidades no desenvolvimento 1,2,3,4,5. Considerando a elevada frequência do problema em questão e com o intuito de evitar perdas animais em decorrência de complicações perinatais, é imperioso envidar esforços durante a temporada de partos em uma criação de PNH. Em colônias de criação de macacos Rhesus (Macaca mulatta) destinados à pesquisa, são observados problemas de abandono, resultando na mudança do manejo reprodutivo no sentido de separar a mãe de uma parcela de recém-natos, demandando cuidados especiais aos mesmos 5,7. Para atender a esta demanda específica, é imprescindível dispor-se de uma equipe treinada em cuidados neonatais, além de uma área adequada com equipamentos, e materiais disponíveis para a manutenção da vida dos filhotes, além do seguimento de um fluxo de práticas padronizadas. Com a aplicação de um procedimento operacional padronizado (POP) para cuidados neonatais, é possível garantir o bem-estar dos animais, com medidas de biossegurança apropriadas e resultados satisfatórios quanto à reintrodução dos animais a um grupo social e, consequentemente, permitindo atender a contento às pesquisas biomédicas 5. Este trabalho descreve incidência, origem e perfil de casos de macacos rhesus lactentes que necessitam de cuidados em um criatório científico, com o objetivo de enfatizar a importância dos cuidados neonatais e de como o manejo reflete sobre o sucesso da reintrodução dos animais nos grupos familiares previamente formados. MATERIAIS E MÉTODOS Animais A colônia de macacos Rhesus do Serviço de Criação de Primatas não Humanos (SCPrim) do Instituto de Ciências e Tecnologia em Biomodelos (ICTB), Fiocruz, Rio de Janeiro, mantém cerca de 505 exemplares (184 machos e 321 fêmeas), utilizados em pesquisas acerca de doenças infecciosas e desenvolvimento de vacinas e fármacos destinados aos humanos. Foi realizado um estudo retrospectivo no período de 2008 a 2017 de 25 lactentes da espécie M. mulatta (13 machos/12 fêmeas), no Setor de Neonatologia (SN) do SCPrim-ICTB/Fiocruz. Como critérios de inclusão, foram considerados os filhotes encaminhados ao berçário do SN/SC- Prim para receber os devidos acompanhamentos neonatais. O desenvolvimento deste trabalho foi devidamente aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/FIOCRUZ) sob a licença número LW-6/16. As instalações de primatas encontram-se em conformidade com as orientações do Guia para cuidados e uso de animais de laboratório 8. Coleta de dados As informações foram obtidas, utilizando os registros de dados contidos no livro de ocorrência diária e formulário de aleitamento do SN/SCPrim e complementados com as informações lançadas no sistema informatizado de gerenciamento de primatas do SCPrim. Os registros do estudo incluíram: a) quantidade de filhotes atendidos; b) sexo; c) motivos que os levaram a receberem cuidados neonatais; d) número de animais que vieram a óbito; e) número de animais que retornaram à colônia de criação (reintroduzidos); f) idade de óbito; g) idade das mães na ocasião do parto desses filhotes; h) quantidade de fêmeas primíparas e multíparas. Visto que a equipe que trabalha com os filhotes na maternidade deve ser devidamente treinada, RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

20 ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL para alimentar, higienizar e manejar corretamente os filhotes, sendo sempre supervisionada por um médico veterinário, ressalte-se que os profissionais especializados e envolvidos neste trabalho foram divididos em dois turnos (diurno e noturno), para permitir que os filhotes tivessem assistência 24 horas por dia. Descrição da área O berçário dispõe de termo higrômetro, balança pediátrica, termômetro clínico, uma bancada em aço inoxidável com saída de água para manipular e higienizar o material e os alimentos dos filhotes, tapetes higiênicos descartáveis destinados a animais domésticos (usado para absorver urina e evitar dermatites de contato), mamadeiras, seringas, rolinhos ou bichos de pelúcia para os animais se agarrarem e brinquedos para enriquecimento ambiental, duas incubadoras e quatro gaiolas do tipo módulo canil, para acolhimento dos filhotes em uma sala separada para essa atividade. Biossegurança Os cuidados com a biossegurança são levados em consideração durante o manejo dos filhotes. Para manuseio dos filhotes e/ou equipamentos e utensílios correspondentes, utilizam-se equipamentos de proteção individual (EPI) adequados: luvas, máscara com filtro PFF-2, gorro, calçado fechado e jaleco. Manejo O manejo dos animais encaminhados ao berçário foi dividido em três fases. Na primeira fase, o neonato era encaminhado ao berçário após a identificação de uma situação crítica na colônia (prostrado, sozinho no piso ou com dificuldades de amamentação ou de se segurar à sua mãe, lesões, magreza etc...). Sempre que possível são realizadas tentativas de unir a mãe ao filhote; porém, quando isso era frustrado foi realizada a transferência do filhote. Na segunda fase, os animais já no berçário, aparentemente sadios ou que apresentassem alterações clínicas, como hipotermia, desidratação, desnutrição, lesões graves relacionadas a quedas ou agressões, foram submetidos a exame clínico minucioso, incluindo: aferição de temperatura, avaliação de cavidade oral e vias aéreas, auscultação cardíaca e pulmonar, pesagem, palpação para avaliação de possíveis fraturas ou luxações e palpação abdominal. Quando necessário, os animais eram submetidos a atendimento de suporte emergencial. Algumas vezes, foi necessário proceder à estabilização dos animais com uso de oxigenioterapia, fluidoterapia, administração oral de glicose 25% e aquecimento com auxílio de colchão térmico, bolsa térmica ou incubadora, de acordo com a necessidade do indivíduo. Depois da estabilização do filhote foram realizados os registros de entrada do animal com seus dados de origem, além de abertura das fichas de atendimento clínico e de aleitamento. A terceira fase foi baseada na manutenção dos filhotes até o período de reintrodução ao seu grupo social. Nesta fase, os filhotes foram mantidos individualizados ou pareados quando possível, para um melhor desenvolvimento social, em recintos de aço inoxidável, medindo 65 cm largura x 65 cm profundidade x 70 cm altura, com espaçamento de 2 cm entre as vigas. Na ausência da mãe, foram oferecidos bichos de pelúcia e rolinhos de pano, para que os filhotes pudessem, junto ao objeto, se sentirem seguros, de forma a mimetizar os seus instintos naturais. Esses objetos eram periodicamente higienizados com imersão em solução clorada, enxaguado com água corrente e secagem ao sol. O ambiente era controlado com umidade variável entre 40 a 70% e luz artificial que se mantinha acesa das 6 às 18h. Diariamente os filhotes foram levados para banhos de sol de 15 a 30 minutos. Os filhotes foram amamentados com leite em pó Nan 1 na proporção de uma medida para 30 ml de água filtrada, com os intervalos descritos a seguir: de uma hora na primeira e segunda semana; de duas horas na terceira e quarta semanas; de três horas na quinta e sexta 118 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

21 Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Gabriel de Moraes Leal, Victor Cavalcante Basílio, Janice Biazzi Pires, Carlos Alberto Soares Raimundo, Andréa Moreira Paulino semana; de quatro horas na sétima e oitava semana; de cinco horas na nona e décima semana; de seis horas na 11ª e 12ª semana; de sete horas na 13ª e 14ª semana; de oito horas na 15ª e 16ª semana; de 12 horas na 17ª e 18ª semana e, finalmente, de 24 horas a partir da 19ª semana. Esses intervalos serviam somente como parâmetro e, sempre que necessário, eram alterados conforme o desenvolvimento individual de cada filhote, observando-se a necessidade de aumentar ou diminuir os intervalos. Os lactentes de macacos rhesus aceitam de 5 a 15 ml de leite de hora em hora, oferecidos na seringa. A quantidade de leite vai aumentando gradativamente de acordo com o desenvolvimento do animal, respeitando sempre à vontade do animal, mas sem deixar de avaliar o grau de abaulamento do seu abdômen. O processo de amamentação artificial começou com o uso de seringas de 1, 3 e 5 ml, depois passando para o uso da mamadeira, presa a um suporte fixo nas grades do recinto (Figura 1). Os materiais utilizados na amamentação foram devidamente higienizados e desinfetados com água, sabão neutro e hipoclorito de sódio (2,0 a 2,5%), C A D B E Figura 1: Amamentação artificial em macacos Rhesus (Macaca mulatta) neonatos criados no ICTB-Fiocruz. A) Amamentação do recém-nato com o uso de uma mamadeira; B) Material utilizado para a amamentação artificial: leite NAN1, seringas de 1, 3 e 10 ml, mamadeira tipo PET para filhotes, recipiente para diluição de leite; C) Aleitamento feito com uma seringa de 1 ml; D) Filhotes mamando direto nas mamadeiras fixadas em frente à gaiola individual onde se encontram alojados, já independentes do auxílio humano; E) Incubadora onde os lactentes permanecem quando chegam no berçário e permanecem até a redução dos seus riscos de morte. RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

22 ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL diluindo em água na proporção de 15 ml para um litro de água. A quantidade oferecida era feita de acordo com a idade, peso e aceitação do filhote. A primeira dose pode ser iniciada utilizando 0,5 ml de leite e 0,5 ml de glicose 25%, depois a glicose foi retirada gradativamente. A água e a ração foram oferecidas em mamadeiras acopladas à grade do recinto e um comedouro de aço inoxidável que fica mobiliado dentro do recinto respectivamente, para estimular a independência do filhote a ir atrás do alimento, a partir da oitava semana de vida. Uma variedade de itens de frutas, legumes, verduras, grãos além de ovos cozidos passou a ser oferecidos diariamente a partir da 12ª semana ou quando o filhote já aceita bem a ração. Processo de reintrodução dos filhotes ao grupo social A reintrodução dos filhotes foi iniciada, em média, após 180 dias de manutenção no berçário. Inicialmente, os animais foram encaminhados aos seus respectivos recintos de origem, onde passavam em princípio uma hora em contato com visual com outros primatas. O tempo de permanência no local aumentava gradativamente, conforme a adaptação dos filhotes. Estes ficavam alojados em gaiolas individuais próximos ao recinto onde seriam reintroduzidos, enquanto no resto do período do dia, voltavam ao berçário. Quando essa exposição alcançava todo o período da manhã e da tarde, eles passavam a pernoitar na antessala próxima à grade de acesso à área interna do recinto ( área de refúgio ) para manterem o contato visual, auditivo e olfativo com o grupo social. Posteriormente, houve uma aproximação da gaiola ao recinto, onde permitiu o contato físico entre os filhotes na gaiola individual e os animais integrantes do recinto. Após esse período, os animais foram soltos no refúgio, e por fim, liberados para circulação em toda a área do recinto. Finalmente, ocorreu a aproximação gradativa com os animais do recinto aos filhotes. Esse processo foi rigorosamente observado durante todo o período de exposição, de maneira a evitar qualquer reação de agressividade contra os filhotes e para um acompanhamento cuidadoso da aceitação dos filhotes no grupo social de primatas do recinto escolhido (Figura 2). Figura 2: Processo de reintrodução de filhotes de macacos Rhesus criados no ICTB-Fiocruz. A) Contato direto entre o filhote e adultos do grupo social; B) Filhote se adaptando ao novo ambiente, ainda separado dos outros animais do grupo; C) Aproximação visual dos filhotes do grupo onde serão introduzidos; D) Aproximação direta do filhote mantido em berçário com animais da nova família. A C B D 120 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

23 Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Gabriel de Moraes Leal, Victor Cavalcante Basílio, Janice Biazzi Pires, Carlos Alberto Soares Raimundo, Andréa Moreira Paulino RESULTADOS No período de nove anos, entre 2008 a 2017, foi recebido um total de 25 filhotes de M. mulatta, sendo 52% de machos (13/25) e 48% de fêmeas (12/25), e desses, 28% (7/25) dos animais vieram a óbito durante o período de vida no berçário, enquanto 72% (18/25) dos animais sobreviveram e retornaram à colônia. Dentre os animais recebidos, 52% (13/25) foram encaminhados ao berçário no mesmo dia em que nasceram, enquanto 12% (3/25) estavam com um dia de vida; 8% (2/25) com três dias; 4% (1/25) com cinco dias; 4% (1/25) com sete dias; 4% (1/25) com 10 dias; 4% (1/25) com 18 dias; um 4% (1/25) com 24 dias; 4% (1/25) com 50 dias e 4%(1/25) com 52 dias de vida. Dentre os sete casos de óbito, 43% (3/7) dos filhotes vieram a óbito no mesmo dia em que deram entrada no berçário; 29% (2/7) vieram a óbito com um dia de vida no berçário; 14% (1/7) veio a óbito com dois dias de vida e 14% (1/7) veio a óbito com 9 dias de vida. Um animal foi reintroduzido ao grupo social com apenas um dia de vida no berçário, uma vez que a mãe o aceitou após ter sido roubado por outra fêmea. Dentre as mães dos filhotes assistidos, 32% (8/25) eram primíparas e 68% (17/25) eram multíparas. Dos oito filhotes de fêmeas primíparas, cinco deles (62,5% - 5/8) foram rejeitados, enquanto que no caso dos 17 filhotes de mães multíparas, houve dois casos de rejeição (11,7% - 2/17), sendo o outro encaminhamento dos animais ao berçário decorrentes de outras causas. A tabela 1 demonstra as causas que resultaram na transferência dos filhotes ao berçário e os históricos reprodutivos das mães por quantidade de partos (multíparas ou primíparas). Tabela 1: Causas de cuidados neonatais assistidos de Macaca mulatta, características dos filhotes e respectivas mães quanto ao seu histórico reprodutivo. Filhote Sexo Idade da mãe ao parto Mãe Primípara (P) / Multípara (M) Motivo da separação da mãe 1 F 16 M Rejeição após roubo 2 F 4 M Rejeição 3 F 3 P Rejeição 4 F 13 M Hemorragia pós-parto da mãe 5 M 7 M Fornecimento mãe 6 M 7 M Fornecimento mãe 7 M 10 M Escoriações traumáticas 8 F 3 P Debilidade do filhote 9 F 8 M Óbito da mãe 10 M 4 P Escoriações traumáticas prostração 11 M 7 M Debilidade 12 F 3 P Rejeição 13 M 3 P Rejeição 14 M 3 P Rejeição 15 F 5 M Debilidade do filhote RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

24 ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL 16 F 8 M Óbito da mãe 17 F 9 M Debilidade do filhote 18 M 10 M Óbito da mãe 19 F 8 M Roubo de filhote e debilidade 20 M 15 M Debilidade 21 F 9 P Patologia do filhote 22 M 6 P Rejeição após roubo 23 M 9 M Obesidade 24 M 15 M Debilidade e queda 25 M 14 M Dispneia, arritmia cardíaca, convulsão, apatia Dados do criatório científico do SCPRim/ICTB, período de Todos os filhotes sobreviventes foram reintroduzidos ao convívio social de sua família de origem ou de um novo grupo social de Macaca mulatta, dependendo da oportunidade de espaço físico e perfil do grupo social de origem. A técnica de reintrodução ao grupo social, nos primeiros 19 casos descritos iniciaram quando os filhotes desmamaram em torno de 180 dias de vida. A partir de 2015, a reintrodução foi realizada em média, em 94 dias de vida do filhote. CONCLUSÃO Em colônias de reprodução de PNH é comum que alguns filhotes sejam mantidos em ambiente de berçário em situações de extrema necessidade devido a dificuldades maternas ou dos filhotes 7,9,10. No período de nove anos, o SCPrim-ICTB acolheu 25 neonatos da espécie M. mulatta, reforçando a necessidade de um local adequado e de uma equipe especializada em lidar com esses animais. Em criatórios científicos que alojam animais para uso biomédico, além de acolher neonatos ou lactentes com risco de morte em razão da ausência dos cuidados maternos, os animais podem ser mantidos em berçários também para atender aos protocolos de pesquisas que envolvam a utilização de lactentes, produzir colônias de livres de patógenos específicos, bem como em caso de seleção fenotípica e genotípica para melhoramento genético do plantel 10. Dentre os atendimentos neonatais, 72% (18/25) dos animais sobreviveram e retornaram ao convívio social, concretizando o sucesso dos cuidados oferecidos durante o período no berçário; porém, 27% vieram a óbito devido a complicações de quadros clínicos. Em um levantamento realizado no período de 1971 a 2001 pelo Infant Primate Research Laboratory (IPRL) o índice de sobrevivência no berçário variou de 12,3 % a 5%, mantendo uma média anual de 9,4% em espécies símias M. mulatta, M. nemestrina, M. fascicularis e Papio sp. 10. Os motivos de transferência ao berçário dessa instituição foram, na maioria dos casos, relacionados a cesarianas programadas, diferente do que normalmente ocorre no SCPrim, onde os neonatos encaminhados encontram-se em situação de risco, com alguma alteração clínica significativa. Essa diferença de manejo pode ser um indicativo de que o maior desafio da criação sob estudo em melhorar o índice de sobrevivência está relacionado à uma identificação o mais precoce possível das alterações que possam constituir um risco elevado para a vida do filhote. No tocante aos óbitos ocorridos, 44% (11/25) dos casos ocorreram no primeiro dia de vida dos 122 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

25 Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Gabriel de Moraes Leal, Victor Cavalcante Basílio, Janice Biazzi Pires, Carlos Alberto Soares Raimundo, Andréa Moreira Paulino filhotes e 28% (7/25) no segundo dia, demonstrando a importância do pronto atendimento, a fim de salvar a vida do filhote 10. Neste trabalho, a transferência dos animais ao berçário incidiu em função de injúrias, debilidade, doença não definida, dispneia, arritmia cardíaca, convulsão e apatia. Em contrapartida, as principais alterações detectadas no IPRL foram baixo peso dos recém- -nascidos, animais prematuros, injúrias e doença prévia 10. Não foi encontrada evidência de maior incidência de cuidados neonatais ligadas ao sexo dos filhotes. A maioria absoluta dos casos atendidos foi de animais que haviam nascido no mesmo dia, demonstrando a importância de uma boa observação ao comportamento da mãe e filhotes desde o primeiro dia de nascimento 7 ; entretanto ocorreram casos de animais com até 52 dias de vida que apresentaram necessidade de transferência ao berçário. Os problemas considerados mais comuns que promoveram o afastamento entre mãe e lactentes, em colônias de macacos, são o abandono ou a rejeição materna. Um estudo retrospectivo de neonatos da espécie Macaca fuscata que receberam cuidados humanos, sugeriu que o fator mais importante envolvendo no abandono de filhotes, era a questão da paridade (multípara ou primípara), seguida do seu respectivo grau de dominância social dentro do grupo. Os autores relataram que os neonatos são 90 vezes mais propensos a serem abandonados por uma mãe primípara do que por uma mãe multípara. Além disso, o abandono foi seis vezes mais provável por uma fêmea submissa do que por uma fêmea de elevado nível hierárquico (dominante) 11,12,13. Já é descrito que primíparas de macacos rhesus têm maior prevalência de casos de abandono e agressão de filhotes do que as multíparas 9. No presente estudo, foi observado que de oito filhotes de fêmeas primíparas, cinco deles (62,5% - 5/8) foram rejeitados, contrastando com um índice de 11,7% (2/17) dos 17 filhotes de fêmeas multíparas, relato que corrobora com a literatura. Os roubos de neonatos ocorrem frequentemente em PNH, onde as fêmeas não parturientes são comumente responsáveis por esses roubos 9. Neste estudo, pelo menos três dos filhotes nascidos (12% - 3/25) foram roubados de suas mães. Uma vez que a criação de macacos Rhesus aqui analisada não dispõe de profissionais no turno de 24h (apenas no berçário), outros casos de roubo podem ter ocorrido; contudo, sem a possibilidade de identificá-los, pois por muitas vezes, os filhotes foram encontrados debilitados no piso do recinto sozinhos na parte da manhã, impossibilitando, assim, registrar tal evento. Outra causa de afastamento entre mãe e filhotes é a distocia, relatada em muitas espécies símias, muitas vezes, associada com a idade juntamente com a percentagem de gestações anteriores que resultaram em cesárea 9,14. Os fatores de risco para o parto distócico incluem: debilidade, tamanho e posição anormal do feto, forma atípica da pelve materna, lesões traumáticas, inércia ou atonia uterina, disfunção uterina, estenose cervical ou vaginal, diabete gestacional, doença óssea metabólica, ruptura de bexiga, bloqueio urinário por trauma, anemia, infecções, hidrocefalia e hidropsia fetal 14. As complicações pós-distócicas também podem ocasionar o encaminhamento de filhotes a berçário. O presente levantamento, uma fêmea apresentou sangramento vaginal intenso pós-parto que resultou na separação do seu filhote para tratamento. O sangramento vaginal intenso ou persistente deve ser motivo de preocupação e precisa ser avaliada prontamente, sendo lesão uterina, endometrite e metrite consideradas as causas mais comuns desta hemorragia perinatal 9,14. Outro problema muito comum após o parto é a retenção de placenta. As placentas são normalmente ingeridas pela mãe ou encontradas no recinto; porém há muitos casos de retenção de placenta que acarretam em letargia pós-parto, falta de cuidados maternos com a sua prole, possível choque com sepse secundária e óbito da mãe 14. A separação entre mãe e filhote de PNH deve ser evitada ao máximo, devido ao isolamento social precoce imposto aos filhotes nestas circunstâncias. Os cuidados em berçários impõem ao lactente que ele seja criado em um ambiente não natural, sem os estímulos maternos e o convívio RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

26 ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL com outros animais de idades diferentes, fato imprescindível para o aprendizado do primata ao longo de sua vida 9. Desta forma, o berçário precisa atender não somente às necessidades nutricionais e clínicas dos filhotes, como também proporcionar o bom desenvolvimento psicológico, motor e oferecer cuidados voltados para o seu bem-estar 10. PNH mantidos sem contato físico com seus semelhantes, durante os primeiros 6 meses vida podem desenvolver comportamentos anormais profundos, irreversíveis e fisiológicos, conhecidos como síndrome do isolamento. Animais portadores desta síndrome apresentam: 1) falha na capacidade de desenvolver relações sociais positivas; 2) inadequado desenvolvimento de expressões faciais e motor 3) distúrbios emocionais, tais como medo ou agressão; e 4) posturas bizarras e comportamentos estereotipados. Quando a separação ocorre entre 0 a 3 meses de vida do filhote, as alterações comportamentais e motoras podem ser irreversíveis, causando prejuízos na qualidade do modelo animal nas pesquisas e também prejudicando o desenvolvimento reprodutivo do animal 9. Por este motivo, na criação analisada neste trabalho busca-se, ao máximo, não afastar os filhotes de suas mães, com tentativas constantes de reaproximação entre mãe e filhote. Devido às consequências comportamentais e de desenvolvimento sofridos pelos filhotes afastados de suas mães 9, procura-se adiantar o processo de reintrodução. Nos últimos dois anos reprodutivos da colônia do SCPrim/ICTB, reduziu-se o prazo de reintrodução de 180 para 94 dias, respeitando a evolução do filhote e atentando-se para a sua segurança quanto aos contatos mais próximo com os animais maiores. Vale enfatizar que em virtude de tantos problemas reprodutivos perinatais de PNH que podem ocasionar cuidados neonatais assistidos, com aleitamento artificial e perda do convívio social, é indispensável que um biotério de criação seja dotado de profissionais capacitados. A habilidade técnica permite seguir as práticas implementadas de manejo com esses animais com eficiência, de modo a impedir alterações comportamentais e realizar controle de enfermidades diversas, obtendo- -se resultados satisfatórios na reintrodução do animal em um grupo familiar, sem causar danos às pesquisas realizadas nesses animais. Desta forma, afirma-se que em um criatório de PNH, diversos fatores podem comprometer a convivência da mãe e filhote, resultando na necessidade de um ambiente preparado com equipamento, material e mão de obra especializada para atendimento dos lactentes afastados de suas mães. Para tanto, o planejamento adequado da reaproximação do filhote ao grupo familiar deve ser realizado, objetivando minimizar as alterações comportamentais e sucesso no convívio social. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Dra. Márcia C.R. Andrade, pela revisão deste trabalho. 124 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

27 Cláudia Andréa de Araújo Lopes, Gabriel de Moraes Leal, Victor Cavalcante Basílio, Janice Biazzi Pires, Carlos Alberto Soares Raimundo, Andréa Moreira Paulino RETROSPECTIVE STUDY OF NEONATAL CARE IN RHESUS MONKEYS (MACACA MULATTA) KEPT IN SCIENTIFIC BREEDING: ACCOMPANIED CASUISTRY, MANAGEMENT, AND REINTRODUCTION TO THE SOCIAL GROUP Reproductive complications of nonhuman primates (NHP) have been detected in animal breeding, which becomes commonly necessary separating the baby from the mother. This paper describes the incidence, origin, and profile cases of nursling rhesus macaques (Macaca mulatta) kept in nursery unit from a scientific creation, with the aims of emphasizing the importance of neonatal care, how the management reflects on the healthy development of the animals, as well as the success of reintroducing them into family groups. A retrospective study was carried out, from 2008 to 2017, of 25 infant rhesus macaques who received neonatal care. Data were obtained from a database of the breeding records. During nine years 25 nursling M. mulatta were received in the neonatal care section, with 52% (13/25) of males and 48% (12/25) of females, and from these, 28% (7/25) died, while 72% (18/25) of the animals have survived. All the surviving infants were reintroduced into social interaction. Work analyzes demonstrated that in a NHP creation several factors could compromise the living together between the mother and its offspring, resulting in the need of a prepared environment with equipment, material, and specialized labor to attend the infants away from their mothers. In addition, adequate planning about rapprochement of the infant to the family group should performed with the purpose of minimizing behavioral alterations and obtaining success on the social life. ABSTRACT Keywords: Macaca mulatta; Newborn; Nursery. 1. Schneider ML. Prenatal stress exposure alters postnatal behavioral expression - under conditions of novelty challenge in rhesus monkey infants. Dev Psychobiol. 1992; 25(7): Cooke SB, Ainsworth SB, Fenton AC. Postnatal growth retardation: a universal problem in preterm infants. Arch Dis Child Fetal Neonatal. 2004; 89: Dettmer AM, Houser LA, Ruppenthal GC, Capuano S, Hewitson L. Growth and developmental outcomes of three high-risk infant rhesus macaques (Macaca mulatta). Am J Primatol. 2007; 69: Saucedo A, Morales PR. Basics of macaque pediatrics. Vet Clin Exot Anim. 2012; 15: Lopes CAA, Fasano DM, Bravin JS, Cysne LB, Andrade MCR, Tannouz VGS. Clínica Aplicada. In: Andrade A, Andrade MCR, Marinho A da M, Ferreira Filho J. (Orgs). Biologia, manejo e medicina de primatas não humanos na pesquisa biomédica. Rio de Janeiro: Fiocruz; p , Chamove AS, Anderson JR. Handrearing infant stumptailed macaques. Zoo Biol; 1982, 1: Andrade A, Andrade MCR, Marinho AM, Ferreira-Filho J. Biologia, manejo e medicina de primatas não humanos na pesquisa biomédica. Rio de Janeiro: Fiocruz; p. 8. Guide for the care and use of laboratory animals. Washington: National Research Council, National. 8th Ed. The National Academic Press; p. 9. Abee CR, Mansfield K, Tardif S, Morris T. Nonhuman primates in biomedical research: biology and management. San Diego: Academic Press; p. REFERÊNCIAS RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

28 ESTUDO RETROSPECTIVO DE CUIDADOS NEONATAIS DE MACACOS RHESUS (MACACA MULATTA) MANTIDOS EM UM CRIATÓRIO CIENTÍFICO: CASUÍSTICA ACOMPANHADA, MANEJO E REINTRODUÇÃO AO GRUPO SOCIAL REFERÊNCIAS 10. Sackett GP, Holm RA, Davis AE, Fahrenbruch CE. Prematurity and low birth weight in pigtail macaques: incidence, prediction, and effects on infant development. In: Proceedings from the Symposia of the Fifth Congress of the International Primatological Society. Tokyo: Japan Science Press; p , Hinde RA. Animal behavior, a synthesis of ethology and comparative psychology. Tokyo: International Student; p , Berman CM. Intergenerational transmission of maternal rejection rates among free-ranging rhesus monkeys. Anim Behav. 1990; 39: Schino G, Troisi A. Neonatal abandonment in Japanese macaques. American Journal of Physical Anthropology. 2005; 126(4): Courtney A. Gestational concerns: when to intervene and what to do. In: Courtney A (Ed). Pocket handbook of nonhuman primate clinical medicine. Boca Raton: CRC Press; p , RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

29 ARTIGO ORIGINAL ISSN PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE RATOS WISTAR PROVENIENTES DO BIOTÉRIO DA PUC GOIÁS Florencia Camila Gonçalves¹, Claudio Quintino de Lima Junior¹, Clayson Moura Gomes², Graziela Torres Blanch², Sérgio Henrique Nascente Costa², Karlla Greick Batista Dias Penna² 1. Graduando (a) em Biomedicina pela Escola de Ciências Médicas Farmacêuticas e Biomédicas, PUC Goiás; 2. Professor (a) Doutor (a) da Escola de Ciências Médicas, Farmacêuticas e Biomédicas, PUC Goiás. DATA RECEBIMENTO: 28/06/2017 ACEITO PARA A PUBLICAÇÃO: 14/11/2017 AUTOR PARA CORRESPONDÊNCIA: Florencia Camila Gonçalves. florenciacamila20@gmail.com Em Países com longa tradição na manutenção de biotérios tem determinado os valores de referência dos seus animais, a fim de avaliar a homeostase e alterações provocadas por processos patológicos, sendo que, esses valores passaram a ser utilizados por biotérios de todo mundo, porém parâmetros bioquímicos e hematológicos podem variar de um biotério para outro, assim, faz-se necessário que cada Biotério obtenha seu próprio valor de referência, uma vez que variações intraespécies podem existir. O objetivo do trabalho foi determinar valores de referência para ratos Wistar do Biotério da PUC-Goiás. Foram utilizados 17 ratos Wistar com peso médio de 344 g, obtidos do biotério setorial da PUC-Goiás e foram avaliados parâmetros hematológicos e bioquímicos utilizando respectivamente sangue colhido com EDTA e soro. Os parâmetros avaliados foram dispostos em tabelas com média, desvio padrão e erro padrão. Para efeito de comparação foram apresentados também alguns resultados obtidos na literatura. No presente estudo foram encontrados valores que destoam da faixa de valores encontrados em outros estudos quando observado as médias, dentre estes temos o número de plaquetas, linfócitos, neutrófilos, eosinófilos, Aspartato Aminotransferase (ASAT) e fosfatase alcalina. Alguns parâmetros mostraram- se discrepantes em relação a outros estudos, destacando a necessidade de cada biotério determinar seus próprios valores de referência para avaliação da homeostasia e desenvolvimento de doenças durante os experimentos científicos. RESUMO Palavras-chave: Ratos Wistar, hematologia, bioquímica, valores de referência. INTRODUÇÃO O uso de animais de laboratório tem grande importância na execução de pesquisas científicas contribuindo para o desenvolvimento da ciência e tecnologia 1. É por meio dos estudos experimentais que ocorre o avanço em relação ao conhecimento dos mecanismos vitais como também o aperfeiçoamento dos métodos de prevenção, diagnóstico e tratamento de diversas doenças que vêm se desenvolvendo ao longo dos anos 2. Várias espécies de animais podem ser utilizadas para o desenvolvimento de pesquisas científicas, porém, camundongos e ratos são os mais utilizados, uma vez que, são os mais conhecidos cientificamente e apresentam características fisiológicas e genéticas similares as de seres humanos 1,3. Os camundongos começaram a ser introduzidos como animais para uso experimental a partir do século XIX e desde então, são os animais mais utilizados na pesquisa. Seguido dos camundongos os ratos representam cerca de 20% do número total de animais envolvidos nesta atividade 3. Como outros mamíferos em estado de higidez, os roedores têm que manter as suas funções fisiológicas e bioquímicas constantes 4. Portanto, há a necessidade de se conhecer os parâmetros fisiológicos para avaliar a homeostasia desses animais, assim como, verificam as RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

30 PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE RATOS WISTAR PROVENIENTES DO BIOTÉRIO DA PUC GOIÁS alterações provocadas por doenças induzidas durante a experimentação animal 5. Países com tradição na manutenção de biotérios determinam os valores de referência dos seus animais de experimentação, que passam a ser usados como sendo iguais para as mesmas linhagens de animais, em diversas regiões do mundo. No entanto, mesmo com a existência de mecanismos próprios de regulação de valores dos parâmetros fisiológicos, sabe-se que ratos e camundongos podem apresentar variações, relacionadas com sexo, linhagem, genótipo, idade, dieta, manuseio, ambiente, entre outras condições. Ainda inclui-se o fato de que os animais experimentais não se comportam do mesmo modo nas diferentes partes do planeta devido às condições a que estão submetidos nos diferentes países onde são mantidos em cativeiro, sendo, portanto, influenciados por vários fatores ecológicos 5. Alguns trabalhos têm demonstrado que valores de referência de parâmetros bioquímicos e hematológicos de animais não tratados apresentam grandes variações intraespécie, resultantes de diferenças geográficas e de manuseio 6,7. Diante do exposto, é importante que cada biotério estabeleça os seus próprios valores de referência dos animais normais, de acordo com a linhagem, gênero e idade de cada espécie utilizada 8. Dessa forma o objetivo deste trabalho foi determinar os valores de referência de alguns parâmetros hematológicos e bioquímicos para que possam ser utilizados em pesquisas com ratos Wistar, provenientes do Biotério Setorial da Pontifícia Universidade Católica de Goiás. MATERIAIS E MÉTODOS Foram utilizados 17 ratos Wistar, machos, com peso de g, obtidos do biotério Setorial da Pontifícia Universidade Católica Goiás (PUC- -Goiás). Os animais foram criados em caixas de polipropileno, forrada com maravalha com até quatro animais, em ambiente controlado com ciclo claro/escuro 12h-12h, água e ração ad libitum. Este experimento foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da PUC-Goiás com licença número CEUA Para a coleta de sangue os animais foram submetidos a 12 horas de jejum e a coleta foi realizada por punção cardíaca após anestesia com administração intraperitoneal de pentobarbital, 80 mg/dose única. A avaliação dos parâmetros hematológicos foi realizada em sangue colhido com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 10% e para os parâmetros bioquímicos em tubos secos com gel separador e tubo com fluoreto. O soro foi separado por centrifugação durante 10 minutos a 3500 rpm (rotações por minuto). Os parâmetros hematológicos analisados foram leucócito total, neutrófilos, linfócitos, eosinófilos, monócitos, basófilos, hemácias, hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração da hemoglobina corpuscular média (CHCM), curva de distribuição das hemácias de acordo com o volume eritrocitário (RDW), plaquetas e volume plaquetário médio (VPM). Foram analisados utilizando o analisador hematológico ABX Pentra 60. Os parâmetros bioquímicos glicose, ureia, creatinina, colesterol total, triglicérides, ácido úrico, aspartato aminotransferase (ASAT), alanina aminotransferase (ALAT), fosfatase alcalina, proteínas totais, albumina, cálcio e magnésio foram analisados utilizando o aparelho automatizado Selectra XL e o sódio e potássio pelo aparelho automatizado AVL 9180 Electrolyte Analyzer. Os valores séricos de globulinas foram obtidos a partir do cálculo dos valores séricos de proteínas totais subtraídos dos valores séricos de albumina. Para cada parâmetro avaliado, os valores foram expressos como média, erro padrão (EP) e desvio padrão (DP). RESULTADOS Os resultados das análises hematológicas dos ratos Wistar machos provenientes do Biotério 128 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

31 Florencia Camila Gonçalves, Claudio Quintino de Lima Junior, Clayson Moura Gomes, Graziela Torres Blanch, Sérgio Henrique Nascente Costa, Karlla Greick Batista Dias Penna Setorial da PUC Goiás estão representados nas tabelas 1 e 2. As tabelas apresentam também dados de outros biotérios expressos em média e erro padrão (tabela 01) e média e desvio padrão (tabela 2) para efeito de estudo e comparação. Os resultados dos parâmetros bioquímicos dos ratos Wistar machos provenientes do Biotério Setorial da PUC Goiás estão representados nas tabelas 3 e 4. As tabelas apresentam também dados de outros biotérios expressos em média e erro padrão (tabela 3) e média e desvio padrão (tabela 4) para efeito de estudo e comparação. DISCUSSÃO Os roedores são animais que apresentam características fisiológicas e genéticas semelhantes aos dos humanos e, portanto, têm sido muito utilizados em projetos de pesquisas de diversas áreas 3. A padronização de linhagens de animais de experimentação é uma importante ferramenta para avaliar a homeostasia e as complexas interações que ocorrem nesse sistema, possibilitando a comparação e compreensão dos eventos relacionados ao desenvolvimento da doença 13. O hemograma avalia quantitativamente e qualitativamente os elementos celulares sanguíneos, sendo essencial para a avaliação da saúde atuando como coadjuvante para o diagnóstico de doenças infecciosas, doenças crônicas, entre outros distúrbios. Para realização do hemograma é necessário o uso correto de anticoagulante, pois o uso inadequado pode danificar a amostra, tornando o resultado obtido questionável 14. O EDTA é o anticoagulante preferido para realização do hemograma em espécies domésticas, pois impede a coagulação e preserva as características celulares, enquanto a heparina pode causar alterações Tabela 1. Resultados dos parâmetros hematológicos, do Biotério da PUC-Goiás comparando com de outros biotérios, expressos em média e EP. Parâmetros Biotério da Biotério da Biotério do PUC Goiás UFES 7 LTF UFPB 9 Hemácias (10 6 /µl) 8,82 ± 0,08 5,73 ± 0,07 8,40 ± 0,50 Hemoglobina (g/dl) 15,26 ± 0,12 12,83 ± 0,21 14,70 ± 0,20 Hematócrito (%) 44,75 ± 0,34 43,59 ± 0,53 41,40 ± 0,61 VCM (fl)(µm³) 50,94 ± 0,33 80,74 ± 3,29 54,10 ± 0,64 HCM (pg) 17,32 ± 0,13 * 19,30 ± 0,28 CHCM (g/dl) 34,14 ± 0,17 29,71 ± 0,52 % 35,60 ± 0,22 RDW (%) 13,04 ± 0,25 * * VPM (fl) 6,41 ± 0,07 * * Plaquetas (10³/µL) 767,65 ± 25,67 * 658,50 ± 18,90 Neutrófilos (%) 4,81 ± 0,40 37,43 ± 1,62 19,50 ± 2,05 Linfócitos (%) 93,85 ± 0,45 43,41 ± 1,32 77,30 ± 1,97 Monócitos (%) 1,03 ± 0,09 16,24 ± 1,62 1,20 ± 0,25 Eosinófilos (%) 0,04 ± 0,01 1,46 ± 0,24 2,00 ± 0,56 Basófilos (%) 0,28 ± 0,03 0,04 ± 0,03 * *Valores não avaliados EP: Erro Padrão, VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média, RDW: Distribuição do Volume Eritrocitário, VPM: Volume Plaquetário Médio. RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

32 PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE RATOS WISTAR PROVENIENTES DO BIOTÉRIO DA PUC GOIÁS Tabela 2. Resultados dos parâmetros hematológicos, do Biotério da PUC-Goiás comparando com de outros biotérios, expressos em média e DP. Parâmetros Biotério da PUC Goiás Biotério da UFS 6 Biotério da UniT 10 Biotério da ULBRA 11 Hemácias (10 6 /µl) 8,82 ± 0,34 8,00 ± 0,55 8,65 ± 1,11 8,40 ± 0,40 Hemoglobina (g/dl) 15,26 ± 0,50 14,50 ± 0,78 15,00 ± 1,45 15,10 ± 0,50 Hematócrito (%) 44,75 ± 1,39 44,20 ± 2,95 43,30 ± 3,51 44,90 ± 2,80 VCM (fl) 50,94 ± 1,34 55,50 ± 2,22 47,75 ± 2,89 53,60 ± 3,30 HCM (pg) 17,32 ± 0,56 18,20 ± 0,57 16,51 ± 0,30 18,00 ± 0,70 CHCM (g/dl) 34,14 ± 0,72 32,80 ± 1,09 34,89 ± 2,41 33,70 ± 1,60 RDW (%) 13,04 ± 1,02 * * 11,50 ± 2,10 VPM (fl) 6,41 ± 0,30 7,52 ± 0,35 * * Plaquetas (10³/µL) 767,65± 105, ,00 ± 152,56 982,34 ± 167, ,00 ± 93,50 Neutrófilos (%) 4,81 ± 1,64 24,80 ± 7,85 33,16 ± 14,99 15,60 ± 5,50 Linfócitos (%) 93,85 ± 1,84 70,00 ± 7,37 67,36 ± 15,31 83,70 ± 5,40 Monócitos (%) 1,03 ± 0,38 3,90 ± 1,31 5,27 ± 3,52 0,80 ± 0,50 Eosinófilos (%) 0,04 ± 0,05 1,30 ± 0,82 1,25 ± 1,09 1,00 ± 0,50 Basófilos (%) 0,28 ± 0,12 * 0,92 ± 0,74 0 *Valores não avaliados. DP: Desvio Padrão, VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média, RDW: Distribuição do Volume Eritrocitário, VPM: Volume Plaquetário Médio. Tabela 3. Resultados dos parâmetros bioquímicos, do Biotério da PUC-Goiás comparando com de outros biotérios, expressos em média e EP. Parâmetros Biotério da PUC Goiás Biotério do LTF-UFPB 9 Biotério do CB FMUSP 12 Glicose (mg/dl) 173,50 ± 9,68 82,00 ± 4,47 102,00 ± 5,55 Ureia (mg/dl) 37,76 ± 1,00 55,00 ± 1,90 43,76 ± 5,40 Creatinina (mg/dl) 0,50 ± 0,01 0,60 ± 0,02 0,36 ± 0,17 Colesterol Total (mg/dl) 64,00 ± 2,42 51,00 ± 3,16 74,40 ± 8,89 Triglicerídeos (mg/dl) 78,88 ± 7,63 100,00 ± 8,04 62,00 ± 9,63 Ácido úrico (mg/dl) 1,06 ± 0,17 1,60 ± 0,10 * ASAT (U/L) 126,29 ± 4,99 78,20 ± 2,62 18,80 ± 7,84 ALAT (U/L) 59,47 ± 2,49 59,00 ± 4,47 22,20 ± 7,88 Fosfatase alcalina (U/L) 257,65 ± 11,40 166,00 ± 7,06 * Proteínas Totais (g/dl) 6,09 ± 0,09 6,80 ± 0,08 6,15 ± 0,61 Albumina (g/dl) 3,59 ± 0,04 3,90 ± 0,04 2,14 ± 0,33 Globulinas (g/dl) 2,49 ± 0,08 2,90 ± 0,08 4,00 ± 0,29 Sódio (mmol/l) 139,29 ± 0,44 135,00 ± 0,66 * Potássio (mmol/l) 5,42 ± 0,20 4,60 ± 0,44 * Cálcio (mg/dl) 10,44 ± 0,22 10,00 ± 0,18 13,28 ± 0,91 Magnésio (mg/dl) 2,49 ± 0,05 1,99 ± 0,15 3,22 ± 0,17 * Valores não avaliados. EP: Erro Padrão, ASAT: Aspartato Aminotransferase, ALAT: Alanina Aminotransferase. 130 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

33 Florencia Camila Gonçalves, Claudio Quintino de Lima Junior, Clayson Moura Gomes, Graziela Torres Blanch, Sérgio Henrique Nascente Costa, Karlla Greick Batista Dias Penna Tabela 4. Resultados dos parâmetros bioquímicos do Biotério da PUC-Goiás comparando com de outros biotérios, expressos em média e DP. Parâmetros Biotério da PUC Goiás Biotério da UFS 6 Biotério da UniT 10 Biotério da UEM 8 Glicose (mg/dl) 173,35 ± 39,91 104,00 ± 17,18 138,72 ± 30,17 108,00 ± 17,40 Ureia (mg/dl) 37,76 ± 4,13 35,90 ± 3,58 39,97 ± 6,78 48,00 ± 7,60 Creatinina (mg/dl) 0,50 ± 0,06 0,50 ± 0,05 0,58 ± 0,24 0,5, ± 0,07 Colesterol Total (mg/dl) 64,00 ± 9,99 67,40 ± 8,72 60,68 ± 6,51 87,00 ± 18,10 Triglicerídeos (mg/dl) 78,88 ± 31,46 89,90 ± 29,16 46,87 ± 18,73 82,00 ± 24,70 Ácido úrico (mg/dl) 1,06 ± 0,68 1,30 ± 0,34 1,81 ± 0,67 * ASAT (U/L) 126,29 ± 20,58 131,70 ± 23,09 131,33 ± 43,98 81,00 ± 11,70 ALAT (U/L) 59,47 ± 10,25 48,40 ± 6,46 57,55 ± 11,95 51,00 ± 12,30 Fosfatase alcalina (U/L) 257,65 ± 46,99 127,10 ± 35,55 91,63 ± 28,70 124,00 ± 6,10 Proteínas Totais (g/dl) 6,09 ± 0,37 6,20 ± 0,26 5,75 ± 0,87 * Albumina (g/dl) 3,59 ± 0,16 3,00 ± 0,12 2,65 ± 0,30 * Globulinas (g/dl) 2,49 ± 0,32 3,10 ± 0,20 3,50 ± 1,15 * Sódio (mmol/l) 139,29 ± 1,83 138,70 ± 3,06 134,03 ± 4,67 * Potássio (mmol/l) 5,42 ± 0,83 4,70 ± 0,53 5,41 ± 1,15 * Cálcio (mg/dl) 10,44 ± 0,89 * 8,19 ± 1,63 * Magnésio (mg/dl) 2,49 ± 0,22 * * * *Valores não avaliados. DP: Desvio Padrão, ASAT: Aspartato Aminotransferase, ALAT: Alanina Aminotransferase. morfológicas nos leucócitos e é menos eficiente para impedir a agregação plaquetária 15,16, porém, Gonzalez e Silva 14 relatam o aumento da susceptibilidade da hemólise após 24 horas quando usado EDTA. No presente trabalho o anticoagulante de escolha foi o EDTA, e os exames foram realizados imediatamente após a coleta do espécime, eliminando a possibilidade de hemólise. Nos resultados do presente estudo os parâmetros hematológicos se apresentaram semelhantes aos de outros estudos que buscaram determinar valores de referências para ratos da linhagem Wistar em seus biotérios, quando observado a média e o desvio padrão ou erro padrão. Os valores de leucócitos, hemácias, hemoglobina, VCM, HCM, CHCM, estavam dentro da faixa dos valores obtidos no estudo de Lima 10 e de Carvalho 7. Plaquetas, apresentaram resultados similares aos obtidos pelo trabalho de Diniz 9 e Lima 10. Porém, encontramos valores abaixo dos obtidos por Melo 6 e Silva 11. Em relação à contagem percentual de neutrófilos foi observado que os resultados estavam abaixo da faixa de valores do estudo de Melo 6 e Lima 10, por sua vez os linfócitos estavam elevados em relação aos valores obtidos no estudo de Carvalho 7 e Diniz 9. Os eosinófilos apresentaram-se menores que os encontrados nas outras literaturas de referência, como no estudo de Melo 6 e Carvalho 7. Estes fatos confirmam a necessidade de se determinar valores de referência para animais de cada biotério 6,8, uma vez que a discrepância entre resultados ocorre devido à ausência de padronização quanto à idade, dieta, estresse do animal durante a coleta, bem como a metodologia empregada¹⁷. Os parâmetros bioquímicos de forma geral corroboraram com os resultados encontrados na literatura quando observado as médias e o desvio padrão ou erro padrão. Diniz 9 e Spinelli 12 que obtiveram valores de glicose abaixo do encontrado no presente estudo, que por sua vez foi semelhante aos de Lima 10. RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

34 PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE RATOS WISTAR PROVENIENTES DO BIOTÉRIO DA PUC GOIÁS Os valores de fosfatase alcalina apresentaram- -se acima do encontrado no estudo de Carvalho 7 e Lima 10. Enquanto que os valores de ASAT foram similares ao de Lima 10, porém acima da faixa de valores para Diniz 9 e Spinelli 12. A elevação dos valores de aminotransferases, principalmente ASAT, pode ter ocorrido devido à coleta ter sido por punção cardíaca, uma vez que, esta enzima é encontrada em grande concentração no coração 6. No que se refere à dosagem de enzimas, vale ressaltar ainda que a metodologia empregada pode determinar variações nos resultados. Consequentemente, a comparação de resultados entre vários estudos mesmo quando se é utilizada a mesma unidade de medida só será possível se forem utilizados os mesmos substratos, ph, e temperatura da reação 16. CONCLUSÃO Alguns parâmetros avaliados neste trabalho mostraram- se discrepantes em relação a outros estudos, demonstrando que fatores como idade, raça dos animais, condições geográficas e a metodologia utilizada para o processamento e obtenção de resultados dos espécimes podem levar a variações intraespécies, confirmando a necessidade de cada biotério determinar seus próprios valores de referência para avaliação da homeostasia e desenvolvimento de doenças durante projetos de pesquisa. HEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERS OF WISTAR RATS FROM PUC - GOIÁS ABSTRACT Countries with a long tradition in the maintenance of bioterium have determined the reference values of their animals in order to evaluate the homeostasis and alterations caused by pathological processes, and these values are now used by bioterium worldwide, but parameters Biochemical and hematological can vary from one animal to another, so it is necessary for each vivarium to obtain its own reference value, since intraspecies variations may exist. The objective of this study was to determine reference values for wistar rats from the PUC-Goiás Bioterium. We used 17 Wistar rats with a mean weight of 344 g, obtained from the sectoral laboratory of PUC-Goiás, and hematological and biochemical parameters were evaluated using EDTA and serum collected. The parameters evaluated were arranged in tables with mean, standard deviation and standard error. For the purpose of comparison, some results obtained in the literature were also presented. Results: In the present study, values were found that deviate from the range of values found in other studies when the averages were observed, among which we have the number of platelets, lymphocytes, neutrophils, eosinophils, Aspartate Aminotransferase (ASAT) and alkaline phosphatase. Some parameters were discrepant in relation to other studies, highlighting the need for each animal to determine its own reference values for homeostasis evaluation and disease development during scientific experiments. KeKeywords: Wistar rats, hematology, biochemistry, reference values. 132 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

35 Florencia Camila Gonçalves, Claudio Quintino de Lima Junior, Clayson Moura Gomes, Graziela Torres Blanch, Sérgio Henrique Nascente Costa, Karlla Greick Batista Dias Penna 1. Chorilli M, Michelin DC, Salgado HR. Animais de Laboratório: o camundongo. Rev Ciênc Farm Básica Apl,. 2007;28(1): Almeida AS, Faleiros ACG, Teixeira DNS, Cota UA, Chica JEL. Valores de referência de parâmetros bioquímicos no sangue de duas linhagens de camundongos. J Bras Patol Med Lab. 2008;44(6): Harkness J, Wagner J. Biologia e clínica de coelhos e roedores. 3 ed. São Paulo: Rocca; Colégio Brasileiro de Experimentação animal (COBEA). Boletim informativo. 2008;3: Pinheiro DCSN, Favali CBF, Filho AAS, Silva ACM, Filgueiras TM, Lima MGS. Parâmetros Hematológicos de Camundongos e Ratos do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará. Bol Inf Cobea. 1997;3(1): Melo MGD, Dória GAA, Serafini MR, Araújo AAS. Valores de referência Hematológicos e Bioquímicos de Ratos ( Rattus novergicus linhagem Wistar ) provenientes do biotério central da Universidade Federal de Sergipe. Sci PLENA. 2012;8(4): Carvalho GD, Paula A, Masseno B, Zanini MS. Avaliação clínica de ratos de laboratório (Rattus novergicus linhagem Wistar ): parâmetros sanitários, biológicos e fisiológicos. Rev Ceres. 2009;56(1): Dantas JA, Ambiel CR, Cuman RKN, Baroni S, Bersani-Amado CA. Valores de referência de alguns parâmetros fisiológicos de ratos do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá, Estado do Paraná. Acta Sci Heal Sci. 2006;28(2): Diniz MFFM, Medeiros IA, Santos HB, Oliveira KM, Vasconcelos THC, Aguiar FB, et al. Padronização dos Parâmetros Hematológicos e Bioquímicos de Camundongos Swiss e Ratos Wistar. Rev Bras Ciências da Saúde. 2006;10(2): Lima CM, Lima AK, Melo MGD, Dória GAA, Leite BLS. Valores de referência hematológicos e bioquímicos de ratos ( Rattus novergicus linhagem Wistar ) provenientes do biotério da Universidade Tiradentes. Sci PLENA. 2014;10(3): Silva L, Oliveira MC de, Junior. SAQM, Witz MI, Allgayer MC. Perfil Hematológico de ratos (Rattus novergicus linhagem Wistar) do Biotério da Universidade Luterana do Brasil Spinelli MO, Junqueira MDS, Bortolatto J. PERFIL BIOQUÍMICO DOS ANIMAIS DE LABORATÓRIO DO BIOTÉRIO DA FACULDADE DE MEDICINA USP. Rev da Soc Bras Ciência em Animais Laboratório. 2012;1(1): Passos LAC. Análise do determinismo genético da resistência de camundongos infectados experimentalmente com a cepa y de Tripanosoma cruzi [Tese]. Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP; Gonzalez FHD, Silva SC. Introdução à Bioquímica Clínica Veterinária Harvey JW. Atlas of Veterinary Hematology Blood and Bone Marrow of Domestic Animals. In Florida: Saunders; Sink CA, Feldman BF. Urinálise e Hematologia Veterinária. 1 ed. São Paulo: Rocca; Lillie L, Temple N, Florence L. Reference values for young normal Sprague-Dawley rats: weight gain, hematology and clinical chemistry. Hum Exp Toxicol. 1996;15(8): Ducan JR, Prasse KW. Patologia Clinica Veterinaria. Apêndice I. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; REFERÊNCIAS RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

36 ARTIGO ORIGINAL FECAL SCORE AND CECUM PROFILE OF WISTAR RATS FED A NOVEL YACON BASED PRODUCT SOURCE OF FRUCTOOLIGOSSACHARIDES/INULIN ISSN Hudsara Aparecida de Almeida Paula 1, Hércia Stampini Duarte Martino 2, Edimar Aparecida Filomeno Fontes 2, Tânia Toledo de Oliveira 2, Mário Jefferson Quirino Louzada 3, Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira 2 ABSTRACT Yacon (Smallanthussonchifolius) is a functional food and its prebiotic activity has recently been emphasized, considering the high concentrations of fructooligosaccharides/ FOS and inulin. The objective of this study was to evaluate different concentrations of FOS/inulin of a yacon-based product (PBY) (0% - control group, 5%, 6%, 7.5% and 10%) on the cecal and fecal profiles in rats. Animal performance (weight gain and feed efficiency ratio) was not affected by increasing the concentration of FOS/inulin in the diets (P>0.05). Animals receiving 6% FOS/inulin in the diet presented the highest concentrations for the Short chain fatty acids acetate and butyrate (P<0.05) in the cecal contents. Higher feces moisture content (55.20% and 58.15%), feces weight (3.95g and 4.59g), relative cecum weight ( and ) and osmotic diarrhea (scores between 2 and 3) were observed in the groups consuming the diets containing 7.5% and 10% FOS/inulin, respectively. Therefore, the addition of the 6% of 6% FOS/inulin from PBY in the diet did not cause gastrointestinal disorders in the cecum of Wistar rats. It is suggested that this concentration could induce functional changes in the host and might be used in in vivo rat models to evaluate specific functional effects of this new functional food product. 1. Federal University of Viçosa-UFV/ Federal University of Alfenas-UNIFAL, Minas Gerais, Brazil; 2. Federal University of Viçosa-UFV, Minas Gerais, Brazil; 3. São Paulo State University Júlio de Mesquita Filho Campus of Araçatuba, São Paulo, Brazil. DATA RECEBIMENTO: 31/08/2017 ACEITO PARA A PUBLICAÇÃO: 14/11/2016 Correspondence should be addressed: Hudsara Aparecida de Almeida Paula hudsarald@gmail.com Keywords: Yacon, inulin-type fructans, cecum, feces, short chain fatty acids INTRODUCTION Yacon (Smallanthus sonchifolius), is a tuberous root of Andean origin considered a functional food and recently its prebiotic activity has been emphasized due to its high contents of fructooligosaccharides (FOS) and inulin 1. The difference between FOS and inulin resides in the number of fructose molecules that make up their molecular chains. In inulin, this number ranges from 2 to 60, while in FOS the chains are smaller and typically range from 2 to 10. Inulin and FOS are also called inulin-type fructans, a generic term used to describe oligo- or polysaccharide prebiotics in which β (2-1) fructosyl-fructose glycosidic bonds dominate 1,2. These bonds give these compounds their unique structural and physiological properties 3. Neither man or animals possess enzymes capable of hydrolyzing these bonds and after consumption, inulin and FOS are selectively fermented in the colon by a group of beneficial bacteria, especially those of the genera Bifidobacterium and Lactobacillus. They act to improve gastrointestinal function, generating organic acids such as lactic acid and other short-chain fatty acids (SCFA) found in the form of acetate, propionate and butyrate 2,3,4 which act differently. 134 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

37 Hudsara Aparecida de Almeida Paula, Hércia Stampini Duarte Martino, Edimar Aparecida Filomeno Fontes, Tânia Toledo de Oliveira, Mário Jefferson Quirino Louzada, Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira The commercial products currently used as prebiotics to make functional foods are usually purified and isolated from roots of chicory and Jerusalem artichoke, and both are expensive. The fact that the yacon root is rich in FOS and can be consumed in natura has increased its popularity as a functional food with the objective of reducing the risk of various types of chronic diseases such as diabetes 5,6, obesity 6, dyslipidemia 7, and osteoporosis 8,9. However, the yacon root in natura has a limited shelf life due to its high water content. Processing of this root is an alternative to increase its shelf life. For this reason a yacon-based product (PBY) was developed with intermediate moisture content, increased shelf-life and high flexibility of use for supplementation of different food matrices. As a new ingredient, the PBY concentrations with functional properties must be evaluated with respect to safety of their consumption. Therefore, in order for the consumption of FOS and inulin prebiotics to benefit the host, especially in regulation of the digestive system 10,11 and improving systemic health 5,6, the dose should be administered so as to promote positive effects without causing gastrointestinal complications such as abdominal distension, flatulence and/or diarrhea. The laxative effect attributed to inulin- -type fructans may be small and difficult to detect except in carefully controlled studies. Concentrations of FOS/inulin which may be administered in the diet is not a topic well discussed in scientific literature. Some studies 12,13 suggest doses that would provide the desired positive effect without gastrointestinal irregularities, but most studies 8,14-18 do not mention the presence of diarrhea even with concentrations of 7.5% and 10% FOS/inulin when using a purified product. In the study conducted by Weaver et al. (2010), utilization of 10% inulin and inulin/fos (purified products) among other types of fibers was proposed, and it was reported that after two weeks of the experiment it was necessary to reduce the fiber content to 5% due to negative changes in the fecal profile. This reinforces the importance of observing the occurrence of adverse effects according to the FOS/inulin concentrations tested, permitting that the best doses be used in subsequent studies. It is therefore necessary to identify the concentration of the prebiotic substance that will promote beneficial effects without causing gastrointestinal disorders such as osmotic diarrhea. Due to the importance of this information for planning intervention studies with prebiotics in the in vivo model, the objective of the present study was to evaluate different concentrations of FOS/inulin in a yacon-based product on the ceacum and feces profiles of Wistar rats. MATERIAL AND METHODS Animals A bioassay was conducted with 15 female Wistar rats (Rattus novergicus, albinus variety), with 30 days of age and an average initial weight of 82.6 g. The animals were obtained from the Central Biotery of the Biological Sciences and Health Center, Federal University of Viçosa, (Viçosa, Minas Gerais, Brazil) and maintained in individual cages with deionized water ad libitum, temperature-controlled environment at 22±2ºC and photoperiod of 12 hours during the 28 days experimental period. Experimental procedures were approved by the Ethics Committee for Animal Research of the Federal University of Viçosa, process no. 55/2011. Experimental Design The study was conducted in a completely by employing a completely randomized design (CRD) with a control (0%) and four concentrations of FOS/inulin in the yacon-based product (5%, 6%, 7.5% and 10%) and three replications, totaling 15 experimental units. Testing doses of FOS/inulin were chosen from scientific studies where gastro intestinal adverse effects were not observed. For analysis of the feces weight, the experiment was performed in a CRD with a split RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,

38 FECAL SCORE AND CECUM PROFILE OF WISTAR RATS FED A NOVEL YACON BASED PRODUCT SOURCE OF FRUCTOOLIGOSSACHARIDES/INULIN plot design, where the plots consisted of the FOS/ inulin concentrations and the subplots were the times for assessment of feces weight. Food consumption, relative weight of the cecum (RW), animal weight gain, cecal ph, feces moisture content, fecal score, and SCFA were evaluated and determined after 28 days of feeding. Experimental Diets and PBY FOS/inulin determination Experimental diets were prepared according to the standard diet for rodents AIN-93G 19 (Table 1). The amount of the PBY added was calculated considering its FOS/inulin composition in order to achieve 5.0%, 6.0%, 7.5% and 10% FOS/ inulin concentration. The control group received the standard diet AIN-93G with no addition of the PBY. The PBY evaluated in this study is a patented process (INPI: ) and contained 19,69% FOS/inulin determined with high performance liquid chromatography (HPLC) according to the methodology of Kaneko et al. 20. In short, it was employed a BIO-RAD HPX 87P column (lead stationary phase), and purified water as the mobile phase. Samples were diluted (1 g in 100 ml of distilled water), centrifuged at 11,269 xg, and then filtered through a Millipore polyvinyl difluoride membrane (PVDF) with 0.22 µm porosity. The samples were then injected into a liquid chromatograph, (Varian, ProStar 410 HPLC Auto Sampler; Varian Inc, USA) with a flow rate of 0.6 ml.min -1 and column temperature of 85ºC (Table 1). Animal performance Food consumption was assessed daily and the animals were weighted once a week. Dietary intake was estimated by the weight of feed supplied and that of the leftover. Weight gain was calculated [weight gain = body weight of the animal at the end of the experiment (g) body weight of the animal at the beginning of the experiment (g)] and Table 1. Composition of the feeding diets. Ingredients* g/100g diet Control 0% FOS/ inulin 5% FOS/ inulin Experimental Diets 6% FOS/ inulin 7.5% FOS/ inulin 10% FOS/ inulin Cornstarch Casein Dextrinizedcornstarch Sucrose Soybeanoil Fiber (microfinecellulose) Mineral mix Vitaminmix L-cystine Cholinebitartrate Yacon-based product - PBY *Based on the composition of AIN-93G (Reeves et al., 1993), the diet indicated for experiments using growing rodents. The yacon-based product used presented the following composition: 14.95% FOS, 4.74% inulin, 9.34% sucrose, 3.01% glucose and 7.87% fructose. The amount of PBY added to the diets and the concentrations of free sugars present in the diet were subtracted from sucrose, maltodextrin and corn starch, at the ratio recommended by the AIN-93G. 136 RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg , 2017

39 Hudsara Aparecida de Almeida Paula, Hércia Stampini Duarte Martino, Edimar Aparecida Filomeno Fontes, Tânia Toledo de Oliveira, Mário Jefferson Quirino Louzada, Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira the Feed Conversion Ratio [FCR = weight gain (g) feed intake (g)], corresponding to the change in body weight per gram of feed consumed 13. Fecal weight (FW), fecal score rate, and humididy The FW and score were monitored daily. For the fecal score th following scale was considered:1. Firm or normal feces consistency; 2. Viscous non-diarrheal feces; 3. Watery feces characteristic of diarrhea (adapted from Freitas et al. 21 ). The representative images of fecal scores used in this study are shown in Figure 1. The moisture content of the feces was measured by pooling the feces from all animals of each treatment group during an eight day period and drying at 105 C according to AOAC 22. Cecum weight (CW), relative cecum weight (RW), ph, and SCFA concentration in the cecal content At the end of this study the animals were euthanized in a carbon dioxide atmosphere. Cecal ph was evaluated in situ by inserting an electrode into the ileocecal junction according to Lobo et al. 23. The cecum was weighed and the relative weight (RW) was calculated according to the equation: [RW = CW (g) final body weight (g)]. The cecal contents were collected in sterile polyethylene plastic bags (Nasco Whirl-Pak ; Nasco, USA). The method for SCFA (acetic, propionic and butyric acids) determination was reported by Smiricky-Tjardes et al. 24. In short, after additions of 500 µl of meta-phosphoric acid 25% to the cecal contents the mix were vortexed and microcentrifuged (model 5804 R; Eppendorf do Brasil, São Paulo-SP), for 30 seconds. After a 30 minute standing at room temperature (± 25ºC) samples were micro centrifuged at x g for 30 minutes The supernatant was transferred to another microcentrifuge tube and centrifuged again for 20 minutes under the same previous conditions. Next, the supernatant corresponding to each sample was separated into individual vials, where an additional 400 µl of meta-phosphoric acid 25% was added followed by freezing at -20ºC. After this step the samples were analyzed in a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (model SPD- 10AVP; SHIMADZU Brazil, São Paulo-SP), coupled to the Ultra Violet detector (UV) using a wavelength of 210 nm; C18 column (reverse phase) (BIORAD; Bio-Rad Laboratories Brazil, Rio de Janeiro) 30 cm x 4.5 mm diameter column, flow rate of 0.8 ml/min, column pressure of 160 kg/cm 2, mobile phase: water in 1% of orthophosphoric acid and injection volume of 20 µl. A B C Figure 1. Representation of the fecal score in Wistar rats that received different concentrations of FOS/inulin in the yacon-based product (Smallanthussonchifolius). A. Score 1 = Firm feces or normal consistency; B. Score 2 = Viscous non-diarrheal feces; C. Score 3 = Watery feces characteristic of diarrhea. RESBCAL, São Paulo, v.5 n.2, pg ,