Palavras-chave: Cão, demodicose, sequenciamento. Keywords: Dog, demodicosis, sequencing.

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1 1 Demodex cornei ENVOLVIDO NA DEMODICOSE GENERALIZADA Demodex cornei INVOLVED IN THE GENERALIZED DEMODICOSE Mayara Aparecida Araujo CAYUELA 1 ; Naiane Domingos GASPARETTO 2 ; Arleana do Bom Parto Ferreira de ALMEIDA 3 ; Valéria Régia Franco SOUSA³; 1 Estudante de graduação em Medicina Veterinária, Bolsista PIBIC/CNPq, Universidade Federal de Mato Grosso, mayaraaacayuela@gmail.com 2 Doutoranda do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso 3 Professora da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso Resumo: A demodicose canina é causada por ácaros do gênero Demodex, sendo representada por três espécies, descritas como Demodex canis, Demodex cornei e Demodex injai. São ácaros diferentes em relação a morfologia e ao local onde permanecem instalados sob o tecido cutâneo, indicando adaptação. Nos cães saudáveis são encontrados vivendo em comensalismo sob o tecido cutâneo sem causar quaisquer lesões. Com base em tais informações, o objetivo do estudo foi identificar a espécie de ácaro do gênero Demodex envolvida na demodicose generalizada em um canino atendido no Hospital Veterinário Universitário de Cuiabá utilizando as técnicas de morfometria e sequenciamento genético. A análise da sequência genômica revelou 98% de homologia com Demodex cornei e Demodex canis. Em relação a morfometria, do comprimento corporal, gnatossoma, podossoma, opistossoma e largura foi feito a média e comparada com o resultado de alguns autores, em média os ácaros foram maiores que os da espécie D. cornei e menores que o D. canis. Não há consenso neste relato em determinar se o D. cornei é realmente uma espécie distinta e está associado ao D. canis ou são uma única espécie com diferenças morfológicas apenas. Talvez seja necessário utilizar um primer quem amplifique outra região do DNA específica para a espécie D. cornei, exigindo mais estudos a respeito. Palavras-chave: Cão, demodicose, sequenciamento. Keywords: Dog, demodicosis, sequencing. Revisão de Literatura: A demodicose canina é uma dermatopatia não contagiosa causada por ácaros do gênero Demodex, que por sua vez estão presentes em pequenas Anais do 38º CBA, p.1792

2 2 quantidades na microbiota cutânea dos cães sem causar quaisquer lesões, assim como em outros mamíferos (TOLEDO, 2009). Nos cães são descritos os seguintes ácaros: Demodex canis, Demodex cornei e Demodex injai. Cada um com suas particularidades distintas, que envolvem algumas diferenças morfológicas e em relação aos sítios de instalação no tecido cutâneo dos cães (IZDEBSKA, 2010; SINGH et al., 2011; SASTRE et al., 2013). Demodex canis é o ácaro mais conhecido e estudado, é encontrado nos folículos pilosos e glândulas sebáceas, sua estrutura corporal é em formato vermiforme. Demodex cornei fica localizado no estrato córneo da epiderme, sua estrutura corporal é curta, ao contrário do Demodex injai que tem o corpo mais alongado e pode ser encontrado em glândulas sebáceas e seus ductos. A morfologia de cada ácaro Demodex juntamente com os diferentes locais de instalação na superfície cutânea indicam que cada espécie tomou uma estratégia de adaptação diferente para manter seu cliclo biológico (IZDEBSKA, 2010; PEREIRA et al., 2013). Em pequenas quantidades esses ácaros não comprometem a integridade da pele, entretanto, em casos de imunossupressão proliferaram-se exageradamente e causam lesões cutâneas de caráter inflamatório. Os sinais clínicos dermatológicos podem se manifestar como seborréia, alopecia, caspas foliculares, pústulas, eritema, hiperpigmentação, comedões, crostas, ulceração, prurido, infecções secundárias podem estar envolvidas agravando o quadro clínico (LEITÃO e LEITÃO, 2008). Com base na distribuição das lesões e idade de surgimento dos sinais a demodicose pode ser classificada como localizada ou generalizada. Na forma localizada o curso clínico é mais benigno, porém quando as lesões são mais numerosas e severas, afetando várias áreas da pele ou toda extensão corporal, é a forma generalizada da demodicose (CURY et al., 2013; FERNANDES, 2016). Descrição do Caso: Um canino, fêmea, de 10 meses de idade, sem raça definida, castrada, com histórico de dermatose há quatro meses, foi atendida no Hospital Veterinário Universitário. Na avaliação dermatológica foi constatada pápulas, pústulas, eritema, crostas e hiperpigmentação, além das áreas de alopecia, na região da cabeça, pescoço, membro torácico, membro pélvico, tórax, dorso, períneo, com descamação Anais do 38º CBA, p.1793

3 3 localizada e prurido intenso classificado em oito pelo proprietário, em uma escala de zero a dez. Diante da suspeita clínica de demodiciose, foi realizado o raspado profundo de pele segundo Georgi et al. (1988), para a avaliação microscópica afim de detectar a presença de ácaros e biopsia cutânea com punch 3mm de diâmetro de acordo com Gasparetto et al. (2013). Posteriormente, foi realizada a morfometria de acordo com Chesney (1999), de dez ácaros aleatórios da mesma lâmina, e fez-se a média do comprimento corporal (174,518 µm), gnatossoma (20,809 µm), podossoma (113,262 µm), opistossoma (96,679 µm) e a largura (37,715 µm). Adicionalmente foram contados quatro ovos, seis larvas, seis ninfas e vinte e três adultos. Do fragmento de pele extraiu-se o DNA pelo método fenol/clorofórmio/álcool isoamilíaco (GOMES et al., 2007). A reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando os primers foward ACTGGTGCTAAGGTAGCGAAGTCA e reverse TCAAAAGCAACATCGAG que amplificam a porção 16S ribossomal DNA para Demodex sp. (BERNSTEIN et al., 2014). O produto obtido foi purificado com o kit GFX tm PCR DNA e sequenciado no Sanger Sequencing (Applies Biosystems Genetic Analysis). As sequências obtidas foram depositadas no GenBank e comparadas com as sequências de diferentes espécies de Demodex depositadas no GenBank utilizando o programa BLAST. E como resultado 98% de homologia para o Demodex cornei assim como para o Demodex canis, respectivamente com acesso HE e JF no GenBank. Discussão: Em 1993 foi descrito o mais recente ácaro do gênero Demodex, denominado de Demodex cornei. Caracterizado por ser uma ácaro pequeno com dimensão corporal de 90 a 148 µm. Possui algumas particularidades, seu opistossoma é mais curto e arredondado, abertura do poro genital localizada entre a quarta placa coxoesternal, e habita o estrato córneo da epiderme dos cães (LEITÃO e LEITÃO, 2008; MOTA, 2010; RAVERA, 2015, FERNANDES, 2016). A patogenicidade pela infecção por D. cornei ainda não foi esclarecida, levando a crer que possa ser semelhante ao D. canis. Aparentemente o D. canis é o ácaro mais prevalente envolvido na demodicose canina, entretanto tem-se a Anais do 38º CBA, p.1794

4 4 possibilidade de co-infecção entre essas duas espécies (CHESNEY, 1999; FERNANDES, 2010; MOTA, 2010). Fourie (2015) cita que o D. cornei está associado com a demodicose generalizada, causando prurido e dermatite escamosa. Similar ao caso, onde a demodicose da cadela era generalizada e clinicamente apresentava alopecia, prurido intenso e áreas localizadas de descamação, além das outras alterações dermatológicas citadas. Rojas et al. (2012) em seu estudo propuseram que as espécies do gênero Demodex nada mais são do que variações morfológicas do D. canis. Para tal conclusão ele avaliou a morfometria dos ácaros e também realizou estudo com marcadores moleculares a partir da sequência mitocondrial 16S rdna e pela Citocromo Oxidase I, e constatou realmente que são ácaros distintos morfologicamente, porém ao sequenciar o genoma não houveram diferenças claras entre as espécies. Assim como foi feito para determinar a espécie de Demodex neste cão, comparando com a técnica utilizada pelo autor, o marcador molecular 16S rdna não foi capaz de distinguir as duas espécies, ambas tiveram 98% de homologia, talvez o uso de um primer mais específico quem amplifique outra região do genoma, seja mais eficiente. Os resultados da morfometria demonstraram que os ácaros são maiores que as medidas médias para D. cornei e menores que D. canis, em relação ao comprimento, podossoma e opistossoma, porém o gnatossoma com 20,809 µm teve a medida mais próxima, ao comparar aos resultados de Chesney (1999) com 19,0 µm, e Izdebska e Fryderyk (2011) com 19,9 µm - 19,1 µm, para Demodex cornei. Não se encaixando totalmente aos valores estabelecidos, apesar da proximidade. Conclusão: Pelo estudo molecular foi identificada homologia similar com as duas espécies, D. cornei e D. canis, envolvidas na demodicose generalizada deste canino. Possivelmente na demodicose desse canino essas espécies estão associadas ou são uma espécie única, sendo necessários mais estudos. Referências: BERNSTEIN, J. A.; FRANK, L. A.; A. KANIA, S. A. PCR amplification and DNA sequence identification of an unusual morphological form of Demodex cati in a cat. Veterinary Dermatology, Anais do 38º CBA, p.1795

5 5 CHESNEY, C. J. Short form of Demodex species mite in the dog: occurrence and measurements. Journal of Small Animal Practice, v. 40, p , CURY, G. M. M.; PEREIRA, S. T.; BOTONI, L. S.; PEREIRA, R. D. O.; TELLES, T. C.; FERREIRA, A. P.; COSTA-VAL, A. P. Daignosis of canine demodicosis: comparative study between hair plucking and adhesive tape tests. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v. 20, p , FERNANDES, D. F. Predisposição para o aumento na presença de Demodex spp. na pele de cães adultos f. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias. Porto Alegre FOURIE, J. J.; LIENBENBERG, J. E.; HORAK, I. G.; TAENZLER, J.; HECKEROTH, A.; FRÉNAIS, R. Efficacy of orally administered fluralaner (BravectoTM) or topically applied imidacloprid/moxidectin (Advocate ) against generalized demodicosis in dogs. Parasites & Vectors, v. 8, p. 187, GASPARETTO, N. D.; TREVISAN, Y. P. A.; ALMEIDA, N. B.; NEVES, R. C. S. M.; ALMEIDA, A. B. P. F.; DUTRA, V.; COLODEL, E. M.; SOUSA, V. R. F. Prevalência das doenças de pele não neoplásicas em cães no município de Cuiabá, Mato Grosso. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 33, n. 3, p , GEORGI, J.R.; GEORGI, M.E. Parasitologia Veterinária. 4ª ed., Ed. Manole, p. GOMES, A. H. S.; FERREIRA, I. M. R.; LIMA, M. L. S. R.; CUNHA, E. A.; GARCIA, A. S.; ARAÚJO, M. F. L.; PEREIRA-CHIOCCOLA, V. L. PCR identification of Leishmania in diagnosis and control of canine leishmaniasis. Veterinary Parasitology, v. 144, p , IZDEBSKA, J. N. Demodex sp. (Acari, Demodecidae) and demodecosis in dogs: characteristics, symptoms, occurrence. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, n. 54, p , IZDEBSKA, J. N.; FRYDERYK, S. Diversity of Three Species of the Genus Demodex (Acari, Demodecidae) Parasitizing Dogs in Poland. Polish Journal of Environmental Studies, v. 20, n. 3, p , LEITÃO, J. P. A.; LEITÃO J. P. A. Demodicose canina. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, v. 103, n , p , Anais do 38º CBA, p.1796

6 6 MOTA, T. E. B. Demodicose canina aspectos da sua abordagem terapêutica f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Técnica de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa, PEREIRA, J. S.; COELHO, W. A. C.; FONSECA, Z. A. A. S.; COSTA, A. C.; NASCIMENTO, J. O.; AGUIAR, K. C. S.AHID, S. M. M. Morfometria em ácaros Demodex canis recuperados de Canis familliares (Linnaeus, 1758) no norte, Brasil. Acta Veterinaria Brasilica, v. 7, n. 1 p , SASTRE, N.; RAVERA, I.; ALTET, L.; SÁNCHES, A.; BARDAGÍ, M.; FRANCINO, O.; FERRER, J. Development of a PCR technique specific for Demodex injai in biological specimens. Parasitology Research, n. 112, p , RAVERA, I. Deconstructing canine demodicosis f. Tese (Doutorado) Universitat Autònoma de Barcelona, Departament de Medicina i Cirurgia Animals, ROJAS, M.; RIAZZO, C.; CALLEJÓN, R.; GUEVARA, D.; CUTILLAS. Molecular study on three morphotypes of Demodex mites (Acarina: Demodicidae) from dogs. Parasitology Research, v. 111, p , SCOTT, D. W.; MILLER, W. H.; GRIFFIN, C. E. Muller & Kirk Dermatologia de Pequenos Animais. 5th. ed. Interlivros, 1996, 1130 p. SINGH, S. K.; MRITUNJAY KUMAR; JADHAV, R. K.; SAXENA S. K. An Update on Therapeutic Management of Canine Demodicosis. Veterinary World, v.4, n.1, p , TOLEDO, F. G. Demodiciose Canina f. Trabalho de conclusão de curso (Graduação em Medicina Veterinária) Centro Universitário das Faculdades Metropolitanas Unidas-UniFMU, São Paulo, Anais do 38º CBA, p.1797