PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE TRAQUEOCENTESE PARA OBTENÇÃO DO LAVADO TRAQUEOBRÔNQUICO E CITOLOGIA DO TRATO RESPIRATÓRIO DE OVINOS SADIOS

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1 PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE TRAQUEOCENTESE PARA OBTENÇÃO DO LAVADO TRAQUEOBRÔNQUICO E CITOLOGIA DO TRATO RESPIRATÓRIO DE OVINOS SADIOS ANUÁRIO DA PRODUÇÃO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DISCENTE Vol. XII, Nº. 14, Ano 2009 Simone Nascimento da Silva Brenda Barcelos RESUMO Professora Orientadora: Dra. Viviani Gomes Curso: Medicina Veterinária CENTRO UNIVERSITÁRIO ANHANGUERA UNIDADE LEME Trabalho apresentado no 9º Congresso Nacional de Iniciação Científica - CONIC. Trabalho apresentado no Evento Interno de Iniciação Científica Anhanguera Educacional S.A. Correspondência/Contato Alameda Maria Tereza, 2000 Valinhos, SP - CEP rc.ipade@unianhanguera.edu.br pic.ipade@unianhanguera.edu.br Coordenação Instituto de Pesquisas Aplicadas e Desenvolvimento Educacional - IPADE Publicação: 10 de maio de 2010 As infecções respiratórias ocorrem com freqüência em ovinos, os quais compreendem uma espécie freqüentemente utilizada como modelo de doenças respiratórias na medicina humana. Entretanto, na literatura há poucas informações referentes à parâmetros celulares do trato respiratório de animais hígidos. Além disso, existem diversas técnicas de colheita para obtenção do lavado traqueobrônquico, e não existem trabalhos com a utilização de cateter para punção traqueal. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os tipos celulares presentes no lavado traqueobrônquico, através de punção traqueal, estabelecendo valores de referência dos parâmetros avaliados. Foram utilizadas 10 fêmeas hígidas adultas da raça Santa Inês. Os animais passaram por triagem após exclusão de afecções respiratórias através da realização de exame físico, hemograma e exame parasitológico de fezes. As fêmeas foram submetidas a jejum sólido e hídrico antes da realização das colheitas. Para a realização do lavado, os animais foram contidos em decúbito lateral, após, realizou-se tricotomia e antissepsia do terço médio da região cervical. Foi introduzida uma cânula na pele entre os anéis traqueais atingindo o lúmen da traquéia, através desta cânula foi introduzido um cateter de 20 cm até alcançar a região da carina. Através do cateter foram introduzidos 50 a 60 ml de solução fisiológica estéril 0,9%, que foram imediatamente aspirados por meio de sucção leve por seringa. Os lavados foram encaminhados ao laboratório para realização do exame bacteriológico e citocentrifugação. Obteve-se sucesso na colheita do lavado traqueobrônquico dos animais, seguido dos valores médios relativos de 3,6% de linfócitos, 4,0% de neutrófilos e 92,4% de macrófagos e células epiteliais. Palavras-Chave: sistema respiratório; lavado traqueobrônquico; citologia; modelo animal; ovelhas. Trabalho realizado com o incentivo e fomento da Anhanguera Educacional S.A. 7 ANUIC_N14_miolo.pdf 7 7/6/ :16:50

2 8 Padronização da técnica de traqueocentese para obtenção do lavado traqueobrônquico e citologia do trato respiratório de ovinos sadios 1. INTRODUÇÃO As infecções respiratórias ocorrem com freqüência em ovinos. Em muitos países, a doença respiratória constitui-se um dos mais sérios problemas na criação desses animais, em decorrência das perdas econômicas oriundas de mortes, redução no ganho de peso, pobre conversão alimentar, aumento da taxa de descarte, além de gastos com medicamentos e honorários veterinários (MARTIN, 1996). Em estudo realizado na Índia, no período de 1985 a 1994, Peer et al. (1998) estudando as possíveis causas de mortalidade em ovinos, de diversas faixas etárias, observaram que a maioria das mortes ocorreu em decorrência de alterações respiratórias e digestivas, respectivamente. Peeler e Wanyangu (1998) investigando as possíveis causas de mortalidade em ovinos descritas na literatura verificaram que, na maioria dos trabalhos, as principais causas de mortalidade em ovinos foram atribuídas às doenças respiratórias. A tecnificação do sistema de criação de ovinos alocando um grande número de animais em uma reduzida área predispõe esta espécie às enfermidades respiratórias. Outros fatores que também contribuem de forma primordial para o aparecimento de injúrias respiratórias são: a introdução de novos animais ao rebanho sem a prévia quarentena, higiene e desinfecção das instalações, época do ano, transporte de animais, fonte de alimento e de água, idade, raça, além de doenças intercorrentes (ROBINSON, 1993). O sistema respiratório possui um eficiente sistema de defesa inespecífico baseado na atividade ciliar, produção de muco e fagocitose, bem como apresenta um sistema de defesa específico, o qual inclui a resposta humoral e a mediada por células. Entretanto, é um dos mais vulneráveis a injúrias, quando comparado a outros sistemas orgânicos, em decorrência da sua exposição a numerosas partículas com potencial nocivo, tais como vírus, bactérias, agentes alérgenos, físicos e químicos. Dependendo da agressividade do agente e da susceptibilidade do hospedeiro, os mecanismos de defesa do aparelho respiratório podem não ser suficientes, possibilitando a instalação de determinadas enfermidades (CARLTON et al., 1998). Dentre as principais enfermidades que acometem o trato respiratório de ovinos podemos citar àquelas causadas por vírus, incluindo o parainfluenza tipo 3, adenovírus e reovírus, que semelhantes à micoplasmose podem predispor a colonização pulmonar por bactérias, principalmente a Pasteurella haemolytica e a Bordetella. (MARTIN, 1996). Infecções causadas por parasitas como o Dictyocaulus filaria, Muellerius capillares e Protostrongylus ANUIC_N14_miolo.pdf 8 7/6/ :16:50

3 Simone Nascimento da Silva, Brenda Barcelos 9 rufescens também contribuem para o aparecimento de alterações no trato respiratório de ovinos. Os ovinos são freqüentemente utilizados como modelo de doenças respiratórias (asbestose, alergias e enfisema) na medicina humana, todavia, há poucas informações na literatura sobre parâmetros celulares normais do trato respiratório nessa espécie, podendo dificultar a correta interpretação dos resultados obtidos nessas pesquisas (COLLIE et al., 1999). O diagnóstico de afecções respiratórias exige, em muitas situações, além do exame físico, a utilização de exames complementares, como o lavado traqueobrônquico, que permitem avaliar as alterações citológicas, decorrentes de enfermidades pulmonares causadas pelos mais diversos agentes etiológicos (BURRELS; SURTHERLAND, 1994). O lavado traqueobrônquico é umas das técnicas mais utilizadas com o objetivo de obtenção do conteúdo das secreções provenientes das vias aéreas distais (FERNANDES, 2000) e a técnica de obtenção do lavado traqueobrônquico, por punção traqueal, foi extensivamente utilizada como um meio auxiliar de diagnóstico em eqüinos com suspeita de doenças do trato respiratório (MANSMANN; STROUSS, 1976; BEECH, 1991; LARSON; BUSCH, 1985; SWEENEY et al., 1992) e adaptada para o uso em outras espécies domésticas: canina (BOWER, 1977), felina (O BRIEN, 1983) e a bovina (GONÇALVES, 1987; BARROS et al., 1994; GONÇALVES, 1997), comprovando-se a sua simplicidade, confiabilidade e baixo custo. Outros pesquisadores concordam com as vantagens da técnica de obtenção do lavado traqueobrônquico por punção traqueal, todavia, também observaram que essa técnica pode, raramente, ocasionar complicações secundárias, tais como celulite no local da incisão, enfisema subcutâneo, corpo estranho em vias aéreas em função de ruptura do cateter junto à agulha e laceração da cartilagem traqueal (MASMANN; KINIGHT, 1972; BEECH, 1991; WILSON; LOFSTEDT, 1993). Marcondes e Gonçalves (2008), que utilizaram a técnica de colheita por sondagem nasotraqueal para verificar a proporção celular do trato respiratório, obtiveram as seguintes proporções celulares: 1,44% de linfócitos, 20,04% de neutrófilos, 0,77% de eosinófilos e 77,75% de macrófagos e células epiteliais. Gonçalves et al. (2004), obtiveram lavados traqueobrônquicos por sondagem nasotraqueal em bezerros e determinaram a seguinte proporção celular: 1,8% de linfócitos, 6% de neutrófilos e 87,10 de macrófagos e células epiteliais. ANUIC_N14_miolo.pdf 9 7/6/ :16:50

4 10 Padronização da técnica de traqueocentese para obtenção do lavado traqueobrônquico e citologia do trato respiratório de ovinos sadios Fernandes et al. (2000) realizaram lavados traqueobrônquicos em cavalos hígidos, utilizando a técnica de traqueocentese e encontraram os valores relativos de 2,91% de linfócitos, 87,26% de macrófagos e células epiteliais, 8,92% de neutrófilos, 0,15% de mastócitos e 0,76% de eosinófilos. Apesar da sua importância para o diagnóstico das enfermidades respiratórias de ovinos, nenhum trabalho foi encontrado na literatura com relação à colheita de lavado traqueobrônquico através da técnica de traqueocentese, em ovinos sadios ou com doenças respiratórias. 2. OBJETIVO Em face da importância das doenças respiratórias na criação de ovinos, que são utilizados como modelo experimental para doenças respiratórias na medicina humana, e a escassez de pesquisas relacionadas aos métodos auxiliares de diagnóstico de afecções respiratórias, este trabalho teve como objetivo avaliar citologicamente os tipos celulares presentes nos lavados traqueobrônquicos de ovinos sadios da raça Santa Inês, através de punção traqueal. 3. METODOLOGIA Animais utilizados Foram utilizadas 10 fêmeas adultas da raça Santa Inês, com idade compreendida entre 02 a 05 anos. Triagem dos animais As fêmeas ovinas utilizadas nesta pesquisa foram submetidas aos seguintes exames: a) Exame Físico: para assegurar o estado de higidez dos animais. b) Hemograma completo. c) Exame parasitológico de fezes. d) Exame bacteriológico do lavado traqueobrônquico. Obtenção do Lavado traqueobrônquico Foi utilizada a técnica de traqueocentese, padronizada após revisão literária de estudos realizados com eqüinos e bezerros (GONÇALVES et al., 2004; FERNANDES et al., 2000). ANUIC_N14_miolo.pdf 10 7/6/ :16:50

5 Simone Nascimento da Silva, Brenda Barcelos 11 Citologia do lavado traqueobrônquico Foi realizada através de citocentrifugação de uma alíquota (200 µl) do lavado e posterior coloração da impressão celular através da técnica de Rosenfeld (1947) (COLLIE et al., 1999). 4. DESENVOLVIMENTO Padronização da Técnica. a) Animais utilizados Para a padronização da técnica foram utilizadas 07 fêmeas adultas da raça Santa Inês. b) Triagem dos Animais As fêmeas ovinas utilizadas nesta pesquisa foram submetidas aos seguintes exames: Exame Físico: foi realizado o exame físico das fêmeas para assegurar o estado de higidez dos animais. Hemograma. Exame parasitológico de fezes para detecção e exclusão das pneumonias verminóticas. Exame bacteriológico do lavado traqueobrônquico para exclusão de infecções bacterianas. c) Posição dos Animais durante a Colheita Os animais foram submetidos ao jejum sólido de 24 horas e hídrico de 06 horas, pois o decúbito lateral foi à posição utilizada para a contenção dos animais e colheita dos lavados traqueobrônquicos, evitando assim, episódios de timpanismo gasoso durante o procedimento. Nas 5 primeiras tentativas optou-se por modificar a posição do pescoço e cabeça dos animais, a fim de obter o lavado traqueobrônquico em quantidade suficiente para a realização da citologia. Obtendo-se sucesso na colheita do lavado traqueobrônquico do sexto e sétimo animal. d) Colheita do lavado traqueobrônquico por traqueocentese Após a contenção das ovelhas em decúbito-lateral, realizou-se a tricotomia de uma área de 10x5 cm do tecido cutâneo, no terço médio da região cervical da traquéia, seguido de antissepsia com iodo degermante e álcool 70%. Utilizando-se luvas cirúrgicas estéreis foi introduzida uma agulha de 14 gauge estéril, que ultrapassou a pele e em seguida a ANUIC_N14_miolo.pdf 11 7/6/ :16:50

6 12 Padronização da técnica de traqueocentese para obtenção do lavado traqueobrônquico e citologia do trato respiratório de ovinos sadios traquéia no espaço entre dois anéis traqueais. Após este procedimento, um cateter de polietileno estéril foi introduzido por dentro da agulha até aproximadamente a bifurcação traqueal, momento em que foi produzida tosse no animal pela movimentação do cateter ou por compressão dos primeiros anéis da traquéia. Na primeira colheita foi realizado o exame radiográfico da região traqueal até a sua bifurcação, para padronização do comprimento do cateter, que deveria atingir a região anatomicamente denominada carina, obtendo-se sucesso com cateter de 20cm de comprimento. Posteriormente, foram injetadas cinco a seis alíquotas de 10 ml, totalizando o volume máximo de 60 ml de solução salina à 0,9%. Sendo o conteúdo recuperado posteriormente com seringas de 60 ml (GONÇALVES et al., 2004). O lavado traqueobrônquico foi acondicionado em frascos estéreis Falcon e mantido sob refrigeração até o momento do processamento, que não ultrapassou quatro horas após a colheita (MORI, 2000). e) Citologia do lavado traqueobrônquico Alíquota de 200µL do lavado traqueobrônquico foi submetida a uma velocidade determinada de 28g, durante 6 minutos em citocentrífuga REFRIGERADA, obtendo impressão celular de 6mm de diâmetro (SANCHES, 1998; MORI, 2000). As lâminas foram confeccionadas em duplicata e após, fixadas em álcool metílico e coradas pelo método de Rosenfeld (1947). Estas lâminas foram avaliadas em microscopia óptica de imersão, quantificando-se 100 células por lâmina e classificando-as em neutrófilo, macrófago e célula epitelial, eosinófilo, mastócito e linfócito (MORI, 2000). Análise estatística Os resultados obtidos apresentaram distribuição paramétrica, sendo calculadas as médias dos tipos celulares encontrados nos lavados traqueobrônquicos. 5. RESULTADOS Obteve-se sucesso na padronização da técnica de colheita do lavado traqueobrônquico com o volume de 6 a 10mL de liquido turvo e espumoso caracterizando presença citológica confirmada pela citocentrifugação, coloração das impressões em lâmina e avaliação microscópica dos lavados. A análise citológica dos lavados apresentou os seguintes valores relativos médios: 3,6% de linfócitos, 4,0% de neutrófilos e 92,4% de macrófagos e células epiteliais. Em função da semelhança entre as células epiteliais alveolares e macrófagos, optou-se por agrupar estas células, evitando interpretações morfológicas incorretas. ANUIC_N14_miolo.pdf 12 7/6/ :16:50

7 Simone Nascimento da Silva, Brenda Barcelos CONSIDERAÇÕES FINAIS Com a padronização da técnica de colheita de lavado traqueobrônquico de ovelhas por traqueocentese, obteve-se eficiência na obtenção de volume adequado de lavado para a realização da citocentrifugação e determinação da citologia da região broncopulmonar. A proporção das células do trato respiratório de ovelhas da raça Santa Inês obtida através do lavado traqueobrônquico por traqueocentese foi de 3,6% de linfócitos, 4,0% de neutrófilos e 92,4% de macrófagos e células epiteliais. Estes resultados diferem dos resultados obtidos por Marcondes e Gonçalves (2008), que utilizaram a técnica de colheita por sondagem naso-traqueal para verificar a proporção celular do trato respiratório. Os retro-referidos autores obtiveram os seguintes resultados: 1,44% de linfócitos, 20,04% de neutrófilos, 0,77% de eosinófilos e 77,75% de macrófagos e células epiteliais. Os diferentes resultados obtidos podem ser decorrentes de: a) diferentes técnicas empregadas nas duas pesquisas; b) a raça utilizada nesta pesquisa foi Santa Inês e os retro-referidos autores utilizaram animais sem raça definida ; c) os retro-referidos autores utilizaram fêmeas e machos, e neste trabalho foram triadas apenas fêmeas. No entanto, os resultados parciais obtidos foi semelhante aos encontrados por Gonçalves et al. (2004), que obteveram lavados traqueobrônquicos por sondagem nasotraqueal em bezerros. A proporção celular encontrada foi de 1,8% de linfócitos, 6% de neutrófilos e 87,10 de macrófagos e células epiteliais. Fernandes et al. (2000) realizaram lavados traqueobrônquicos em cavalos hígidos, utilizando a técnica de traqueocentese e encontraram os valores relativos de 2,91% de linfócitos, 87,26% de macrófagos e células epiteliais, 8,92% de neutrófilos, 0,15% de mastócitos e 0,76% de eosinófilos. Os resultados obtidos pelos retro-referidos autores são semelhantes ao encontrado na presente investigação. O valor de linfócitos da presente pesquisa foi superior aos citados nas pesquisas de Marcondes e Gonçalves (2008), Fernandes et al. (2000) e Gonçalves et al. (2004), provavelmente porque alguns núcleos podem ter sido desprendidos das células epiteliais alveolares e contados como linfócitos, em função da sua semelhança morfológica. É possível que a divergência dos resultados desta pesquisa esteja relacionada ao manejo dos animais utilizados nas diferentes pesquisas. Os autores (MARCONDES; GONÇALVES, 2008) sugeriram que a alta proporção de neutrófilos obtida em sua pesquisa pode ter sido determinada ao hábito de pastejo extensivo e tipo de manejo dos ovinos, que recebem ração pulverulenta e são mantidos em ambientes fechados e com cama, facilitando a inalação e instalação de agentes patogênicos e alérgenos ambientais, ANUIC_N14_miolo.pdf 13 7/6/ :16:50

8 14 Padronização da técnica de traqueocentese para obtenção do lavado traqueobrônquico e citologia do trato respiratório de ovinos sadios que aumenta o aporte de células de defesa, como os neutrófilos, para o lúmem traqueobrônquico. Ao contrário, os animais da presente pesquisa são criados em sistema de produção extensivo, em ambiente aberto. REFERÊNCIAS BARROS, M.S.R.M.; CASTRO, R.S.; TABOSA, J.H.; BRITO, M.F.; AMARAL, B. Colheita do fluido brônquio-alveolar de bezerros através de traqueocentese transcutânea. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.46, n.1, p.41-9, BEECH, J. Traqueobronchial aspirates. In:. Equine respiratory disorders. Philadelphia: Lea & Febiger, 1991a, p Infections caused by viruses. In:. Equine respiratory disorders. Philadelphia: Lea & Febiger, 1991b, p BOWER, J.D. A pulmonary diagnostic technique. California Veterinarian, v.10, p.11-3, BURRELS, C.; SUTHERLAND, A.D. Phenotypic analysis of lymphocytes obtained by broncoalveolar lavage of normal sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology, v.40, p.85-90, CARLTON, W.W.; McGAVIN, M.D. Patologia Veterinária Especial de Thomson. 2. ed. Porto Alegre: AtMed, p COLLIE, D.D.S.; BAKER, A.; MAUCHLINE, S.; PORTEOUST, D.; McLACHLAN, G. Ovine bronchoalveolar lavage cellularity: reproducibility and the effect of multiple repeated lavage. Research in Veterinary Science, n.67, p , FERNANDES, W.R.; MORI, E.; SANCHES, A. Avaliação citológica de lavados traqueobrônquico e broncoalveolar em cavalos clinicamente sadios pelo método de coloração Rosenfeld. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v. 52, n.6, dez GONÇALVES, R.C. Estudo da flora bacteriana traqueobronquica em bezerros clinicamente sadios e portadores de pneumonia bacteriana na região de Botucatu- São Paulo f. Tese (Mestrado). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu.. Estudo clínico e citológico em bezerros clinicamente sadios e portadores de broncopneumonia moderada e grave- o lavado traqueobrônquico como complemento diagnóstico f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Paulista, Botucatu. GONÇALVES, R.C.; MATTOS, M.C.F.I.; KUCHEMBUCK, M.R.S.; LOPES, R.S.; BORGES, A.S. Lavagem traqueobrônquica por sondagem nasotraqueal em bezerros. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.56, n.3, p , LARSON, V.L.; BUSCH, R.H. Equine traqueobronchial lavage: comparision of lavage cytology and pulmonary histopathologic findings. American Journal Veterinary Research, v.46, n.11, p.144-6, MANSMANN, R.A.; KNIGHT, H.D. Tracheal aspiration in the horse. Journal American Veterinary Medical Association, v.160, n.11, p , MANSMANN, R.A.; STROUSS, A.A. A evoluation of trantracheal aspiration in the horse. Journal American Veterinary Medical Association, v.169, n.6, p.631-3, MARCONDES, J.S., GONÇALVES, R.C. Metodologia da colheita de células do trato respiratório em ovinos sadios através da técnica de lavagem traqueobrônquica por via nasotraqueal. Ciência Animal Brasileira, v.9, n.2, p , abr./jul MARTIN, W.B. Respiratory infections of sheep. Comp. Immun. Microbiol. Infection Disease. v.19, n.3, p , ANUIC_N14_miolo.pdf 14 7/6/ :16:50

9 Simone Nascimento da Silva, Brenda Barcelos 15 MORI, E. Avaliação da função dos macrófagos alveolares após infecção experimental em cavalos (Equus cabalus-linnaeus, 1758) por herpesvírus eqüino tipo 1 (HVE-1) f. Dissertação (Mestrado)- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. O BRIEN, S.E. Transtracheal aspiration in dogs and cats. Modern Veterinary Practice, v.64, n.5, p.412-3, PEELER, E.J.; WANYANGU, S.W. Infections causes of small ruminant mortality in Kenya: a review. Small Ruminant Research, n.29, v.1, p.1-11, PEER, M.S.; SUDHAN, N.A.; RISAM, K.S.; KIRMANI, M.A. Preweaning lamb mortality pattern at an organised sheep farm under temperate conditions of Kashmir. Indian Veterinary Journal, v.75, n.1, p.46-48, ROSENFELD, G. Corante pancrônico para hematologia e citologia clínica. Nova combinação dos componentes do May-Gruwald e do Giemsa num só corante de emprego rápido. Memórias do Instituto Butantan, v.20, p , ROBINSON, R.A. Respiratory Disease of sheep and goats. Veterinary Clinics of North America: Large Animal Practice, v.5, n.3, nov SANCHES, A. Avaliação citológica do lavado traqueobrônquico de eqüinos clinicamente sadios e daqueles portadores de afecções do sistema respiratório f. Dissertação (Mestrado)- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo. SWEENEY, C.R.; ROSSIER, Y.; ZIEMER, E.L.; LINDBORG, S. Effects of lung site and fluid volume on results on bronchoalveolar lavage fluid analisys in horses. American Journal Veterinary Research, v.53, n.8, p , WILSON, W.D.; LOFSTEDT, J. Alterações na função respiratória. In: SMITH, B.P. Tratado de medicina interna de grandes animais. São Paulo: Manole, 1993, v.1, p ANUIC_N14_miolo.pdf 15 7/6/ :16:50

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