DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINA M1 EM LEITE BOVINO IN NATURA

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1 DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINA M1 EM LEITE BOVINO IN NATURA L. Gonçalves 1, A. Dalla Rosa 2, S. L. Gonzalez 3, M. M. C. Feltes 4, E. Badiale-Furlong 5, G. C. Dors Departamento de Alimentos Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia CEP: Concórdia SC Brasil, Telefone: (55-49) Fax: (55-49) (luana_g@hotmail.com.br). 2 - Departamento de Alimentos Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia CEP: Concórdia SC Brasil, Telefone: (55-49) Fax: (55-49) (andreia.dallarosa@ifc-concordia.edu.br). 3 - Departamento de Alimentos Instituto Federal Catarinense, Campus Concórdia CEP: Concórdia SC Brasil, Telefone: (55-49) Fax: (55-49) (samantha.lemke@concordia.ifc.edu.br). 4 - Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Santa Catarina- CEP: Florianópolis SC Brasil, Telefone: (55-48) (manuela.feltes@ufsc.br). 5 Escola de Química e Alimentos Universidade Federal de Rio Grande, CEP: Rio Grande RS Brasil, Telefone: (55-53) (dqmebf@furg.br) 6 - Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial Universidade Federal de Pelotas, Campus Capão do Leão -Caixa Postal 354 CEP: Pelotas RS Brasil, Telefone: (55-53) (dorsgi@yahoo.com.br). RESUMO A aflatoxina M 1 (AFM 1) em leite provém da biotransformação da aflatoxina B 1 (AFB 1) após a ingestão, pelo animal, de ração ou silagem contaminada. O objetivo deste trabalho foi determinar aflatoxina M 1 em amostras de leite bovino in natura coletados na microrregião de Concórdia, Santa Catarina. Um total de 20 amostras foram analisadas utilizando o método QuEChERS para extração, seguidas de cromatografia de camada delgada (CCD) para verificar a presença ou ausência de aflatoxina M 1 e cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência (CLAE-FL) para confirmação e quantificação. Todas as amostras apresentaram contaminação com aflatoxina M 1, sendo que 80% apresentaram níveis acima do limite permitido pela legislação brasileira (0,5 g L -1 ). Estes resultados indicam a importância de implantação de boas práticas de fabricação e armazenamento para os alimentos destinados à nutrição das vacas leiteiras. ABSTRACT The aflatoxin M 1 (AFM 1) in the milk comes from the biotransformation of the aflatoxin B 1 (AFB 1) after the intake by the animal of contaminated feed or silage. This way, the objective was to determine aflatoxin M 1 in samples of bovine milk collected in the micro region of Concórdia, Santa Catarina. A total of 20 samples were analysed, using the QuEChERS method for extraction, Thin Layer Chromatography (TLC) to verify the presence of the contaminant, and High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detector (HPLC-FL) for confirmation and quantification. All the samples were contaminated with aflatoxin M 1, and 80% of them had levels above the limit allowed by the Brazilian regulation (0,5 g L -1 ). Results showed the importance of care that must be taken for assuring the good manufacturing and storage practices for milk cow s feed. PALAVRAS-CHAVE: Micotoxinas; QuEChERS; CLAE-FL; CCD. KEYWORDS: Mycotoxins; QuEChERS; HPLC-FL; TLC.

2 1. INTRODUÇÃO As micotoxinas são agentes químicos produzidos durante o metabolismo secundário de fungos filamentosos que podem se proliferar, contaminando alimentos e rações animais, produzindo efeitos agudos ou crônicos tanto ao homem quanto ao animal. As aflatoxinas foram as primeiras micotoxinas caracterizadas, sendo reconhecidas como substância tóxica em 1960 na Inglaterra, após serem identificadas como a causa da morte de milhares de aves depois da ingestão de ração à base de amendoim (Midio; Martins, 2000; Oliveira; Oliveira, 2010). As aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos do gênero Aspergillus, sendo que existem pelo menos vinte substâncias diferentes neste grupo. A aflatoxina B 1 é conhecida como agente natural carcinogênico (hepatoxicidade) e sua incidência é alta em diversas matériasprimas como grãos e, consequentemente, rações e silagem, que fazem parte da dieta de bovinos leiteiros. A aflatoxina B 1 é metabolizada, podendo ser convertida em aflatoxina M 1, que é excretada no leite. Esta micotoxina, segundo a classificação da International Agency for Research on Cancer (IARC), esta no Grupo 2B, ou seja, é considerada provável carcinógeno humano (Moss, 2002; Park, 2002; Mallmann; Dilkin, 2007; Oliveira; Olivera, 2010). O leite, apesar de ser um alimento nutritivo, fornecendo macro e micronutrientes para o crescimento, o desenvolvimento e a manutenção da saúde humana, também pode ser veículo de contaminantes, como a aflatoxina M 1 (Gourama; Bullerman, 1995; Ordóñez, 2005; Tronco, 2010). Devido ao consumo de leite e produtos derivados, principalmente por crianças, sendo estas mais susceptíveis aos efeitos tóxicos, torna-se justificável a determinação de aflatoxina M 1 em amostras de leite bovino in natura (Galvano; Galofaro; Galvano, 1996; Sherif; Salama; Abdel-Wahhab, 2009). Esta preocupação torna-se mais importante quando se considera o fato que, na região sul do Brasil, o inverno dificulta a pastagem de animais, tornando-se necessária a alimentação com silagem e rações, aumentando o risco de contaminação com a micotoxina. Diante deste contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar aflatoxina M 1 em amostras de leite bovino in natura coletados na microrregião de Concórdia, SC. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Coleta e preparo das amostras As amostras de leite bovino foram coletadas no mês de novembro de 2014 em 20 propriedades rurais do município de Concórdia - SC, com média de produção de 112 L dia -1. As coletas foram realizadas no período matutino, direto do tanque de refrigeração, utilizando tubos Falcon de 50 ml, em duplicata. Estes frascos foram acondicionados em caixa isotérmica com gelo e enviados ao laboratório, onde as amostras foram mantidas congeladas até o momento das determinações. O preparo das amostras de leite bovino in natura consistiu no descongelamento das mesmas, seguido de centrifugação a 2600 g por 3 min para a retirada da gordura (sobrenadante) e posterior homogeneização para pesagem. 2.2 Determinação de aflatoxina M1 em amostras de leite bovino in natura A extração da aflatoxina M 1 foi realizada em triplicata, utilizando o método de QuEChERS segundo Sartori et al. (2015). Para a identificação das amostras contaminadas com aflatoxina M 1, foi realizada triagem por CCD, segundo método 401/IV do Instituto Adolfo Lutz (2008), e a confirmação

3 e quantificação das amostras contaminadas foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência Shimadzu com detector de fluorescência (λ excitação = 360 nm e λ emissão = 450 nm), equipado com coluna cromatográfica Kromasil C18 5μ 250x4,6 mm com alça de injeção de 20 μl e vazão de 1,0 ml min -1. Para a obtenção da concentração de aflatoxina M 1 nas amostras contaminadas, foi utilizada a equação da curva de calibração y = x 6973,83 que apresentou coeficiente de correlação de 0,9991 e coeficiente de determinação de 0,9983, indicando linearidade adequada (Scaglioni, 2013). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO O método de extração QuEChERS foi escolhido por ser rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro (Sartori et al., 2015), e a identificação por CCD, por ser simples, de rápida execução e não necessitar de equipamentos de alto custo. A capacidade de extração e separação das aflatoxinas por estes métodos confere razoável nível de especificidade e sensibilidade (Midio; Martins, 2000; Souza et al., 2003), possibilitando a implementação de ambos como análise de rotina para o controle de aflatoxina M 1 e auxiliando na triagem de amostras com possíveis contaminações na matriz em questão. A Figura 1a ilustra o comportamento cromatográfico em CCD do padrão da aflatoxina M 1 que foi aplicado nas concentrações de 10 µg ml -1 (primeiro ponto); 0,5 µg ml -1 (segundo ponto) e 0,5 µg L -1 (terceiro ponto), obtendo-se um fator de retenção (Rf) de 0,90. Na Figura 1b pode-se visualizar uma placa contendo 5 amostras de leite in natura avaliadas. Figura 1 Comportamento cromatográfico em placas de camada delgada de a) Padrão de aflatoxina M 1 (Rf = 0,90); b) Amostras de leite in natura coletadas e analisadas. a) b) A técnica de CCD aplicada no presente trabalho apenas forneceu um indicativo da presença de aflatoxina M 1 nas amostras, sem quantificá-las, por isso, após a triagem, as amostras suspeitas foram confirmadas e quantificadas em CLAE-FL, técnica bastante empregada para a separação, identificação e quantificação de substâncias, sendo considerada de alta precisão (Oliveira; Germano, 2003). Para validar o método utilizado por Scaglioni (2013), uma amostra de leite integral pasteurizado não fortificada e uma fortificada com aflatoxina M 1 foi injetada em triplicata, apresentando concentrações médias de 0,01 g L -1 (tempo de retenção, tr = 6,038) e 0,03 g L -1 (tr = 6,296), respectivamente (Figura 2). É importante ressaltar que o cromatograma desta amostra, quando comparado às amostras de leite in natura avaliadas (Figura 3), apresentou mais picos de interferência.

4 Figura 2 - Cromatograma da amostra de leite integral pasteurizado (a) antes e (b) depois da adição intencional do padrão de aflatoxina M 1 a) b) A Figura 3 ilustra um dos cromatogramas das amostras analisadas cuja concentração de aflatoxina M 1 foi de 0,73 g L -1 (tr = 6,128). Figura 3 - Cromatograma de uma amostra de leite in natura analisada De um total de 20 amostras analisadas por CCD, todas indicaram suspeitas de contaminação com aflatoxina M 1, sendo confirmadas por CLAE-FL. Após quantificação, foram encontrados valores que variaram de 0,075 a 1,280 µg L -1, sendo que 80% das amostras estavam acima do limite máximo permitido pela legislação brasileira, que é de 0,5 µg L -1 (Brasil, 2011). Avaliando as amostras com base na legislação da União Europeia, que é de 0,05 µg L -1, todas apresentaram níveis acima do permitido (European Commission, 2010). Outros autores têm encontrado elevadas frequências de contaminação de aflatoxina M 1 em leite (Oliveira et al., 2010; Santili, 2010; Scaglioni et al., 2014). Os estudos citados, no entanto, indicam um número menor de amostras contaminadas que excedem o limite preconizado pela legislação, por se tratarem de amostras processadas, diferente do que foi avaliado no presente trabalho, leite in natura com pouco tempo de ordenha. Fatores como o confinamento do gado leiteiro, que acarreta em uso de alimentação constituída praticamente por rações e/ou silagem, podem justificar os resultados aqui obtidos (Midio; Martins, 2000). A qualidade das rações e silagens é diretamente influenciada pelos cuidados na produção e armazenamento. Quando estes procedimentos não são conduzidos de forma correta poderá haver contaminação, perdas de qualidade e de valor nutritivo, refletindo diretamente na segurança dos alimentos ofertados aos animais e, por consequência, dos seres humanos (Oliveira; Germano, 2003).

5 O clima também interfere, pois as culturas de áreas tropicais e subtropicais estão mais sujeitas à contaminação por aflatoxinas do que outras regiões, pois propiciam condições ideais para a proliferação dos fungos produtores destes metabólitos, devido à temperatura e à umidade mais elevada registradas nestes locais (Shundo; Sabino, 2006). Fatores como estágio de lactação, produtividade e saúde da glândula mamária do animal também influenciam a de transferência de aflatoxina M 1 para o leite. Assim, os animais que possuem infecção por Staphylococcus spp. no úbere apresentam taxa de secreção deste contaminante mais elevada do que os animais sadios (Veldman et al., 1992), embora neste estudo não tenha sido avaliado este efeito. E entre os fatores citados, as boas práticas no campo com as matérias-primas utilizadas, na fabricação e no armazenamento das rações e silagem, auxiliam na diminuição do risco de contaminação por aflatoxina B 1 e, consequentemente, na redução da conversão em aflatoxina M 1, que posteriormente é excretada no leite. Pode-se citar como boas práticas o uso de adsorventes sequestrantes de micotoxinas, a avaliação das condições físicas e sanitárias dos grãos que serão utilizados nas rações, e os cuidados com a fermentação secundária da silagem através da compactação e vedação adequada dos silos, diminuindo o teor de umidade e controlando a temperatura (Oliveira; Germano, 2003). 4. CONCLUSÕES Foi possível identificar por CCD, e confirmar e quantificar por CLAE-FL, a presença de aflatoxina M 1 em todas as amostras de leite in natura avaliadas, sendo que 80% das amostras quantificadas estavam com teores acima do limite permitido pela legislação brasileira (0,5 μg L -1 ). 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. (2011). Dispõe sobre limites máximos toletados (LMT) para micotoxinas em alimentos, (Resolução nº7, de 18 de fevereiro de 2011). Diário Oficial da República Federativa do Brasil. European Commision. (2010). Amending Regulation (EC) No 1881/2006 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs as regards aflatoxins. (No 165/2010, of 26 February 2010). Official Journal of the Europe Union. Galvano, F., Galofaro, V., Galvano, G. (1996). Occurrence and stability of aflatoxin M 1 in milk products: a worldwide rewiew. Journal of Food Protection, 59(10), Gourama, H., Bullerman, L. B. (1995), Aspergillus flavusand Aspergillus parasiticus: aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds. Journal of Food Protection, 58(12), Instituto Adolfo Lutz. (2008). Métodos físico-químicos para análise de alimentos (4. ed.). São Paulo: IAL. Mallmann, C. A., Dilkin, P. (2007). Micotoxinas e Micotoxicoses em Suínos. Santa Maria: Sociedade Vicente Pallotti. Midio, A. F., Martins, D. I. (2000). Toxicologia de Alimentos. São Paulo: Varela. Moss, M. O. (2002). Mycotoxin rewiew: Aspergillus and Penicillium. Mycologist, 16(3), Oliveira, C. A. F., Germano, P. M. L. (2003). Aflatoxina M 1 em leite e derivados (2. ed.). São Paulo: Varela.

6 Oliveira, C. A. F., Sebastião, L. S., Fagundes, H., Rosim, R. E., Fernandes, A. M. (2010). Determinação de aflatoxina B 1 em rações e aflatoxina M 1 no leite de propriedades do Estado de São Paulo. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 30(1), Oliveira, F. A., Olivera F.C. (2010). Toxicologia Experimental de Alimentos. Porto Alegre: Metodista IPA. Ordo n ez, P. J. (2005). Tecnologia de alimentos. Porto Alegre: Artmed. Park, D. L. (2002). Effect of processing on aflatoxin. Advances in Experimental Medicine an Biology, 504(1), Santili, A. B. N. (2010). Ocorrência de aflatoxina M 1 em leite cru de três mesorregiões produtoras do Estado de São Paulo e sua correlação com parâmetros de qualidade do leite (Dissertação de mestrado). Universidade de São Paulo, Piracicaba. Sartori, A. V., Mattos, J. S., Moraes, M. H. P., Nóbrega, A. W. (2015). Determination of Aflatoxins M 1, M 2, B 1, B 2, G 1 and G 2 and Ochratoxin A in UHT and Powdered Milk by Modified QuEChERS Method and Ultra-High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. Food Analytical Methods, 8(3), Scaglioni, P. T. (2013). Redução dos níveis de aflatoxina B 1 e M 1 em leite utilizando a casca de arroz como adsorvente (Dissertação de mestrado). Fundação Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande. Scaglioni, P. T., Becker-Algeri, T., Drunkler, D., Furlong, B. (2014). Aflatoxin B 1 and M 1 in milk. Analytica Chimica Acta, 829(1), Sherif, S. O., Salama, E. E., Abdel-Wahhab, M. A. (2009). Mycotoxins and child health: the need for health risk assessment. International journal of hygiene and environmental health, 212(4), Shundo, L., Sabino, M. (2006). Aflatoxin M 1 in milk by immunoaffinity column cleanup with TLC/HPLC determination. Brazilian Journal of Microbiology, 37(2), Souza, S. V. C., Vargas, E. A., Castro, L., Junqueira, R. G. (2003). Validação intralaboratorial de método para determinação de aflatoxina M 1 em leite por cromatografia de camada delgada. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 23(1), Tronco, V. M. (2010). Manual para Inspeção da Qualidade do Leite. (4. ed.). Santa Maria: UFSM. Veldman, A., Meijs, J. A. C., Borggreve, G. J., Tol, J. J. H. (1992). Carry-over of aflatoxin from cows food to milk. Animal Production, 55(1),