AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DA OCRATOXINA A DURANTE A ELABORAÇÃO DE SUCO DE UVA PELO MÉTODO DE ARRASTE A VAPOR

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1 AVALIAÇÃO DO COMPORTAMENTO DA OCRATOXINA A DURANTE A ELABORAÇÃO DE SUCO DE UVA PELO MÉTODO DE ARRASTE A VAPOR B. Dachery 1, S. Canossa 1, J. E. Welke 2, V. Manfroi 1 1-Laboratório de Bebidas e Enologia Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (ICTA) Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Av. Bento Gonçalves, 9500 Campus do Vale Prédio CEP: Porto Alegre RS Brasil, Telefone: (51) Fax: (51) (brudachery@yahoo.com.br) 2- Laboratório de Toxicologia de Alimentos - Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos (ICTA) Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) RESUMO - O suco de uva é o produto do setor vitícola que mais cresce em consumo no Brasil. A ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina que pode estar presente em diversas matérias primas agrícolas e alimentos, como o suco de uva. Sua presença é favorecida pela ação de fungos pertencentes ao gênero Aspegillus em vinhedos. Esta micotoxina possui propriedades nefrotóxicas, hepatotóxicas e carcinogênicas. Verificou-se o comportamento da OTA, através da adição da mesma, durante a elaboração do suco de uva, produzido através do método de arraste a vapor. A OTA foi detectada através do uso cromatografia líquida, com detector de fluorescência (CLAE- FL). O limite de detecção foi de 0,06 µg L -1 e o limite de quantificação foi de 0,6 µg L -1. O método de elaboração do suco de uva por arraste a vapor, mostrou-se eficaz no controle da quantidade de OTA e redução da mesma durante o processo. ABSTRACT - Grape juice is the product of wine fastest growing sector in consumption in Brazil. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin present in various agricultural raw materials and food, as grape juice. Its presence is favored by the action of fungi belonging to the genus Aspergillus in vineyards. This mycotoxin has nephrotoxic, hepatotoxic and carcinogenic properties. It was the behavior of OTA by the addition of the toxin, during the preparation of grape juice produced by the method of steam distillation. OTA was detected by using High Performance Liquide Chromatograph (HPLC) with fluorescence detection (FD). The detection limit was 0.06 μg L -1 and limit of quantification was 0.6 μg L -1. The method of grape juice by steam distillation, was effective in controlling the amount of OTA and reduce it during the process. PALAVRAS-CHAVE: micotoxinas, suco de uva, qualidade de alimentos KEYWORDS: mycotoxins, grape juice, food quality 1 INTRODUÇÃO O mercado do suco de uva cresce de 15 a 20% ao ano no Brasil, sendo que o suco natural/ integral tem um incremento ainda maior, por volta de 40%. A busca por uma vida mais saúdavel tem uma grande influência no aumento do consumo de suco de uva, além disso, por ser um produto

2 não alcoólico, pode ser consumido em todas as faixas etárias, principalmente por crianças, podendo fornecer os benefícios que o vinho oferece (IBRAVIN, 2014). A ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina produzida por fungos pertencentes aos gêneros Aspergillus sp. e Penicillium sp, presentes em diversos alimentos, inclusive em uvas (Cabanes et al., 2010). Uma vez encontrada na uva, pode estar presente em vinhos e derivados, como o suco (Hocking et al., 2003). A ingestão de alimentos contaminados por OTA pode ocasionar efeitos tóxicos como hepatotoxicidade e nefrotoxicidade (Anninou et al., 2014). A Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) classificou a OTA no grupo 2B, ou seja, como um possível carcinógeno para humanos (IARC, 1993). Devido ao risco que o consumo de alimentos contaminados por OTA podem ocasionar ao consumidor, desde 2006 a União Européia possui leis que regulamentam os limites máximos permitidos desta toxina em vários produtos. No Brasil, a legislação brasileira estabeleceu limites máximos para várias micotoxinas em diversos produtos, incluindo a OTA. Em sucos de uva e vinhos, o limite máximo fixado é de 2 μg L -1, que é a mesma concentração máxima permitida pela legislação europeia ( European Comission, 2006; ANVISA, 2011). A OTA tem sido detectada em amostras de sucos de uva avaliados, no entanto, sua concentração é frequentemente abaixo do valor estabelecido pela legislação (Ng et a., 2004; Rosa et al., 2004; Shundo et al., 2006; Baggio et al., 2014). Por ser considerado uma bebida de alto valor nutricional e também como incentivo ao crescimento do setor vitícola, no estado do Rio Grande do Sul o suco de uva está incluso na merenda escolar na rede de ensino estadual (Rio Grande do Sul, 2009) Dados referentes à determinação de OTA em sucos produzidos pelo método de arraste a vapor não foram encontrados na literatura. Este processo é amplamente utilizado por pequenos produtores e por cerca de 400 agroindústrias no Rio Grande do Sul (IBRAVIN, 2014). O objetivo deste trabalho foi verificar o comportamento da OTA, através da adição da mesma, durante a elaboração do suco de uva, produzido pelo método de arraste a vapor, sistema amplamente utilizado por pequenas empresas e agroindústrias no Rio Grande do Sul. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Amostras A variedade Concord é uma das mais importantes variedades utilizadas para a produção de suco de uva no Brasil. Neste estudo foram utilizados 1,5kg de uva da variedade Concord (Vitis labrusca - Brix: 16 ), coletada em vinhedo localizado na Serra Gaúcha, Rio Grande do Sul, Brasil. 2.2 Solução padrão de OTA A solução padrão de estoque de OTA usada para contaminação das uvas foi preparada dissolvendo 5 mg de OTA pura cristalina (Sigma-Aldrich) em tolueno-ácido acético (99:1v/v) até a concentração de µg L -1. A solução padrão foi mantida congelada (-18 C). A concentração de OTA da solução estoque foi determinada por medição da absorbância UV a 333nm e calculada usando o coeficiente de absorção molar ε de 544m 2 mol -1. A concentração da solução padrão do trabalho em tolueno: ácido acético (99:1v/v) foi de 22,49 µg ml Elaboração do suco

3 Bagas aleatórias foram contaminadas com solução de OTA com o auxílio de uma seringa. Na figura 1 pode-se observar o sistema de elaboração do suco pelo método arraste a vapor. As uvas foram colocadas no conjunto extrator de suco, que é formado por um depósito de água, que é aquecido para geração do vapor e sobre ele existe um recipiente com abertura cônica no centro para passagem do vapor. Além disso, o aparato apresenta uma abertura lateral para escoamento do suco e na parte superior há um recipiente perfurado onde as uvas são colocadas. O tempo de elaboração do suco neste aparato foi de 2 horas, com amostragens em tempo 30, 60, 90 e 120 minutos, em triplicata. A temperatura de extração variou de 75 a 85 C. Figura 1: Processo de elaboração do suco de uva pelo método arraste a vapor. Fonte: Macanuda 2.4 Extração de OTA e análise em HPLC A determinação por HPLC foi realizada de acordo com o método oficial da AOAC Uma porção de 10 ml de vinho foi acrescida de de 10ml de solução de diluição (1%PEG e 5% NaHCO3). Desta solução, 10 ml foram passados em uma coluna de imunoafinidade Ochratest TM (VICAM) específica para OTA. A coluna foi lavada com 5ml de solução de lavagem (2,5% NaCl e 0,5% NaHCO3) seguidos de 5ml de água destilada. A OTA foi extraída com 2ml de metanol. O extrato foi evaporado com nitrogênio e reconstituído em 250µL da fase móvel acetonitrila: água: ácido acético (99:99:2) para posterior leitura. Um volume de 20 µl do extrato reconstituído foi injetado no aparelho cromatográfico pelo sistema de injeção automática. O aparelho HPLC Waters e2695 com Multi λ Fluorescence Detector 2475 ( λex=333 nm, λem=460 nm). A separação foi realizada com Waters Xbridge tm Shield RP 18 5µm (4,6x150mm). A fase móvel consistiu na mistura isocrática de acetonitrila: água: ácido acético (99:99:2) eluída a um fluxo de 1.0ml/ min. A identificação da OTA foi realizada pela medida das áreas do pico no tempo de retenção correspondente ao da toxina padrão também injetada no cromatógrafo. A quantificação foi feita através do método de calibração externa, utilizando uma curva de calibração de 7 pontos elaborada no intervalo de 0,5 a 6 µg L -1 de OTA, r=0,997. O limite de detecção foi de 0,06 µg L -1 e o limite de quantificação foi de 0,6 µg L RESULTADOS E DISCUSSÃO Este é o primeiro trabalho avaliando o comportamento da OTA durante o processo de elaboração de suco de uva. Os resultados são apresentados na tabela 1. Tabela 1: Concentração de OTA durante os diferentes tempos de amostragem no processo. Temperatura durante o processo: 75 a 85 C.

4 Tempo (min) Concentração de OTA (µg L -1 ) , , , Processos térmicos aplicados à alimentos podem afetar a concentração da OTA (Vidal et a., 2015). Na tabela 1, as concentrações da toxina diminuíram em cada amostragem realizada, sendo que, quanto mais tempo a toxina ficou exposta ao calor, menor a concentração encontrada. Entre os tempos 30 e 60 minutos houve uma redução de 22% da toxina. Uma redução menor foi observada entre 60 e 90 minutos (17,3%). A maior redução foi encontrada no período em que a toxina ficou mais tempo exposta as altas temperaturas aplicadas, entre 90 e 120 minutos, apresentando 49,4% de redução. Após duas horas de processo, a redução total da OTA foi de 67,3%. O uso de uma alta concentração de toxina, possibilitou acompanhar seu comportamento do início ao fim da elaboração do suco. O processo de elaboração afetou a quantidade de OTA encontrada em sucos de uvas, comprovando o efeito do tratamento térmico sobre a concentração de OTA. No método de arraste a vapor, durante todo o processo a baga se mantém praticamente intacta, sem ser submetida ao processo de maceração, que ocorre nos processos industriais. A maceração das uvas é considerada um ponto crítico de controle da contaminação do suco, pois a maior concentração de OTA é encontrada na casca da uva do que na polpa (Blayteron et al., 2006) e desta maneira, a maceração possibilita a migração da OTA presente na casca para o suco. OTA foi detectada em suco de uva pela primeira vez na Suíça por Zimmerli e Dick (1996) onde a média de concentração encontrada em 8 amostras foi de 0,23 μg L -1. Woese (2000) analisou 37 amostras de sucos de uva da Alemanha e encontrou OTA em 78% da amostras, sendo que uma delas apresentou valor de 6,72 μg L -1, bem acima do permitido pela legislação atual Européia. Ng et al. (2004) analisaram 70 amostras de suco de uva comercializadas no Canadá e observaram que 4 amostras apresentaram OTA chegando a concentração de 0,10 μg L -1. No estudos realizados com sucos de uva produzidos no Brasil, nenhum apresentou limites de OTA acima do permitido pela legislação (Rosa et al., 2004; Shundo et al., 2006; Baggio et al., 2014). Terra et al. (2012) avaliou a presença de OTA em suco elaborado com base em três cultivares (Isabel, Cora e Rúbea) enxertadas com porta-enxertos diferentes e produzidas na região do Vale São Francisco, Brasil (9 S 40 W), totalizando 11 variedades. As amostras de sucos foram preparadas com o uso de espremedores domésticos, para extração a 75 C, seguida de uma pasteurização e subsequente engarrafamento. Em nenhuma das amostras analisadas foi detectada a OTA.. 4 CONCLUSÕES Os resultados obtidos em nosso estudo evidenciam que o método de elaboração do suco por arraste a vapor, através do uso de altas temperaturas afeta a concentração de OTA presente na uva e mostrou-se eficaz na redução da mesma durante o processo. Este é considerado um ponto positivo, no que diz respeito a qualidade do produto final oferecido para o consumidor, já que o suco produzido por este método é fabricado por pequenas empresas familiares e agroindústrias.

5 Futuramente, o comportamento da OTA deve ser obsevado em métodos de elaboração industriais e submetidos a comparação entre métodos, a fim de avaliar o melhor eficiência do processo para redução desta toxina. REFERENCIAS ΑNNINOU N.; CHATZAKI E.; PAPACHRISTOU F.; PITIAKOUDIS M.; SIMOPOULOS C. Mycotoxins Activity at Toxic and Sub-Toxic Concentrations: Differential Cytotoxic and Genotoxic Effects of Single and Combined Administration of Sterigmatocystin, Ochratoxin A and Citrinin on the Hepatocellular Cancer Cell Line Hep3B. Int. J. Environ. Res. Public Health, v.11, p , 2014 ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Regulamento Técnico sobre os limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, Resolução RDC Nº 7, fevereiro de Diário Oficial da União, Poder Executivo, n. 37, AOAC Official Method , Determination of ochratoxin Ain wine and beer. AOAC International, BAGGIO, M.; SPINELLI F.R.; DUTRA S.V.; VANDERLINE R.. Determinação de ocratoxina A em suco integral por cromatografia de alta eficiência. R. Bras. de Vit. e En. v. 6, n. 6, p , BELLI, N.; MARÍN S.; CORONAS I.; SANCHIS V.; RAMOS A.J. Skim damage, high temperature and relative humidity as detrimental factors for Aspergillus carbonarius infection and ochratoxin A production in grapes. Food Control v. 18, p , BLAYTERON L.; BONTEMPS E.; GRANÉS D.; ROUSSEAU J. Conhecimentos recentes sobre OTA. Revista internet de viticultura e enologia, Revisão de publicações. Acesso em 8 jan Online. Disponível em: < CABANES F. J.; ACCENSI F.; BRAGULAT M.R.; ABARCA M.L.; CASTELLA G.; MINGUEZ S.; PONS A. What is the source of ochratoxin A in wine? International Journal of Food Microbiology. v. 79, p , European Commission, European Commission Regulation No. 401/2006. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs. Off J Eur Union 70:12 34 (2006). HOCKING, A. D.; VARELIS P.; PITT H.; CAMERON.; LEONG S. Occurrence of ochratoxin A in Australian wine. Australian J. of Grape and Wine, v.9 p.72-78, IARC. Ochratoxin A. In: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Some Naturally Occurring Substances: Food Items and Constituents, Heterocyclic Aromatic Amines and Mycotoxins. Int. Ag. for Research on Cancer v. 56, p , IBRAVIN. Programa de Desenvolvimento Setorial Suco de Uva. Instituto Brasileiro do Vinho. Acesso em 23 jan Online. Disponível em: < NG, W.; MANKOTIA M.; PANTAZOPOULOS P.; NEIL R.J.; SCOTT P.M. Ochratoxin A in wine and grape juice sold in Canadá. Food Add. And Contam., v.21, n.10, p , RIO GRANDE DO SUL. Lei nº , de 08 de setembro de Inclui o suco de uva e o suco de laranja produzidos no Estado do Rio Grande do Sul no cardápio da merenda escolar da rede pública estadual de ensino. Acesso em 5 jan Disponível em:

6 ROSA, C. A. R.; MAGNOLI C.E.; FRAGA M.E.; DALCERO A.M.; SANTANA D.M.N. Occurrence of ochratoxin A in wine and grape juice marketed in Rio de Janeiro, Brazil. Food Add. and Contam., v. 21, p , SHUNDO, L.; ALMEIDA A.P.; ALABURDA J.; RUVIERI V.; NAVAS S.A.; LAMARDO L.C.A.; SABINO M. Ochratoxin A in wines and grape juices commercialized in the city of São Paulo, Brazil. Braz. J. of Microbiol., v. 37, p , TERRA M.F.; PRADO G.; PEREIRA G.E.; EMANTNÉ H.J.; BATISTA L.R. Detection of ochratoxin A in tropical wine and grape juice from Brazil. J. Scien. Food Agr.., v. 93, p , VIDAL A.; SANCHIS V.; RAMOS A. J.; MARÍN S. Thermal stability and kinetics of degradation of deoxynivalenol, deoxynivalenol conjugates and ochratoxin A during baking of wheat bakery products. Food Chemistry, n 178, p , WELKE, J. E.; HOELTZ M.; DOTTORI H.A.;NOLL I.B. Determination of Ochratoxin A in Wine by High-Performance Thin- Layer Chromatography using Charged Coupled Device. J. Braz. Chem. Society, v. 21, p , WOESE K. Ochratoxin A in grape juice and wine. Myc. Res., v.16, p , ZIMMERLI, B.; DICK, R. Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood, serum, milk and some foodstuffs by high performance liquid chromatography with enhance, fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup: methodology and Swiss data. J. of Chromat. B, v.666, p.85 99,