Ciência e Tecnologia de Alimentos ISSN: Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos.

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1 Ciência e Tecnologia de Alimentos ISSN: revista@sbcta.org.br Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos Brasil Fernandes de OLIVEIRA, Carlos Augusto; Soares SEBASTIÃO, Luciana; FAGUNDES, Helena; ROSIM, Roice Eliana; FERNANDES, Andrezza Maria Determinação de aflatoxina B1 em rações e aflatoxina M1 no leite de propriedades do Estado de São Paulo Ciência e Tecnologia de Alimentos, vol. 30, núm. 1, mayo, 2010, pp Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos Campinas, Brasil Disponível em: Como citar este artigo Número completo Mais artigos Home da revista no Redalyc Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe, Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto

2 Ciência e Tecnologia de Alimentos ISSN Determinação de aflatoxina B 1 em rações e aflatoxina M 1 no leite de propriedades do Estado de São Paulo Determination of aflatoxin B 1 in animal feed and aflatoxin M 1 in milk in dairy farms of São Paulo State Original Carlos Augusto Fernandes de OLIVEIRA 1 *, Luciana Soares SEBASTIÃO 1, Helena FAGUNDES 1, Roice Eliana ROSIM 1, Andrezza Maria FERNANDES 2 Resumo A ocorrência de aflatoxina B 1 (AFB 1 ) em rações e aflatoxina M 1 (AFM 1 ) no leite cru foi avaliada em propriedades leiteiras situadas na região nordeste do Estado de São Paulo, Brasil, de outubro de 2005 a fevereiro de A análise de aflatoxinas foi efetuada utilizando-se colunas de imunoafinidade para purificação dos extratos, sendo a quantificação realizada através de cromatografia líquida de alta eficiência. A AFB 1 foi detectada em 40% das rações em níveis de 1,0 a 19,5 µg.kg 1. A concentração d em 36,7% de amostras de leite positivas variou de 0,010 a 0,645 µg.l 1. Somente uma amostra de leite estava acima do limite de tolerância adotado no Brasil (0,5 µg.l 1 ) para AFM 1. Concluiuse que as concentrações de aflatoxinas na ração e no leite foram relativamente baixas, embora a alta frequência das aflatoxinas nas amostras analisadas indique a necessidade de contínuo monitoramento a fim de prevenir a contaminação de ingredientes e rações destinadas ao gado leiteiro. Palavras-chave: micotoxinas; resíduos; ocorrência. Abstract The occurrence of aflatoxin B 1 (AFB 1 ) in animal feed and aflatoxin M 1 (AFM 1 ) in raw milk was evaluated in dairy farms located in the Northeast region of São Paulo state, Brazil, from October 2005 to February The Aflatoxin analysis was performed using immunoaffinity clean-up with high performance liquid chromatography for quantification. AFB 1 was found in 40% of the animal feeds at the levels of 1.0 to 19.5 µg.kg 1. The concentration of AFM1 in raw milk (36.7%) ranged from to µg.l 1. Only one single sample of raw milk presented values above the tolerance limit adopted in Brazil (0.5 µg.l 1 ) for AFM 1. In conclusion, the concentrations of aflatoxins in the animal feed and milk samples studied were relatively low although the high frequency of mycotoxins in the both analysed samples indicates the necessity of continuous monitoring in order to prevent mycotoxin contamination of animal feed ingredients for dairy cattle. Keywords: mycotoxins; residues; occurrence. 1 Introdução As aflatoxinas, metabólitos secundários produzidos por certos fungos do gênero Aspergillus, podem causar vários efeitos tóxicos em animais (COUNCIL FOR AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY, 2003). A exposição humana e de animais às aflatoxinas ocorre predominantemente pela ingestão de alimentos e rações contaminados, especialmente cereais e grãos, como milho, trigo, amendoim, entre outros. Dezoito diferentes tipos de aflatoxinas foram identificados, mas somente as aflatoxinas B 1 (AFB 1 ), B 2 (AFB 2 ), G 1 (AFG 1 ) e G 2 (AFG 2 ) foram detectadas como contaminantes naturais de rações e ingredientes, sendo a AFB 1 a toxina de maior toxicidade (MOSS, 1998). A contínua ingestão de AFB 1 por animais em lactação leva à excreção de aflatoxina M 1 (AFM 1 ) no leite (PARK; POHLAND, 1986). Os efeitos tóxicos carcinogênicos da AFM 1 têm sido extensivamente demonstrados em espécies de laboratório (RILEY; PESTKA, 2005), portanto, a International Agency for Research on Cancer (1993) classificou a AFM 1 no Grupo 2 (um provável carcinógeno humano). A taxa de transferência de AFB 1 da ração para o leite de vacas está situada entre 1 e 3%, com uma transferência média de 1,7%, embora estes valores possam variar de acordo com vários fatores como o nível de AFB 1 ingerido, produção de leite, saúde individual e sensibilidade às aflatoxinas (JOUANY; DIAZ, 2005). Frobish et al. (1986) observaram AFM 1 no leite de vacas lactantes, 12 horas após o consumo de ração contaminada, com uma transferência média de 1,74% do total de AFB 1 ingerida na ração. Patterson, Glancy e Roberts (1980) e Price et al. (1985) encontraram resultados semelhantes em vacas leiteiras, observando taxas de transferência de 2,2 e 1,6%, respectivamente. No Brasil, a ocorrência d em leites pasteurizados e esterilizados (longa-vida) é variável (GARRIDO et al., 2003; JUSSARA, 2000; MARTINS, J. L. S.; MARTINS, I. S., 1986; OLIVEIRA; ROSMANINHO; ROSIM, 2006; SABINO; Recebido para publicação em 21/8/2008 Aceito para publicação em 21/6/2009 (003640) 1 Departamento de Engenharia de Alimentos, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo USP, Av. Duque de Caxias Norte, 225 CEP , Pirassununga SP, Brasil, carlosaf@usp.br 2 Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo USP, São Paulo SP, Brasil *A quem a correspondência deve ser enviada Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1): , maio

3 Aflatoxinas B 1 e M 1 em propriedades leiteiras do Estado de São Paulo PURCHIO; ZORZETTO, 1989; SYLOS; RODRIGUEZ-AMAYA; CARVALHO, 1996), mas os níveis observados geralmente se encontram abaixo do limite de tolerância (0,5 µg.l 1 ) determinado pelas normas vigentes (BRASIL, 2002a). A ocorrência de AFB 1 em ingredientes para rações do gado leiteiro é relativamente frequente no Brasil (RODRÍGUEZ-AMAYA; SABINO, 2002), porém são poucos os trabalhos que avaliam a ocorrência de AFB 1 na ração fornecida ao gado leiteiro e de AFM 1 no leite em condições de campo. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi verificar a ocorrência de aflatoxinas em rações e leite produzidos em propriedades leiteiras do Estado de São Paulo. 2 Material e métodos 2.1 Amostragem Seis propriedades leiteiras de leite tipo B, localizadas em áreas próximas aos municípios de São Carlos e Ribeirão Preto, região nordeste do Estado de São Paulo, foram utilizadas para a amostragem. Todas as propriedades leiteiras amostradas utilizavam rações à base de soja e milho, produzidos e armazenados localmente. Outros ingredientes utilizados eram: caroço de algodão, sorgo, forragem, silagem de milho, cana de açúcar, polpa cítrica, cevada e trigo. Não foram observadas diferenças significativas nos ingredientes das rações de cada fazenda durante as coletas. Em cada fazenda, cinco alíquotas de 500 g de ração foram colhidas de diferentes áreas do cocho de alimentação. Portanto, as cinco alíquotas foram representativas da ração disponível para as vacas em lactação imediatamente após a ordenha. As alíquotas foram adicionadas em uma mesma embalagem de polipropileno estéril para constituir uma amostra de 2,5 kg de ração colhida em cada propriedade. Após a ordenha de todos os animais em lactação, retirou-se uma amostra de 500 ml de leite do tanque de refrigeração, que foi colocada em um frasco estéril. Esta amostra, juntamente com a amostra de ração colhida na mesma propriedade, foi acondicionada em caixa isotérmica e transportada com gelo até o laboratório para serem analisadas em um prazo de até 24 horas. Os procedimentos para a colheita das amostras foram repetidos cinco vezes em cada propriedade, uma vez por mês, nos meses de outubro de 2005 a fevereiro de 2006, totalizando 30 amostras de ração e 30 de leite analisadas. 2.2 Análise de aflatoxina na ração A determinação de aflatoxina B nas amostras de ração 1 foi efetuada em duplicata, seguindo-se os procedimentos preconizados pela empresa fabricante de colunas de imunoafinidade (Aflatest, Vicam, Watertown, MA, EUA) e quantificação através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A amostra de ração (2,5 kg) foi previamente triturada e homogeneizada em um moinho (Marconi, Piracicaba, Brasil). Em seguida, a amostra analítica (50 g) foi colocada em um blender, juntamente com 5 g de NaCl e 100 ml de metanolágua ( ). Após a agitação em alta velocidade (1 minuto), o extrato foi filtrado em papel de filtro e recolheram-se 10 ml em um béquer. Foram adicionados ao extrato 40 ml de água ultrapurificada (Milli-Q, Millipore, Billerica, MA, EUA) e a mistura completamente homogeneizada foi filtrada (filtro de microfibra, 1,5 µm, Millipore). Recolheram-se 10 ml para passagem através de coluna de imunoafinidade, adaptada a um suporte para extração em fase sólida, conectado a um sistema de vácuo (fluxo de 1-2 gotas/segundo). Após a eluição da amostra, a coluna foi lavada através da passagem de 10 ml de água Milli-Q. Em seguida, foi passado 1 ml de metanol (grau CLAE), de maneira a eluir as aflatoxinas, recolhendo o eluato em frasco âmbar. O eluato foi diluído com 1 ml de água Milli-Q, para formar uma solução de metanol-água ( ), semelhante à fase móvel utilizada na corrida cromatográfica (SCOTT, 1990). A separação e a quantificação das aflatoxinas foram conduzidas em um sistema de cromatografia líquida (Shimadzu, Kyoto, Japan), equipado com detector de fluorescência (excitação: 360 nm e emissão: 440 nm) e coluna Shim-pack CLC-ODS (5 µm) 4,6 250 mm, precedida de pré coluna Shim-pack (5 µm) 4 10 mm. Foram injetados 20 µl da amostra filtrada (membrana filtrante PTFE, 0,45 µm, Millex, Millipore, Billerica, MA, EUA) e foi utilizado metanolágua ( ) como fase móvel, com fluxo de 0,8 ml/minuto. A quantificação da aflatoxina B 1 nas amostras foi realizada através da interpolação das áreas dos picos cromatográficos, obtidos nas amostras, na equação de regressão da curva de calibração. O padrão de AFB 1 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi dissolvido em solução de benzeno-acetonitrila (98 + 2), a qual foi calibrada espectrofotometricamente (λ = 350 nm) para obtenção da concentração exata das toxinas. Após a calibração, foram transferidos, para um frasco, 200 µl do padrão, que foi evaporado até a secura sob fluxo de nitrogênio e ressuspendido em volume conveniente de metanol grau CLAE, de maneira a obter uma solução de trabalho contendo aproximadamente 1,0 µg AFB 1 ml 1. Estas soluções foram utilizadas no preparo dos padrões da curva de calibração (concentrações aproximadas de 2,5, 5,0, 10,0 e 20,0 ng.ml 1 ), a qual foi construída através da injeção de 20 µl da solução padrão. O tempo de retenção foi de aproximadamente 6,8 minutos para a AFB Análise de aflatoxina M1 A extração e purificação das amostras para a determinação d foram realizadas em duplicata de acordo com as recomendações de Tuinstra, Roos e van Trijp (1993), com adaptações propostas pelo fabricante das colunas de imunoafinidade (Aflatest, Vicam, Watertown, MA, EUA), como descrito por Oliveira et al. (2006). Em síntese, a amostra analítica (25 ml) foi previamente aquecida a 37 C, adicionada de 1 g de NaCl e submetida à centrifugação (2.500 g, 15 minutos), após o que foi passada diretamente através de coluna de imunoafinidade, sendo adaptada a uma seringa de vidro e conectada a um sistema de vácuo (fluxo de 2-3 ml/minuto). Após a eluição da amostra, a coluna foi lavada através da passagem de 20 ml de água ultrapurificada (Milli Q, Millipore)-metanol (9:1, v/v). Em seguida, passou-se 1 ml de metanol, de maneira a eluir a AFM 1, recolhendo-se o eluato em frasco âmbar. O eluato foi diluído com água ultrapurificada até formar uma solução de metanol- 222 Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1): , maio 2010

4 Oliveira, et al. água (7:3, v/v), semelhante à fase móvel utilizada na corrida cromatográfica. A identificação e quantificação de resíduos de AFM 1 foram conduzidas com a injeção de 20 µl dos extratos das amostras em sistema CLAE sob as mesmas condições descritas para a análise de aflatoxinas em rações, exceto pela fase móvel isocrática, a qual foi constituída de metanol-água (7:3, v/v) com fluxo de 0,8 ml/minuto. Sob estas condições, o tempo de retenção para a AFM 1 foi de aproximadamente 3,7 minutos. A curva de calibração da AFM 1 foi preparada usando soluções padrão d (Sigma, St Louis, MO, EUA) previamente avaliadas de acordo com Scott (1990), nas concentrações de 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 e 10,0 ng.ml 1. 3 Resultados e discussão Os métodos analíticos empregados no experimento foram previamente avaliados com a utilização de rações e leites contaminados experimentalmente com AFB 1 em diferentes níveis. Na amostras de ração contaminada com AFB 1 em níveis de 5,0 e 50,0 µg.kg 1, os percentuais de recuperação variaram de 89 a 108%, sendo os desvios padrão relativos de 2,3 a 12,0%. As amostras de leite contaminadas com AFM 1 em níveis de 0,05 e 0,50 µg.l 1 revelaram percentuais de recuperação de 75 a 124%, com desvios padrão relativos de 3,9 a 22,1%. Os limites de quantificação para AFB 1 foram 1,0 e 0,010 µg.l 1, respectivamente, considerando-se a quantidade mínima de toxina que poderia gerar um pico cromatográfico três vezes acima da linha de base do desvio padrão. A Tabela 1 apresenta dados de produção de leite e composição da ração, o número de amostras positivas, a variação e as concentrações médias de aflatoxinas na ração e no leite das propriedades amostradas. Todas as propriedades apresentaram AFB 1 na ração, sendo que o maior número de amostras positivas foi observado na propriedade que fornecia somente silagem aos animais. A frequência de amostras de ração positivas para AFB 1 foi de 40% e as concentrações observadas variaram de 1,2 a 19,5 µg.kg 1 (média de 8,4 µg.kg 1 ). Pozzi et al. (1995) detectaram apenas uma amostra contaminada com AFB 1 (500 µg.kg 1 ) em 130 amostras de milho que seria utilizado como ração no Estado de São Paulo. Os resultados deste estudo são semelhantes aos obtidos por Corrêa et al. (1997), que observaram 14 de 96 amostras de ração positivas para AFB 1 em níveis de 11 a 287 µg.kg 1. Deve-se ressaltar, no entanto, que a comparação entre os resultados do presente estudo com os reportados por outros autores é difícil, uma vez que a contaminação de ingredientes varia de acordo com a área, diferenças climáticas e práticas agrícolas, entre outros (JOUANY; DIAZ, 2005). Os níveis de AFB 1 observados nas amostras de ração mantiveram-se abaixo do limite de tolerância recomendado para ingredientes de rações no Brasil (50 µg.kg 1 somatória de B 1 + B 2 + G 1 + G 2 ) (BRASIL, 1988). A frequência de detecção d no leite foi de 36,7%, em concentrações variando de 0,010 a 0,645 µg.l 1 (média de 0,144 µg.l 1 ). Esta frequência foi coerente com a detecção de AFB 1 nas rações das propriedades. As fazendas com produção de leite entre e L/dia apresentaram três amostras (60%) positivas para AFM 1 no leite de mistura, enquanto que a fazenda com maior produção de leite ( L/dia) apresentou duas amostras (40%) de leite com níveis detectáveis d. A detecção d nestas duas amostras pode ter contribuído de maneira significativa para a ocorrência da toxina nos leites de consumo, devido ao grande volume de leite produzido pela propriedade. No único trabalho sobre a ocorrência d no leite cru no Estado de São Paulo, Sabino, Purchio e Zorzetto (1989) encontraram 18% de amostras positivas em níveis de 0,10 a 1,68 µg.l 1. Recentemente, Sassahara, Netto e Yanaka (2005) encontraram AFM 1 em níveis de 0,29 a 1,97 µg.l 1 em 24% das amostras de leite cru colhidas em fazendas do Estado do Paraná, das quais apenas três (7%) estavam acima do limite de 0,5 µg.l 1. O processo de modernização do setor de produção de leite, com vistas à adequação às normas contidas na Instrução Normativa 51 (BRASIL, 2002b), tem promovido um aumento significativo na produção leiteira no Brasil, possibilitando a exportação de produtos lácteos. Este aumento se deve, em parte, ao fornecimento intensivo de rações aos animais, sobretudo nos meses de entressafra (outono e inverno), o que pode ter contribuído para a obtenção de níveis detectáveis d no leite das regiões estudadas. Ressalte-se que no presente estudo a amostragem foi efetuada nos meses de primavera e verão, obtendo-se apenas uma amostra com AFM 1 acima de Tabela 1. Aflatoxinas nas rações e nos leites colhidos em propriedades leiteiras do Estado de São Paulo. Fazenda Produção de leite (L/dia) Produtividade (L vaca/dia) Composição da AFB 1 AFM 1 ração 1 n 2 % Variação 3 (µg.kg 1 ) Média 4 (µg.kg 1 ) n % Variação (µg.l 1 ) Média (µg.l 1 ) ,2 ACDF ,5 19,5 11,5 + 11, ,041 0,045 0, , ,990 23,3 ABE ,3 15,3 10,3 +7, ,144 0,645 0, , ,100 22,8 ADF ,5 16,5 9,0 + 10, ,014 0,285 0, , ,861 48,5 ADFG ,8 1,8 + 0,0 0 0 * * 5 3,806 22,0 D ,2 15,2 6,4 + 7, ,010 0, ,0 6 19,890 15,3 AD ,5 15,7 9,1 + 9, ,019 0,145 0, ,089 1 Todas as rações eram à base de milho e soja com: A: algodão, B: sorgo, C: forragem, D: silagem, E: cana-de-açúcar, F: polpa cítrica, G: trigo; 2 Número de amostras positivas. Foram analisadas (em duplicata) 5 amostras de ração e 5 amostras de leite para cada propriedade, totalizando 30 amostras; 3 Níveis mínimo e máximo detectados em amostras analisadas em duplicata; 4 Valores reportados como média ± desvio padrão, para amostras contendo níveis detectáveis de aflatoxinas; * Nível abaixo do limite de quantificação do método analítico (aflatoxina B 1 : 1,0 µg.kg 1 ; aflatoxina M 1 : 0,010 µg.l 1 ). Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1): , maio

5 Aflatoxinas B 1 e M 1 em propriedades leiteiras do Estado de São Paulo 0,5 µg.l 1. No entanto, 20% das amostras de leite apresentaram níveis d superiores a 0,050 µg AFM 1 L 1, limite de tolerância adotado pela União Europeia. Portanto, estes níveis poderiam motivar restrições às exportações de produtos lácteos brasileiros. Dez amostras, sendo cinco de ração e cinco de leite, colhidas na mesma propriedade no mesmo dia de amostragem, apresentaram níveis detectáveis de AFB 1, respectivamente. As concentrações médias de AFB 1 nessas amostras foram 8,8 + 8,1 µg.kg 1 e 0, ,273 µg.l 1, respectivamente. Vários pesquisadores calcularam a quantidade d excretada no leite como uma porcentagem da AFB 1 ingerida na ração. Deste modo, utilizando-se os dados obtidos nas dez amostras, estima se que cerca de 2,3% da AFB 1 na ração foi excretada na forma d no leite. Apesar da dispersão dos resultados obtidos em nosso estudo, o valor encontrado é coerente com a taxa de conversão obtida experimentalmente, sendo possível utilizá-la para predizer a conversão de AFB 1 em AFM 1 em condições de campo. Além disso, o resultado do estudo demonstra que o limite para AFM 1 no leite (0,5 µg.l 1 ) é ultrapassado quando a ração contém AFB 1 a partir de 40 µg.kg 1, aproximadamente. Consequentemente, o limite recomendado pela legislação brasileira para aflatoxinas em rações (50 µg.kg 1 somatória de B 1 + B 2 + G 1 + G 2 ) (BRASIL, 1988) parece não ser adequado para prevenir a ocorrência d no leite. Este fato reforça a importância da revisão desta norma, com a finalidade de estabelecer limites coerentes para aflatoxinas para ingredientes e rações destinadas ao gado leiteiro. 4 Conclusões A detecção das aflatoxinas B 1 e M 1, embora em concentrações abaixo dos limites de tolerância brasileiros, indica a frequente presença da toxina nas rações e no leite, respectivamente. Há, portanto, a necessidade de adequação das práticas agrícolas nas propriedades leiteiras estudadas do Estado de São Paulo, para evitar a contaminação dos ingredientes destinados à alimentação animal, e consequentemente a exposição humana à AFM 1 através do consumo de leite. Agradecimentos Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), processo n o 2005/ , o auxílio financeiro. Referências bibliográficas BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA. Resolução RDC n. 274, de 15 de outubro de 2002a. 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6 Oliveira, et al. RODRÍGUEZ-AMAYA, D. B.; SABINO, M. Pesquisa em micotoxinas no Brasil: a última década em foco. Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, n. 1, p. 1-11, SABINO, M.; PURCHIO, A.; ZORZETTO, A. P. Variations in the level of aflatoxin in cows milk consumed in the city of São Paulo, Brazil. Food Additives and Contaminants, v. 6, n. 3, p , SASSAHARA, M.; NETTO, D. P.; YANAKA, E. K. Aflatoxin occurrence in foodstuff supplied to dairy cattle and aflatoxin M 1 in raw milk in the North of Paraná state. Food Chemistry and Toxicology, v. 43, n. 6, p , SCOTT, P. M. Natural poisons. In: HELRICH, K. (Ed.). Official methods of analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 15 ed. Arlington, p SYLOS, C. M.; RODRIGUEZ-AMAYA, D. B.; CARVALHO, P. R. Ocurrence of aflatoxin M 1 in milk and dairy products commercialized in Campinas, Brazil. Food Additives and Contaminants, v. 13, n. 2, p , TUINSTRA, L. G.; ROOS, A. H.; van TRIJP, J. M. Liquid chromatographic determination of aflatoxin M 1 in milk powder using immunoaffinity columns for clean-up: interlaboratory study. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v. 76, n. 6, p , Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 30(Supl.1): , maio