VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO SIMULTANEA DE MICOTOXINAS E FUNGICIDAS EM GRÃOS DE TRIGO
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1 VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA DETERMINAÇÃO SIMULTANEA DE MICOTOXINAS E FUNGICIDAS EM GRÃOS DE TRIGO S.R. Luz 1, P.C. Pazdiora 2, J. Hoffmann 1, G.C. Dors 1, L.J. Dallagnol 2, F.C. Chaves 1 1-Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Campus Capão do Leão - Universidade Federal de Pelotas, s/n, CEP Pelotas - RS Pelotas Telefone: (53) suzanerickes@gmail.com; jessicafh91@hotmail.com; dorsgi@yahoo.com.br; fabio.chaves@ufpel.edu.br 2- Departamento de Proteção de Plantas, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Campus Capão do Leão - Universidade Federal de Pelotas, s/n, CEP Pelotas - RS Pelotas Telefone: (53) paulo.pazdiora@yahoo.com.br, ljdallagnol@gmail.com RESUMO O trigo está entre os cereais mais produzidos e consumidos mundialmente e constitui a base de diversos produtos alimentícios como farinhas, pães e massas. No Brasil 90% de sua produção se concentra na região Sul. Este cereal é suscetível a vários patógenos, especialmente fungos produtores de micotoxinas. Os grãos de trigo tratados com fungicidas podem apresentar tanto contaminação por fungicidas como micotoxinas e representam riscos à saúde humana e animal. Para a verificação desses contaminantes é necessário o desenvolvimento e a validação de métodos analíticos, para obtenção de resultados confiáveis e interpretáveis. O objetivo deste estudo foi validar um método analítico por LC-ESI-QToF- MS visando determinar simultaneamente micotoxinas e resíduos de fungicidas em grãos de trigo. O método foi validado para a determinação de aflatoxinas, deoxinivalenol, ocratoxina, zearalenona, protioconazol, trifloxistrobina, epoxiconazol e piraclostrobina em grãos de trigo. Todos os parâmetros avaliados ficaram dentro dos limites estabelecidos pela ANVISA, AOAC e SANCO. ABSTRACT Wheat is among the most produced and consumed cereals worldwide and forms the basis of various food products such as flour, bread and pasta. In Brazil 90% of its production is concentrated in the South. This cereal is susceptible to various pathogens, especially fungi producing mycotoxins. Wheat grains treated with fungicides may have either contamination fungicides as mycotoxins and pose risks to human and animal health. For verification of these contaminants is necessary to the development and validation of analytical methods, to obtain reliable and interpretable results. The aim of this study was to evaluate an analytical method by LC-ESI-QTOF-MS to determine both mycotoxins and residues of fungicides in wheat grains. The method was used for the determination of aflatoxins, deoxynivalenol, ochratoxin, zearalenone, prothioconazole, trifloxystrobin, pyraclostrobin and epoxiconazole in wheat grains. All parameters were within the limits established by ANVISA, AOAC and SANCO. PALAVRAS-CHAVE: Validação de método; Triticum aestivum; micotoxinas; resíduos de fungicidas. KEYWORDS: Method validation; Triticum aestivum; mycotoxins; fungicide residues.
2 1. INTRODUÇÃO O trigo (Triticum aestivum L.) é uma cultura anual, este cereal é um dos cereais mais produzidos e consumidos mundialmente, constituindo a base de diversos produtos alimentícios como farinhas, pães e massas. Este cereal é suscetível a vários patógenos, especialmente fungos produtores de micotoxinas (Tibola et al., 2013). Os grãos de trigo tratados com fungicidas podem, porém apresentar tanto contaminação por fungicidas como micotoxinas, representando riscos à saúde humana e animal (Zanella et al., 2012). As micotoxinas são metabólitos oriundos do metabolismo especializado de fungos filamentosos, sendo os principais do gênero Fusarium, Penicillium e Aspergillus, responsáveis pela produção de fumonisinas, zearalenona, deoxinivalenol, ocratoxinas e aflatoxinas (Georgianna e Payne, 2009). O consumo de alimentos contaminados com micotoxinas e resíduos de agrotóxicos podem causar malefícios à saúde do consumidor (Zanella et al., 2012). Em busca de praticidade, simplicidade e redução de tempo e custos foi desenvolvido um método de extração multiresíduos de alimentos denominado QuEChERS (rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro) (Anastassiades e Lehotay, 2003). A partir deste método, vários outros autores foram otimizando o método para expandir o número de compostos a serem analisados e aumentar o percentual de recuperação (Prestes et al., 2011). O método tem como vantagem a extração de vários analitos de interesse, em apenas três etapas: extração com solvente, partição com sais e limpeza do extrato, que é imprescindível para remoção dos interferentes, diminuindo o efeito de matriz (Prestes et al., 2011). Além do método de extração, faz necessária a validação do método analítico, que é um processo de confirmação ou demonstração do desempenho do método, que se faz necessária para a obtenção de informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra. Os parâmetros utilizados para a validação de um método são linearidade, limite de detecção e quantificação, exatidão, precisão, seletividade (AOAC, 2002). O objetivo deste trabalho foi validar metodologia analítica por LC-ESI-QToF-MS para determinação simultânea de micotoxinas e resíduos de fungicidas em grãos de trigo extraídas pelo método QuEChERS. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Amostras e padrões As amostras de trigo da cultivar TBIO Alvorada, armazenadas á 25 C, que não apresentavam contaminação nem por micotoxinas nem por fungicidas foram utilizadas para o processo de validação do método. Os padrões das micotoxinas (mix de aflatoxina B 1, B 2, G 1 e G 2 ; deoxinivalenol; zearalenona e ocratoxina A) e dos fungicidas (epoxiconazol; piraclostrobina; trifloxistrobina e protioconazol) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Brasil). 2.2 Método de extração O método de extração foi baseado no método QuEChERS proposto por Anastassiades e Lehotay (2003).
3 2.3 LC-ESI-QToF-MS As micotoxinas e os fungicidas foram identificados e quantificados utilizando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometro de massas (LC-ESI-QToF-MS). Foi utilizado um LC (Shimadzu) equipado com desgaseificador on line, bomba binária, amostrador automático e coluna de fase reversa (C18) Shim-pack XR ODS (75mm x 2,0mm; 2,2µm) e detector por arranjo de diodos (DAD) e por espectrômetria de massas (Bruker), equipado com fonte de ionização por electrospray, filtro de massas por quadrupolo e analisador por tempo de voo em sequência. As condições de analise seguiram o método proposto por Ortega et al. (2012). 2.4 Faixa de linearidade As curvas analíticas para cada substância de referência foram elaboradas em solvente (acetonitrila) e extrato de matriz. Foram utilizados 11 pontos compreendidos na faixa de concentração de 5 a 5000ηg ml -1, exceto para a fumonisina B 1, onde a faixa foi de 156 a 5000ηg ml -1. Cada ponto foi injetado em triplicata. 2.5 Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) A estimativa do LD e do LQ foram determinados com base no coeficiente angular e no desvio padrão do coeficiente linear de cada curva analítica (Equação 1 e 2) (ANVISA, 2003). LD = 3 x (desvio padrão x coeficiente linear)/coeficiente angular LQ = 10 x (desvio padrão x coeficiente linear)/coeficiente angular (eq.1) (eq.2) 2.6 Exatidão A exatidão foi determinada a partir de ensaios de recuperação que consistiram na adição dos padrões ao extrato de matriz de trigo, em triplicata. Os extratos foram fortificados com três concentrações (baixa, intermediária e alta) utilizando as concentrações de 19,5ηg ml -1, 312ηg ml -1 e 5000ηg ml -1. O percentual de recuperação foi obtido conforme a Equação 3. % Recuperação = [(Área do pico da amostra fortificada com o padrão - Área da amostra não fortificada)/área do pico do padrão)] x 100 (eq.3) 2.7 Precisão A precisão e a precisão intermediária foram determinadas pela repetitividade. Foi injetando um mix em triplicata, contendo todos os padrões de micotoxinas e fungicidas em três concentrações: 19,5ηg ml -1, 312ηg ml -1 e 5000ηg ml -1. Todos os pontos foram injetados em um mesmo dia para a precisão e para a precisão intermediária os pontos foram injetados em três dias consecutivos. Os resultados foram avaliados através do coeficiente de variação (CV) conforme a Equação 4. CV = (desvio padrão/concentração média determinada) x 100 (eq.4) 2.8 Especificidade e Seletividade A seletividade foi avaliada comparando os cromatogramas obtidos no sistema LC-ESI-QToF- MS a partir da injeção dos extratos fortificados e não-fortificados. Avaliou-se a ocorrência de coeluição de interferentes advindos da matriz com os analitos de interesse.
4 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Linearidade e curva analítica A linearidade ou faixa linear foi calculada a partir da equação da reta, conhecida como curva analítica. A Tabela 1 apresenta os valores dos coeficientes de determinação (r 2 ) para as equações das curvas analíticas em solvente (acetonitrila) e no extrato de trigo. Tabela 1 Equação da reta e coeficiente de determinação das micotoxinas e fungicidas em solvente e em extrato de matriz Coeficiente de determinação (r 2 ) Analitos Equação Solvente Equação Matriz AFB 1 y = x ,9998 y = x ,9932 AFB 2 y = x ,9983 y = x ,9985 AFG 1 y = x ,9996 y = 200.6x ,9975 AFG 2 y = x ,9996 y = x ,9979 DON y = x ,9990 y = x ,9771 OTA y = x ,9996 y = x ,9994 ZEA y = x ,9984 y = x ,9958 Epoxiconazol y = x ,9997 y = 418.1x ,9994 Piraclostrobina y = x ,9977 y = x ,9955 Protioconazol y = x ,9975 y = x ,9978 Trifloxistrobina y = x ,9978 y = x ,9923 Aflatoxina (AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2 ), deoxinivalenol (DON), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). Todas as curvas analíticas apresentaram valores superiores a 0,99 para o coeficiente de determinação (r 2 ) atendendo a recomendação da ANVISA (2003), exceto o deoxinivalenol elaborado em extrato de matriz que apresentou um coeficiente de correlação de 0,9771, porém ainda dentro do limite recomendado pelo INMETRO (2010), que é acima de 0,90. Quanto mais próximo de 1 for o r 2, maior o ajuste dos dados. As curvas apresentaram linearidade na faixa de concentração estudada, comprovando que os resultados obtidos são proporcionais a estas concentrações. 3.2 Limite de detecção e quantificação Em acetonitrila todos os analitos apresentaram valores de LD e LQ menores que os analitos em extrato de matriz. Possivelmente, os componentes da matriz exerceram alguma interferência que provocou a supressão do sinal dos íons dos analitos (Tabela 2).
5 Tabela 2 - Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ) das micotoxinas e fungicidas em solvente (acetonitrila) e em extrato de matriz de trigo LD (ηg ml -1 ) em solvente LQ (ηg ml -1 ) em solvente LD (ηg ml -1 ) em extrato de matriz LQ (ηg ml -1 ) em extrato de matriz AFB 1 1,21 3,68 1,44 4,38 AFB 2 0,45 1,45 0,90 2,73 AFG 1 0,53 1,61 2,09 6,34 AFG 2 0,53 1,61 1,50 4,55 DON 0,76 2,29 2,21 5,32 OTA 0,56 1,69 1,53 4,63 ZEA 1,56 4,72 2,09 4,99 Epoxiconazol 0,85 2,58 1,96 5,92 Piraclostrobina 0,53 1,61 1,17 3,53 Protioconazol 1,50 4,53 1,64 4,98 Trifloxistrobina 1,06 3,21 2,28 6,90 LD Limite de detecção; LQ Limite de quantificação. Aflatoxina (AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2 ), deoxinivalenol (DON), ocratoxina A (OTA) e zearalenona (ZEA). 3.3 Exatidão Para a análise de exatidão foram realizados ensaios de recuperação instrumental, ou seja, o extrato da matriz foi fortificado em três concentrações: 19,5ηg ml -1, 312ηg ml -1 e 5000ηg ml -1, utilizando como base a faixa linear da curva analítica. A média de recuperação variou para as micotoxinas de 81% ± 6 a 94% ± 4 e para os fungicidas de 85% ± 2 a 89% ± 2. A ANVISA (2003) e SANCO (2013) estabelece a faixa aceitável entre 70 a 120% e a AOAC (2002) recomenda a faixa entre 70 a 125% para analitos na concentração de µg kg -1 (ppb). Os valores de recuperação foram aceitáveis ficando dentro do limite especificado pelas diretrizes da ANVISA (2003) e AOAC (2002). 3.4 Precisão A avaliação da precisão instrumental foi obtida a partir da repetitividade e da precisão intermediária. O coeficiente de variação, tanto para a repetitividade quanto para a precisão intermediária, ficaram abaixo de 5% (dados não mostrados). A AOAC (2002) sugere que para analitos encontrados em concentração de ppb (µg kg -1 ) o coeficiente de variação (CV%) seja até 15% e o CV% para os analitos em concentrações de ppm (µg g -1 ) seja de até 6%. A SANCO estabelece que o desvio padrão deve ser menor que 20%. Portanto, o método analítico é preciso. 3.5 Especificidade e seletividade O método de análise utilizando cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas foi considerado altamente seletivo. Neste trabalho foi verificada a ausência de interferentes com íons de mesma relação massa/carga no mesmo tempo de retenção dos analitos avaliados. Deoxinivalenol (DON), Aflatoxina (AFB 1, AFB 2, AFG 1 e AFG 2 ), ocratoxina A (OTA), e zearalenona (ZEA).
6 4. CONCLUSÃO Através dos resultados obtidos pode-se concluir que é possível a utilização do método descrito para a identificação e quantificação das micotoxinas aflatoxina B 1, B 2, G 1 e G 2, deoxinivalenol, ocratoxina A e zearalenona e de resíduos dos fungicidas protioconazol, trifloxistrobina, epoxiconazol e piraclostrobina em grãos de trigo por LC-ESI-QToF-MS com segurança e confiabilidade, pois todos os parâmetros de validação ficaram dentro do estipulado pelas diretrizes AOAC, ANVISA e SANCO. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Anastassiades, M.; Lehotay, S. (2003). Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive SPE for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC International, 86, ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitárias. Resolução RE nº 899, de 29 de maio de Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos AOAC. Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals. Association of Official Analytical Chemists International, Georgianna, D. R.; Payne, G. A. (2009). Genetic regulation of aflatoxin biosynthesis: from gene to genome. Fungal Genetics and Biology, 46, González, R. R.; Frenich, A. G.; Vidal, J. L. M.; Prestes, O. D.; Grio S. L. (2012). Generic sample treatment method for simultaneous determination of multiclass pesticides and mycotoxins in wines by liquid chromatography mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1249, ICH- International Conference on Harmonisatio; Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1), INMETRO Instituto de Metrologia, Normatilização e Qualidade InsdustriaL, Orientação sobre validação de métodos analíticos, DOQ-CGCRE-008, Ortega, P. P.; López, B. G.; Reyes, J. F. G.; Martos, N. R.; Díaz, A. M. (2012). Generic sample treatment method for simultaneous determination of multiclass pesticides and mycotoxins in wines by liquid chromatography mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1249, Prestes, O. D.; Adaime, M. B.; Zanella, R. (2011). QuEChERS: possibilidades e tendências no preparo de amostra para determinação multirresíduo de pesticidas em alimentos. Scientia Chromatographica, 3, SANCO (European Commission), Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed, documento nº SANCO/12571/ 2013, Tibola, C. S; et al. (2013). Indicações técnicas para minimizar a contaminação de trigo por micotoxinas. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, Embrapa trigo, Zanella, R.; Prestes, O. D.; Friggi, C. A.; Martins, M. L.; Adaime, M. B. (2012). An Overview about recent advances in sample preparation techniques for pesticide residues analysis in cereals and feedstuffs. INTRCH,
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