USO DE ULTRASSOM NA OBTENÇÃO DE EMULSÕES O/W ESTABILIZADAS POR CONCENTRADO PROTEICO DE SORO DE LEITE.
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- Osvaldo das Neves Aires
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1 USO DE ULTRASSOM NA OBTENÇÃO DE EMULSÕES O/W ESTABILIZADAS POR CONCENTRADO PROTEICO DE SORO DE LEITE. E.M. Vélez-Erazo 1, L. Consoli 1, M.D. Hubinger 1 1- Departamento de Engenharia de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), CEP: Campinas SP Brasil, Telefone: +55 (19) Fax: +55 (19) (elianamve@gmail.com) (larissa.consoli@gmail.com) (mhub@fea.unicamp.br) RESUMO No presente trabalho usou-se ultrassom na obtenção de emulsões óleo em água de óleo de chia (rico em ômega 3) estabilizadas por concentrado proteico de soro de leite. Estudou-se o efeito da amplitude da potência (50, 75 e 100%) e o tempo (2, 4, 6, 10 e 15 min) na estabilidade, potencial ζ, diâmetro médio, distribuição de tamanho, microscopia ótica e comportamento reológico das emulsões. O efeito combinado de potência e tempo resulta em emulsões mais estáveis, com tamanho de gota menor e distribuição unimodal. Todas as emulsões apresentaram comportamento newtoniano. Um aumento extremo de tempo e potência (15 minutos e 75 e 100% de amplitude) resulta no excesso de processamento, formando emulsões cineticamente instáveis devido à re-coalescência das gotas. ABSTRACT In this study an ultrasound was used to obtain oil-in-water emulsions of chia oil (rich in omega 3) stabilized by whey protein concentrate. We studied the effect of power amplitude (50, 75 and 100%) and time (2, 4, 6, 10 and 15 min) on the stability, ζ-potential, superficial mean diameter, size distribution, optical microscopy and rheological behavior of emulsions. The combined effect of power and time resulted in emulsions kinetically more stable, with smaller droplets size and unimodal distribution. All emulsions showed newtonian behavior. The use of extreme conditions of sonication time and power (15 minutes and 75 and 100% amplitude) resulted in overprocessing, causing recoalescence of the droplets and, thus, kinetically unstable emulsions. PALAVRAS-CHAVE: óleo de chia; estabilidade; microemulsão; excesso de processamento. KEYWORDS: chia oil; stability; microemulsion; overprocessing. 1. INTRODUÇÃO. O óleo de chia é a fonte vegetal com maior teor de ômega 3 atualmente conhecida (Julio et al., 2015), porém seu uso como bioativo pode ser limitado devido a sua sensibilidade à deterioração oxidativa (Ixtaina, et al., 2012). A emulsificação representa uma alternativa para proteger os compostos do óleo, além de possibilitar o seu uso como aditivo em diversos produtos. Para obter emulsões podem ser utilizados diferentes métodos, sendo um deles a aplicação de ultrassom. Esta técnica ainda é pouco estudada em comparação aos métodos convencionais que envolvem o uso de dispositivos mecânicos (agitadores tipo rotor-estator, homogeneizadores a alta pressão), para a produção de emulsões que atuem como veículo de bioativos, apesar de representar um método promissor em comparação aos mesmos métodos (Silva, et al., 2016). Neste sentido, é importante estudar as condições de processo do ultrassom (potência e tempo) para obter emulsões com
2 estabilidade à cremeação, tamanho de gota pequeno, distribuição de tamanho unimodal, e que possam ser usadas como aditivo em algum alimento líquido, ou para posterior secagem. Com base no exposto anteriormente, este trabalho propõe o estudo das condições de processo (tempo e potência) de sonicação para obter emulsões óleo em água (O/W) de óleo de chia, estabilizadas com concentrado proteico de soro de leite com objetivo futuro de usá-la na forma de pó. 2. MATERIAL E MÉTODOS. 2.1 Material. O óleo de chia foi doado pela empresa R&S Blumos Comercial de Produtos Alimentícios Ltda. (Brasil) e o concentrado proteico de soro de leite (WPC) foi fornecido pela Fonterra Cooperative Group Limited (Auckland, Nova Zelândia). 2.2 Preparação e Caracterização das Emulsões. Emulsões óleo em agua (O/W) foram preparadas a 25±2 ºC com 18% (m/m) óleo de chia, e como fase contínua foi usada uma solução aquosa 1,5% (m/m) de estabilizante (WPC). As duas fases foram misturadas e homogeneizadas usando um ultrassom (QSonica de 700W). Variou-se a amplitude nominal da potência em 50, 75 e 100%, nos tempos 2, 4, 6, 10 e 15 minutos de sonicação. A dispersão de WPC foi acidificada até ph de 3,8 com HCl 1M antes do preparo da emulsão, para assegurar carga positiva da proteína. As emulsões foram preparadas em duplicata e caracterizadas quanto à: Índice de cremeação: Alíquotas de 100 ml de cada emulsão foram transferidas para provetas graduadas de 100 ml imediatamente após o preparo. As provetas foram seladas e estocadas à temperatura ambiente por 24 horas. A estabilidade foi medida pela altura da fase superior e foi expressa como índice de cremeação, segundo a equação 1. %IC = ( H H o ) 100 (1) Onde H o é a altura inicial e H é a altura da fase inferior da emulsão. Densidade de carga superficial: A densidade de carga superficial foi determinada através da medida do potencial zeta (ζ) em uma câmara de medição de microeletroforese (ZetaSizer Nano-ZS, Malvern Instruments Ltda, Worcestershire, Reino Unido). As amostras foram diluídas em água acidificada até ph 3,8 à temperatura ambiente. As medidas foram feitas em triplicata. Microscopia ótica: A microestrutura da emulsão foi observada com ampliação de 1000X com óleo de imersão no microscópio ótico Carl Zeiss (modelo Axio Scope A1, Gottingen, Alemanha). A imagem foi avaliada no software AxioVision Rel. 4,8 (Carl Zeiss, Alemanha). Distribuição de tamanho de gota: Foi usada a técnica de espalhamento de luz por difração a laser através do equipamento Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Ltda, Malvern, Reino Unido). As medições foram realizadas em quintuplicata. Para o tamanho de gota foi considerado o diâmetro médio superficial (D [3,2]) e o índice de polidispersão (IPD) como mostrado nas equações 2 e 3. D [3,2] = n id i 3 n i d i 2 (2)
3 IPD = d (90) d (10) d (50) (3) Onde d i é o diâmetro das gotas, n o numero de gotas, e d (10), d (50), d (90) são os diâmetros a 10%, 50% e 90% de volume acumulativo respectivamente. Ensaio reológico: Curvas de escoamento foram construídas para medir a viscosidade das emulsões. Os ensaios foram feitos em triplicata em um reômetro de deformação controlada AR1500ex (TA Instruments, Elstree, UK), em geometria de placa cone de 60 mm de diâmetro e GAP de 67µm. As curvas obtidas foram ajustadas aos modelos empíricos para fluidos Newtonianos e lei de potência segundo as equações 4 e 5 respectivamente. A viscosidade aparente foi calculada como a relação entre tensão de cisalhamento (σ) e a taxa de deformação (γ ). σ = γ μ (4) σ = K (γ ) n (5) Onde µ é a viscosidade (Pa.s); K é o índice de consistência (Pa.s n ) e n é o índice de comportamento. 2.3 Análise Estatística. Realizou-se Análise de Variância utilizando-se o Software Statistica 8,0 (Statsoft, Tulsa, EUA) e o Teste de Tukey foi utilizado para a análise de diferença de médias, com p 0, RESULTADOS E DISCUSSÃO. 3.1 Índice de Cremeação e Densidade de Carga Superficial. O índice de cremeação é um indicativo da estabilidade das emulsões à separação gravitacional; as gotas de óleo se movimentam para cima devido à diferença de densidade com o meio aquoso (Gómez-Mascaraque & López-Rubio, 2016). Como se pode ver na Figura 1, após 24 horas do preparo, as emulsões produzidas com 50% de amplitude e 2, 4 e 6 minutos, e 75% e 2 minutos, apresentaram separação de fases, ao contrário das emulsões feitas com 100%, onde todas foram estáveis à cremeação. Na mesma figura são apresentados os valores do índice de cremeação e observamos que à medida que se aumenta a potência e o tempo, as emulsões obtidas são mais estáveis. Figura 1 Índice de cremeação (%) das emulsões O/W após 24 horas. 63,75 ± 0,96 A 44,25 ± 0,50 B 40,75 ± 1,26 C 35,5 ± 0,58 D 2 minutos 4 minutos 6 minutos 2 minutos 50% 75%
4 Os valores de carga superficial das emulsões medidas através do potencial zeta encontram-se na Tabela 1. A medição foi feita em ph 3,8, onde o WPC apresenta carga positiva, com a finalidade de possibilitar o uso posterior de um estabilizante de carga negativa e formar uma camada dupla. Quanto mais estável é a emulsão, maior é o valor do potencial zeta com valor máximo de 23,56±1,02 mv. As emulsões que apresentaram separação de fases têm valores entre 16,93 ± 2,02 e 18,15 ± 1,48 mv. Estes resultados estão de acordo com outros autores, que concluíram que as emulsões com potencial zeta menor que 20 mv tendem a ser instáveis (Chuah, et al., 2009). De forma geral, a instabilidade e baixos valores do potencial zeta das emulsões produzidas com baixa potência junto com tempos curtos, pode estar relacionada à falta de energia necessária para diminuir o tamanho das gotas. Tabela1 Potencial ζ (mv) das emulsões feitas a 50 (59,76±1,16 W), 75 (89,39±2,13 W) e 100% (128,14±1,58 W) de amplitude de potência nos tempos 2, 4, 6, 10 e 15 minutos. 2 min 4 min 6 min 10 min 15 min 50% 17,68±1,61 Cb 16,93±2,02 Cb 18,38±1,02 BCc 19,50±1,20 Bb 21,44±1,17 Aa 75% 18,15±1,48 Cb 21,25±1,40 Ba 22,15±0,79 ABb 23,07±1,28 Aa 21,13±1,29 Ba 100% 22,92±0,96 ABa 22,61±0,83 ABa 23,36±1,02 Aa 23,56±1,02 Aa 22,04±0,88 Ba Diferentes letras indicam diferença significativa (p 0,05). Letras maiúsculas: diferença na mesma amplitude. Letras minúsculas: diferença no mesmo tempo. 3.2 Microscopia ótica e distribuição de tamanho de gota. As emulsões feitas a 50% de amplitude apresentaram os maiores tamanhos de gota, diminuindo conforme aumenta o tempo de processo (Tabela 2). Esse mesmo comportamento se observa quando se utiliza 75 e 100% de amplitude, além de apresentar queda significativa (p < 0,05) do tamanho de gota ao aumentar a potência utilizada. Tamanhos de gota maiores que 3,77 µm apresentaram separação de fase e menor potencial zeta. O índice de polidispersão variou entre 1,76 ± 0,19 e 2,35 ± 0,36, e teve maior influência da potência do que do tempo de sonicação. O menor tamanho de gota foi 1,60 ±0,04 µm obtido com 100% de amplitude e 10 minutos, mas não apresenta diferença significativa com o valor alcançado no mesmo tempo a 75%. Na emulsão produzida com 15 min a 75 e 100% de potência, observa-se um aumento significativo (p<0,05) no D [3,2] comparado com o resultado obtido no tempo de 10 min. Esta ocorrência provavelmente se deve a um excesso de processamento, onde uma homogeneização muito intensa promove o choque entre as gotas, levando à sua re-coalescência (Silva, et al., 2016). Tabela 2 Diâmetro médio de gota D [3, 2] e índice de polidispersão (IPD) das emulsões feitas a 50, 75 e 100% da amplitude da potência nos tempos 2, 4, 6, 10 e 15 minutos. Tempo 50% 75% 100% (min) D [3, 2] (µm) IPD D [3, 2] (µm) IPD D [3, 2] (µm) IPD 2 4,11 ± 0,33 Aa 2,29 ± 0,06 3,77 ±0,16 Aa 2,13 ±0,03 2,23 ±0,03 Bb 2,78 ±0,05 4 3,94 ± 0,25 ABa 1,93 ± 0,05 3,52 ±0,26 Aa 2,15 ±0,09 1,94 ±0,01 Cb 2,46 ±0,05 6 3,69 ± 0,28 ABCa 2,09 ± 0,11 3,42 ±0,13 Aa 1,95 ±0,02 1,72 ±0,24 Db 2,06 ±0, ,51 ± 0,23 BCa 1,99 ± 0,01 1,66 ±0,03 Bb 1,88 ±0,08 1,60 ±0,04 Db 1,76 ±0, ,30 ± 0,09 Ca 2,32 ± 0,01 3,62 ±0,21 Aa 2,09 ±0,01 3,31 ±0,20 Aa 2,35 ±0,36 Diferentes letras indicam diferença significativa (p 0,05). Letras maiúsculas: diferença na mesma amplitude. Letras minúsculas: diferença no mesmo tempo. Na Figura 2 são apresentados os gráficos de distribuição de tamanho e as micrografias das emulsões. Todas as distribuições de tamanho das emulsões feitas com 50% de amplitude apresentam um comportamento com tendência bimodal (Figura 2A), talvez devido a uma fração de gotas grandes
5 que ficaram como resultado de uma baixa eficiência na homogeneização, sendo mais sensíveis à floculação (Dickinson, et al., 2003). Ao passar para a amplitude de 75% e 10 minutos de processo, a distribuição tem forma unimodal (Figura 2B), o que sugere homogeneidade no tamanho de gota e, portanto, maior estabilidade da emulsão, afirmação que se suporta com a micrografia, onde não se observa floculação ou coalescência das gotas. Já na Figura 2C se exibe a distribuição unimodal obtida com o menor tempo de processo; esta emulsão tem um tamanho de gota maior do que a apresentada na figura 2B, mas dependendo da possível aplicação final, pode ser uma boa opção devido à baixa energia de processo utilizada para obter uma emulsão estável. Figura 2 Micrografias e distribuição de tamanho. A: 50%, 2 min; B: 75%, 10 min; C: 100%, 2 min. Escala: 5µm. A B C 3.3 Ensaio reológico. As curvas de escoamento das emulsões que não apresentaram separação de fases em 24 horas após o preparo são ilustradas na Figura 3. Estas emulsões apresentaram bom ajuste (R 2 >99%) aos modelos estudados, valores de n entre 0,97 e 1,10 (dados não apresentados) e exibiram baixa viscosidade (Tabela 3), portanto todas as emulsões apresentaram características de fluido newtoniano. Quando se preparam emulsões a concentrações baixas de proteína, estas apresentam baixa viscosidade e comportamento newtoniano, provavelmente devido ao pouco excesso de proteína não diluída na fase aquosa (Julio et al., 2015). Figura 3 Curvas de escoamento das emulsões estáveis após 24 horas de preparo. A: 50%; B: 75%; C:100% de amplitude da potência. A B C As viscosidades (µ) variam entre 0,0026 e 0,0040 Pa.s, mostrando diferença significativa (p 0.05) à medida que aumenta o tempo e a amplitude de potência, diferenças que também ficam evidentes nos valores de tensão de cisalhamento (Figura 3), que diminuem à medida que decresce a viscosidade.
6 Tabela 3 Parâmetros reológicos das emulsões estáveis após 24 horas de preparo. (µ: Viscosidade, D.P.: desvio padrão). 50% 75% 100% 10 min 15 min 4 min 6 min 10 min 15 min 2 min 4 min 6 min 10 min 15 min µ (Pa.s) 0,0040 a 0,0035 b 0,0038 a 0,0038 a 0,0027 c 0,0034 b 0,0028 b 0,0027 bc 0,0027 bc 0,0026 c 0,0033 a D.P. 0,0001 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001 0, , , , , ,00004 R 2 (%) 99,94 99,85 99,87 99,96 99,48 99,82 99,63 99,55 99,86 99,49 99,80 Diferentes letras indicam diferença significativa (p < 0,05) na mesma amplitude. 4. CONCLUSÕES. Emulsões O/W de óleo de chia estabilizadas com concentrado proteico de soro de leite foram obtidas usando ultrassom a diferentes amplitudes de potência em diferentes tempos de processo. Quando se usou 50% de amplitude houve separação de fases, potencial zeta baixo, os maiores tamanhos de gota e distribuições de tamanho com tendência bimodal. À medida em que a amplitude e o tempo aumentaram, alcançaram-se tamanhos de gota menores, distribuição unimodal e emulsões cineticamente mais estáveis. Todas as emulsões apresentaram características de fluido Newtoniano com baixa viscosidade. Os melhores parâmetros de processo foram 100% de potência e 2 minutos, já que se obtiveram os melhores resultados usando pouco gasto energético. Quando se usam tempos longos (15 min) e altas potências, ocorre o excesso de processamento, com um aumento do tamanho de gota causado devido à sua re-coalescência 5. AGRADECIMENTOS. Os autores agradecem o financiamento, acesso aos equipamentos, e assistência ao Laboratório de Engenharia de Processos da Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP, FAPESP (2015/ ; 2004/ ) e EMU (2009/ ); à CAPES pela bolsa de mestrado e ao CNPq pela bolsa de Doutorado. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. Chuah, A. M., Kuroiwa, T., Ichikawa, S., Kobayashi, I., & Nakajima, M. (2009). Formation of biocompatible nanoparticles via the self-assembly of chitosan and modified lecithin. Journal of Food Science, 74(1). Dickinson, E., Radford, S. J., & Golding, M. (2003). Stability and rheology of emulsions containing sodium caseinate: Combined effects of ionic calcium and non-ionic surfactant. Food Hydrocolloids, 17(2), Gómez-Mascaraque, L. G., & López-Rubio, A. (2016). Protein-based emulsion electrosprayed micro- and submicroparticles for the encapsulation and stabilization of thermosensitive hydrophobic bioactives. Journal of Colloid and Interface Science, 465, Ixtaina, V. Y., Nolasco, S. M., & Tomás, M. C. (2012). Oxidative stability of chia (Salvia hispanica L.) seed oil: Effect of antioxidants and storage conditions. Journal of the American Oil Chemists Society, 89(6), Julio, L. M., Ixtaina, V. Y., Fernández, M. A., Sánchez, R. M. T., Wagner, J. R., Nolasco, S. M., & Tomás, M. C. (2015). Chia seed oil-in-water emulsions as potential delivery systems of ω-3 fatty acids. Journal of Food Engineering, 162, Silva, E. K., Azevedo, V. M., Cunha, R. L., Hubinger, M. D., & Meireles, M. A. A. (2016). Ultrasoundassisted encapsulation of annatto seed oil: Whey protein isolate versus modified starch. Food Hydrocolloids, 56,
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