INTERAÇÃO ELETROSTÁTICA ENTRE PROTEÍNAS DE SOJA E PECTINA NA ESTABILIZAÇÃO DE EMULSÕES O/W
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1 INTERAÇÃO ELETROSTÁTICA ENTRE PROTEÍNAS DE SOJA E PECTINA NA ESTABILIZAÇÃO DE EMULSÕES O/W K.M. Albano 1, V.R.N. Telis 2 1-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista - UNESP, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas CEP: São José do Rio Preto SP Brasil, Telefone: 55 (17) Fax: 55 (17) (kivia_engalimentos@yahoo.com.br) 2- idem ao 1. RESUMO Proteínas e polissacarídeos, quando combinados em proporções adequadas e em ph de maior potencial para interação eletrostática, podem agir como emulsificantes/estabilizantes de emulsões. Este trabalho avaliou o comportamento reológico e a estabilidade de emulsões formuladas com diferentes proporções de isolado proteico de soja (SPI) e pectina de alta metoxilação (PEC), com teores de óleo na faixa de 5 a 15%, e submetidas à aplicação de ultrassom. O comportamento das emulsões variou em função da proporção de biopolímeros: na proporção 1:1 (50%SPI:50%PEC) os sistemas apresentaram comportamento Newtoniano, menores gotículas e ausência de cremeação, características de emulsões estáveis; já os sistemas na proporção 4:1 (80%SPI:20%PEC) mostraramse pseudoplásticos, com gotas maiores e elevado índice de cremeação, caracterizando um sistema desestabilizado por separação gravitacional. A microestrutura das emulsões foi avaliada por microscopia ótica e laser confocal, permitindo observar que as emulsões preparadas com proporção 50%SPI:50%PEC permaneceram estáveis por um período de 7 dias. ABSTRACT Proteins and polysaccharides, when combined in suitable proportions and at ph of higher potential for electrostatic interaction, may act as emulsifiers/emulsion stabilizers. This work evaluated the rheological behavior and stability of emulsions formulated with different proportions of soy protein isolate (SPI) and high methoxyl pectin (PEC), with oil contents in the range of 5 to 15%, and subjected to ultrasound application. The emulsion behavior varied with the biopolymer proportion: at a ratio 1:1 (50%SPI:50%PEC) the systems presented Newtonian behavior, smaller oil droplets and absence of cremeation, characteristics of stable emulsions; on the other hand, systems of ratio 4:1 (80%SPI:20%PEC) showed to be pseudoplastic, with larger droplets and high cremeation indexes, characterizing a system destabilized by gravitational separation. The emulsion microstructure was evaluated by optical and laser confocal microscopy, allowing observing that the emulsions prepared with ratio 50%SPI50%PEC remained stable along a period of 7 days. PALAVRAS-CHAVE: reologia, ultrassom, cremeação, microestrutura KEYWORDS: rheology, ultrasound, cremeation, microstructure 1. INTRODUÇÃO Informações sobre a estabilidade de emulsões são importantes para o desenvolvimento de produtos que apresentem propriedades desejáveis por um longo período de tempo (Dickinson, 1992). Por se tratar de sistemas termodinamicamente instáveis, emulsões cineticamente estáveis por períodos consideráveis precisam conter substâncias químicas (emulsificantes e/ou estabilizantes) e, em muitos
2 casos, ser submetidas à aplicação de forças mecânicas intensas (processo de homogeneização) para que ocorra a diminuição do tamanho de gotas (McClements, 2005). As proteínas possuem ação emulsificante, sendo adsorvidas na interface óleo/água, reduzindo a tensão interfacial e formando membranas protetoras ao redor das gotas que resultam do processo de homogeneização (McClements, 2005). O isolado proteico de soja é uma boa alternativa para tal aplicação devido ao seu alto teor de proteínas e ao bom desempenho tecnológico dos produtos (Manion; Correding, 2006; Tomoskozi et al., 2001). Por outro lado, a principal ação dos estabilizantes se dá pela modificação da viscosidade ou gelificação da fase aquosa contínua (Dickinson, 2003). A pectina constitui-se em um coloide por excelência e, em função de seu caráter hidrofílico, apresenta a propriedade de reter grande quantidade de água, produzindo uma solução viscosa, e sendo amplamente utilizada em alimentos com a função de espessante, texturizante, emulsificante ou estabilizante (Bowers, 1992). Com base nas considerações acima, o objetivo deste trabalho foi investigar a estabilidade de emulsões estabilizadas pela interação eletrostática entre isolado proteico de soja e pectina de alta metoxilação submetidas à aplicação de ultrassom, por meio de medidas reológicas, microscopia ótica e laser confocal, índice de cremeação, avaliando o efeito da proporção de biopolímeros e o teor de óleo. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Os materiais utilizados foram pectina de alta metoxilação (PEC) (Danisco Brasil Ltda.), isolado proteico de soja (SPI) (Tovani Benzaquen Ingredientes) e óleo de soja comercial (Liza ). A solução estoque de pectina (0,02 kg/kg) foi preparada em tampão McIlvaine ph 3,5 (Morita e Assumpção, 2007), agitada e deixada em repouso por 12 horas a 25 ºC para completa hidratação. A solução estoque de SPI (0,02 kg/kg) foi preparada em duas etapas: inicialmente a proteína foi solubilizada em água destilada (1/3 do peso total da solução), em ph 11,0 ajustado com NaOH (1 N); após solubilização, a massa total da solução foi completada com tampão McIlvaine ph 3,5. As soluções foram adicionadas de azida de sódio (0,03 %) para prevenir crescimento microbiano. Emulsões do tipo óleo em água (O/W) foram preparadas conforme Kaltsa et al. (2013) com algumas modificações, nas proporções 50%SPI:50%PEC (1:1) e 80%SPI:20%PEC (4:1), as porcentagens em massa de SPI e de Pectina se referem à massa total de biopolímeros na emulsão. Óleo de soja (5, 10 e 15 % em relação à massa total da emulsão) foi disperso na solução de SPI com agitador ultra turrax (T-25, IKA, Alemanha) por 4 minutos a rpm. Em seguida, a massa desejada de solução de pectina foi misturada à emulsão, a qual foi agitada por mais 4 min na mesma velocidade. As emulsões foram então levadas ao ultrassom na frequência de 20 khz por 1 minuto de forma contínua, com potência de 120 W. Finalmente, as emulsões foram transferidas para tubos de ensaio e mantidas em repouso por 48 horas, sendo submetidas a ensaios reológicos, determinação do índice de cremeação, microscopia ótica e laser confocal. O comportamento reológico das emulsões foi determinado em reômetro rotacional AR- 2000EX (TA Instruments, Delaware, USA), com geometria de placas paralelas ranhuradas, gap de 400 μm, obtendo-se curvas de tensão (τ) versus taxa de deformação ( ), com rampas descendente (100 a 0,1 s -1 ) e ascendente (0,1 a 100 s -1 ), a 25 ºC. Os modelos de Newton (Equação 1) e lei da potência (Equação 2) foram ajustados às curvas de escoamento, permitindo o cálculo dos parâmetros reológicos (viscosidade, µ, índice de consistência, K, e índice de comportamento, n). A morfologia das emulsões foi avaliada em microscópio ótico (Olympus CX31), com lente de aumento de 40 acoplada a uma câmara de vídeo (Olympus, SC30), e por microscopia laser confocal em microscópio ZEISS LSM 710 com aumento de 40, com imagens fluorescentes verdes e vermelhas obtidas a partir de dois canais separados e posteriormente superpostas. O índice de cremeação (IC), indicativo da estabilidade da
3 emulsão, foi determinado, conforme Perrechil e Cunha (2013), a partir da altura do soro (H) e da altura inicial da emulsão no tubo (H 0 ), de acordo com a Equação 3: (1) n K (2) H (3) IC(%) 100 Ho 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Índice de cremeação (IC) e morfologia das emulsões Todas as emulsões na proporção SPI:PEC (1:1) foram estáveis, sem separação de fases (IC = 0), conforme mostra a Figura 1. Por outro lado, na proporção SPI:PEC (4:1), em todos os teores de óleo houve separação de fases, formando-se um sistema cremoso na fase superior e um líquido transparente na fase inferior. A estabilidade do sistema 1:1 em comparação com a separação de fases observada no sistema 4:1 pode ser discutida em função das proporções entre os diferentes biopolímeros, o óleo e a água presentes em cada formulação, de acordo com a Tabela 1. Enquanto a proporção SPI:óleo é cerca de 1,6 vezes maior no sistema 4:1, a proporção PEC:óleo foi cerca de 2,5 menor na emulsão 4:1. Isso demonstra que a maior disponibilidade de proteína, o que pode favorecer maior recobrimento da interface óleo/água, não foi capaz de compensar a deficiência de pectina no sistema. A insuficiência de pectina, também demonstrada pelas proporções PEC:H 2 O, pode ter sido responsável pela baixa viscosidade da fase contínua, a qual permitiu a separação gravitacional das emulsões 4:1. O índice de cremeação das emulsões 4:1 apresentou valores de 46,2, 38,6 e 37,2 % para 5, 10 e 15 % de óleo, respectivamente. Considerando que o óleo presente no sistema tende a se alojar na fase creme, pode-se atribuir o aumento do volume ocupado pela fase creme ao aumento da massa (ou volume) de óleo presente na emulsão. Figura 1 - Aspecto visual das emulsões após 48 horas de repouso. Tabela 1 - Proporções entre os diferentes componentes das emulsões. 50%SPI:50%PEC (1:1) 80%SPI:20%PEC (4:1) Óleo (%) SPI:Óleo PEC:Óleo PEC:H 2 O Óleo (%) SPI:Óleo PEC:Óleo PEC:H 2 O 5 % 1:5,3 1:5,3 1:98 5 % 1:3,3 1:13,2 1: % 1:11,1 1:11,1 1:98 10 % 1:6,9 1:27,8 1: % 1:17,6 1:17,6 1:98 15 % 1:11,0 1:44,1 1:245 A morfologia das emulsões foi avaliada por microscopia ótica e por microscopia laser confocal. No caso das emulsões 4:1, tais análises foram efetuadas apenas em amostras da fase creme. As análises na fase creme se justificam por serem úteis para a compreensão dos mecanismos de
4 desestabilização, bem como pelo fato que se trata de um material com propriedades de textura que podem ser de interesse em determinadas aplicações na indústria de alimentos, uma vez que, logo após a separação inicial, suas características foram mantidas por um período de 7 dias. Nas imagens obtidas por microscopia ótica se observa que a população de gotas aumentou com o aumento do teor de óleo. Além disso, as emulsões 50%SPI:50%PEC (1:1) apresentaram menores gotículas dispersas na fase contínua, num comportamento característico de emulsões estáveis (Figura 2). As imagens também mostram que, para formulações adequadas, a homogeneização por ultrassom proporcionou a obtenção de pequenas gotículas. Figura 2 - Microscopia ótica das emulsões com diferentes proporções SPI:PEC e teores de óleo. 2 dias 7 dias 2 dias 7 dias 1:1 5% 1:1 5% 4:1 5% 4:1 5% 1:1 10% 1:1 10% 4:1 10% 4:1 10% 1:1 15% 1:1 15% 4:1 15% 4:1 15% A Figura 2 revela que o mecanismo de desestabilização está associado ao crescimento das gotas de óleo, já que o tamanho médio e a polidispersão das gotas aumentou em 4:1. Esse crescimento pode ocorrer pela junção de gotas próximas entre si (coalescência parcial) ou pelo crescimento das gotas maiores à custa da difusão de gotas menores que, na sequência, se fundem às gotas maiores (Ostwald ripenning) (McClements, 2005). Esse processo foi mais intenso em sistemas 4:1, possivelmente porque houve separação de fases e maior empacotamento das gotas devido à menor proporção de pectina utilizada. Cho e McClements (2008) avaliaram a microscopia ótica de emulsões em diferentes concentrações de pectina e constataram diferenças nas emulsões, destacando a importância do controle da concentração de polissacarídeo para assegurar a estabilidade coloidal da emulsão. Perrechil e Cunha (2013) avaliaram a estabilidade de emulsões preparadas com diferentes biopolímeros e reportaram que a baixa concentração de polissacarídeo causou a desestabilização das emulsões. As imagens de microscopia laser confocal mostram que as gotículas de óleo foram revestidas pela proteína (em verde) e recobertas e aprisionadas pela pectina (em vermelho) em uma rede na fase contínua (Figura 3). Enquanto no sistema 1:1 as gotas são pequenas, a fase creme das emulsões 4:1 apresenta gotas grandes e flocos de pequenas gotas que se formaram, provavelmente devido à aproximação das partículas originais após a drenagem da água da fase contínua. Nesse caso, é possível identificar um terceiro mecanismo de desestabilização, i.e., a floculação, processo no qual as gotas emulsificadas se associam em flocos sem a destruição das gotas individuais (McClements, 2005).
5 Tensão de Cisalhamento (Pa) Tensão de Cisalhamento (Pa) Figura 3 Microscopia laser confocal de emulsões com 15 % de óleo nas proporções SPI:PEC 1:1 (a) e 4:1 (b) (ambas com o mesmo aumento). (a) (b) 3.2 Comportamento reológico O ajuste dos modelos reológicos às curvas de escoamento apresentou altos coeficientes de determinação (R 2 > 0,9) e não foram observados índices significativos de tixotropia (Figura 4), uma vez que os parâmetros reológicos não sofreram grandes variações entre a rampa descendente (rampa 1) e a rampa ascendente (rampa 2) (Tabela 2). A ausência de tixotropia indica boa estabilidade das emulsões frente ao cisalhamento. Tabela 2- Parâmetros reológicos e coeficiente de determinação (R 2 ) para emulsões com diferentes porcentagens de óleo preparadas com SPI:PEC nas proporções 1:1 e 4:1 a 25 C. Modelo de Newton Modelo Lei da Potência SPI:PEC Rampa 1 Rampa 2 SPI:PEC Rampa 1 Rampa 2 1:1 µ 4:1 % Óleo R 2 µ R 2 K n R 2 K n R 2 (kg/m.s) (kg/m.s) % óleo (Pa.s n ) (Pa.s n ) 5% % % % % % Figura 4- Comportamento reológico das emulsões com 5 % de óleo (verde), 10 % (vermelho) e 15 % (preto) nas proporções SPI:PEC 1:1 (a) e 4:1 (b); curvas de escoamento em rampa descendente (, e ) e ascendente (, e ) Taxa de Deformação (s -1 ) Taxa de Deformação (s -1 ) (a) Para as emulsões com proporção SPI:PEC 1:1, as curvas de escoamento apresentaram comportamento Newtoniano e não houve diferenças para os teores de óleo de 5 e 10 %, enquanto para 15 % de óleo houve apenas um leve aumento da viscosidade (Figura 4a). O comportamento Newtoniano revela a estabilidade das emulsões frente ao cisalhamento, o que pode ser atribuído a um balanço adequado entre os biopolímeros estabilizantes. Piazza et al. (2009), ao avaliar a reologia interfacial de filmes formados com proteínas de soja e pectina de alta metoxilação, constataram um efeito estabilizador e estruturante da pectina, o qual foi atribuído à formação de agregados proteínapolissacarídeo na interface óleo/água. (b)
6 Nas emulsões com proporção SPI:PEC 4:1 (Figura 4b), os ensaios reológicos foram feitos apenas para a fase creme. Estes apresentaram comportamento pseudoplástico (n < 1) em todos os teores de óleo analisados. Houve aumento no índice de consistência (K) com o aumento do teor de óleo, indicando o aumento do empacotamento em maiores teores de óleo. É interessante notar que, ao contrário dos sistemas 1:1, nas emulsões 4:1 a segunda rampa (ascendente) apresenta menores viscosidades aparentes em altas taxas de deformação do que a primeira rampa. Isso demonstra que esses materiais são mais suscetíveis ao cisalhamento, o qual pode ser responsável pelo rompimentos de agregados ou pela deformação de gotas (Marfil et al., 2012). 4. CONCLUSÕES Emulsões estabilizadas pela combinação de SPI e pectina de alta metoxilação foram estáveis quando foram empregados na proporção de 1:1, com teor de óleo de 5 a 15%, possibilitando sua aplicação em alimentos com baixo nível calórico. Sistemas formulados com menor proporção de pectina (4:1) sofreram cremeação, provavelmente devido à insuficiência de pectina na fase contínua. Mesmo assim, os cremes obtidos permaneceram estáveis após 7 dias e não apresentaram separação de óleo, e possuem características reológicas interessantes para aplicações na indústria de alimentos. 5. AGRADECIMENTOS À FAPESP (Procs. 2013/ and 2014/ ), Danisco e Tovani Benzaquen. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bowers, J. (1992). Food Theory and Aplications (2.ed.). New York: Macmillan Publishing Company. Cho, Y-H.; McClements, D. J. Theoretical (2008). Stability Maps for Guiding Preparation of Emulsions Stabilized by Protein-Polysaccharide Interfacial Complexes. Langmuir, 25(12), Dickinson, E. (1992). An introduction to food hydrocolloids (chapter 1). Oxford, UK: University Press. Dickinson, E. Colloidal aggregation: mechanisms and implications. In E. Dickinson, T. Van Vliet (Eds). (2003). Food colloids, biopolymers and materials, Kaltsa, O.; Michon, C.; Yanniotis, S.; Mandala, I. (2013). Ultrasonic energy input influence on the production of sub-micron o/w emulsions containing whey protein and common stabilizers. Ultrasonics Sonochemistry, 20(3), Manion, B.; Correding, M. (2006). Interactions between Whey Protein Isolate and Soy Protein Fractions at Oil Water Interfaces: Effects of Heat and Concentration of Protein in the Aqueous Phase. Journal of Food Science, 71(8), Marfil, P.H.M.; Telis-Romero, J.; Telis, V.R.N. (2012). Biopolymer Engineering in Food Processing. (Cap 3.Rheological Behavior of Biopolymer Suspensions). USA: CRC Press. McClements, D.J. (2005). Food emulsions: principles, practice, and techniques (2.ed.). Washington: CRC Press. Morita, T.; Assumpção, R. M. V. Manual de Soluções, reagentes e solventes (2.ed.). Blucher: 2 Ed. 2007, 724p. Perrechil, F.A.; Cunha, R.L. (2013). Stabilization of multilayered emulsions by sodium caseinate and - carrageenan. Food Hydrocolloids, 30(2), Piazza, L.; Durr-Auster, N.; Gigli, J.; Windhab, E. J.; Fischer, P. Interfacial rheology of soy proteins high methoxyl pectin films. Food Hydrocolloids, 23(8), , Tömösközi, S.; Lásztity, R.; Haraszi, R. Baticz, O. (2001). Isolation and study of the functional properties of pea proteins. Nahrung, 45(6),
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