Contaminação Bacteriana na Fermentação Etanólica. Profª. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis

Transcrição

1 Contaminação Bacteriana na Fermentação Etanólica Profª. Dra. Dejanira de Franceschi de Angelis

2 1. INTRODUÇÃO O planeta Terra com seus estimados 4,8 bilhões de anos passou por diferentes etapas desde a sua formação até tornar-se um ambiente que favorecesse a condição de vida como entendemos hoje. Destas etapas, a primeira delas foi o resfriamento da superfície e a condensação da água. Durante este período as condições energéticas provavelmente eram muito severas: intensa radiação atômica; radiação solar e energia vulcânica ativa.

3 Soma-se a isto as descargas elétricas da atmosfera. Neste ambiente altamente energético e atmosfera tóxica foram sendo formadas muitas moléculas orgânicas simples e outras fotossensíveis que foram interagindo e complexando-se, formando na água um ambiente rico em nutrientes.

4 Com a formação das moléculas de ácidos graxos com sua polaridade hidrofílica e hidrofóbica formaram-se as micelas. Provavelmente, destas micelas surgiram as primeiras reações bioquímicas e os primeiros mecanismos biológicos de replicação, que denominamos de metabolismo.

5 Partindo pois destas micelas, as primeiras formas metabólicas que surgiram foram os metabolismos fermentativos anaeróbios, pois são muito mais simples que o metabolismo respiratório aeróbio. Esta forma é mais eficiente no aproveitamento da energia química acumulada nas moléculas. Deste período de cerca de 3,5 bilhões de anos já se evidenciaram alguns organismos simples capazes de captar a energia solar e produzir oxigênio (O 2 ). A produção de O 2 pelos microrganismos fotossintetizantes introduziu uma das mais importantes modificações da superfície terrestre, transformando-a de redutora para oxidante.

6 A produção de O 2 propiciou também a formação da camada de ozônio, impedindo pois que a radiação ultravioleta atingisse a Terra. Isto liberou a vida dos esconderijos das rochas e da profundidade oceânica. Neste período teve origem a biodiversidade. Supõe-se que os seres vivos tenham sua origem em um ancestral comum que se diversificou em três domínios:

7 ARCHAEA arqueobactérias BACTERIA bactérias verdadeiras EUKARYA Animais, plantas, algas, protozoários, fungos, leveduras ANCESTRAL COMUM

8 Esta divisão da Biologia não surgiu por acaso, mas sim por muitos estudos de todos os organismos para que pudessem ser entendidos em sua ecologia, fisiologia, genoma, constituição química, e outros atributos. Portanto, quando se faz referência aos organismos de cada domínio deve-se sempre considerá-los especiais em cada segmento e entender a diversidade biológica em cada domínio.

9 Os organismos dos 3 domínios são encontrados predominantemente no solo. As Arqueobactérias, bactérias e eucariotos são encontrados dispersos nos ambientes mais estranhos e suportando ambientes estressantes com alta biodiversidade. Tais organismos estão presentes também nos diferentes sítios onde está inserido o complexo ambiente de uma indústria sucro-alcooleira. Considerando-se a origem dos microrganismos na indústria, parece e inúmeras pesquisas comprovam que a terra ainda é a maior fonte de seus contaminantes.

10 2. CONTAMINANTES NA INDÚSTRIA Uma vez que o solo é o grande reservatório biológico de microrganismos, a contaminação que atinge a indústria em sua maior parte tem nele sua origem. A contaminação chega até a indústria mediante a terra aderida às raízes, caule, folhas, água, partículas carregadas pelas correntes aéreas, etc. SHEATA (1960) e TILBURY (1975) mostraram em seus trabalhos que na cana pode-se encontrar de 10 4 a 10 8 unidades formadoras de colônias (UFC).

11 Dentre os gêneros de bactérias encontradas destacam-se: Aerobacter Escherichia Flavobacterium Pseudomonas Enterobacter Erwinia Lactobacillus Leuconostoc Bacillus Micrococcus Corynebacterium

12 Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Lactobacillus ssp Lactobacillus plantarum Corynebacterium diphtheriae

13 Aerobacter aerogenes Leuconostoc mesenteroides Enterobacter

14 Bacillus Flavobacterium Erwinia Micrococcus

15 Também foram detectadas leveduras dos gêneros Candida, Saccharomyces, Torula e Pichia; além dos fungos filamentosos. Candida Candida parapsilosis

16 Pichia pastoris Saccharomyces cerevisiae Torula Fungo filamentoso

17 LIMA et al. (1974) constataram que as espécies de microrganismos encontradas na indústria são as mesmas daquelas presentes no solo da lavoura de cana. A cana ao ser queimada e cortada entra em contato com o solo e através de corte os microrganismos invadem os tecidos do vegetal. Tem aí a origem de muitos contaminantes encontrados na indústria (QUIMATEC, 1991).

18 Microrganismos que chegam à indústria vão encontrar condições ideais ao seu desenvolvimento. O caldo de cana constitui um ótimo meio de cultura que estimula o desenvolvimento microbiano considerando-se a sua composição de sais minerais e carboidratos, atividade de água, ph e temperatura favoráveis.

19 Além disso fatores como: variações nas formas de colheita terrenas, diferentes variedades de cana, condições climáticas muito oscilantes, pragas e doenças, tipo de transporte, armazenamento, tempo decorrido entre o corte da cana e o seu processamento na usina,

20 estado da matéria-prima ao dar entrada na usina (limpa, suja, molhada, seca, queimada, nova, velha, deteriorada, com raízes, perfuradas por insetos) Contribuem significativamente no número de microrganismos presentes na cana e conseqüentemente no caldo (GALLO; CÃNHOS, 1991). Durante a colheita, transporte e armazenamento, alguns desses microrganismos tendem a penetrar nos colmos através de lesões e se multiplicam agravando o problema.

21 Por outro lado, durante a lavagem da cana há duas possibilidades: remoção parcial dos contaminantes se a qualidade da água e os cuidados operacionais forem adequados; aumento drástico dos contaminantes quando os cuidados não são assumidos corretamente. Com controle adequado de matéria-prima, da água de lavagem e do processo de extração, pode-se obter um caldo misto com ph ao redor de 5.5 (BAYMA, 1973) e com números de contaminantes inferiores a 10 7 UFC/mL (COPERSUCAR, 1983).

22 Quando o ph da água encontra-se entre 10,0 e 11,0 em circuitos fechados, possui contagens de bactérias mais baixas. SERRA et al. (1979) efetuaram contagens microbianas em águas de lavagem de cana em duas usinas que operavam com diferentes circuitos. Os autores concluíram que na usina que não recirculava a água as contagens eram de 10 a 20 vezes menores.

23 LOBO et al. (1987) avaliaram o número de bactérias da água de lavagem de duas usinas e uma destilaria. Os autores verificaram que os valores obtidos de 10 4 e 10 5 UFC/mL não influenciavam nas contagens que eram efetuadas posteriormente nos caldos dos primeiros ternos de cada unidade analisada. Na indústria o preparo da cana para a extração do caldo mediante a ação dos picadores e desfibradores constitui um ponto importante para a exposição do caldo à ação microbiana.

24 Microrganismos aí encontrados por BEVAN, BOND (1971) mostraram que são ótimos metabolizadores de sacarose, glicose e frutose (Leuconostoc, Actinomycetos, Brevibacterium, fungos e leveduras). Dentre os pesquisadores TILBURY (1977) destaca-se pela preocupação com as perdas do processo. Dentre as perdas, o autor verificou que: 13% ocorrem pela inversão química, 25% pela inversão enzimática das enzimas extracelulares invertase, 63% em conseqüência da atividade microbiana.

25 As perdas de sacarose na moenda podem atingir, segundo TILBURY (1977), 1kg de sacarose por tonelada de cana. Outros autores, ORTH in MOROZ (1969), tinham registrado perdas de 3,07% dos caldos em moendas lavadas e sem lavar. O caldo bruto, segundo LIMA et al. (1977), pode apresentar de 10 4 leveduras e 10 8 bactérias/ml. AMORIM, OLIVEIRA (1982) em seu trabalho verificaram que a diminuição da produção de etanol pode ser causada por diferentes motivos:

26 consumo de açúcar pelo contaminante; consumo do álcool produzido; liberação de substâncias tóxicas; excesso de ácidos; biocidas empregados no controle das infecções; perda do fermento nas centrífugas ou fundos de dorna; floculação do fermento, etc.

27 Deve-se considerar que em uma unidade industrial todos estes fatores podem acontecer simultaneamente. Ainda segundo os autores, durante uma safra pode acontecer perdas nas destilarias por formação de ácido. Se ocorrer, por exemplo, 5 a 6 g de acidez por litro de vinho, haverá diminuição do rendimento alcoólico em 60%. GUERRA e ANGELIS (1998) verificaram durante o acompanhamento da incidência de floculação do fermento a presença de bactérias indutoras da floculação.

28 A pesquisa pôde diferenciar quatro biotipos de bactérias que possuíam sensibilidades diferentes aos biocidas e antibióticos empregados na indústria estudada. Este fato permite verificar a dificuldade de solucionar o problema.

29 3. POR QUE CULTIVAR BACTÉRIAS? A preocupação dos pesquisadores com a contaminação microbiana dos processos industriais está voltada especialmente no que se refere à bebidas alcoólicas fermentadas. Deve-se considerar que a entrada de microrganismos em uma indústria constitui uma população mista proveniente do solo, água, etc. Nesta situação considera-se uma comunidade de espécies em competição. Mudanças nas condições externas podem favorecer o crescimento de uma ou poucas espécies particulares.

30 Isto pode resultar no estabelecimento de uma população predominante às custas de outras espécies. Diante da diversidade das espécies microbianas no interior de uma indústria sucroalcooleira, deve-se aplicar técnicas adequadas para sua detecção. Eventualmente há necessidade de se aplicar a técnica de enriquecimento onde se suprime determinada condição, favorecendo assim o desenvolvimento de outras espécies, que embora presentes não se desenvolvem por falta das condições que não lhes propiciam o crescimento.

31 Muitas tentativas têm sido feitas para promover um levantamento real dos microrganismos, predominantemente bactérias e mais recentemente as leveduras. Após a implantação do PRO-ÁLCOOL no Brasil como fonte alternativa de combustível, houve maior preocupação com os contaminantes da fermentação etanólica e com as conseqüentes perdas no processo. Os inconvenientes provocados pelos contaminantes formadores de gomas foram as primeiras características para as quais voltou-se a atenção dos pesquisadores.

32 A microbiologia dos caldos destinados à produção de açúcar e posteriormente à do álcool pode ser considerado o ponto inicial para a elucidação da formação dos compostos mucilaginosos nos caldos de cana. Quanto à detecção dos microrganismos nas usinas, a literatura mostra que muitos países adaptaram e desenvolveram métodos para a área do açúcar. Entretanto, a metodologia visa sempre o controle da qualidade bacteriológica do produto final.

33 Dentro do setor de produção de álcool o conhecimento de métodos de avaliação de contaminantes na fermentação alcoólica é muito restrito e não existe uma metodologia padronizada. Dentre as possibilidades existe a recomendação da contagem microscópica, esta, no entanto deixa a desejar porquanto muitas bactérias confundem-se com partículas do próprio caldo. As contagens das bactérias no microscópio ainda não avalia aquelas que estão mortas das vivas. Contudo para avaliar leveduras vivas e mortas a contagem microscópica constitui uma ferramenta importante.

34 A microscopia pode ainda associar-se com alguns tipos de coloração, o que evidenciará o material além de poder diferenciar sua morfologia como no caso das bactérias Gram-positivas das Gramnegativas. Este conhecimento poderá ser útil no controle dos contaminantes ao se procurar aplicar antibióticos ou biocidas. A vantagem da contagem microscópica é a sua rapidez, por outro lado, apresenta como desvantagem a possibilidade de se poder contar partículas que estejam em valores superiores a por ml.

35 Entretanto, a contagem em placas pode avaliar até um por ml, mais precisamente 30/mL. Embora com restrições, a contagem microscópica tem mostrado correlações positivas entre os valores de acidez e o número de bactérias. Por outro lado, a contagem nas placas contendo meio sólido embora seja um método indireto de avaliação, indica com segurança a quantidade de microrganismos vivos presentes na amostra mesmo quando estão em baixo número.

36 O uso deste método em fermentação alcoólica só foi possível com a descoberta de antibiótico que pudesse inibir o crescimento de levedura e desta forma quantificar as bactérias. A aplicação de actidiona (cicloheximida) em 1951 por GRAY permitiu o desenvolvimento de técnicas de avaliação bacteriana em cervejarias Dentre os meios recomendados para avaliação de bactérias pode-se destacar o Plate Count Agar (PCA) e Man, Rogosa e Sharpe (MRS). Há também indicações de suplementação do PCA com extrato de levedura para contagem total de bactérias.

37 ROSALES, FURLETTI, ANGELIS (1987) propuseram o emprego de meios de cultivo para dinamizar o levantamento dos principais problemas microbiológicos da indústria sucroalcooleira. Estes meios permitem verificar de 18 a 24 horas as bactérias produtoras de goma. O meio de oxidação do etanol exige um período maior, aproximadamente 30 horas.

38 Quando se propõe um levantamento microbiano na indústria sucro-alcooleira, parte-se em geral de um meio complexo onde há a possibilidade de crescer muitas espécies que normalmente não interagem em meios seletivos onde alguns grupos seriam favorecidos.

39 Contudo, hoje entendemos que existem grandes problemas microbiológicos na fermentação etanólica: gerado por bactérias: - produtoras da inversão e posterior polimerização na formação da goma. - produtoras de ácido empregando o açúcar. - consumidoras de etanol produzindo ácido acético.

40 gerado por leveduras selvagens: - células que consomem açúcar vorazmente e das quais sabemos pouco. Da população altamente diversificada da indústria, importante é conhecer o que estaria viável em cada etapa do processo.

41 Para tanto elegem-se meios de avaliação total dos contaminantes, que denominamos meios seletivos, para quantificar: bactérias totais; bactérias produtoras de gomas; bactérias produtoras de ácidos; bactérias consumidoras de etanol

42 4. UTILIDADES DO ACOMPANHAMENTO MICROBIOLÓGICO Independente do método aplicado o importante é estarem em sintonia: laboratório, processo e área agrícola. No controle do processo industrial da fermentação e na produção de açúcar podemos correlacionar: Água de lavagem acompanhar a água de lavagem da cana mantendo o ph entre 10 e 11. Moenda efetuar sempre que possível amostragens compostas; existem equipamentos específicos para coletas das amostras: caldo primário, caldo misto e caldo decantado.

43 Microrganismos = População bacteriana do caldo 1º terno População bacteriana do caldo misto Se a População do caldo misto é X e a População do caldo decantado é Y X-Y = W e W/X = Z, então Z x 100 = % redução Desta forma é possível avaliar a eficiência do tratamento do caldo.

44 NB = número de bactérias (avalia-se somente os bacilos ao microscópio) 4.3 FERMENTAÇÃO A contaminação bacteriana deve sempre ser o mínimo possível. O índice de contaminação (IC) de bactérias por ml pode ser correlacionado com diferentes parâmetros do processo: CV = número de células vivas de leveduras /ml VC = viabilidade celular da levedura RF = rendimento da fermentação A = acidez

45 IC = CV NB IC = VC NB RF IC = NB IC = A NB Estas correlações se bem reproduzidas poderão nortear as ações a serem assumidas em qualquer parte do processo. Pode-se calcular também as taxas de multiplicação do fermento na dorna (TMF). TMF = População que entra na dorna no início da fermentação (DIF) População na dorna no final da fermentação (DFF) X 100

46 Pode-se construir um gráfico correlacionando-se com o rendimento da fermentação. Outro parâmetro a ser considerado é a recirculação das bactérias (RC). RC = População das bactérias do leite População de bactérias na dorna no final da fermentação

47 5 JUSTIFICATIVA PARA EFETUAR O CONTROLE A fermentação etanólica processa-se no Brasil em condições não estéreis e as contaminações no processo causam prejuízos no rendimento final. As causas principais são relativas ao consumo de açúcar, produção de toxinas, mucilagens (gomas) que provocam entupimentos nas tubulações e floculação no fermento. A presença de bactérias está ligada à qualidade da matéria-prima e é influenciada pelo solo, variedade, tipo de corte, armazenagem, transporte, associado ainda à água de lavagem e da diluição do mosto.

48 Considera-se uma dorna contaminada aquela onde o número de bactérias atinge níveis que prejudiquem a produção de etanol. As bactérias presentes no mosto ou nas dornas causam fermentações secundárias tais como: acética, láctica, dextrânica, butírica, levânica. Todas as fermentações secundárias utilizam direta ou indiretamente o açúcar para produzirem o produto final.

49 5.1 FERMENTAÇÃO ACÉTICA As bactérias acéticas produzem a oxidação do etanol à ácido acético. Possuem tolerância relativamente alta à ácidos. São bactérias Gram (-), bastonetes curtos, aeróbios, desenvolvem-se entre 15 a 45ºC, sendo que a temperatura mais favorável é de 15 a 34ºC. O gênero mais freqüente é Acetobacter e as espécies: A. acetii, A. pasteurianum, A. acetosum, A. sub-oxydans.

50 5.2 FERMENTAÇÃO LÁCTICA Possuem a habilidade de inibir o crescimento de outras bactérias. São bactérias Gram (+), anaeróbias ou microaerófilas. Desenvolvem-se em temperaturas elevadas até 45ºC. Podem ser homofermentativas ou heterofermentativas.

51 Os principais gêneros: Lactobacillus e Streptococcus. As espécies mais freqüentes são: L. fermentum, L. plantarum L. bulgaricus, L. delbruckei, L. casei, S. lactis, S. thermophilus. Glicose homofermentação 2 ácido láctico Glicose heterofermentação Ácido lático + CO 2 +álcool etílico

52 5.3 FERMENTAÇÃO DEXTRÂNICA O principal agente é a bactéria Leuconostoc mesenteroides. São bactérias cocos Gram (+), vivem isoladas, em pares ou cadeias. Do metabolismo da sacarose forma-se uma massa gelatinosa transparente em polímeros de dextrana, conhecida como canjica. Temperatura ótima de desenvolvimento 36ºC é heterofermentativa. n C 12 H 22 O 11 Leuconostoc mesenteroides (C 6 H 10 O 6 ) n + n C 6 H 12 O 6 dextrana frutose

53 5.4 FERMENTAÇÃO DO LEVÂNIO As principais bactérias são do gênero Bacillus (Gram (+)), Aerobacter (Gram (-)) e Streptococcus (cocos Gram (+)). São do metabolismo da sacarose, polimerizam a frutose e liberam a glicose. n C 12 H 22 O 11 (C 6 H 10 O 5 ) n + n C 6 H 12 O 6 levânio glicose

54 5.5 Fermentação Butírica Geralmente está associada ou ocorre depois da fermentação láctica. São bactérias cilíndricas, ovais ou em forma de losangos ou de raquetes. São esporuladas, crescem bem a temperaturas de 40ºC e em mostos pouco ácidos. Metabolicamente geram ác. butírico, acético, fórmico, CO 2, álcoois, etc. Segundo ROSALES (1989), 222 linhagens isoladas do processo de fermentação etanólica foram identificadas:

55 BACTÉRIAS ISOLADAS Gram (+) 75,68% 222 CULTURAS Gram (-) 24,32% Bastonetes 76,78% Cocos 23,21% Acetobacter 29,63% Xantobacter 14,81% Pseudomonas 5,55% Acinetobacter 27,77% Enterobacter 27,77%

56 Bastonetes 76,78% Cocos 23,21% Lactobacillus 77,52% Bacillus 16,28% Sporolactobacillus sp 6,2% Leuconostoc - 82,05% Micrococos 10,25% Staphylococcus 7,69%

57 L. fermentum -29% Lactobacillus Bacillus L. brevis 33% L. canfusus 20% L. plantarum 7% outros 11% B. coagulans 14,28% B. subtilis 47,62% B. megaterium 28,57% B. firmus 9,50% Sporolactobacillus sp

58 LITERATURA RECOMENDADA Microrganismos da fermentação etanólica e possibilidade de utilização da vinhaça.seminário. UNIMEP. UNESP-IB.RC.ed. Buckman Lab. Ltda, 1987 (vários autores) ROSALES, S,V,R. Contaminantes bacterianas da fermentação etanólica: isolamento em meios diferenciais, identificação e avaliação de desinfetantes. Rio Claro. UNESP. Instituto de Biociências. Tese de doutorado. Área de Ciências Biológicas

59 GUERRA, E,J. Isolamento de bactérias da fermentação etanólica que induzem a floculação em Saccharomyces cerevisiae e sua sensibilidade a agentes microbianos. Rio Claro. UNESP Dissertação de Mestrado em Ciências Biológicas. Área de Microbiologia Aplicada GUERRA, E,J.; ANGELIS,D,F. Floculação da levedura induzida por bactérias na fermentação etanólica. I Método de detecção preventiva e estudos para o controle. STAB. YOKOIA,F.;OLIVA-NETO,P. Características da floculação de leveduras por Lactobacillus fermetum. Revista de Microbiologia. São Paulo, v.22, n.1, p

60 LIMA,U.A.;GOLDONI,J,S.;CEREDA,M,P.;SOUZA,L,Ocor rência de microrganismos em caldo bruto, caldo misto e água de embebição de uma usina de açúcar de cana. Brasil açucareiro. V.83, p