Palavras-chave: Camundongos. Ratos. PCR. Pasteurella pneumotropica. Cultura bacteriana. 1 Introdução

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1 artigo original ISSN Estudo comparativo de sensibilidade das técnicas de cultura bacteriana e PCR para a detecção de Pasteurella pneumotropica em roedores Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy, Milena Coutinho da Motta, Marilda Osti Spinelli, Robison José da Cruz, Jussimara Félix Sartorelli Diretoria Técnica de Apoio ao Ensino e à Pesquisa, FMUSP Laboratório de Controle de Qualidade Genética e Sanitária Animal. Autor para correspondência: Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy cyntia@biot.fm.usp.br Recebido para publicação: 27/11/2011 Aceito para publicação: 10/08/2012 Objetivo: Realizar uma comparação, em relação a sensibilidade, das técnicas de cultura bacteriana e PCR para detecção de Pasteurella pneumotropica, em colônias convencionais de camundongos das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c e heterogênica Swiss; ratos Wistar e Hamster Golden. Materiais e Métodos: 230 amostras de traquéia foram coletadas e divididas em partes iguais: uma parte foi encaminhada para a cultura bacteriana, onde foram realizadas provas bioquímicas manuais e semi-automatizadas. A outra parte foi submetida à reação de PCR, onde os oligonucleotídeos iniciadores foram F; 5 ACCTACTCTTGACATCCAGA 3 e R; 5 CGCTCCACATCGCTGCTT 3 que amplificam em 296 pb. Os produtos obtidos foram separados por eletroforese em gel de agarose. A visualização e fotodocumentação foram realizadas sob luz ultravioleta. Resultados e conclusão: Os resultados obtidos através da cultura bacteriana foram de 1,75% de casos positivos e 98,25% de negativos. Em relação ao PCR observamos o resultado de 63% de positivos e 37% de casos negativos. Concluindo, nossos resultados demonstram que a técnica de PCR oferece significativamente maior sensibilidade para detecção de P. pneumotropica quando comparado a cultura bacteriana. CEUA nº 251/11. RESUMO Palavras-chave: Camundongos. Ratos. PCR. Pasteurella pneumotropica. Cultura bacteriana. 1 Introdução A família de bactérias Pasteurellaceae inclui aproximadamente 12 gêneros: Pasteurella, Actinobacillus, Haemophilus, Lonepinella, Mannheimia, Phocoenobacter, Gallibacterium, Histophilus, Volucribacter, Avibacterium, Nicoletella, Aggregatibacter, e 61 espécies 1. As pasteurelas são cocobacilos gram-negativos, que não apresentam motilidade a temperaturas entre 22 e 37ºC, formando colônias circulares com a superfície lisa, cinza translúcidas em ágar sangue de carneiro. São anaeróbias facultativas, oxidase e catalase positivos 2. Podem ser facilmente encontradas na mucosa nasofaríngea, traquéia, pulmões, aparelho digestório, vagina e outros órgãos de animais de laboratório 3,4. Animais infectados com estes organismos são usualmente portadores assintomáticos 5, o que facilita a transmissão. A Pasteurella pneumotropica, considerada a mais patogênica da família Pasteurellaceae em roedores 5, deve ser monitorada como rotina em controle sanitário, como recomendado pela FELA- RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set

2 Estudo comparativo de sensibilidade das técnicas de cultura bacteriana e PCR para a detecção de Pasteurella pneumotropica em roedores SA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations) 6. Seu diagnóstico pode ser realizado através de cultura de bactérias com período mínimo de incubação de 48 horas. O seu crescimento ocorre em ágar sangue de carneiro e raras vezes em ágar chocolate, necessitando de posterior identificação por bioquímica extensa 7. Outros métodos utilizados para a identificação de P. pneumotropica em roedores são os testes sorológicos. Contudo, não muito confiáveis devido à possibilidade de reações cruzadas com outras espécies de microorganismos da família Pasteurellaceae e/ou reações falso-positivas 5. Os métodos de identificação convencionais existentes para este microorganismo exigem longo tempo para a identificação 8. A reação de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR), utilizando sequências de 16S rrna, está sendo usada para determinar as relações filogenéticas entre organismos eucarióticos e procarióticos, bem como para detectar patógenos de diversos materiais com identificação específica 2,4,9. A sensibilidade de um teste define-se como sendo a relação direta entre o número de casos positivos e de casos verdadeiros, ou seja, a medida da capacidade do método de predizer a condição patológica para aqueles casos que realmente a apresentam 10. Assim, o objetivo deste trabalho foi comparar a sensibilidade entre as técnicas de detecção da Pasteurella pneumotropica através da cultura bacteriana e da PCR. 2 material e método 2.1 Animais Foram utilizados de 40 a 50 animais das linhagens isogênicas C57BL/6, BALB/c, e da linhagem heterogênica Swiss; ratos Wistar e hamsters Golden, com idade entre 2 e 4 meses, machos e fêmeas, coletados aleatoriamente nas salas de criação do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, e encaminhados para o laboratório, no período de janeiro de 2008 a dezembro de 2010, dentro do programa de Controle Sanitário da unidade. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com princípios internacionais de ética e bem estar animal e aprovados pelo Comitê de Ética do complexo HC/FMUSP, CEUA nº 251/11. As condições ambientais nas salas são convencionais, com temperatura variando de 20 a 24ºC, ciclo de luz/escuridão de 12/12 horas; mantidos em gaiolas de polipropileno e tampa de aço inoxidável, recebendo água e ração (Nuvital, Paraná, Brasil) ad libitum, maravalha e gaiolas esterilizadas, com barreiras sanitárias para entrada de material e circulação de pessoas. Todas as linhagens foram mantidas há mais de 30 anos neste biotério, em condições convencionais, com barreiras sanitárias introduzidas posteriormente. 2.2 Manipulação dos Animais Todos os animais foram eutanasiados em câmara de CO 2 e após a assepsia da região abdominal e torácica com etanol 70%, em cabine de fluxo laminar realizou-se uma incisão mento-pubiana mediana. A cavidade orofaríngea foi exposta, procedendo-se à retirada de um fragmento de traquéia de aproximadamente 0,5 mm. O material coletado foi dividido em partes iguais onde, uma parte foi acondicionada em tubo falcon contendo 2 ml de BHI caldo e mantido a 37ºC por 24 horas e, a outra parte, em microtubo e mantido a -80ºC até o momento do uso. 2.3 Identificação Bacteriana Para a identificação da Pasteurella pneumotropica através da cultura, o material semeado em BHI caldo foi repicado em ágar Infusão de Cérebro e Coração (BHI Oxoid, São Paulo, Brasil) suplementado com 5% de sangue de carneiro desfibrinado e incubado à 37 C por 24 horas. Após esse período, foi realizada a coloração de gram. Em caso de cocobacilo gram negativo, oxidase e catalase positiva, provas bioquímicas semi-automatizadas foram realizadas com o Kit de 230 RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set. 2012

3 Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy, Milena Coutinho da Motta, Marilda Osti Spinelli, Robison José da Cruz, Jussimara Félix Sartorelli identificação bacteriana Api-20 NE (BioMérieux, São Paulo, Brasil). 2.4 Extração de DNA e PCR Realizamos a extração do DNA como descrito por Frederick 11, com pequenas modificações. Resumidamente, a solução de lise foi preparada com os seguintes reagentes Tris-HCL 0,5M; NaCl 5M; SDS 10%; EDTA 0,5M; Proteinase K, diferenciando da original que utiliza fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. Para a reação de PCR, foram utilizados 1ml de DNA a 100 ng; 0,2 mm dntps mix (desoxiribonucleotídeos trifosfato); 1X tampão da Taq DNA polimerase; 1,5 mm MgCl 2 ; 1U (unidade) de Taq DNA polimerase Platinum; água milli-q autoclavada em quantidade suficiente para 1 reação de 20 ml e 0,5 mmol/l de cada oligonucleotídeo iniciador F; 5 ACCTACTCTTGACATCCAGA 3 e R; 5 CGCTCCACATCGCTGCTT 3 que amplificam um produto de 296 pb. A amplificação foi realizada em termociclador Eppendorf, nas seguintes condições: 93ºC por 3 minutos; 25 ciclos de 93ºC por 1 minuto, 60ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto e uma extensão final de 72ºC por 7 minutos e ao final foi mantido a 4ºC. Os produtos obtidos pela PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose (Invitrogen ultrapura, Guarulhos, SP, BR) 2,0% contendo brometo de etídio. O marcador de peso molecular utilizado foi 100 pb DNA Ladder (Invitrogen TM, Guarulhos, SP,BR). O controle positivo foi a cepa ATCC nº de Pasteurella pneumotropica, e o negativo, uma mistura de reagentes sem DNA. A visualização e fotodocumentação foi realizada sob luz ultravioleta no BioDoc-It Imaging System UVP. 2.5 Teste de sensibilidade e estatística A determinação da sensibilidade dos testes foi feita comparando-se a proporção observada de resultados positivos e negativos da cultura bacteriana e da PCR, empregando-se o teste de x 2, com nível de rejeição de 5%, testando-se a hipótese de que as proporções observadas dos resultados dos testes NÃO diferiram significantemente. 3 resultados Os resultados obtidos através da cultura de bactérias para o isolamento de Pasteurella pneumotropica apresentou-se muito inferior quando comparado com a reação de PCR, perfazendo um total de 2% para as linhagens de camundongos C57BL/6 e rato Wistar e 0% para as demais linhagens. As mesmas amostras submetidas à técnica de PCR (Tabela 1) apresentaram a positividade de 54%, 50%, 38%, 55% e 2% em camundongos isogênicos C57BL/6, BALB/c e heterogênicos Swiss; ratos Wistar e hamsters Golden respectivamente (Tabela 2). Os produtos da PCR para Pasteurella pneumotropica estão representados na Figura 1, sendo apenas ilustrada uma amostra por espécie/linhagem por canaleta. Tabela 1: Número de animais positivos e porcentagens sobre o total analisados por Cultura bacteriana, para detecção de Pasteurella pneumotropica. Espécie Camundongos Rato Hamster Linhagem C57BL/6 BALB/c Swiss Wistar Golden Positivos/Total de animais 1/50 0/40 0/50 1/40 0/50 % positivos RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set

4 Estudo comparativo de sensibilidade das técnicas de cultura bacteriana e PCR para a detecção de Pasteurella pneumotropica em roedores Tabela 2: Número de animais positivos e porcentagens sobre o total analisados por PCR, para detecção de Pasteurella pneumotropica. Espécie Camundongos Rato Hamster Linhagem C57BL/6 BALB/c Swiss Wistar Golden Positivos/Total de animais 27/50 20/40 19/50 22/40 01/50 % positivos A comparação dos resultados totais, de casos positivos e negativos das 230 amostras submetidas aos dois testes, apontou para 1,75% e 63% de casos positivos; 98,25% e 37% de casos negativos, respectivamente, para cultura bacteriana e PCR (Tabela 3). A comparação da sensibilidade entre os dois testes demonstrou a superioridade da PCR para detectar Pasteurella pneumotropica em colônias de roedores (x 2 =0,10; 0,80<p<0,50). 4 discussão Os roedores portadores assintomáticos de agentes patogênicos ou oportunistas não são modelos biológicos apropriados para pesquisas Tabela 3: Comparação de resultados positivos e negativos apresentados pela cultura bacteriana e PCR, para detecção de Pasteurella pneumotropica. Figura 1. Expressão de Pasteurella pneumotropica em diferentes linhagens de camundongos, rato e hamster analisados por PCR. O DNA foi extraído de um fragmento de traquéia e submetido a PCR utilizando primers específicos. Canaleta 1- marcador de peso molecular 50 pb; 2- Amostra positiva de camundongo C57BL/6; 3- Amostra positiva de camundongo BALB/c; 4- Amostra positiva de camundongo Swiss; 5- Amostra positiva de rato Wistar; 6- Amostra positiva de hamster Golden; 7- Controle negativo Reagente. Resultados Cultura bacteriana n=230 (%) PCR n=230 (%) Positivos 1,75 63* Negativos 98,25 37 *A sensibilidade de PCR foi significantemente maior x 2 =0,10; 0,80<p<0,50. biomédicas. Isto se deve a presença destes microorganismos provocarem interferências nos resultados experimentais. Consequentemente, levando à repetições dos ensaios, elevando os custos do ensaio e comprometendo a confiabilidade dos resultados. As colônias de roedores do Centro de Biote- 232 RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set. 2012

5 Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy, Milena Coutinho da Motta, Marilda Osti Spinelli, Robison José da Cruz, Jussimara Félix Sartorelli rismo da Faculdade de Medicina, embora sejam convencionais, estão sendo submetidas a triagem regulares para bactérias, vírus, ecto e endoparasitas. Tradicionalmente a pesquisa de espécies da família Pasteurellacea era feita através de cultura bacteriológica e identificação bioquímica em kits comerciais, no entanto dada a importância da detecção deste agente nas colônias foi implantada a técnica de detecção por PCR. Ao longo dos últimos anos publicações que envolvam a pesquisa de bactéria através do 16S rdna tem aumentado, a apreciação por métodos moleculares tem ação significante na compreensão da diversidade e o reconhecimento que a identificação pela técnica de cultura apresenta certas limitações na interpretação de resultados 11,12. A identificação das bactérias com base em características fenotípicas e bioquímicas, pela determinação de açúcares, catalase, oxidase e morfologia, geralmente não é tão precisa como a identificação com base em métodos genotípicos. A comparação da sequência do gene bacteriano 16S rdna emergiu como uma técnica preferida por detectar quantidades mínimas na 16S rrna na amostra. Esta técnica pode ser rotineiramente utilizada para a identificação de bactérias e pode conduzir ao reconhecimento de novos patógenos e bactérias de difícil acesso a cultura 13. A superioridade dos resultados apresentados pela reação de PCR deve-se ao fato deste ensaio possuir uma sensibilidade de detecção de 3-10 bactérias na amostra; esta sensibilidade pode ser afetada por diferentes fatores, incluindo inibidores de polimerases termoestáveis presentes na amostra, a qualidade do molde de DNA ou RNA, e as condições de amplificação 14. As condições de PCR utilizados neste estudo foram rigorosamente otimizadas para qualquer destino, especificidade ou outro ensaio. Em geral, estas condições parecem dar um confiável rendimento no tamanho da amostra 4. Os resultados encontrados diferem dos observados por outros autores que detectaram por PCR 89,6% de amostras positivas de swab nasofaríngeos de ratos, e 8,3% por cultura bacteriana; para camundongos a positividade foi de 21,9% 15. As diferentes taxas de contaminação encontradas pelos diversos autores, provavelmente, deve-se ao fato das colônias convencionais terem origens e manejo diversos, além de terem sido detectados por diferentes métodos. Os resultados apresentados neste artigo referem-se a animais de laboratório mantidos há mais de 30 anos em condições convencionais, com as barreiras sanitárias sendo introduzidas ao longo dos anos. Assim, no aperfeiçoamento do programa de controle de qualidade dos roedores produzidos pelo Centro de Bioterismo da FMUSP, foi introduzido o ensaio por PCR para detecção de Pasteurella pneumotropica por tratar-se de um método rápido, sensível e específico na detecção deste agente etiológico, ficando desta forma integrado ao programa, suplementando o tradicional isolamento utilizado para outros agentes. 5 conclusão A comparação da sensibilidade das técnicas de detecção de Pasteurella pneumotropica através da cultura bacteriana e da PCR, ambas utilizadas no monitoramento bacteriológico do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, analisando o resultado de 230 amostras de fragmentos de traquéia de diferentes linhagens de camundongos, ratos Wistar e hamsters, apontou para a maior sensibilidade de PCR que detectou 63% de positividade, contra 1,75% pela cultura bacteriana. RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set

6 Estudo comparativo de sensibilidade das técnicas de cultura bacteriana e PCR para a detecção de Pasteurella pneumotropica em roedores Comparative sensivity study for Pasteurella pneumotropica detection of rodents by bacterial culture and PCR techniques ABSTRACT OBJECTIVE: To conduct a comparative study of the sensitivity by bacterial culture and PCR detection of Pasteurella pneumotropica in conventional colonies of inbred mice strains C57BL/6, BALB/c and Swiss outbred; Golden Hamster and Wistar rats. MATERI- ALS AND METHODS: 230 samples of the trachea were collected and divided into equal parts: one part was sent for culture, where biochemical tests were performed manually and semi-automated, after bacterial isolation. The other part was subjected to PCR, used primers F, 5 ACCTACTCTTGACATCCAGA 3 and R, 5 CGCTCCACATCGCTGCTT 3 which amplifies at 296 bp. The products obtained were separated by electrophoresis in agarose gel. Visualization and photodocumentation were performed under ultraviolet light. RESULTS AND CONCLUSION: The results obtained by bacterial culture were 1.75% of positive cases and negative in 98.25%; 63% and 37% of cases positive and negative, respectively, by PCR. These results point to the greater sensitivity of PCR (x 2 = 0.10, 0.80 < p <0.50) when compared to bacterial culture. CEUA nº 251/11 Keywords: Mice. Rats. PCR. Pasteurella pneumotropica. Bacterial culture. REFERêNCias 1.Christensen H, Kuhnert P, Busse HJ, Frederiksen WC, Bisgaard M. Proposed minimal standards for the description of genera, species and subspecies of the Pasteurellaceae. Int J Syst Evolut Microbiol Jan;57(Pt 1): Christensen H, Bojesen AM, Bisgaard M. Mannheimia caviae sp. Nov., isolated from epidemic conjunctivitis and otitis media in guinea pigs. Int J Syst Evoluc Microb. 2011; 61(7): Sasaki H, Kawamoto EE, Tanaka Y, Sawada T, Kunita S, Yamagmi K. Comparative analysis of Pasteurella pneumotropica isolates from laboratory mice and rats. Antonie van Leeuwenhoek. 2009; 95: Hayashimoto N, Aiba T, Itoh K, Kato M, Kawamoto E, Kiyokawa S, et al. Identification procedure for Pasteurella pneumotropica in microbiologic monitoring of laboratory animals. Exp Anim. 2005;54(2): Bootz F, Kirschnek S, Nicklas W, Wyss SK, Homberger FR. Detection of Pasteurellaceae in rodents by polymerase chain reaction analysis. Lab An Sci. 1998; 48(5): Rehbinder C, Baneux P, Forbes D, Van Herck H, Nicklas W, Rugaya Z, Winkler G. Report of FELASA working Group on Animal Health. Recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig and rabbit experimental units. Lab Anim Jul;30(3): Nicklas W, Baneux P, Boot R, Decelle T, Deeny AA, Fumanelli M, et al. Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim Jan;36(1): Nozu R, Goto K, Ohashi H, Takakura A, Itoh T. Evaluation of PCR as a means of identification of Pasteurella pneumotropica. Exp Anim Jan;48(1): Hayashimoto N, Takakura A, Toshio T. Genetic diversity on 16SrDNA sequence and phylogenic tree analysis in Pasteurella pneumotropica strains isolated from laboratory animals. Cur Microbiol. 2005;51: Sabbatini RME. Um programa para o cálculo da acurácia, especificidade e sensibilidade de testes médicos. [citado 16 mar 2012]. Disponível em: unicamp.br/~sabbatin 234 RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set. 2012

7 Cyntia Marques dos Santos Corrêa de Godoy, Milena Coutinho da Motta, Marilda Osti Spinelli, Robison José da Cruz, Jussimara Félix Sartorelli 11. Ausubel FM. Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley; p Needham JR, Cooper JE. An eye infection in laboratory mice associated with Pausteurella pneumotropica Lab Anim. 1975;9: Drancourt M, Boilet C, Carlioz A, Martelin R, Gayel JP, Raoult D. 16S Ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol. 2000; 38(10): Compton SR, Riley LK. Detection of infectious agents in laboratory rodents: Traditional and molecular techniques. Comp Med Apr;51(2): Wang RF, Campbell W, Cao WW, Summage C, Steele RS, Cerniglia CE. Detection of Pasteurella pneumotropica in laboratory mice and rats by polymerase chain reaction. Lab Anim Sci Feb;46(1):81-5. REFERêNCias 1 CONGRESO INTERNACIONAL FESSACAL/SBCAL Sede: Facultad de Ciencias Farmaceúticas. USP. San Pablo, Brasil Fecha: 4-6 Diciembre 2012 Este evento tiene como finalidad reunir a especialistas, investigadores y docentes de la región que trabajan en Ciencia del Animal de Laboratorio. Sus objetivos son la interacción entre los especialistas de los distintos países sudamericanos, la promoción y difusión del desarrollo académico, científico y tecnológico de esta disciplina en la región y la vinculación entre las Asociaciones que forman parte de FESSACAL. 4ª Asamblea de FESSACAL. Temas: Dirección estratégica. Planificación de la estrategia. Impacto de las directrices y políticas institucionales, nacionales e internacionales Gerenciamiento de Bioterios. Manejo y Gestión. Información sobre Curso Manager of Animal Resources (CMAR). Situación edilicia de los bioterios en Sudamérica. La psicología del trabajo en los bioterios: la interacción entre el bienestar del hombre y el del animal. Dirección de programas de trabajo. Categorías profesionales y desarrollo de la estructura de personal. Selección de personal. Estándares de formación. Acreditación AAALAC Internacional Es posible en Sudamérica? BPL para registro de fármacos y certificación de bioterios de caninos. Prevención de riesgos laborales en experimentación animal.. Actividades de la WSPA Educación. Categorías de Formación. Bienestar Animal en Latinoamérica. CICUALES: Instrumento de regulación. CICUAL Colombia. Modelo Estructura de Federación Regional El pez como modelo animal. Patología en Primates tropicales. Reconocimiento del dolor. Principios fisiológicos. Valoración del dolor: principio de analogía, escalas de severidad y protocolos de supervisión. Punto Final humanitario. Palestrantes do exterior Alejandro Ramirez- Colombia/ Hernán Serna Espanha/ Ignacio Alvarez- Espanha/ Javier Guillén- Espanha/ Jesús Martínez Palacios- Espanha/ Joana Visa- Espanha/ María Nelly Cajiao- Colômbia/ Keith Astrofsky- USA/Nikole Tschaepe- USA/ Paulina Bugys- USA/ Peter Morgan- USA/ Steve Baker- USA/ Cameellia Symonowicz-USA/ Palestrantes nacionais Ekaterina Rivera/ Ingrid Dragan Taricano /Luisa Braga/ Vera Peters/ A confirmar : Eduardo Moacyr Krieger/ Marcelo Marco Morales e Alcides Pissinatti ARANCELES U$S 100 taxa única. UBICACIÓN GEOGRÁFICA La Facultad de Ciencias Farmaceúticas de la Universidade de São Paulo- USP, en la ciudad de San Pablo, Brasil Consejo Deliberativo de FESSACAL : Ana María Guaraldo, Silvina Laura Diaz, Alejandra Romera, Adela Rosenkranz, Hernán Serna, Alba Salvarrey, Ekaterina Rivera y Cecilia Carbone. Los participantes podrán presentar sus trabajos de investigación en forma oral. Habrá espacios de 30 minutos para que empresas innovadoras en el área de los animales de laboratório presenten sus avances aplicables en Sudamérica. CONTACTO: Silvina L. Diaz silvinalauradiaz@yahoo.com.ar Silvania Peris Neves silvania@usp.br, Ana Maria Guaraldo anaguaraldo@gmail.com RESBCAL, São Paulo, v.1 n.3, p , jul./ago./set