UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU PARÂMETROS OPERACIONAIS DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE POLPA DE MANDIOCA ELONEIDA APARECIDA CAMILI Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Energia na Agricultura). BOTUCATU-SP Setembro

2 II UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU PARÂMETROS OPERACIONAIS DO PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE POLPA DE MANDIOCA ELONEIDA APARECIDA CAMILI Orientador: Prof. Dr. Cláudio Cabello Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp - Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia Área de ConcentraçãoEnergia na Agricultura. BOTUCATU - SP Setembro 2010

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5 V AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Cláudio Cabello pela orientação deste trabalho; À Profa. Dra. Marta Mischan pela realização das análises estatísticas; À Dra. Magali Leonel pela ajuda na interpretação das análises estatísticas; Ao Luiz, técnico do Laboratório de Análises do CERAT/UNESP pela ajuda na realização das análises de cromatografia; Ao Sérgio, técnico do Laboratório de matérias-primas do CERAT/UNESP pela ajuda na colheita da mandioca; A todos os funcionários da pós-graduação pela atenção; Ao CNPq pela concessão da bolsa de doutorado; As minhas amigas Tânia, Paula, Juliana, Lívia, Vanessa, Priscila, que me apoiaram nos momentos difíceis, obrigado pela compreensão e pelos momentos alegres... Aos amigos Mané e Léia, que me acolheram em sua casa, me apoiaram nos momentos difíceis, obrigado pela compreensão e pelos momentos alegres... Ao meu marido Miguel pela compreensão, dedicação, incentivo nos momentos mais difíceis e pelo amor e carinho; Aos meus pais e minhas irmãs que me apoiaram e se dedicaram ao meu projeto me deram amor e carinho; A Deus; A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho; Muito Obrigada!!!

6 VI SUMÁRIO LISTA DE TABELAS...XI LISTA DE FIGURAS...XIII LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS...XV RESUMO...01 SUMMARY INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Matéria-prima Cultura da mandioca Produção Brasileira de Mandioca Composição da mandioca Grânulo de amido Composição do amido Mandioca como matéria-prima para o processo fermentativo Etanol produzido a partir de fontes amiláceas Hidrólise enzimática Enzimas amilolíticas comerciais no Brasil Termamyl AMG Fermentação alcoólica Bioquímica Microbiologia Leveduras Alcoólicas Processos de fermentação Fatores que afetam a fermentação alcoólica Fatores Químicos Nutrição mineral e orgânica ph Inibidores da fermentação Concentração de açúcares...37

7 VII Antissépticos Antibióticos Teor alcoólico do produto Pressão Osmótica Fatores Físicos Temperatura Agitação Fatores Microbiológicos Agente de fermentação Concentração do inoculo Contaminação bacteriana MATERIAL E MÉTODOS Matéria-Prima Caracterização Físico-Química da Mandioca Umidade Cinzas Proteínas Matéria graxa Fibras ph Açúcares totais Amido Enzimas amilolíticas Levedura Teor de Glicose (GOD) Primeiro ensaio - Determinação do parâmetro tempo para a etapa de sacarificação Processo de hidrólise-sacarificação Segundo ensaio - Avaliação do processo de hidrólise Delineamento experimental...51

8 VIII Materiais para os ensaios Preparo das suspensões de mandioca Preparo das soluções de enzimas Produção dos hidrolisados Análise dos ensaios de hidrólise Determinações físico-químicas nos produtos hidrolisados Determinação de açúcares Determinação do ph Determinação dos sólidos solúveis (BRIX) Rendimento do processo de hidrólise Análise do resíduo Terceiro ensaio - Avaliação do processo de fermentação alcoólica Delineamento experimental Preparo do mosto para o processo fermentativo Preparo das suspensões de leveduras Ensaio de fermentação alcoólica Análise dos ensaios de fermentação Determinação do teor de etanol, metanol e glicerol e açúcares residuais Determinação da eficiência da fermentação alcoólica Determinação da viabilidade celular Análise comprobatória dos resultados obtidos (Hidrólise e Fermentação) Avaliação do processo de hidrólise Análises dos ensaios comprobatórios de hidrólise Determinação de açúcares Determinação dos sólidos solúveis (BRIX) Análise microbiológica Método Direto Método Indireto Coloração de Gram Rendimento do processo de hidrólise Análise do resíduo...64

9 IX Avaliação do processo fermentativo comprobatório Análise dos ensaios comprobatórios de fermentação Determinação do teor de etanol, metanol e glicerol e açúcares residuais Determinação de ácidos orgânicos Avaliação da contaminação microbiológica Determinação da eficiência da fermentação alcoólica Determinação da viabilidade celular Balanço de massas nos processos de hidrólise enzimática e fermentação alcoólica RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização físico química da matéria-prima Primeiro Ensaio - Determinação do parâmetro fixo (tempo) para a etapa de sacarificação Ajuste dos modelos estatísticos e influência das variáveis de processo sobre as respostas em estudo Segundo Ensaio - Produção de hidrolisado Glicose Maltose Maltotriose Maltotetraose Caracterização dos resíduos do hidrolisado Terceiro Ensaio FERMENTAÇÃO Valores experimentais das variáveis dependentes (respostas) para os fermentados produzidos a partir do hidrolisados obtidos anteriormente Glicose Etanol Metanol Glicerol Conversão Viabilidade celular...97

10 X 4.6 Resultados comprobatórios Caracterização físico-química da matéria-prima Hidrólise Determinação de açúcares Análise microbiológica Análise do resíduo Fermentação Determinação do teor de etanol, metanol e glicerol e açúcares residuais Determinação de ácidos orgânicos Avaliação da contaminação microbiológica Determinação da eficiência da fermentação alcoólica Determinação da viabilidade celular Balanço de massas nos processos de hidrólise enzimática e fermentação alcoólica CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES...122

11 XI LISTA DE TABELAS 1. Área plantada, produção e rendimento dos principais estados brasileiros produtores de mandioca, na sabra de Composição centesimal, em base seca, da mandioca Proporção dos diversos produtos da fermentação alcoólica, em g 100g -1 de glicose metabolizada, de acordo com várias fontes e para diferentes eficiências fermentativas Concentração de nutrientes minerais no mosto para se obter uma fermentação alcoólica adequada Níveis das variáveis no planejamento experimental para determinação dos parâmetros operacionais para produção de álcool de mandioca Níveis das variáveis no planejamento experimental para determinação dos parâmetros operacionais para produção de álcool de mandioca Composição centesimal da mandioca in natura em % de base úmida e seca Concentração de glicose produzida durante processo de sacarificação Valores experimentais das variáveis dependentes (respostas) para os hidrolisados produzidos a partir de mandioca in natura Rendimento da conversão de glicose no processo de hidrólise Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para a glicose produzida Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para produção de maltose na hidrólise enzimática Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para produção de maltotriose durante a hidrólise enzimática Análise físico-química em base úmida do resíduo sólido do processo de fabricação do hidrolisado Valores experimentais das variáveis dependentes (respostas) para os fermentados produzidos a partir do hidrolisado obtido anteriormente Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para o teor de glicose no vinho fermentado...88

12 XII 17. Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para o teor de etanol produzido no vinho fermentado Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para o teor de metanol produzido nos vinhos fermentados Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para o teor de glicerol produzido nos vinhos fermentados Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para conversão de glicose em etanol no vinho fermentado Resultados obtidos em porcentagem para a viabilidade celular Composição centesimal da mandioca in natura em % de base úmida e seca Valores obtidos para análise do hidrolisado no ensaio comprobatório Análise físico-química do resíduo sólido do processo de fabricação do hidrolisado Resultados médios das análises do fermentado Resultados dos valores dos ácidos encontrados no fermentado Resultados obtidos em porcentagem para a viabilidade celular na análise comprobatória...107

13 XIII LISTA DE FIGURAS 1. Raízes da mandioca Tipos de ligações entre moléculas de glicose e amido Ligações α(1,4) da molécula de amilose Ligações α(1-4) e α(1-6) da molécula de amilopectina Rotas tecnológicas para produção de bioetanol Catabolismo da glicose Célula de levedura Saccharomyces cerevisiae Morfologia da célula de levedura Processo descontínuo de fermentação alcoólica com recirculação de levedura Processo contínuo de fermentação alcoólica com recirculação de levedura (a)vista do reator no suporte; (b) Reator aberto com agitador tipo âncora Fluxograma do processo de hidrólise Reator de hidrólise com capacidade de 150 litros, dotado de sistema de agitação e camisa de aquecimento com vapor (a) Filtro a vácuo utilizado; (b) Polpa após processo de hidrólise sendo filtrada Gráfico com o perfil da concentração de glicose durante o processo de sacarificação da polpa de mandioca Gráfico de superfície de resposta para produção de glicose para as variáveis de (%)matéria seca e (AGU.g -1 ) amiloglucosidase Gráfico de superfície de resposta para produção de maltose para as variáveis (KNU.g - 1 )termamyl e (AGU.g -1 ) amiloglucosidase Gráfico de superfície de resposta para produção de maltose para as variáveis de (%) matéria seca e (AGU.g -1 ) amiloglucosidase Gráfico de superfície de resposta para produção de maltotriose para as variáveis de (%) matéria seca e (AGU.g -1 ) amiloglucosidase Gráfico de superfície de resposta para produção de maltotriose para as variáveis de (KNU.g -1 ) termamyl e (AGU.g -1 ) amiloglucosidase Gráfico de superfície de resposta para produção de maltotriose para as variáveis de (%) matéria seca e (KNU.g -1 ) termamyl...83

14 XIV 22 Fermentação em batelada alimentada Efeito do tempo sobre a concentração de glicose no vinho Efeito do tempo sobre a quantidade de etanol produzida no vinho Efeito do tempo sobre a quantidade de metanol produzido no vinho Efeito da concentração de levedura sobre o teor de glicerol no fermentado de mandioca % de conversão de glicose em etanol em relação ao tempo de fermentação Níveis de contaminação durante o período de fermentação Balanço de massa no processo de hidrólise para produção de glicose Balanço de massa no processo fermentação para produção de álcool etílico...109

15 XV LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS AGU.g -1 Unidade enzimática de amiloglucosidase que decompõe 1 g de amido AMG 400L Amiloglucosidase ART Açúcares redutores totais ART. L -1 Açúcares redutores totais por litro ATP Trifosfato de adenosina BRIX Porcentagem de sólidos solúveis na solução Ca ++ CaCl 2 cel. ml -1 CERAT Co ++ CO 2 Cu ++ C3 C4 C 6 H 12 O 6 C 2 H 5 OH Cálcio Cloreto de Cálcio células viáveis por ml Centro de Raízes e Amidos Tropicais Cobalto Gás carbônico Cobre Carbono três Carbono quatro Sacarose Etanol ºC Graus Celsius DCCR delineamento central composto rotacional DE Dextrose Equivalente E.S.T Extrato Seco Total Fe ++ g g.l -1 g.ml -1 GOD h ha H 2 O Ferro grama grama por litro grama por mililitro Glicose oxidase Hora Hectare Água

16 XVI H 2 SO 4 Ácido sulfúrico IAC Instituto Agronômico de Campinas K + KCl Kg Kg.t -1 KH 2 PO 4 KNU.g -1 L L.t -1 M Mg ++ mg mg ml -1 min ml ml.min -1 mm Mn ++ mol Potássio Cloreto de Potássio Quilograma Quilograma pro tonelada Dihidrogenofosfato de Potássio Unidade enzimática de α-amilase que decompõe 1 g de amido Litros Litro por tonelada Molar Magnésio miligramas miligramas por mililitros Minuto mililitro Mililitro por minuto Milímetro Manganês nome da unidade de base do Sistema Internacional de Unidades para a grandeza quantidade de matéria ou quantidade de substância m.s Matéria seca N Normal Na + Sódio NaCl Cloreto de Sódio NADPH 2 Metilenotetrahidrofolato redutase NaOH Hidróxido de sódio NaHCO 3 Bicarbonato de sódio (NH 4 ) 2 SO 4 Sulfado de amônio NH 4 + nm Amônia Nanômetro

17 XVII O 2 P ph ppm p/p rpm Termamyl 120 L ton ou t ton.ha -1 UFC.mL -1 U.I. por litro v/v Zn ++ Oxigênio fósforo potencial hidrogeniônico ou potencial hidrogênio iônico Parte por milhão peso por peso Rotação por minuto α-amilase Tonelada Tonelada por hectare Unidade formadora de colônia por mililitro Unidades Internacionais por litro volume por volume Zinco µl Microlitro µm Micrometro % porcentagem % p/p Porcentagem peso por peso

18 1 RESUMO A crescente necessidade de ampliar de modo sustentável o uso de fontes renováveis de energia, para proporcionar maior segurança ao suprimento energético, e reduzir os impactos ambientais associados aos combustíveis fósseis, encontra no bioetanol uma alternativa viável economicamente e com significativo potencial de expansão. Atualmente, a produção de etanol de mandioca por processo fermentativo, visando sua utilização como combustível veicular, é limitada, principalmente em comparação a processos que utilizam a cana-de-açúcar como matéria prima, e o eficiente uso do bagaço gerado. Todavia, a possibilidade de se produzir etanol refinado a partir de mandioca in natura vem obtendo o interesse de alguns industriais da área, devido ao fato do produto apresentar um maior valor de mercado que o etanol carburante. Este trabalho teve como finalidade contribuir para a inovação do processo de obtenção de etanol a partir da mosturação de raízes da mandioca, a etapa de fermentação e caracterização dos produtos, utilizando um sistema de produção em escala laboratorial que simulou as operações numa planta industrial. Buscou-se definir as melhores condições de tempos de processo, catalisadores enzimáticos e concentrações de substrato. No sentido de promover uma inovação tecnologicamente viável, traçou-se um planejamento experimental que minimizasse as operações de preparo, definindo as condições mais adequadas para o processo de hidrólise e fermentativo. A primeira etapa do trabalho consistiu em estudar o tempo de sacarificação do amido contido na polpa de raízes de mandioca, utilizando um delineamento central composto rotacional (DCCR) 2 3 onde o valor da variável dependente (concentração de glicose do sacarificado) ficou em função das variáveis independentes

19 2 (concentração de matéria seca, concentração de enzima dextrinizante e concentração de enzima sacarificante). O ensaio fermentativo teve como objetivo verificar o efeito do tempo de fermentação e a concentração de levedura sobre o perfil cromatográfico do vinho obtido, utilizando um delineamento central composto rotacional (DCCR) 2 2. Os melhores resultados obtidos para o primeiro e o segundo ensaio foram às seguintes condições de tratamento: tempo de sacarificação 16 horas; concentração do catalisador de 3KNU.4g -1 de amido, 3AGU.4g -1 de amido e 33,5% de matéria seca, com uma quantidade de glicose produzida de 274,08g.L -1, tendo como resposta uma conversão de amido em glicose no hidrolisado de 84,72%. No ensaio fermentativo as melhores condições de trabalho foram: concentração de leveduras desidratadas 4% em p/p (4x10 8 células viáveis. ml -1 ) e um tempo de fermentação de 12horas, mostrando-se mais promissor, com um teor de conversão em etanol de 79,57%. Através das melhores condições de trabalho um ensaio comprobatório em maior escala foi realizado simulando uma escala industrial, obtendo-se um hidrolisado com 281,16 g.l -1 de glicose e um rendimento na conversão a açúcares redutores de 90,44 %, sendo o hidrolisado utilizado como substrato para o processo fermentativo Este hidrolisado já filtrado e separado dos resíduos lignocelulósicos foi inoculado com leveduras etanólicas e os resultados indicaram a concentração de etanol de 69,65g.L -1, o que mostrou uma conversão no processo fermentativo de 78,6%. Considerando os resultados obtidos, concluí-se que, a polpa integral de mandioca apresentou-se como adequada matéria prima para produção de etanol. Palavras-chave: Hidrólise, amido, etanol, fermentação

20 3 OPERATIONAL PARAMETERS IN THE PROCESS OF ETHANOL PRODUCTION USING CASSAVA PULP AS SUBSTRATE. Botucatu, p. Thesis (Doctorate in Agronomy/Energy in Agriculture) School of Agronomical Sciences, São Paulo State University. Author: ELONEIDA APARECIDA CAMILI Advisor: CLAUDIO CABELLO SUMMARY Based on the increasing need of enlarging the use of renewable sources sustainably to provide greater security for energy supply and reduce environmental impacts associated with fossil fuels, bioethanol represents an economically viable alternative with significant potential of expansion. Currently, ethanol production from cassava through fermentation aimed at its use as vehicle fuel has been limited, mainly compared to processes employing sugarcane as raw material and the efficient use of the generated bagasse. However, the possibility of producing refined ethanol from cassava in natura has attracted the interest of some industries in the area, since this product has a higher market value than combustible ethanol. This work aimed to contribute to the innovation of the process of obtaining ethanol from cassava root mashing, as well as the stage of fermentation and characterization of products, using a production system in laboratory scale simulating operations in an industrial plant. We attempted to define the best

21 4 conditions for process times, enzymatic catalysts and concentrations of the substrate cassava root whole pulp. In order to provide a technologically viable innovation, an experimental planning was elaborated to minimize preparation operations, defining the most suitable conditions for hydrolysis and fermentation. The first step of this work was to study the saccharification time of the starch present in the pulp of cassava roots, using a central composite rotational design (CCRD) 2 3, so that the value of dependent variables (glucose concentration in the saccharified product) remained in function of independent ones (dry matter concentration, dextrinizing enzyme concentration and saccharifying enzyme concentration). The fermentative assay aimed to verify the effect of fermentation period and yeast concentration on the chromatographic profile of the obtained wine, using a central composite rotational design (CCRD) 2 2. In the first and second assays, the best results were obtained under the following treatment conditions: 16h saccharification time, 3KNU.4g -1 starch catalyst concentration, 3AGU.4g -1 starch and 33.5% dry matter, with 274,08g.L -1 produced glucose, resulting in 84,72% starch converted into glucose in the hydrolyzed product. In the fermentative assay, the best work conditions were: 4% concentration of dehydrated yeasts in w/w (4*10 8 viable cells.ml -1 ) and 12h fermentation time, becoming more promising, with 79,57% level of conversion into ethanol. Based on the best work conditions, an evidential test on a larger scale was carried out simulating an industrial scale, which led to a hydrolyzed product with 281,16 g.l -1 glucose and 90,44% yield in the conversion into reducing sugars. Such a product was used as substrate during fermentation and, after filtration and separation from lignocellulosic residues, it was inoculated with ethanol yeasts; results indicated 69,65g.L -1 ethanol concentration, showing 78,6% conversion during fermentation. The obtained results led to the conclusion that cassava whole pulp was an appropriate raw material to produce ethanol. Keywords: Hydrolisis, starch, ethanol, fermentation

22 5 1. INTRODUÇÃO No Brasil, a mandioca foi vista como matéria-prima para produção de álcool carburante em dois períodos, e , entretanto, após isso não houve seguimento desse uso. Atualmente, a produção de álcool carburante de mandioca é inviável, principalmente em comparação ao processo a partir da cana-de-açúcar e o eficiente uso do bagaço gerado. Todavia, a possibilidade de se produzir álcool refinado a partir de mandioca in natura tem obtido o interesse de alguns industriais da área, pois o produto apresenta um maior valor de mercado que o álcool carburante (LEONEL e CABELLO, 2001). A crescente necessidade de ampliar de modo sustentável o uso de fontes renováveis de energia, para proporcionar maior segurança ao suprimento energético e reduzir os impactos ambientais associados aos combustíveis fósseis, encontra no bioetanol uma alternativa viável economicamente e com significativo potencial de expansão. A produção e o uso de bioetanol como combustível veicular são praticados regularmente no Brasil desde 1931, com notável evolução durante as últimas décadas, alcançando maturidade e consistência, segundo um modelo produtivo que pode ser adaptado e implementado em contextos similares. Os primeiros trabalhos sobre produção de etanol combustível a partir de mandioca foram publicados no Brasil na década de 40. Até este período, encontravam-se experiências e estudos isolados, geralmente conseqüência de particularidades regionais e crises esporádicas de abastecimento de outros combustíveis. Almeida (1991), já num estudo mais técnico, comparou as produções de etanol a partir de cana de açúcar, melaço e mandioca, preconizando esta última à necessidade de um maior desenvolvimento de tecnologia para tornar-se

23 6 competitiva. Alertou ainda sobre a possibilidade de aproveitamento de terras onde, dada a sua natureza, a cultura de cana fosse pouco recomendada, mas que se prestassem a cultura da mandioca, por ser esta menos exigente. Esse tema só voltou a ser objeto de estudos mais constantes no final da década de 70, quando voltaram a surgir publicações de pesquisadores do Instituto Nacional de Tecnologia INT (ARAÚJO, 1975; BIANCO et al, 1976; ARAÚJO, 1981), e do Instituto Tecnológico de Alimentos (MENEZES & LAMO, 1976; MENEZES et al, 1976). A partir da década de 80, aumentou consideravelmente a quantidade de estudos visando um melhor conhecimento do processo, e um aprimoramento tecnológico que viabilizasse a sua aplicação. Apesar destes estudos, o número de instalações industriais foi muito influenciado por questões políticas. No entanto, ao final da década de 80, a maioria das usinas instaladas encontrava-se inoperantes, ou dedicadas à produção de álcool de amiláceos em pequena escala e para fins farmacêuticos, devido à falta de catalisadores baratos o que acarretava alto custo de produção de etanol e amiláceos. Hoje, a agroindústria açucareira é a responsável pela produção brasileira de etanol para fins carburantes, industriais, porém, quaisquer matérias-primas vegetais, ricas em açúcares, amido ou celulose, constituem fontes para produção de etanol. Deve ser ressaltado, entretanto, que a viabilidade de exploração de uma determinada espécie vegetal para fins industriais depende muito das condições clima-edafológicas reinantes na região. De acordo com Cereda et. al. (2004), dois fatores têm desmobilizado o uso da mandioca para produção de etanol quais sejam: a baixa produtividade agrícola e o maior consumo energético necessário à hidrólise do amido no preparo do mosto. Na China, o governo vê o etanol proveniente da mandioca como fonte de energia alternativa e, também, principalmente como fonte segura, renovável e não poluente. A mandioca é um produto de grande abundância. O país importa 25% de petróleo para a demanda interna, e calcula-se que em 2015 serão necessário mais de 50%. Por isso o governo promove o desenvolvimento da produção de etanol de mandioca como a fonte energética do país (ZHANG et. al., 2003). Quimicamente, o álcool etílico hidratado não apresenta diferença quando produzido por diferentes matérias-primas como cana-de-açúcar, cereais, beterraba e mandioca. As

24 7 diferenças estão restritas as impurezas que acompanham o álcool que é característico de cada matéria-prima e o grau de purificação pelo qual passou o produto. A mandioca é uma planta que se destaca entre as matérias-primas, para produção de etanol, devido à facilidade de sua cultura, sendo cultivada em vastas extensões no nosso país e também em quase todos os países tropicais e subtropicais. Segundo dados parciais AGRIANUAL (2010) a produção brasileira de mandioca foi de 26,3 milhões de toneladas em 2009 em uma área colhida de 1,889 milhões de hectares. O amido é encontrado em abundância na natureza, onde seu depósito permanente nas plantas ocorre nos órgãos de reserva, como é o caso dos amiloplastos de grãos de cereais, tubérculos, raízes e leguminosas. O grânulo de amido é formado essencialmente por dois polissacarídeos: a amilose e a amilopectina. A amilose é definida como uma molécula essencialmente linear formada por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas α(1-4) e, a amilopectina é uma molécula ramificada formada por unidades de α-d-glicose ligadas em α(1-4), essas cadeias estão unidas entre si por ligações α(1-6). A funcionalidade do amido depende da massa molar destes dois componentes, bem como da organização molecular no grânulo. Amidos de diferentes fontes botânicas possuem diferentes tamanhos, formas e propriedades físicas. O amido contido na mandioca, não é disponível à levedura alcoólica e necessita de uma transformação a mono e dissacarídeos fermentescíveis, que pode ser realizada utilizando amilases como catalisadores no processo de hidrólise. Esta etapa é imprescindível para disponibilizar os açúcares redutores requeridos à fermentação. Nos últimos anos, vários trabalhos de pesquisa vêm sendo realizados com o objetivo de determinar os melhores parâmetros operacionais para produção de etanol de mandioca. Algumas destilarias brasileiras operam de forma ineficiente, com perdas e rendimentos baixos tanto para o processo de hidrólise, como durante a fermentação. Desta forma, é de se esperar que exista um baixo rendimento operacional dessas destilarias. Não se sabe ao certo quais são as melhores condições operacionais a serem utilizadas para minimizar esses resultados. Contudo, os objetivos deste trabalho foram: estudar o processo de produção de etanol por hidrólise enzimática a partir da mosturação de raízes de mandioca, avaliando a influência de alguns parâmetros operacionais, como o tempo de hidrólise, concentrações de substrato e catalisadores (enzimas), sobre o teor de glicose. No

25 8 hidrolisado produzido, avaliar o comportamento fermentativo e caracterização dos produtos formados, utilizando um sistema de produção em escala laboratorial que simulasse as operações numa planta industrial, buscando-se definir as melhores condições de tempos de processo e concentrações de leveduras.

26 9 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Matéria-prima Cultura da mandioca A mandioca é uma espécie de origem latino-americana e sua produção está voltada para o consumo humano. Devido à sua adaptabilidade, é uma planta que pode ser cultivada em áreas onde outras espécies amiláceas não se desenvolvem com a mesma desenvoltura. A mandioca, produto muito consumido no Brasil pode ser utilizado diretamente para o consumo ou destinada para a indústria. Originária da América do Sul, a mandioca (Manihot esculenta Crantz) constitui um dos principais alimentos energéticos para cerca de 500 milhões de pessoas, sobretudo nos países em desenvolvimento, onde é cultivada em pequenas áreas com baixo nível tecnológico. Mais de 80 países produzem mandioca, sendo que o Brasil participa com mais de 15 % da produção mundial. De fácil adaptação, a mandioca é cultivada em todos os estados brasileiros, situando-se entre os nove primeiros produtos agrícolas do País, em termos de área cultivada (IBGE, 2009). Segundo Cereda (1994), a mandioca é cultura amplamente difundida por todo território nacional. Sua utilização, entretanto, é feita em duas opções: uma direta, o consumo culinário ou de mesa ; outra, o industrial pelo qual se processa a farinha de mandioca e a

27 10 extração de fécula. A dimensão da cultura é também variada, indo das plantações de fundo de quintal até as extensivas, mais comuns no sul do país. A mandioca é uma raiz que tem sido considerado uma importante fonte de alimento para a grande população em países da Ásia, África e América Latina. É conhecida como cassava, aipim, castelinha, macaxeira, mandioca, yuca e manioc (PANDEY et al., 2000). As oportunidades para o setor da mandioca em nível mundial mostram que o aparecimento de novas indústrias, o crescimento das indústrias já existentes, as quais podem usar produtos derivados da mandioca, e as possibilidades de substituir importações explicam as expectativas otimistas de crescimento da demanda do setor para os próximos anos (PHILLIPS, 1999). A mandioca é reconhecidamente uma raiz amilácea, onde o amido se encontra juntamente com os outros carboidratos de diferentes pesos moleculares, incluindo desde açúcares simples até glicosídeos e material celulósico. Apesar da pouca contribuição dos outros componentes, tais como proteínas, lipídios, vitaminas e sais minerais, eles devem ser considerados devido a importância da raiz como matéria-prima com elevado teor de umidade, oferecendo condições composicionais tanto na estocagem quanto no processamento. O cultivo desta raiz é feito principalmente em países tropicais, sendo o Brasil o terceiro maior produtor mundial. Parte desta produção é transformada em farinha ou usada diretamente na alimentação e outra parte é processada para obtenção de fécula. Duas características agronômicas do cultivo da mandioca são importantes para explicar a dispersão geográfica de sua produção: a capacidade para usar eficientemente o recurso água e ter grande adaptação a solos de baixa fertilidade, nos quais alguns cultivos não conseguem produzir, e, quando produzem o fazem de forma bastante precária. A cultura da mandioca é de fácil propagação, tolerante a pragas e doenças e pouco exigente quanto às condições edafoclimáticas. No entanto, tem baixa resistência ao frio, apresenta um longo período de crescimento e alto potencial de deterioração fora do solo. Tais mudanças ocorrem após 2 a 3 dias da colheita devido a processos fisiológicos seguidos pela deterioração microbiológica após 5 a 7 dias devido ao elevado teor de umidade (PLUMBLEY; RICKARD,1991). A capacidade dessa cultura para usar água eficientemente permite sua exploração em zonas de estação seca prolongada, como o Nordeste do Brasil e a África. Além disso, a sua

28 11 adaptação aos solos de baixa fertilidade permite a conversão eficiente de energia solar (que é abundante nos trópicos) em carboidratos, sem competir com outras culturas que demandam uma quantidade maior de nutrientes do solo. Outra característica agronômica reside na possibilidade de as raízes serem armazenadas no próprio solo, por um período razoável, sem perdas significativas de qualidade e rendimento e se bem manejada, a cultura pode até aumentar o rendimento. Em outras palavras, a relativa versatilidade de ser colhida com diferentes idades permite aos produtores melhor aproveitar as oportunidades de mercado e, em função da demanda, fazer ajustes alternativos dentro das unidades de produção (SAMPAIO et al., 1994). Esta planta vem desempenhando um papel importante desde os primórdios, não só como fonte de subsistência para muitos povos, mas também como matéria-prima para diversos produtos fermentados. A Figura 1 mostra as raízes da mandioca. Figura 1. Raízes da mandioca Produção brasileira de mandioca A importância sócio-econômica que a mandioca vem exercendo nos últimos anos induz ao aumento da sua área de cultivo e melhoria na sua produtividade. A situação atual do mercado nacional de mandioca, diferentemente da situação do mercado nas décadas de 70 e 80, vem obrigando o setor produtivo a buscar cada vez mais melhorias na produtividade para ampliação na produção de raízes (EMBRAPA, 2006). O tubérculo tem grande importância para as populações de baixa renda como fonte de energia, tanto para o homem quanto para os animais. De fácil cultivo, adaptada a solos de

29 12 baixa fertilidade e com alta resistência a seca, a mandioca está presente em todo o Brasil. Os estados com maior produção são Pará, Bahia, Paraná, Maranhão, Rio Grande do Sul, Amazônia e São Paulo. Em 2009 o país colheu 26,3 milhões de toneladas de raízes, com produtividade média de 15,45 ton.ha -1 (AGRIANUAL, 2010). A Tabela 1 mostra a área plantada e o rendimento dos principais estados brasileiros produtores de mandioca, na safra de Tabela 1 Área plantada, produção e rendimento dos principais estados brasileiros produtores de mandioca, na sabra de Estado Área colhida (ha) Produção (ton) Rendimento (ton.ha -1 ) Pará Bahia Paraná Rio Grande do Sul Maranhão Amazônia São Paulo Brasil ,45 Fonte: AGRIANUAL, Composição da mandioca As raízes de mandioca são compostas, basicamente, por água e carboidratos. Em termos nutricionais, são importante fonte de energia. Um dos fatores que determina a forma de aproveitamento das raízes de mandioca é seu teor de compostos cianogênicos, variável para diferentes cultivares de mandioca. Estes compostos, presentes em todas as partes da planta, são potencialmente tóxicos. Assim, as raízes de cultivares que apresentam baixo teor de compostos cianogênicos, popularmente denominadas de mandiocas mansas ou aipins, podem ser consumidas cozidas ou fritas. As raízes de cultivares com alto teor de compostos cianogênicos, mandiocas bravas, são destinadas ao processamento industrial, principalmente na forma de farinha e fécula. As raízes de mandioca possuem ainda compostos que, em presença de oxigênio (ar), levam à formação de estrias escuras nas raízes (deterioração fisiológica). Assim, o processamento das raízes deve ocorrer no máximo até 2 ou 3 dias após a colheita, conforme a

30 13 variedade, o manuseio pós-colheita (ocorrência de danos mecânicos, exposição à luz solar ou a temperaturas elevadas, etc) e o produto a ser elaborado (FOLEGATTI; MATSUURA, 2006). A composição da mandioca varia muito com a espécie, idade e condições de cultivo. A Tabela 2 mostra a composição da mandioca. Tabela 2 - Composição centesimal, em base seca, da mandioca. Amido (%) 90,1 Proteína (%) 1,5 Fibra (%) 5,6 Lipídios (%) 0,3 Açúcares (%) 0,7 Cinzas (%) 1,8 Outros (%) - Fonte: Mendes (1992) Vários fatores podem afetar o teor de amido da raiz e, conseqüentemente, a produtividade. Viégas (1976) indicou alguns deles, tais como a temperatura, a altitude, a umidade do ar e do solo, a ocorrência de chuvas, a luminosidade, a ação mecânica dos ventos, os tipos de solos e as diferentes variedades utilizadas. Podendo ainda ser acrescentada a esses fatores, a época do plantio, a época da colheita, a idade da planta e até mesmo a metodologia empregada nas análises químicas efetuadas (COCK, 1987). Quanto às diferenças sazonais, principalmente no que se refere à transformação da matéria-prima em farinha. Segundo Silva et al., (1996), as variações na produtividade podem ser explicadas pela existência de fatores como a diminuição do rendimento industrial na estação chuvosa, a dificuldade de acesso à lavoura devido a estradas ruins e o conseqüente crescimento dos custos do processamento Grânulo de amido O amido é a principal substância de reserva nas plantas superiores, fornecendo de 70 a 80% das calorias consumidas pelo homem. Os depósitos permanentes de amido nas plantas ocorrem principalmente nos órgãos de reserva como é o caso de grãos de cereais, como o arroz, o milho e o trigo; de tubérculos e de raízes, como a batata, a mandioca, o taro, a batatadoce e outras e de leguminosas, como o feijão, a ervilha (CIACCO; CRUZ, 1987; LEONEL; CEREDA, 2002).

31 14 Suas características físico-químicas estão relacionadas às características estruturais do grânulo as quais dependem da fonte botânica, do local e das condições de crescimento, entre outras (HERMANSSON; SVEGMARK, 1996; SLATTERY; KAVAKLI; OKITA, 2000) Composição do amido Considera-se como amido a fração extraída da parte aérea de plantas e fécula a fração amilácea extraída de raízes, tubérculos e rizomas. BeMiller (1997) afirma que cada amido é único e que quando se reconhece isso abrem-se caminhos para o desenvolvimento de novos produtos. A composição do amido influencia diretamente suas propriedades funcionais. Devido às diferenças estruturais dos diversos tipos de amido não se pode generalizar nada sobre propriedades e comportamentos dos amidos de diferentes fontes botânicas. Amido e fécula são polímeros de unidades de glicose, cujas ligações glicosídicas são do tipo α (alfa). Estas ligações podem ser facilmente hidrolisadas, quando comparadas com as do tipo β (beta, encontradas na celulose). Esta peculiaridade faculta ao amido um maior interesse para a sua utilização como substrato de processos biossintéticos. Em termos estruturais, o amido é um polímero composto (amilose e amilopectina, sendo esta última forma ramificada) em concentrações diferentes em função de sua origem botânica. A amilose é de maior predominância, composta de unidades de glicose polimerizadas por ligações glicosídicas α 1,4, de forma linear. A segunda fração, amilopectina, é um polímero de maior peso molecular, onde as unidades de glicose estão unidas por ligações α 1,4 e α 1,6 em configuração ramificada (LEONEL; CABELLO, 2001). O amido apresenta diferentes propriedades conforme a origem botânica, notadamente na forma e tamanho dos grânulos, na proporção entre amilose e amilopectina, capacidade de absorção de água e temperatura de gelatinização (CABELLO, 1995). É a principal substância de reserva das plantas superiores, fornecendo de 70 a 80% das calorias consumidas pelo homem. Os depósitos permanentes do amido nas plantas ocorrem nos órgãos de reserva, que é o caso de grãos em cereais (milho, arroz) e de tubérculos e raízes (batata e mandioca) (CIACCO; CRUZ, 1987; LEONEL; CEREDA, 2002).

32 15 Independente de sua origem é tradicionalmente empregado nas indústrias alimentícia, metalúrgica, de mineração, de construção, cosmética, farmacêutica, de papel e papelão, têxtil, etc. O amido de mandioca, devido à proporção entre amilose/amilopectina, pelas características de ligações glicosídicas e da estrutura granular, apresenta propriedades singulares que o torna preferido em diversos processamentos alimentares e usos industriais (CEREDA, 1989). As principais fontes de amido comercial no mundo são o milho, o arroz, trigo e a mandioca. Seu uso, nos últimos anos vem crescendo o interesse em amidos naturais que possam ser utilizados pela indústria alimentícia (LEONEL et al., 2002). O amido é um polissacarídeo de reserva energética da célula vegetal. É formado por moléculas de glicose ligadas entre si através de numerosas ligações α (1,4) e poucas ligações α (1,6), ou "pontos de ramificação" da cadeia. A molécula sem pontos de ramificação é denominada amilose de forma linear e hélice em solução aquosa, enquanto aquela que se apresenta com ramificações recebe o nome de amilopectina. Encontra-se armazenado em grandes proporções em raízes tuberosas como a mandioca, caules, tubérculos, como a batata inglesa, e em certas sementes como o milho. A hidrólise total do amido forma moléculas de glicose, enquanto a hidrólise parcial produz moléculas de maltose. É um polissacarídeo que consiste de resíduos de α-d-glicose, com suas ligações glicosídicas identificadas através de átomos de carbono numeradas de um a seis, como mostram as Figuras 2 e 3. Essas numerações facilitam a compreensão das propriedades e reatividade dos grupos funcionais da molécula de glicose no amido (BULÉON, 1998).

33 16 Figura 2. Tipos de ligações entre moléculas de glicose e amido. Fonte:SURMELY et al. (2003). A composição do amido depende de vários fatores, como a variedade e condições climáticas. As condições de estocagem da matéria-prima também podem influenciar alguns componentes, como a quantidade de açúcar (KEARSLEY; DZIEDZIC, 1995). Os grânulos de amido são formados, basicamente, por dois polímeros: a amilose e a amilopectina. A funcionalidade dos amidos está diretamente relacionada a essas duas macromoléculas e também à organização física das mesmas, dentro da estrutura granular (BILIADERIS, 1991). A amilose e a amilopectina se apresentam em proporções relativamente constantes de 20:80, porém podem apresentar quantidades relativas de 2% de amilose em amidos cerosos e até cerca de 80% de amilose no amilomilho (BULÉON, 1998). A amilose é descrita como uma molécula essencialmente linear, sendo formada por unidades de D-glicose unidas entre si por ligações glicosídicas α(1-4), como mostra a Figura 3. No entanto, um certo grau de ramificação (9-20 ramificações) em α(1-6) tem sido encontrado em sua estrutura (FRENCH, 1984; HOOVER, 2001).

34 17 Figura 3. Ligações α(1,4) da molécula de amilose. Fonte: Thomas; Atwell (1999). Essas ramificações aumentam com o peso molecular da amilose, que varia de 10 5 a 10 6 (HOOVER, 2001). Entretanto, estudos demonstraram comportamento similar entre amiloses de diferentes pesos moleculares, em que a presença de ramificações não alterou o comportamento em solução das cadeias de amilose, permanecendo idêntico ao comportamento das cadeias totalmente lineares (BULÉON, 1998). A molécula de amilose se apresenta na forma helicoidal e em função desta formação de hélice, os filmes e fibras formados por ela são mais elásticos que aqueles formados por moléculas de celulose (WHISTLER, 1964; BEMILLER, 1997). O interior da hélice é lipofílico, contendo predominantemente ligações de hidrogênio, enquanto os grupos hidroxila permanecem na parte externa da mesma. A estrutura helicoidal da amilose permite a acomodação de átomos de iodo formando um composto de inclusão de cor azul intensa com absorção máxima a comprimentos de onda entre 620 a 680 nm. Essa reação é usada na avaliação quantitativa do teor de amilose e como indicador da presença de amido (HOOVER, 2001). As amiloses de tubérculos e raízes apresentam teores variando entre 18,3 a 20,4% e número de ramificações entre 2,2 12 (HOOVER, 2001). A amilopectina é uma molécula grande e altamente ramificada, com peso molecular médio de É formada por várias cadeias constituídas de unidades de α-d-glicose ligadas em α(1-4). Essas cadeias, por sua vez, estão unidas por ligações α(1-6) constituindo de 4-5% do total das ligações glicosídicas, como mostra a Figura 4 (WHISTLER; BEMILLER, 1997; BULÉON, 1998; HOOVER, 2001; FRANCO et al., 2001).

35 18 Figura 4. Ligações α(1-4) e α(1-6) da molécula de amilopectina. Fonte: Thomas; Atwell (1999). 2.4 Mandioca como matéria-prima para o processo fermentativo A produção de álcool, principalmente para fins alimentícios (bebidas), farmacológicos e laboratoriais, também se apresenta como uma alternativa de mercado para a mandioca (FONSECA, 1996). Os hidrolisados produzidos a partir de mandioca tem as mesmas propriedades dos hidrolisados de milho. Uma vantagem competitiva da mandioca é de que os hidrolisados podem ser elaborados através de um processo mais simples e com menor investimento, devido a características particulares da mandioca, tais como menor temperatura de gelatinização e menores teores de proteínas e lipídeos (SURMELY et al, 2003). Vários autores defendem a produção de etanol a partir da mandioca, pois a mandioca produz álcool de qualidade superior podendo apresentar outras aplicações além de carburante. A produção de álcool de mandioca poderia ser incentivada em regiões nas quais as condições de solo são impróprias para o cultivo da cana-de-açúcar e apropriada para essa raiz, que é pouco exigente em fertilidade. A produção pode ser feita em regiões de baixa densidade demográfica e de baixa renda per capita, como forma de melhorar a distribuição de renda no país (VENTURINI FILHO e MENDES, 2003). A produção de etanol a partir de mandioca segue uma linha industrial semelhante à fabricação desse álcool a partir de cereais. As principais operações unitárias envolvidas na manufatura do álcool etílico industrial a partir da mandioca pelo processo de hidrólise enzimática do amido são:

36 19 a. Pesagem Lavagem Descascamento: Após a pesagem as raízes de mandioca são lavadas e descascadas em descascadores para a eliminação de impurezas como terra e areia, que afetam negativamente o processo. b. Desintegração: A desintegração da raiz é feita para aumentar a superfície específica e facilitar a penetração do calor, a gelificação e o ataque das enzimas amilolíticas durante a sacarificação do amido. c. Dextrinização e Sacarificação: É realizada através do uso de enzimas comerciais (αamilase e amiloglicosidase). d. Fermentação: A fermentação alcoólica é o processo bioquímico, que é responsável pela transformação de açúcar em álcool etílico. e. Destilação: Processo de separação de componentes de uma mistura que está baseado na volatilidade de cada um desses componentes, numa dada temperatura e pressão. 2.5 Etanol produzido a partir de fontes amiláceas A produção de bioetanol é efetuada em bases comerciais por duas rotas tecnológicas, utilizando matérias-primas doces, diretamente fermentáveis, como a cana-deaçúcar e a beterraba açucareira, ou matérias-primas amiláceas, como o milho o trigo e a mandioca, cujo amido deve ser convertido em açúcares (sacarificado) antes da fermentação, como esquematizado na Figura 5.

37 20 Figura 5 - Rotas tecnológicas para produção de bioetanol No Brasil, o aproveitamento da mandioca para obtenção de álcool foi pesquisado inicialmente no período de Nesta época chegaram a funcionar com êxito, por alguns anos, algumas destilarias de álcool de mandioca nos estados de Minas Gerais, Rio Grande do Sul e São Paulo. Uma das principais razões por que a mandioca não tenha sido devidamente explorada pela indústria alcooleira parece ter sido o progresso exponencial dessa indústria à base se melaço de cana que prescinde da trabalhosa e onerosa etapa de hidrólise de amido (SAWADA, 1979). Novos estudos foram realizados em 1979, devido à problemática escassez de Petróleo, o que causou o aumento a demanda por fontes renováveis para produção de energia, tendo como fonte alternativa a produção de etanol a partir de mandioca. Incentivado pelo Programa Nacional do Álcool - PROÁLCOOL criado em 1975 pelo governo brasileiro para reduzir a importação de petróleo, uma importante iniciativa para substituir combustíveis fósseis por um combustível alternativo e renovável: o álcool carburante. Porém, novamente o Brasil encontrou no álcool de cana de açúcar, a solução para enfrentar o aumento abrupto dos preços do petróleo que importava.

38 21 Hoje, com a necessidade premente de encontrar novas fontes de energia e com grande avanço tecnológico, tornou-se oportuno um reexame desta via de industrialização da mandioca. Estudos mais técnicos compararam as produções de etanol a partir de cana-deaçúcar e mandioca, preconizando para esta última a necessidade de um maior desenvolvimento de tecnologia para tornar-se competitiva. Alertando ainda sobre a possibilidade de aproveitamento de terras onde, dada a sua natureza, a cultura de cana fosse pouco recomendada, mas que fosse aproveitada pela cultura da mandioca, por ser esta menos exigente. O álcool etílico hidratado, do ponto de vista químico, não apresenta diferença quanto às matérias-primas utilizadas como cana-de-açúcar, cereais, beterraba e mandioca. As diferenças estão restritas às impurezas que acompanham o álcool, que são características de cada matéria-prima e o grau de purificação pelo qual passou o produto (LOPES, 1986). Operacionalmente, o processo de produção de álcool fino é idêntico ao de produção de álcool hidratado carburante ou industrial. Devido às características próprias, há a necessidade de manutenção das cargas das colunas de destilação na faixa de trabalho e também a impossibilidade de se obter álcool fino com duas colunas (COPERSUCAR, 1987). O álcool fino constitui-se principalmente em bem de produção intermediário, ou seja, matéria-prima para as indústrias de bebidas, perfumaria, farmacêutica e eventualmente indústrias químicas e alimentícias. Na indústria de bebidas, o álcool fino é usado principalmente na fabricação de vodca, licores e aperitivos e também para a correção do teor alcoólico em vinhos, sendo este o maior mercado. Já nas indústrias de perfumaria é usado desde a extração de princípios ativos naturais até a elaboração dos perfumes. Na indústria farmacêutica é usado na extração de princípios ativos naturais e como diluente. Atualmente no Brasil, as destilarias que produzem álcool fino utilizam cana de açúcar, arroz ou milho como matérias-primas, sendo a mandioca utilizada por pequenas destilarias para a produção de bebidas destiladas. Porém, a grande maioria das destilarias utiliza como matéria-prima o milho, este apresenta tratamento para utilização como semente e, conseqüentemente, impróprio para o consumo como alimento ou ração animal. Esta matériaprima são descartes de empresas fabricantes de sementes que não apresentaram rendimento adequado ou prazo de validade vencido.

39 22 Outra demanda que se apresenta para álcoois produzidos a partir deste resíduo está na relação de isótopos. Os álcoois originários de plantas de metabolismo do tipo C3 (caso da mandioca), em relação às plantas de metabolismo C4 (caso da cana-de-açúcar); esta relação é importante para discriminar o etanol quando há necessidade de correção de teor alcoólico de bebidas (DUCATTI, 2004). O processo de fotossíntese consiste em três fases; a primeira é fotoquímica onde ocorre a absorção de energia luminosa, a segunda quando há transferência de elétrons, produção de NADPH 2 e ATP, e a terceira fase, a bioquímica onde ocorre a síntese de carboidratos. Nestas rotas bioquímicas, o primeiro composto orgânico sintetizado pode conter três ou quatro átomos de carbono. As plantas que possuem ciclo bioquímico onde o primeiro composto orgânico sintetizado possui três átomos de carbono são denominadas de plantas do ciclo C3. Por outro lado, as plantas em que o primeiro composto orgânico formado possui quatro átomos de carbono são denominadas de plantas do ciclo C4 (DUCATTI, 2004). As proporções de álcoois advindos de plantas dos ciclos fotossintéticos C3, C4, expressas como uma relação entre o isopentanol/isobutanol e npropanol/isobutanol, se situa em faixas distintas e típicas para cada bebida. Estas relações têm como objetivo a elucidação da origem, falsificação e identidade das bebidas alcoólicas, não se aplicando à avaliação da qualidade das mesmas. (OLIVEIRA, 2001). A legislação permite adições de quantidades específicas de álcool para cada bebida. 2.6 Hidrólise enzimática Os amidos podem ser hidrolisados por vias físico-químicas (ácidos) ou por via enzimática. A hidrólise ácida apresenta algumas desvantagens tais como: elevado consumo de energia, baixo rendimento e seletividade e pouca flexibilidade operacional. Em função disso, os processos enzimáticos assumiram maior importância, pois conseguiram eliminar quase que totalmente essas desvantagens. A hidrólise se dá pelo desdobramento total das moléculas de amilose e amilopectina, que ao se romperem se transformam em dextrinas cada vez mais simples e finalmente em glicose. O amido não tem sabor, mas os produtos de uma hidrólise intensa apresentam sabor adocicado (FRANCO, 2001).

40 23 Os produtos resultantes da hidrólise são a glicose, maltose, e uma série de oligossacarídeos e polissacarídeos. Essa ampla faixa de hidrolisados, produzidos a partir de diferentes graus de hidrólise, é classificada em valores de dextrose equivalente (DE), o qual mede a quantidade de açúcar redutor presente no produto e é expresso em peso seco (CHRONAKIS, 1998). O número de extremidades redutoras indica a polimerização da molécula de amido. Por convenção, considera-se que o valor redutor da glicose é de 100%. Ao medir as extremidades redutoras do amido e seus produtos de hidrólise, os resultados são expressos em glicose equivalente ou Dextrose Equivalente (DE). Quanto maior o valor de DE, maior o efeito de hidrólise ou despolimerização do amido. Entretanto, dois hidrolisados preparados em condições diferentes, podem apresentar o mesmo DE e um perfil de açúcar completamente diferente, sendo as propriedades dos hidrolisados também diferentes. Para que a hidrólise de uma solução de amido hidratada possa ser completa, partindo-se de uma solução formada de água e amido, que ao final resultará em solução composta apenas por moléculas de D-glicose, que é definido como (DE) ou dextrose Equivalente igual a 100. Portanto quando a hidrólise não é total, esta solução formada é denominada xarope de glicose, sendo assim uma composição de carboidratos variáveis, que depende seguramente das condições do tratamento a que foi submetida essa suspensão de amido. O DE é empregado como medida do grau de hidrólise da suspensão. Os grânulos de amido insolúveis em água são mantidos unidos por ligações de hidrogênio no meio dos polímeros, amilose e amilopectina. Na hidrólise do amido são utilizados, basicamente, quatro grupos de enzimas. As endo e exoamilases que agem primeiramente nas ligações α(1-4); as desramificantes que agem exclusivamente nas ligações α(1-6) e as transferases que quebram ligações glicosídicas α(1-4) e as transferem para um receptor glicosídico, formando uma nova cadeia glicosídica. As enzimas amilolíticas são catalisadoras da hidrólise de ligações dos tipos α 1,4 e α 1,6, encontradas nos polissacarídeos, recebendo a denominação de amilases. Estas enzimas oriundas de plantas, bactérias, fungos e animais e recebem classificação como α-amilases, β- amilases, amiloglucosidases e isoenzimas. Cada uma dessas enzimas possui um mecanismo diferenciado de catálise, o que resulta em produtos diferentes. As α-amilases, por exemplo, são endo-glicosidases que atuam em regiões internas do polissacarídeo afastadas da extremidade

41 24 redutora, produzindo inúmeros tipos de oligassacarídeos. Por outro lado, as β-amilases hidrolisam o polissacarídeo na região externa do grupo não redutor, produzindo cadeias de baixo peso molecular em configuração do tipo β. As enzimas α-amilases não são capazes de clivar ligações α-1,4 próximas de ligações α-1,6. Desta forma, sua catálise resulta em cadeias com três e seis unidades de glicose, denominadas dextrina-limite, principalmente as maltotrioses e isomaltoses. As amiloglucosidases são consideradas exoenzimas (FUJII et al., 1988), por atuarem nas extremidades não redutoras. Assim, não tem ação sobre a estrutura helicoidal da amilose. Outra peculiaridade dessas enzimas, é que elas são produtoras de dextrinas, pois hidrolisam as ligações do tipo α-1,6 e α-1,4, fornecendo como produto final moléculas de D-glicose. Em processos de degradação de polissacarídeos, geralmente é utilizada uma endoenzima, a α- amilase, associada amiloglucosidase. Na hidrólise, espera-se que as primeiras formem moléculas menores de substrato facilitando assim a ação da amiloglucosidase. As pupulanases apresentam especificidade para hidrolisar somente ligações α-1,6 podendo atuar em conjunto com as amiloglucosidases, em substratos ricos em amilopectinas (CABELLO, 1995). Assim que uma suspensão aquosa de amido é aquecida, as ligações enfraquecidas permitem que os grânulos possam absorver água. Isto pode acontecer em diferentes faixas de temperatura. Para o amido de trigo, a temperatura de gelatinização é de 58 C; ponto médio a 61 C e final a 64 C. Ao mesmo tempo em que ocorre a quebra das ligações de hidrogênio, ocorre o intumescimento do grânulo que libera cadeias de amilose e amilopectina. Assim, a solubilidade do amido tende a aumentar, com aumento paralelo da viscosidade e transparência das suspensões iniciais. Assim temos o processo de gelatinização. Nestas condições, as enzimas α-amilases aumentam a velocidade de hidrólise, em sistema de ataque múltiplo, cuja formação de complexo entre enzima e substrato, dará origem às primeiras clivagens. Parte da cadeia será liberada e a parte remanescente continuará complexada com a enzima quando várias ligações α-1,4 serão hidrolisadas até a dissociação do sítio da enzima (CABELLO, 1995). Enzimas comerciais estão presentes no mercado brasileiro, como exemplos tem-se as comercializadas pela NOVO NORDISK S/A. Uma delas, utilizada para a hidrólise de amido, é a Termamyl 120 L que é de forma líquida, composta por uma α-amilase notavelmente termo-estável e produzida por uma cepa selecionada de Bacillus licheniformis.

42 25 Segundo a Novo (1995) essa enzima é uma endoamilose que hidrolisa encadeamentos 1-4-αglucosídeos em amilose e amilopectina, em temperaturas na faixa de 93 C, quando o amido será decomposto em dextrinas e oligossacarídeos solúveis. Sua atividade declarada é de cerca de 120 KNU.g -1 (KNU, Kilo-NOVO-Alfa-amilase-Unit), sendo que uma unidade corresponde à quantidade de enzima necessária para hidrolisar 5,26 g de amido por hora. Para produção de álcool, esta enzima é normalmente utilizada para solubilizar o amido, ou seja, degradar o amido em dextrinas solúveis e oligossacarídeos. Já a enzima AMG 400L (amiloglucosidase) é de forma líquida sendo uma exoglucosidase α-1,4 (glucoamilase) obtida através da fermentação submersa de uma cepa selecionada de Aspergillus niger. Denominada tecnicamente por glucohidrolase 1,4 α-d glucano. De acordo com a Novo (1981) esta enzima catalisa ligações α-1-4 e α-1-6 do amido, onde durante a hidrólise eliminam-se gradualmente as unidades de glucose do extremo não redutor da molécula do substrato. A velocidade de hidrólise depende do tipo de ligação e da longitude da cadeia: as ligações α-1-4, se hidrolisam mais facilmente que as ligações α-1-6, porém a maltotriose, e especialmente a maltose, hidrolisam-se a uma velocidade mais lenta que os oligossacarídeos. Sua atividade (Novo amiloglucosidase unit, AGU) é definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 micromol de maltose por minuto, sob condições padrão de temperatura (60 C). O rendimento do processo é calculado sobre a quantidade usada de matéria-prima, mais comumente considerada a quantidade de amido que entrou no processo. É normal encontrar rendimentos acima de 100%. O fracionamento do amido em cadeias menores é acompanhado pela adição de uma molécula de água (hidrólise) em cada ligação rompida, o que acarreta aumento do peso de amido fracionado e conseqüentemente um aumento do rendimento. Por exemplo, no caso teórico de hidrólise total do amido em moléculas de glicose, 1 g de amido daria 1,1g de glicose, com rendimento de 110% (SURMELY et al, 2003). Estudos sobre o efeito de hidrólise de amidos originários de mandioca no perfil de açúcares e fermentação alcoólica feitos por Abraham et al. (1987) demonstraram que no método enzima-enzima 96% dos açúcares totais presentes no hidrolisado era glicose, sendo observados pequenos teores de maltose e maltotriose. Para definir os valores de amido que se transformaria em glicose, foi assumida a seguinte conversão:

43 26 - Quando se hidrolisa uma ligação glicosídica, ocorre à incorporação do grupo hidroxílico e do cátion hidrogênio. Estequiometricamente, cada mol de glicose produzida incorpora um mol de água. - Considerando que: 1mol de glicose = 1mol de H 2 O + massa de amido, então: 180,16g de glicose = 18g de água + 162,16g de amido ou 100g de amido teoricamente produz 111,1g de glicose. Segundo Lloyd e Nelson (1984), um hidrolisado com alto teor de glicose apresenta concentração de glicose de 94% em peso e dextrose equivalente de 96,28%, pode-se então calcular a concentração máxima de conversão a partir do amido Enzimas amilolíticas comerciais no Brasil As preparações enzimáticas apresentam-se na forma de um líquido não viscoso, de cor marrom escura, podendo ser divididas em três categorias, devido às características das preparações: α-amilase termorresistente, com temperatura ótima de ação a 90ºC; α-amilase termosensível, com temperatura ótima de ação entre 70 a 80ºC; Enzimas de sacarificação de tipo amiloglicosidase e β-amilase. Apesar das tentativas de padronização internacional, a atividade das preparações é especifica de cada produtor ou comerciante. As enzimas exigem substratos, temperaturas e ph diferentes, dificultando a comparação das atividades a partir das fichas técnicas dos produtos. Em condições fora dos parâmetros ótimos, à atividade enzimática acaba alterando a cinética, diminuindo então o rendimento do processo. A Novozymes S/A é a maior produtora de enzimas em nível mundial e possui uma filial no Brasil Termamyl É um preparado enzimático líquido e concentrado, a base de α-amilase termoestável, produzido a partir de uma cepa selecionada de Bacillus licheniformes. A enzima hidrolisa as ligações α-1,4 da amilose e da amilopectina, convertendo rapidamente o amido em dextrinas e oligossacarídeos solúveis.

44 27 A Termamyl foi especificamente desenvolvida para promover a liquefação (dextrinização) do amido e produção de maltodextrinas. Possui aparência líquida não viscosa de cor marrom escuro e densidade de 1,2 g.ml -1. O ph ótimo de ação enzimática esta entre 6 e 8 e temperatura de 90 a 105ºC, devendo-se adicionar no meio de reação de 30 a 60 ppm de cálcio a fim de otimizar a atividade da enzima (NOVOZYMES, 2008) AMG A AMG é uma amiloglicosidase de grau alimentício, produzida a partir de uma cepa selecionada de Aspergillus niger. A enzima hidrolisa as ligações α-1,4 e α- 1,6 do amido liquefeito. Durante a hidrólise, eliminam-se gradualmente as unidades de glicose da extremidade não redutora do sacarídeo. A velocidade de hidrólise depende do tipo de ligação e do comprimento da cadeia. A AMG é recomendada para sacarificação do amido na produção de glicose. Possui aparência liquida não viscosa de cor marrom claro e densidade 1,2 g.ml -1. O ph ótimo de ação enzimática esta entre 4 e 4,5 e temperatura de 58 a 60ºC (NOVOZYMES, 2008). 2.7 Fermentação alcoólica Bioquímica O processo de fermentação alcoólica caracteriza-se como uma via catabólica, na qual há degradação de moléculas de açúcar (glicose ou frutose), no interior da célula de microrganismos (levedura ou bactéria), até a formação de etanol e CO 2, havendo liberação de energia química e térmica (LEHNINGER et al, 2002). O trabalho de quebrar essas moléculas (açúcares) é feito através de uma série de reações simples, cada uma catalisada por uma enzima, que se situa em regiões determinadas da célula (COPERSUCAR, 1987).

45 28 Figura 6- Catabolismo da glicose. Fonte: Lehninger et al (2002). A glicólise é a via central do catabolismo da glicose, sendo que o piruvato é o produto final desse processo, o qual pode seguir diferentes vias metabólicas: fermentação alcoólica, fermentação láctica e respiração através do ciclo de Krebs e cadeia respiratória. Na fermentação alcoólica, o piruvato é descarboxilado, formando acetaldeído e posteriormente reduzido a etanol (LEHNINGER et al, 2002). Segundo Ribeiro et al., (1987), as leveduras são capazes de assimilar, mono, di e trissacarídeos e como são aeróbios facultativos, os produtos finais da metabolização dos açúcares irão depender das condições ambientais em que ela se encontra. Uma fração do açúcar é transformada em biomassa, CO 2 e H 2 O em aerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO 2 em anaerobiose (fermentação alcoólica). Juntamente com o etanol e CO 2, o metabolismo anaeróbio permite a formação e excreção de glicerol, ácidos orgânicos (succínico, acético, pirúvico e outros), álcoois superiores, acetaldeídos, acetoína, etc e

46 29 simultaneamente ocorre o crescimento das leveduras. Estima-se, que 5 % do açúcar metabolizado pela levedura seja desviado para gerar tais produtos secundários da fermentação. Na Tabela 3, segundo Lima et al, (2001), é possível observar a formação de produtos e a eficiência fermentativa durante a fermentação alcoólica por vários autores. Tabela 3 Proporção dos diversos produtos da fermentação alcoólica, em g 100g -1 de glicose metabolizada, de acordo com várias fontes e para diferentes eficiências fermentativas. Produto da fermentação Pasteur 95 % Jackman, % Basso et al., % Etanol 48,5 45,0-49,0 43,0-47,0 Gás carbônico 46,4 43,0-47,0 41,0-45,0 Glicerol 3,3 2,0-5,0 3,0-6,0 Ácido succínico 0,6 0,5-1,5 0,3-1,2 Ácido acético - 0,0-1,4 0,1-0,7 Óleo fúsel - 0,2-0,6 - Butilenoglicol - 0,2-0,6 - Biomassa (massa seca) 1,2 0,7-1,7 1,0-2,0 Fonte: LIMA et al., (2001) A fermentação alcoólica de açúcares fermentescíveis na presença de leveduras obedece à ordem seqüencial de reações metabólicas da via de Embden - Meyerhof -Parnas (LIMA et al., 2001). O fenômeno como um todo pode ser representado pela equação (1) de Gay - Lussac, que serve de base para cálculos de eficiência: C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2 CO 2 eq. (1) O balanço de massa teórico indica que 1 mol de glicose é convertida a 2 moles de etanol e 2 moles de gás carbônico, que em termos mássicos seria: 180g 92g + 88g Com um rendimento teórico de 51,1 % sobre a massa da glicose.

47 Microbiologia produzir álcool. A fermentação é realizada por leveduras, embora alguns tipos de bactérias possam Leveduras Alcoólicas As leveduras são fungos unicelulares, isto é, formados por uma única célula e, geralmente, não formam filamentos. Células presentes em suspensões muito diluídas formam colônias ou clones de células individuais (população de células iguais sobre meio sólido) quando espalhadas em um meio nutriente solidificado com ágar-ágar. Na produção industrial de álcool, o microrganismo mais usado no processo de fermentação é a levedura Saccharomyces cerevisiae, como mostra a Figura 7. Nas grandes indústrias produtoras de etanol são usadas leveduras de panificação, prensadas e secas ou leveduras selecionadas, com tolerância a altos teores de etanol e com boa velocidade de fermentação (BELLUCO, 2001). As leveduras são organismos eucariotos e suas estruturas correspondem basicamente àquelas de outras células eucarióticas. As células são esféricas, elípticas ou cilíndricas, variando grandemente em suas dimensões, porém variam consideravelmente no que se refere a suas dimensões, com limites desde 1 a 5µm de largura e 5 a 12µm de comprimento (PELCZAR et al, 1980). A reprodução ocorre por gemação, esporulação ou fissão, sendo mais comum a gemação ou brotamento (LIMA et al., 2001). Figura 7- Célula de levedura Saccharomyces cerevisiae. Fonte: INFOESCOLA, (2009).

48 31 Nas leveduras existem duas regiões fundamentais: o núcleo, que contém as características hereditárias e o citoplasma, contendo enzimas responsáveis pela assimilação, transformação de substâncias vitais, crescimento e multiplicação celular. A Figura 8 mostra a morfologia de uma célula de levedura. Figura 8 Morfologia da célula de levedura. Fonte: Lehninger et al (2002). De acordo com a Figura 8 pode-se observar que o protoplasma é envolvido por uma membrana e esta por uma parede. Ele contém um núcleo, um grande vacúolo, glóbulos de gordura e numerosas outras estruturas reveladas por técnicas específicas de coramento e de microscopia. Através de microscópio eletrônico pode-se observar que a parede celular é composta de uma densa camada externa de cerca de 0,05µm de espessura e camadas menos densas de cerca de 0,2µm. A parte interna da parede pode ser subdividida em 3 camadas, compostas de polímeros de glicose e de manose, com pequenas quantidades de proteínas, lipídeos e quitina. A distribuição destes polímeros é variável com as condições de cultivos e representam papel importante no comportamento da levedura no que se refere, por exemplo, á floculação. Algumas enzimas importantes como a invertase, a fosfatase, a amino-peptidase e a glucoamilase, se localizam na parede celular. No caso de Saccharomyces cerevisiae a parede

49 32 tem entre 6 a 8% em peso de proteínas, a maior parte dela na forma das enzimas acima mencionadas. Essa espécie, é a mais importante da levedura alcoólica, possui um largo espectro de utilização, sendo empregado na produção de pães, bebidas alcoólicas, etanol. Sua biomassa pode ser recuperada como subproduto de fermentação e transformada em levedura seca, que se constitui em matéria-prima para a fabricação de ração animal ou suplemento vitamínico para o homem. Os critérios tecnológicos que fazem com que uma levedura seja utilizada comercialmente na fermentação alcoólica são o alto rendimento e a elevada produtividade, ou seja, a rápida conversão de açúcar em álcool, com baixa produção de componentes secundários Processos de fermentação Os processos de condução de fermentação alcoólica utilizados podem ser classificados em: Batelada (ou Descontínuo) Batelada alimentada Contínuo Segundo Venturini Filho e Mendes (2003), em casos particulares como da produção industrial de álcool de mandioca, processos descontínuos e contínuos com recirculação de células devem ser utilizados, pois a reciclagem do fermento aumenta a concentração de levedura no mosto em fermentação, aumentando a produtividade do processo. O processo descontínuo com reaproveitamento de células é conhecido no meio sucroalcooleiro com a denominação de descontínuo alimentado, batelada alimentada ou Melle-Boinot como mostra a Figura 9. Nesse processo, o inoculo já preparado no fundo do fermentador recebe o mosto em filete contínuo até o enchimento da dorna. A fermentação é monitorada pelo controle de sua temperatura e pelo acompanhamento da atenuação do ºBrix do mosto. Quando a atenuação limite (ºBrix constante) é atingida, a fermentação é considerada encerrada e o vinho (mosto fermentado), juntamente com o fermento em suspensão, é enviado a centrifuga. Esse equipamento separa as células de levedura do vinho. O vinho praticamente isento de células segue para a destilaria, visando a recuperação do álcool etílico, enquanto que o fermento passa por tratamento químico. As leveduras são enviadas para uma cuba de tratamento na qual recebem água e ácido sulfúrico na proporção de 1 : 1 o até que o ph do

50 33 meio caia para 2,5-3,0. As células permanecem nesse ph por duas horas, sob agitação realizada por um agitador mecânico ou por injeção de ar. Esse tratamento é realizado visando destruir a maior parte dos microrganismos contaminantes, bem como as leveduras alcoólicas debilitadas. Após o tratamento químico, o fermento é enviado novamente ao fermentador, reiniciando o processo (VENTURINI FILHO e MENDES, 2003). De acordo com a publicação feita pelo Jornal Cana, 2008 o professor Jorge Horii, da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da Universidade de São Paulo (Esalq/USP), de Piracicaba, SP diz que: A fermentação contínua depende, como um decantador, de uma vazão específica de alimentação que mantenha um regime estacionário dos parâmetros da fermentação, ou seja, todos os parâmetros devem permanecer estáveis ao longo do processo, enfatiza. Diz ainda que a fermentação em batelada alimentada se encaixa muito bem nas usinas e destilarias, que não apresentam planejamento adequado e que operam com muitas variações em todos os setores. Dessa forma, acabam resolvendo problemas de fermentação com o aumento do volume de suas dornas para que comportem todas essas variações, revela. Ele afirma que essa situação proporciona, freqüentemente, aumento no gasto de insumos, mão-de-obra, manutenção, equipamentos e análises laboratoriais (JORNAL CANA, 2008). Figura 9- Processo descontínuo de fermentação alcoólica com recirculação de levedura. Fonte: VENTURINI FILHO e MENDES, (2003).

51 34 O processo contínuo de fermentação alcoólica pode ser conduzido com uma ou mais dornas ligadas em série. O sistema com dornas ligadas em série deve ser preferido, por apresentar maior produtividade. Nesse processo, representado de Figura 10, o primeiro fermentador recebe continuamente mosto e ar, os quais fornecem as leveduras alcoólicas, nutrientes e oxigênio para a multiplicação e produção de etanol. O mosto parcialmente fermentado do primeiro fermentador é enviado em fluxo contínuo para os demais fermentadores, os quais apresentam tempo de residência que varia em função do volume e fluxo de mosto. A fermentação deve terminar na última dorna. O vinho, contendo o fermento em suspensão, que sai continuamente da última dorna, é enviado para centrifugação. Após essa operação, o vinho delevurado segue para a destilaria para recuperação do etanol, enquanto o fermento passa por tratamento ácido, retornando posteriormente ao processo (VENTURINI FILHO e MENDES, 2003). Figura 10- Processo contínuo de fermentação alcoólica com recirculação de levedura. Fonte: VENTURINI FILHO e MENDES, (2003). Aparentemente é muito mais fácil fermentar no processo contínuo do que no sistema em batelada. Mas, acontece que na contínua não ocorre à lavagem das dornas e isto acaba ocasionando um problema de contaminação muito alta. E a contaminação é uma coisa séria,

52 35 pois diminui o rendimento, explica Henrique Amorim, presidente da Fermentec. Ele ressalta que no sistema em batelada, ocorre a lavagem do tanque após o término da fermentação. Na contínua, isto só ocorre quando há a interrupção do processo (JORNAL CANA, 2008) Fatores que afetam a fermentação alcoólica Na fermentação pode ocorrer diminuição em seu rendimento, ou seja, diminuição na eficiência de conversão de açúcar em etanol. Geralmente as quedas na eficiência fermentativa decorrente de alterações na estequiometria do processo, levam uma maior formação de produtos secundários e biomassa, em especial glicerol e ácidos orgânicos, levadas por fatores químicos, físicos e microbiológicos Fatores Químicos Nutrição mineral e orgânica Entre as necessidades nutricionais das leveduras, assim como a outras formas de vida, estão os elementos químicos; carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, fósforo, potássio, enxofre, magnésio, ferro, zinco, etc., além de co-fatores para o crescimento como as vitaminas. Especificamente a Saccharomyces cerevisiae cresce melhor em meios ácidos (ph 4,5-5,0) e numa faixa de temperatura (30 a 34ºC) (LIMA et al, 2001). A Tabela 4 apresenta as concentrações dos principais minerais para uma boa fermentação alcoólica. Tais nutrientes podem já estar presentes no mosto, sendo desnecessárias adições. Entretanto, podem ocorrer teores inadequados e deficiência de alguns e concentrações excessivas de outros.

53 36 Tabela 4 Concentração de nutrientes minerais no mosto para se obter uma fermentação alcoólica adequada. Nutrição mineral Concentração em mg/l Nutriente mineral Concentração em mg/l NH Co ++ 3,5 P Zn ++ 0,5-10 K Cu ++ 7 Ca Mn Mg Fe ++ 0,2 SO Na Fonte: (Lima et al, 2001) ph As fermentações se desenvolvem numa ampla faixa de valores de ph, sendo adequada entre 4 e 5. Os valores de ph dos mostos industriais geralmente se encontram na faixa de 4,5 a 5,5, com boa capacidade tamponante, especialmente os preparados com melaço. No processo de fermentação com reutilização da levedura, faz-se seu tratamento com ácido sulfúrico em ph de 2,0 a 3,2, durante aproximadamente uma hora, visando a redução da carga microbiana. A fermentação alcoólica inicia com valores de ph baixos, finalizando com valores de 3,5 a 4,0. Fermentações conduzidas em meios mais ácidos resultam em maiores rendimentos de etanol, pelo fato de restringir o crescimento do fermento, com a conseqüente redução da produção de glicerol, ao mesmo tempo em que reduz a contaminação bacteriana. Entretanto, fermentações alcoólicas desenvolvem-se bem em níveis mais elevados, em substratos de alto poder tampão, como os melaços, em ph 5,8/5,9. Os caldos de cana fermentam sem correção de acidez, em ph natural que varia de 5,2 a 6,8 (LIMA,2001) Inibidores da fermentação O processo fermentativo pode ser inibido não só pelos seus próprios produtos, como o etanol, como por diferentes substâncias que podem deliberadamente estar presentes nos

54 37 mostos. Assim, alguns minerais como potássio e cálcio podem se apresentar em quantidades excessivas, que acarretam efeitos negativos à fermentação, quando se emprega elevada proporção de melaço. Recentemente, o alumínio foi identificado como elemento estressante da levedura, em condições de fermentação industrial, acarretando queda simultânea da viabilidade e dos teores de trealose da levedura. A sulfitação do caldo de cana para sua clarificação pode resultar em melaços com elevados teores de sulfito, que pode acarretar efeitos tóxicos à levedura, comprometendo a fermentação, bem como aumentar a acidez do álcool obtido (LIMA, 2001) Concentração de açúcares A concentração de açúcares pode afetar tanto a produção de levedura como também o próprio processo da fermentação. Durante a fase de multiplicação da levedura é importante que a alimentação da dorna de açúcar seja mantida extremamente baixa para evitar a fermentação. Contudo, quando a massa de células atinge nível considerado adequado ao processo, aumenta-se gradativamente a concentração de açúcar para, através do efeito Crabtree (repressão da respiração pela concentração de açúcares), inverter o metabolismo para a etapa fermentativa. Contudo, para a fermentação alcoólica, o efeito depressivo da glicose e frutose na cadeia respiratória pode ser até benéfico, pois, na fermentação não se visa a multiplicação do levedo, mas sim a produção de etanol (ANGELIS, 1992). Sabe-se que limites razoáveis de concentração de açúcares fermentescíveis são necessários para que ocorram boas fermentações, havendo necessidade de adaptação do organismo agente de fermentação, após a qual obtem-se capacidade de fermentar mostos com 18 a 22% de açúcares (ANGELIS, 1992). Altas concentrações de açúcares podem ocasionar altos teores alcoólicos, podendo comprometer a viabilidade das células ou ainda ocorrer fermentações leves e incompletas, com formação de subprodutos, fatos estes que podem baixar consideravelmente o rendimento alcoólico e a viabilidade celular da levedura. Além disso, pode ocorrer o desenvolvimento dos contaminantes (ANGELIS, 1992) Antissépticos

55 38 No Brasil não é usual esterilizarem-se os mostos nas destilarias de álcool e de aguardente. Quando se faz a clarificação do caldo por aquecimento, há uma redução dos microrganismos, mas não é uma esterilização, pois após a clarificação, o meio é resfriado e colocado em dornas sem os cuidados necessários para manter um ambiente livre de microrganismos. As contaminações encontram um caminho aberto. Para controlar o problema das contaminações, aconselha-se o uso de antissépticos, capazes de criar ambiente favorável ao desenvolvimento das leveduras e desfavorável a outros microrganismos. Cada antisséptico atua de uma forma diferente, agindo sobre um ou mais grupos de microrganismos. Alguns agem favoravelmente às leveduras, ao mesmo tempo inibem bactérias e fungos. Os antissépticos não são largamente usados; há restrições, porque existe possibilidade de deixarem resíduos nos destilados. Pentaclorofenol foi usado durante alguns anos nas proporções de 0,01 a 0,05g por litro de mosto, com bons resultados, porém seu uso é hoje proibido. O hexaclorofeno em dose de 4mg por litro de mosto contribui para boas fermentações. O ácido sulfúrico que se adiciona nos mostos em fermentação, é um antisséptico (LIMA, et al, 2001) Antibióticos Pela mesma razão por que se empregam os antissépticos, usam-se antibióticos nas fermentações industriais para produção de etanol. Sua ação esterilizante decorre de suas propriedades bacteriostáticas. A penicilina é um bom inibidor de contaminações, com o emprego de 500 a U.I. por litro de mosto, observando-se apreciável aumento do rendimento em álcool nos mostos tratados. A aplicação é econômica, não exigindo modificações nas técnicas e nos aparelhamentos usados; as fermentações são mais puras e regulares. Pode-se usar também cloranfenicol, tetraciclina e clorotetraciclina. A escolha do antibiótico depende de seu custo no tratamento (LIMA, et al, 2001) Teor alcoólico do produto O aumento do teor alcoólico do mosto em fermentação inibe o desenvolvimento da própria levedura: no geral este cessa em concentrações de 11-12% do álcool. Deve-se ter em conta que o teor alcoólico depende do teor inicial em açúcares, o qual, por sua vez, é variável

56 39 com o fim que se tem. Entretanto, o etanol parece não ter um efeito único, provocando modificações nas propriedades na membrana lipídica e nos sistemas de transporte de soluto e agindo sobre algumas enzimas (STECKELBERG, 2001) Pressão osmótica Pressão osmótica é a força com a qual um solvente se movimenta de uma solução menos concentrada para uma solução mais concentrada, através de uma membrana semipermeável. Os microorganismos são muitas vezes capazes de viver em meios hipotónicos, ou seja, meios em que a concentração de solutos é menor que a sua própria concentração de solutos. Quando são transferidos para meios de concentração de soluto mais elevada que a do seu soluto interno, eles sofrem o fenômeno de plasmólise (perda de água) Fatores Físicos Temperatura As leveduras são mesófilas. As temperaturas ótimas para a produção industrial de etanol situam-se na faixa de 26 a 35 C, mas, não raramente, a temperatura nas destilarias alcança 38 C. À medida que a temperatura aumenta, aumenta a velocidade de fermentação, mas favorece a contaminação bacteriana, ao mesmo tempo em que a levedura fica mais sensível à toxidez do etanol. Por outro lado, temperaturas elevadas permitem maior perda de etanol por evaporação em dornas abertas. Tais aspectos justificam o controle da temperatura no processo industrial (LIMA, et al, 2001) Agitação A agitação é um fator que compensa ou diminui a sedimentação das células, mantendo-as em suspensão homogênea, para propiciar um contato eficiente com o substrato. A turbulência do mosto em fermentação pode auxiliar na manutenção das células em suspensão (ANGELIS, 1992) Fatores Microbiológicos

57 Agente de fermentação As leveduras são os microorganismos mais importantes na obtenção do álcool por via fermentativa. Bactérias, entre as quais a Zymomonas mobilis, são tidas como capazes de produzir etanol, mas, economicamente, as leveduras ainda são os agentes largamente usados. A levedura da fermentação alcoólica é principalmente da espécie Saccharomyces cerevisiae, da qual foram selecionadas várias linhagens, tidas por muito tempo como espécies: Saccharomyces ellipsoideus, S. carlsbergensis e S. uvarum. Cada linhagem (isolada de meios diferentes) de vinho, de cerveja ou de mostos de destilarias tem suas características próprias, afetadas pelas condições em que o processo fermentativo se desenvolve. O desempenho do processo fermentativo é enormemente afetado pelo tipo de levedura que o executa (LIMA et al. 2001) Concentração do inóculo Maiores concentrações de levedura na dorna permitem fermentações mais rápidas, com maior produtividade e com maior controle sobre as bactérias contaminantes, além de restringir o crescimento da própria levedura. Por outro lado, elevado teor de levedura exige energia de manutenção maior, isto é, maior consumo de açúcar para manter as células vivas. Como conseqüência, resulta em maior competição pelos nutrientes do meio, minerais e vitaminas, diminuindo a viabilidade do fermento. Daí, existir um teor ótimo de levedura na dorna, dependendo das condições do processo industrial. Dependendo das condições do processo, da concentração de nitrogênio amoniacal no mosto e da taxa de recirculação do fermento, são atingidas concentrações excessivas de levedura. A utilização de ácido benzóico mostra-se capaz de reduzir o crescimento excessivo da levedura, ao mesmo tempo em que diminui a formação de glicerol e aumenta o rendimento da fermentação. Entretanto, devido à redução da formação do ácido succínico pela levedura, esta não exerce ação antagônica às bactérias e, no transcorrer dos reciclos fermentativos, inviabiliza a utilização prática do ácido benzóico nas fermentações correntes, devido à contaminação bacteriana (LIMA, et al, 2001) Contaminação bacteriana

58 41 Desde que a fermentação industrial, pela dimensão do processo não é conduzida em condições de assepsia, a contaminação bacteriana, principalmente de Lactobacillus e Bacillus, está sempre presente e, dependendo de sua intensidade, compromete o rendimento do processo fermentativo. As altas temperaturas e o aumento do tempo de fermentação favorecem a contaminação bacteriana, causando o estresse da levedura. A contaminação bacteriana associase ao aumento da formação de ácido láctico e, embora não haja uma confirmação definitiva sobre as causas da floculação da levedura, considera-se, na indústria, que essa contaminação é o principal responsável pelo acidente da fermentação alcoólica (LIMA, et al, 2001). Entre os contaminantes que mais aparecem nos processos fermentativos, ocorrendo inclusive na etapa da fermentação alcoólica, predominam as bactérias gram-positivas dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc. A sacarose consumida por esses microrganismos deixará de ser transformada em álcool, provocando assim perdas do açúcar, o qual será transformado em ácidos orgânicos, por exemplo. A determinação do número e tipos de bactérias presentes no processo são parâmetros importantes para o controle da infecção. Técnicas têm sido propostas para estimar a população bacteriana de amostras coletadas nas diferentes fases do processo: contagem direta ao microscópio e semeadura em placas (plaqueamento). O emprego de um ou outro método vai depender das condições e instalações do laboratório da indústria, além de um treinamento específico aos laboratoristas. Estudos já realizados revelaram que uma concentração bacteriana da ordem de 10 9 UFC.mL -1 leva a uma queda no rendimento alcoólico. Existem também bactérias que induzem a floculação de Saccharomyces cerevisiae, tendo sido observados aumento no tempo de fermentação e redução de aproximadamente 15% no rendimento fermentativo como conseqüência desta floculação. Essa acontece provavelmente devido à presença de uma capa protéica de natureza gelatinosa sobre as bactérias, acarretando assim a fixação mecânica nas células de leveduras ou através de uma ponte entre íons de cálcio e polímeros aniônicos da superfície da levedura. Essas bactérias indutoras de floculação do fermento estão restritas a linhagens de Lactobacillus, mais particularmente L. fermentum. A utilização de agentes antimicrobianos reduz os danos causados pelos contaminantes, além de medidas como limpeza das moendas, tubulações, instalações da fermentação e vários outros procedimentos, tais como descarte de fundo de dorna, returbinação do fermento e

59 42 tratamento ácido. Porém, o eficiente controle só é conseguido com o uso de antimicrobianos adequados e na dosagem correta, pois a aplicação racional desses produtos deve visar apenas a população de bactérias e não a de leveduras. O uso contínuo de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de linhagens resistentes, as quais se tornam cada vez menos sensíveis à sua ação, além do alto custo.

60 43 3. MATERIAL E MÉTODOS O presente trabalho foi realizado no CERAT Centro de Raízes e Amidos Tropicais UNESP Campus de Botucatu Matéria-Prima As matérias-primas utilizadas neste trabalho foram raízes de mandioca in natura das variedades Fécula Branca e IAC14, fornecidas pelo CERAT/UNESP, onde foram processadas no mesmo dia da colheita. Ao chegar ao laboratório de processamento de matérias-primas, as raízes de mandioca foram pesadas, submetidas a limpeza, sendo retiradas terra e impurezas aderentes à casca, bem como parte da película da raiz. As raízes foram trituradas com adição de água, de acordo com cada ensaio, com a finalidade de formar uma polpa Caracterização físico-química das raízes de mandioca As raízes de mandioca foram caracterizadas quanto ao teor de umidade, amido, concentração de matéria graxa, proteínas, fibras totais, teor de cinzas, ph e concentração de açúcares solúveis, conforme metodologias descritas a seguir Umidade Procedimento: Secar os cadinhos de porcelana em temperatura de 104ºC durante no mínimo 1 hora, retirar os cadinhos da estufa e deixar em dessecador para esfriar durante no

61 44 mínimo ½ hora, pesar os cadinhos vazios e anotar o peso; em cada cadinho pesar aproximadamente 3g de amostra e anotar o peso exato do conjunto. Levar os cadinhos à estufa a 104ºC durante 8 horas, retirar da estufa e deixar esfriar durante o mínimo ½ hora, pesar e anotar o peso de cada cadinho com amostra seca, retornar os cadinhos à estufa e deixar mais 1 hora, retirar e esfriar em dessecador, pesar novamente, repetir a operação até obter dois pesos constantes.calcular a porcentagem de umidade através das equações 2 e 3. (AOAC, 2007). Cálculo: E.S.T (Extrato Seco Total) E.S.T = Peso cadinho amostra seca Peso cadinho vazio * 100 eq. 2 alíquota % umidade = 100 E.S.T eq Cinzas Procedimento: Calcinar os cadinhos de porcelana limpos e vazios, em mufla sob temperatura de 500ºC durante mínimo uma hora. Baixar a temperatura a 200ºC, retirar os cadinhos da mufla e deixar esfriando em dessecador, pesar e anotar, em cada cadinho pesar 3 g de amostra e anotar o peso exato do conjunto. Levar a mufla a cerca de 100ºC e programar para aquecer de 100 em 100ºC ate atingir 400ºC mantendo a porta semi-aberta para a saída dos gases, fechar a porta e levar a 550ºC, deixar calcinando por 2 horas, desligar a mufla, deixar sua porta entreaberta e aguardar o resfriamento até próximo a 200ºC, retirar os cadinhos da mufla e esfriar em dessecador, pesar e anotar o peso dos cadinhos após a calcinação. Calcular a quantidade de cinzas através da equação (4) a seguir. (AOAC, 2007). % Cinzas = Peso cadinho com cinzas peso cadinho vazio *100 eq. 4 alíquota Proteínas Procedimento: Pesar entre 0,2 e 0,3 g de amostra em balão de Kjeldahl ou tubo digestor de proteínas, anotando a massa exata, adicionar 5g de mistura digestora de proteínas, adicionar 4ml de ácido sulfúrico concentrado, fazer uma prova em branco, usando a mesma quantidade de mistura digestora de proteína e ácido sulfúrico concentrado, exceto a amostra.

62 45 Colocar os tubos nas cavidades do bloco digestor e ligá-lo, ligar a exaustão de gases da capela e aumentar gradativamente a temperatura do bloco digestor, deixar digerir em bloco digestor dentro da capela com o sistema de exaustão ligado até que o liquido esteja límpido (azul claro ou incolor). Desligar o aquecimento do bloco digestor e aguardar até parar o desprendimento de gases, desligar o exaustor de gases. (repetir esta operação), transferir o produto da digestão para o tubo destilador, com auxilio de água destilada (material tem q estar frio), pipetar 10 ml da solução receptora para proteínas e transferir para um erlenmeyer de 125 ml, adaptar o erlenmeyer à saída do condensador da saída do condensador do aparelho de destilação de maneira que sua extremidade fique mergulhada na solução de acido bórico, transferir para o reservatório do aparelho de destilação de micro-kjendhal aproximadamente 30 ml de hidróxido de sódio, ajustar nível de água e destilar 75 ml e titular até a viragem da cor verde para a cor rosa, anotar volumem gasto. Realizar o cálculo de proteína através das equações 5 e 6. (AACC, 2000) % Nitrogênio = (V A) * 0,00014 * 100 eq. 5 P Proteína Bruta = % Nitrogênio * 6,25 eq. 6 onde: A = Volume gasto na titulação da prova em branco V = Volume gasto na titulação da amostra P = Peso inicial da amostra Matéria graxa Procedimento: Secar os balões de fundo chato em temperatura de 104ºC no mínimo por 2 horas, esfriar os balões em dessecador por mínimo ½ hora, pesar e anotar os pesos. Pesar aproximadamente 3 g de amostra (anotando a massa exata) em cartucho feito com papel de filtro comum dobrado (fechar a abertura do cartucho com chumaço de algodão), colocar o cartucho dentro de um conjunto extrator de Soxhlet e acoplar os balões de tara conhecida, adicionar sobre os cartuchos cerca de 200 ml de éter de petróleo ou o suficiente para preencher toda a parte superior do sifão e escorrer para o balão, ligar o aquecedor do extrator e deixar em refluxo durante 6 a 8 horas. Retirar os balões do extrator e levar à estufa de secagem com

63 46 circulação de ar a 10ºC por 2 horas, para evaporar todo o éter, retirar e esfriar em dessecador por no mínimo ½ hora pesar e anotar os pesos. A quantidade de matéria graxa é calculada de acordo com a equação (7) abaixo. (AOAC, 2007). % Matéria Graxa = (peso balão com resíduo peso balão)*100 eq. 7 peso amostra Fibras Procedimento: Pesar de 2 a 5 g de amostra, anotando massa exata, transferir para o tubo digestor de fibras, acrescentar 200 ml de solução de H 2 SO 4 a 1,25% medidos em proveta de 250 ml. Levar a ebulição branda por 30 minutos, retirar do bloco de aquecimento e filtrar em papel filtro qualitativo simples, lavar o material que ficou retido no papel com cerca de 500 ml de água destilada quente, transferir o material retido e lavado para o mesmo tubo de digestão usado anteriormente, com ajuda de 200 ml de solução de NaOH 1,25%, medidos em uma proveta de 250ml, levar a ebulição branda por 30 minutos, retirar do bloco de aquecimento e filtrar em papel filtro qualitativo simples previamente seco em estufa a 105ºC por pelo menos uma hora, retirado em dessecador pelo menos por 2 horas para esfriar e tarado, lavar o material que ficou retido no papel com cerca de 500 ml de água destilada quente. Dobrar o papel mais os resíduos da amostra cuidadosamente, colocar dentro de uma placa de petri ou vidro relógio e levar a estufa a 105ºC até secagem completa (mínimo 8 horas), retirar da estufa, colocar em dessecador por mínio ½ hora, pesar o papel com o resíduo seco e anotar o peso, para posterior cálculo (eq. 8). (AOAC, 2007). % Fibra Bruta = papel com resíduo seco (g) peso do papel * 100 eq. 8 massa amostra ph Procedimento: Pesar 2,5 gramas de amostra em um Becker de 250 ml, adicionar 100 ml de água destilada, agitar em agitador magnético durante 30 minutos, deixar em repouso por 10 minutos, decantar o líquido sobrenadante para um frasco seco e imediatamente

64 47 determinar o ph inserindo o eletrodo do ph-metro na amostra e girando o botão SBT na posição ph e esperando estabilizar o display. (AOAC, 2007) Açúcares totais Procedimento: Pesar próximo de 1g de amostra em um erlenmeyer anotando sua massa exata, preparar uma prova em branco em outro erlenmeyer com todos os reagentes exceto a amostra, adicionar 50 ml de água destilada, levar a banho de aquecimento a 65ºC durante 30 minutos com agitação constante; retirar do banho e resfriar até temperatura ambiente, transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 ml, completar o volume com água destilada e homogeneizar. Filtrar em papel de filtro simples, recebendo o filtrado em Becker, determinar o teor de açucares redutores expressos como % de glicose, segundo o método de Somogy e Nelson da seguinte maneira: Pipetar 1 ml da solução da amostra diluída e transferir para um tubo de ensaio, acrescentar 1ml do reativo de Somogy, tampar com bolinhas de vidro, levar no banho Maria com água em ebulição por 10 minutos, retirar do banho e esfriar ate temperatura ambiente, acrescentar 1 ml do reativo de Nelson e 7 ml de água destilada; homogeneizar em agitador de tubos Vortex, fazer a leitura da absorbância no espectrofotômetro a 535 nm, zerando com 1ml de água destilada. O teor de açúcares totais foi determinado (eq. 9) pelo método de Somogy, adaptado por Nelson (1944). % Açúcares Totais = A*K*100 eq. 9 µg onde: A = absorbância da amostra a 535 nm.; K = Constante curva padrão de glicose µg = massa da amostra, em microgramas presente na alíquota da reação Amido - Método enzimático Procedimento: Pesar 200 mg de amostra peneirada em um erlenmeyer anotando sua massa exata, preparar uma prova em branco em outro erlenmeyer com todos os reagentes exceto a amostra, acrescentar 42 ml de água destilada e 1 ml de solução comercial de alfaamilase (Termamyl 120L) a 50% (v/v). Após estes procedimentos levar os erlenmeyers a

65 48 banho-maria, com agitação suave a 90 C, durante 15 a 20 minutos. Nas amostras dextrinizadas, acrescentar 2,5 ml de solução tampão acetato 4M, de ph 4,8 e 5 ml de solução recém preparada e filtrada de Amiloglucosidase. Levar os erlenmeyers com as amostras mais a prova em branco ao banho-maria com agitação contínua a 55 C por 120 minutos. Retirar a amostra hidrolisada e resfriar até a temperatura ambiente transferindo-a para um balão volumétrico de 250 ml, neutralizar com solução de NaOH a 2N, até ph entre 7 e 9 e completar o volume com água destilada. Transferir 5 ml desta diluição para um balão volumétrico de 100 ml, completar o volume com água destilada, filtrar a solução em papel simples e dosar no material filtrado o teor de açúcares redutores pelo método de Somogy, adaptado por Nelson (1944), sendo feita a conversão para amido pela multiplicação da porcentagem de açúcar obtida pelo fator 0,9. %amido= (% A.R.T.) * 0,9 eq Enzimas amilolíticas As enzimas utilizadas são produzidas, purificadas e padronizadas pelo fabricante, para aplicação industrial de grau alimentício. As enzimas utilizadas foram provenientes da Novo Nordisk Bioindustrial do Brasil Ltda Araucária-PR. As enzimas utilizadas foram: Hidrolítica TERMAMYL 120 L alfa amilase líquida, com densidade de 1,2g. ml -1 e atividade padronizada de 120 KNU.g -1 de enzima. Apresenta maior termo-estabilidade em relação a outras alfa-amilases, onde KNU Unidade Kilo Novo de alfa-amilase é a quantidade de enzima que decompõe 5,26g de amido por hora, pelo método padrão da Novo Nordisk, para determinação de alfa-amilase, tomando como base as seguintes condições: (NOVO, 1995) Substrato...Amido Solúvel Conteúdo de cálcio no solvente...0,0043m Tempo de reação min Temperatura...37ºC ph...5,6

66 49 Sacarificante AMG 400L exoglucosidase líquida, com densidade de 1,2 g.ml -1 e atividade padronizada em 400AGU.mL -1, onde AGU Unidade de Amiloglucosidase Novo Nordisk é a quantidade de enzima que hidrolisa um micromol de maltose por minuto, sob as seguintes condições padrão: (NOVO, 1995) Substrato...maltose Tempo de reação...30min Temperatura...25ºC ph Levedura A cepa utilizada foi a Saccharomyces cerevisiae LNF CAT-1, importada pela Latino Americana, localizada em Bento Gonçalves, RS. A LNF CAT-1 é uma cepa de levedura que foi selecionada de um processo contínuo para fabricação de etanol com reciclo total de células. Ela contém a cepa Saccharomyces cerevisiae CAT-1 sob a forma seca, estável e altamente concentrada. A LNF CAT-1 foi selecionada para o uso na fermentação do mosto de cana e melaço em processos com reciclo total de células e teores alcoólicos de até 15% (v/v). Suas principais características são a alta resistência aos choques de ph, a longas paradas na fermentação e ao processo de reciclo. Também apresenta baixa formação de espuma, alta capacidade de implantação e predominância e elevado rendimento fermentativo (LNF, 2009). Características do Produto Descrição: Levedura selecionada ativa desidratada Cepa: Saccharomyces cerevisiae CAT-1 Aparência: Granular Cor: Bege claro Odor: Tostado Solubilidade em água: Parcial 3.5 Teor de Glicose (GOD)

67 50 A concentração de glicose foi determinada pelo método glicose oxidase. As amostras foram diluídas a concentração de 10%. Sendo adicionados 20 µl da amostra em tubo de ensaio, 20 µl do reativo de trabalho e 2 ml de água destilada. Os tubos de ensaio foram colocados em banho à 37ºC por 10 minutos. Em seguida, foram feitas leituras em espectrofotômetro a 505 nm e o teor de glicose foi determinado pela equação 11. Glicose = abs*f*diluição eq. (11) onde: abs - absorbância em 505nm; F- fator de correção, expresso pela equação (12) Diluição - g.l -1 F = 100 eq. (12) padrão onde: Padrão -g.l Primeiro ensaio - Determinação do parâmetro tempo para a etapa de sacarificação Este ensaio teve como objetivo determinar o tempo de ação da enzima amiloglucosidase, para a sacarificação do amido em glicose Processo de hidrólise-sacarificação Após a caracterização das raízes de mandioca realizou-se o primeiro ensaio de hidrólise, o qual teve por objetivo avaliar o tempo adequado de sacarificação durante o processo de hidrólise. a) temperatura de dextrinização - 90ºC, tempo de dextrinização 2 h, concentração de Termamyl 2 KNU.4g -1 amido b) temperatura de sacarificação - 60ºC, concentração de Amiloglucosidase 2 AGU.4g -1 amido Para a realização deste ensaio foi preparada uma suspensão de 18 Kg contendo mandioca fresca e água de forma que a suspensão ficasse com 20% de amido.

68 51 Na etapa de liquefação foram utilizados como parâmetros fixos a concentração das α-amilases (1,2 Kg.t -1 de amido) e o tempo de reação (2 h), sendo o reator mantido a 90ºC com a adição de enzima. Nesta etapa foi utilizada α-amilase Termamyl 120. Na sacarificação foi utilizada a enzima amiloglucosidase (AMG 400L) na concentração de 2,25 L.t -1 de amido, e temperatura de reação de 60ºC. Após a adição da amiloglucosidase foram retiradas amostras nos tempos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 horas para posteriores análises de rendimento do processo e perfil dos açúcares extraídos. Os ensaios foram realizados em duplicata. Os hidrolisados obtidos foram caracterizados quanto ao teor de glicose, determinado conforme método de Glicoseoxidase (GOD). 3.7 Segundo ensaio - Avaliação do processo de hidrólise A partir do resultado obtido no primeiro ensaio, foi realizado o segundo ensaio que teve por objetivo avaliar o efeito das concentrações de matéria seca e das concentrações das enzimas Termamyl e AMG 400L, sobre o teor de glicose Delineamento experimental A determinação dos parâmetros operacionais para obtenção de glicose foi definida mediante modelo estatístico, que simulou o processo em planta piloto, utilizando um delineamento central composto rotacional (DCCR) 2 3, mais 6 ensaios axiais e 7 repetições no ponto central, totalizando 23 ensaios. Os valores utilizados nos ensaios do planejamento estão apresentados na Tabela 5. Os pontos centrais (0) servem para estimar o erro experimental e determinar a precisão da equação polinomial. Os pontos axiais (±α) são utilizados para a ampliação do modelo linear, tornando-o um modelo quadrático. O valor de α é função do número de variáveis independentes (k), sendo definido pela equação 13 (BARROS NETO; SCARMÍNIO; BRUNS, 2003). α = (2 k ) ¼ eq. (13) Sendo k = 3, tem-se que: α = (2 3 ) ¼ = 1,68.

69 52 Tabela 5- Níveis das variáveis no planejamento experimental para determinação dos parâmetros operacionais para produção de álcool de mandioca Variáveis -α(-1,68) α(+1,68) Conc.matéria seca % p/p m.s 26, ,5 Conc. enzima dextrinização Conc enzima sacarificação KNU.4g -1 KNU 1, ,7 AGU.4g -1 AGU 1, ,7 Através do presente estudo foi possível obter modelos estatísticos capazes de predizer o comportamento das variáveis dependentes (respostas) em função das variáveis independentes. A análise de regressão obtida pode ser ajustada para cada resposta (φ) através de um polinômio de segunda ordem com as variáveis explicativas (Xk). A expressão geral utilizada para predizer o comportamento de cada resposta avaliada pode ser escrita da seguinte forma: φ = β0 + β1x1 + β2x2 + β3x3 + β11x1 2 + β22x2 2 + β33x3 2 + β12x1x2 + β13x1x3+ β22x2x3 + ε eq. ( 14) onde, φ = função resposta; X1, X2, X3 = valores das variáveis independentes; β0 = coeficiente relativo à intercepção do plano com o eixo de resposta; β1, β2, β3 = coeficientes lineares estimados pelo método dos mínimos quadrados; β11, β22, β33 = coeficiente das variáveis quadráticas; β12, β13, β23 = coeficientes de interação entre as variáveis independentes; ε = erro experimental. O processamento dos dados e a análise estatística foram realizados com o auxílio do RSREG e do STEP-WISE do sistema SAS versão 8.2. A significância do modelo foi testada pela análise de variância (ANOVA). Foi adotado o nível de significância de 5% (α = 0,05) Materiais para os ensaios Preparo das suspensões de mandioca

70 53 Os experimentos foram realizados com suspensão de mandioca in natura de acordo com o planejamento experimental descrito na Tabela 5. A mandioca utilizada apresentava um teor de umidade de 63,6%. Abaixo a equação (15) utilizada para determinação da quantidade de água necessária para cada suspensão. M1.x1 + M2.x2 = M3.x3 eq. 15 Onde: M1 = raiz de mandioca M2 = água M3 = polpa de mandioca x1, x2, x3 = concentração de matéria seca Cada suspensão foi preparada na quantidade necessária para um ensaio, misturando a massa de mandioca com a água na operação de triturar a mandioca, para formar a polpa. A suspensão era preparada minutos antes de cada ensaio Preparo das soluções de enzimas Nos ensaios realizados utilizou-se como enzima hidrolítica na primeira etapa de gelatinização a TERMAMYL 120-L, preparada nas concentrações 1,3 KNU.4g -1 de amido; 2 KNU.4g -1 de amido, 3 KNU.4g -1 de amido, 4 KNU.4g -1 de amido, 4,7 KNU.4g -1 de amido. Os ensaios foram realizados nas concentrações de 26,5, 28, 30, 32, 33,5% de matéria seca, os cálculos para determinação das quantidades de enzima foram de acordo com o planejamento experimental para 5 Kg de massa de mandioca. A enzima utilizada no processo de sacarificação foi AMG 400L, preparada nas concentrações 1,3 AGU.4g -1 de amido, 2 AGU.4g -1 de amido, 3 AGU.4g -1 de amido, 4 AGU.4g -1 de amido, 4,7 AGU.4g -1 de amido, para 5 Kg de massa de mandioca Produção dos hidrolisados Levando-se em consideração que o presente trabalho teve como enfoque a elaboração de um quadro comparativo entre escala laboratorial e escala industrial, os ensaios de hidrólise foram realizados de forma que simulassem um processo industrial.

71 54 No primeiro ensaio utilizou mandioca in natura, a fim de possibilitar o estudo pretendido confrontando, por idêntico processo, a influência dos respectivos parâmetros, da concentração de matéria seca, da concentração de enzima dextrinizante, da concentração de enzima sacarificante. Os ensaios foram realizados em um reator de aço inoxidável fabricado pela R.A.B Ranazzi e Cia Ltda/Bauru-SP como mostra a Figura 11, com volume útil de 6,9 litros, 260 mm de altura e 175 mm de diâmetro. O equipamento possui trocador de calor na parede externa que é isolado com lã de vidro, o aquecimento é produzido por resistências elétricas fixadas externamente ao casco do reator encapsulado por uma segunda cobertura de isolante térmico para minimizar perdas de calor. Internamente possui acabamento do tipo espelhado com fundo semi-esférico com válvula esférica para escoamento central, e o sistema de agitação possui um impelidor tipo âncora com diâmetro interno das pás de 170 mm e altura de 230 mm. (a) (b) Figura 11- (a)vista do reator no suporte; (b) Reator aberto com agitador tipo âncora. Para a produção dos hidrolisados foi realizada a lavagem e o descascamento da mandioca para retirada da terra e da película marrom. Posteriormente, foi realizada a desintegração da mandioca para aumentar a superfície especifica e facilitar a penetração do calor, a gelificação e o ataque das enzimas amilolíticas, durante a sacarificação do amido. A desintegração da mandioca foi realizada adicionando água na quantidade pré-determinada

72 55 conforme cada tratamento, sendo adicionado ao reator e aquecidos à 90ºC. Adicionou-se a massa de mandioca uma suspensão de enzima α-amilase de acordo com o especificado para cada ensaio e 100 ppm de CaCl 2. O volume total utilizado no reator foi de 5 litros. O ph da solução foi ajustado para 6,0 com hidróxido de sódio a 0,5 M. A hidrólise foi realizada a 90-95ºC sob agitação mecânica por tempo pré-determinado de 2 horas. Após a dextrinização, o ph da dispersão foi ajustado para 4,0±0,5 com ácido clorídrico 3 M e resfriada a 60ºC. Após a temperatura atingir 60 ºC foi adicionada uma suspensão de enzima amiloglucosidase e sob agitação mecânica por tempo pré-determinado de 16 horas. Os hidrolisados foram filtrados a vácuo para a remoção de impurezas (fibras). Cada ensaio foi realizado em seqüência, sendo que os hidrolisados foram congelados para posteriormente serem fermentados. A Figura 12 mostra o fluxograma da produção de hidrolisado de mandioca usando-se um reator. α - amilase MASSA RALADA ph 6,0 100 ppm CaCl 2 DEXTRINIZAÇÃO 90-95ºC 2 h SACARIFICAÇÃO amiloglucosidase ph 4,5-60ºC - 16 h HIDROLISADO Figura 12 Fluxograma do processo de hidrólise Análise dos ensaios de hidrólise Após cada ensaio de hidrólise foram retiradas amostras para posterior análise quanto ao teor de açúcares formado, ph, brix e rendimento Determinações físico-químicas nos produtos hidrolisados

73 Determinação de açúcares As concentrações dos açúcares presentes nos hidrolisados obtidos após cada ensaio no reator foram determinadas em Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (HP série 1100), empregando-se as seguintes condições: guarda coluna cromatográfica BIO RAD n ; coluna BIO RAD AMINEX HPX-87P (300 x 7,8 mm); temperatura da coluna 80 C; detector de índice de refração (IR); eluente água destilada ionizada em coluna de troca iônica, filtrada em filtro de polietileno 0,45µm de poro e em seguida desgaseificada em banho de ultra-som; fluxo do eluente de 0,6mL.min -1 ; volume da amostra injetada 20µL. As amostras foram filtradas em filtro de membrana (DURAPORE) em PVDF, 0,22µm de poro. A determinação das concentrações dos açúcares foi calculada em relação às análises de soluções padrões destes açúcares previamente realizados (SAITO, 2005) Determinação do ph O ph das amostras foi determinado em ph-metro Chemcadet modelo , a temperatura de 20ºC, que também executa leituras de temperatura através de uma sonda apropriada Determinação dos sólidos solúveis (BRIX) As concentrações de sólidos solúveis nas amostras de hidrolisados foram determinadas em refratômetro de bancada da marca Biobrix Rendimento do processo de hidrólise O rendimento do processo de hidrólise foi definido como a porcentagem de amido que foi removido da mandioca e transformado em glicose. Considerando a utilização de um fator de conversão de 100%, assumir-se-á que 100,0 g de amido produzem 110,0 g de glicose. A equação (16) ficará definida como: Rendimento = concentração de glicose produzida x 100 eq. (16) concentração de glicose teórica

74 Análise do resíduo O resíduo foi caracterizado de acordo com as metodologias da AOAC (2007) e AACC (2000), quanto ao teor de umidade, amido, fibras totais, teor de cinzas, e concentração de açúcares totais (SOMOGY, 1945). 3.8 Terceiro ensaio - Avaliação do processo de fermentação alcoólica A partir do resultado obtido no segundo ensaio, foi realizado o terceiro ensaio que teve por objetivo avaliar o efeito do tempo (h) e das concentrações de levedura desidratada (p/p). Um novo hidrolisado foi produzido de acordo com os resultados obtidos no segundo ensaio, sendo utilizado como substrato no processo de fermentação alcoólica Delineamento experimental O processo de produção de etanol, foi estudado mediante modelo estatístico que simulou o processo em planta piloto utilizando um delineamento central composto rotacional (DCCR) 2 2, mais 4 ensaios axiais e 5 repetições no ponto central, totalizando 13 ensaios. Os valores utilizados nos ensaios do planejamento estão apresentados na Tabela 6. Os pontos centrais (0) serviram para estimar o erro experimental e determinar a precisão da equação polinomial. Os pontos axiais (±α) são utilizados para a ampliação do modelo linear, tornando-o um modelo quadrático. O valor de α é função do número de variáveis independentes (k), sendo definido pela equação 17 (BARROS NETO; SCARMÍNIO; BRUNS, 2003). α = (2 k ) ¼ eq. (17) Sendo K = 2, tem-se que: α = (2 2 ) ¼ = 1,41. Tabela 6- Níveis das variáveis no planejamento experimental para determinação dos parâmetros operacionais para produção de etanol de mandioca Variáveis -α(-1,41) α(+1,41) Conc. Levedura % p/p 3, ,82 Tempo horas 9, ,46

75 58 Através do presente estudo foi possível obter modelos estatísticos capazes de predizer o comportamento das variáveis dependentes (respostas) em função das variáveis independentes. A análise de regressão obtida pode ser ajustada para cada resposta (φ) através de um polinômio de segunda ordem com as variáveis explicativas (Xk). A expressão geral utilizada para predizer o comportamento de cada resposta avaliada pode ser escrita da seguinte forma: φ = β0 + β1x1 + β2x2 + β11x1 2 + β22x2 2 + β12x1x2 + ε eq. (18) onde, φ = função resposta; X1, X2 = valores das variáveis independentes; β0 = coeficiente relativo à intercepção do plano com o eixo de resposta; β1, β2 = coeficientes lineares estimados pelo método dos mínimos quadrados; β11, β22, = coeficiente das variáveis quadráticas; β12 = coeficientes de interação entre as variáveis independentes; ε = erro experimental. O processamento dos dados e a análise estatística também foram realizados com o auxílio do RSREG e do STEP-WISE do sistema SAS versão 8.2. A significância do modelo foi testada pela análise de variância (ANOVA). Foi adotado o nível de significância de 5% (α = 0,05) Preparo do mosto para o processo fermentativo O volume de hidrolisado obtido, foi diluído (18ºBrix) e dividido em 13 porções de 500 ml, em seguida foi adicionado nutriente nas proporções: Cloreto de Magnésio - 20mg, Adubo foliar - 5mg, Uréia- 200mg, Super fosfato - 100mg, sendo definidos como parâmetros fixos do processo: a) concentração de sólidos solúveis (BRIX) - 18, b) temperatura fermentação - 30ºC, c) ph 4,5, d) agitação 100rpm Preparo das suspensões de leveduras

76 59 Nos ensaios realizados, utilizou-se como inóculo levedura Saccharomyces cerevisiae cepa CAT 1, desidratada produzida pela empresa LNF -Latino Americana, nas concentrações (p/p) estabelecidas no delineamento experimental descrito na Tabela Ensaios de fermentação alcoólica Após a diluição do hidrolisado para 18º Brix e a adição de nutrientes, cada erlenmeyer recebeu inicialmente 15% do meio e as concentrações de levedura descritas anteriormente, recebendo o restante do mosto em processo de alimentação de forma contínua até o enchimento do erlenmeyer, num tempo aproximado de 10 minutos completando um volume de 500 ml, simulando um processo industrial. Os erlenmeyers ficaram sob agitação constante de 100 rpm e temperatura de 30 C pelo tempo determinado em cada ensaio. Depois de decorrido o tempo de cada ensaio o vinho (mosto fermentado), juntamente com o fermento em suspensão, foi enviado a centrifuga, separando as células de levedura do vinho. O vinho praticamente isento de células seguiu para análises Análise dos ensaios de fermentação Após cada ensaio de fermentação foram retiradas amostras para posterior análise quanto ao teor de etanol, metanol glicerol, açúcares residuais, eficiência e viabilidade celular Determinação do teor de etanol, metanol e glicerol e açúcares residuais As concentrações de etanol, metanol e glicerol e açúcares residuais foram determinados em cromatógrafo líquido de alta eficiência (HP série 1100), empregando-se as seguintes condições: guarda coluna da BIO RAD n ; coluna BIO RAD AMINEX HPX-87H (300 x 7,8 mm); temperatura da coluna 65 C; detector de índice de refração (IR); solução de ácido sulfúrico à 0,001M, eluente água destilada e filtrada em coluna de troca iônica e filtrada em filtro de polietileno 0,45µm de poro em seguida desgaseificada devidamente em banho de ultra-som; fluxo de 0,8mL.min -1 ; volume da amostra injetada 20µL. As amostras após devidamente filtradas em filtro de membrana (DURAPORE) em PVDF, 0,22µm de poro, 13mm de diâmetro, hidrofílica, branca e lisa (SAITO, 2005) Determinação da eficiência da fermentação alcoólica

77 60 Depois de decorrido o processo de fermentação, o material foi centrifugado e analisado conforme item , sendo a eficiência da fermentação calculada através da equação (19). Eficiência (%) = concentração de etanol produzido x 100 eq. (19) Concentração de etanol teórico Determinação da viabilidade celular A determinação da viabilidade e número de células totais antes e após a fermentação foi feita segundo a metodologia de Lee et al. (1981). Em um tubo de ensaio, foram colocados 0,5 ml da suspensão de levedura (mosto em fermentação) e 9,5 ml de solução corante. O tubo foi fechado e agitado intensamente por 30 segundos e depois deixado no suporte por 1 minuto. A leitura foi feita em microscópio ótico através de contagem em câmara de Neubauer de duas montagens diferentes, sendo contados cinco quadrantes. Foram contadas apenas as células, sendo consideradas as coradas de azul como mortas e as não coradas como vivas. Não foram considerados os brotos, flocos de células e pseudomicélio. Os cálculos para a determinação da viabilidade e número total de células foram: Número total de células / ml = N x 2,5 x 10 5 x D onde, N= número total de células presentes no quadrado médio D= fator de diluição % de células viáveis = número células não coradas x 100 eq. (20) número total de células A solução corante tem a seguinte composição: azul de metileno (0,025 %), NaCl (0,9 %), KCl (0,042 %), CaCl 2. 6 H 2 O (0,048 %), NaHCO 3 (0,02 %),glicose (1,0%). A solução foi mantida em agitação por 6 horas e filtrada em papel de filtro. 3.9 Análise comprobatória dos resultados obtidos (hidrólise e fermentação) Este ensaio teve como objetivo a validação experimental das condições estabelecidas pelas análises estatísticas dos experimentos anteriores Avaliação do processo de hidrólise

78 61 Uma suspensão de 150 kg contendo polpa de raiz de mandioca e água (33,5 % matéria seca) foi adicionada no reator como mostra a Figura 13, e realizou-se o processo de hidrólise utilizando 3 KNU.4g -1 de Termamyl 120L e 3 AGU.4g -1 de AMG 400L seguindo as etapas descritas anteriormente na Figura 12. Figura 13 Reator de hidrólise com capacidade de 150 litros, dotado de sistema de agitação e camisa de aquecimento com vapor. Após o processo de hidrólise a suspensão foi filtrada em filtro a vácuo marca MF DIMAN-ME (Figura 14), onde o líquido foi separado da parte sólida, resíduos lignocelulósicos.

79 62 (a) (b) Figura 14- (a) Filtro a vácuo utilizado; (b) Polpa após processo de hidrólise sendo filtrada Análises dos ensaios comprobatórios de hidrólise Amostras foram retiradas ao final da hidrólise para posteriores análises Determinação de açúcares As concentrações dos açúcares presentes no hidrolisado obtido foram determinadas em cromatógrafo líquido de acordo com a metodologia descrita no item Determinação dos sólidos solúveis (BRIX) As concentrações de sólidos solúveis nas amostras de hidrolisados foram determinadas em refratômetro de bancada da marca Biobrix Análise microbiológica Método Direto Para a avaliação de contaminantes no hidrolisado, foram realizadas análises para determinação da contagem microbiana pelo Método Direto. Em um tubo de ensaio foi adicionado 1,0 ml da amostra e 1,0 ml do corante (solução de Azul de Metileno + Sulfato de Azul de Nilo), e após a homogeneização foi transferido 0,003 ml dessa mistura para uma

80 63 lâmina de vidro 20 x 20 mm e colocada em cima da lâmina uma lamínula, tomando cuidado para não formar bolhas de ar. Foi adicionada uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula, e feito a contagem em microscópio em objetiva de 100 x somente de bastonetes não corados (vivos), contando 50 campos uniformemente distribuídos em toda área da lamínula. Cálculo do número de bactérias (bastonetes) Nº. de Bastonestes.mL -1 = V x M x D eq. (21) onde: V = volume de amostra (0,003 ml) M = média de número de microorganismos por campo (nº Bastonetes encontrados dividido por nº campos contados) D = diluição da amostra Observação: no caso da amostra com baixa população bacteriana deve aumentar o número de campos a serem contados. Quando em 100 campos uniformemente distribuídos, nenhum bastonete for encontrado, deve-se expressar a contagem como sendo menor que 10 4.mL -1 (<10 4.mL -1 ) que é o limite de precisão da metodologia. Soluções utilizadas na contagem de bactérias: Solução de sulfato de Azul de Nilo 2g de sulfato de Nilo em 100mL de água destilada. Solução de azul de metileno 0,2 g de azul de metileno em 100mL de água destilada Método Indireto O sistema Petrifilm TM é um sistema onde se tem uma placa para contagem de bactérias aeróbias totais constituída de um meio de cultura pronto, que contém ágar nutriente padrão, um agente gelificante solúvel em água fria e um indicador de potencial de óxido redução, o cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). Para a semeadura nas placas Petrifilm, de acordo com as instruções do fabricante 3M, suspendeu-se o filme superior do Petrifilm e alíquotas de 1,0ml, das amostras de hidrolisado in natura e do mosto em fermentação diluídas, foram depositadas com lentidão e cuidado, no centro do filme inferior das placas codificadas. O filme superior foi deixado cair sobre a amostra, evitando o aprisionamento de bolhas de ar, e em seguida pressionou-se o difusor de plástico, delicadamente, no centro da placa por cerca

81 64 de 10 segundos. Após a remoção do difusor, as placas Petrifilm foram mantidas em repouso, por pelo menos 1 minuto para a solidificação do gel. Então, as placas foram acondicionadas em câmara bacteriológica úmida, na posição horizontal e formando pilhas de até 20 unidades, foram incubadas à temperatura de 35ºC por 48 horas Coloração de Gram A coloração de Gram é um método muito utilizado na identificação de bactérias. É um método de coloração diferencial que utiliza um corante primário (cristal violeta) e um contracorante (safranina). O procedimento utilizado esta descrito abaixo: 1- Com a alça de platina, retirar assepticamente uma pequena porção da amostra e espalhar suficientemente para obter um esfregaço fino. 2- Secar a preparação ao ar ou na chama do bico de gás. 3- Fixar o esfregaço, passando a lâmina três vezes diretamente na chama. 4- Antes de corar, deixar que a lâmina esfrie completamente. 5- Tratar durante 1 minuto com solução de cristal violeta. 6- Lavar em água corrente (suavemente). 7- Tratar 1 minuto com solução de Lugol. 8- Lavar em água corrente (suavemente). 9- Descorar durante 30 segundos com álcool. 10- Secar. 11- Tratar com solução de Safranina por 10 segundos. 12- Lavar com água corrente, secar e examinar ao microscópio Rendimento do processo de hidrólise O rendimento do processo de hidrólise foi calculado de acordo com o item Análise do resíduo O resíduo foi caracterizado de acordo com a metodologia descrita no item Avaliação do processo fermentativo comprobatório

82 65 Foi utilizado como substrato 100 kg do hidrolisado de mandioca, obtido após filtração da suspensão, conforme item e diluídos a 18ºBrix. Posteriormente o inóculo foi preparado com 4% de levedura seca e 15% de meio sendo adicionado no fundo do fermentador onde recebeu o restante em filete contínuo. Foi realizado o acompanhamento do Brix até o enchimento da dorna, onde a mesma foi mantida em agitação (100rpm) e a 30ºC por 12 h Análise dos ensaios comprobatórios de fermentação Amostras de 10 ml foram retiradas de duas em duas horas e ao final do processo fermentativo para posteriores análises Determinação do teor de etanol, metanol e glicerol e açúcares residuais O vinho foi caracterizado quanto ao teor de etanol, metanol, glicerol e açúcares residuais em cromatográfico líquido, de acordo com a metodologia descrita no item Determinação de ácidos orgânicos As concentrações de ácidos orgânicos foram determinados em cromatógrafo líquido de alta eficiência (HP série 1100), empregando-se as seguintes condições: guarda coluna da BIO RAD n ; coluna BIO RAD AMINEX HPX-87H (300 x 7,8 mm); temperatura da coluna 65 C; detector de índice de refração (IR); solução de ácido sulfúrico à 0,0005M, eluente água destilada e filtrada em coluna de troca iônica e filtrada em filtro de polietileno 0,45µm de poro em seguida desgaseificada devidamente em banho de ultra-som; fluxo de 0,8mL.min -1 ; volume da amostra injetada 20µL. As amostras após devidamente filtradas em filtro de membrana (DURAPORE) em PVDF, 0,22µm de poro, 13mm de diâmetro, hidrofílica, branca e lisa (SAITO, 2005) Avaliação da contaminação microbiológica A avaliação da contaminação microbiológica foi realizada de acordo com os itens , e Determinação da eficiência da fermentação alcoólica

83 66 Depois de decorrido o processo de fermentação, o material foi centrifugado e analisado por cromatografia líquida, sendo a eficiência da fermentação calculada através da equação 9, exposta no item Determinação da viabilidade celular A determinação da viabilidade e número de células totais antes e após a fermentação foi feita segundo a metodologia descrita no item Balanço de massas nos processos de hidrólise enzimática e fermentação alcoólica Realizou-se balanço de massa da produção de hidrolisado de mandioca e do processo fermentativo para avaliar a produtividade e consolidar a metodologia do processo. Foram coletadas raízes frescas da variedade IAC 14 com idade de cultivo de 12 meses. Inicialmente procedeu-se a análise centesimal do substrato úmido, determinando-se a umidade, teor de amido, fibra, matéria graxa, açúcares redutores, cinzas, proteínas, ph, acidez. Para realização da hidrólise utilizaram-se as enzimas α-amilase (TERMAMYL KNU. ml -1 ) e amiloglucosidase (AMG AGU. ml -1 ). A primeira etapa da hidrólise foi realizada durante um período de 2h, em temperatura de 90ºC. Dois procedimentos básicos foram adotados para realização da segunda parte do processo: temperatura do hidrolisado à 60ºC, durante 16 h; ajustes do ph entre 4,5 e 4,8, usando ácido sulfúrico. Após o processo de sacarificação, a suspensão foi filtrada em filtro a vácuo, para remoção do material lignocelulósico. Utilizou-se como inóculo na etapa de fermentação a levedura CAT1, sendo o mosto fermentescível constituído de 18% de açúcares. A determinação da quantidade de água necessária à diluição da massa, originada pela desintegração das raízes de mandioca, foi determinada pelo delineamento experimental descrito anteriormente, de modo a produzir um substrato de diluição mínima que facilitasse a hidrólise completa do amido e máxima que não comprometesse os custos energéticos necessários a sua realização. O experimento fermentativo foi conduzido em planta piloto, que é composta de um reator com capacidade de 150 litros, porém apenas 100 Kg de mosto foram fermentados, dos quais 15% foram mantidos como pé de cuba na parte inferior e o restante foi adicionado em

84 67 filete. O reator é dotado de um sistema de aquecimento do tipo encamisado, com agitação, sendo alimentado por um conjunto de condutores (mangueiras).

85 68 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Caracterização físico-química da matéria-prima A variedade de mandioca denominada Fécula Branca é intensamente cultivada nas regiões sudeste do Brasil e apresenta características desejáveis cujas análises físico-químicas estão apresentadas na Tabela 7. Segundo VENTURINI FILHO; MENDES, (2003), dentre as matérias-primas caracterizadas como amiláceas ou feculentas, a mandioca se destaca como excelente opção para a fermentação alcoólica por apresentar alto teor de amido. Tabela 7. Composição centesimal da mandioca in natura em porcentagem na base úmida e seca Análises Teores(% em base úmida) Teores (%em base seca) Umidade 63,6±0,2 12±0,3 Amido 31,18±0,2 82,9±0,2 Matéria graxa 0,08±0,1 0,23±0,1 Proteína 0,06±0,3 0,16±0,2 Fibras 1,44±0,1 4,54±0,3 Açúcares totais 2,72±0,3 7,64±0,2 Cinzas 0,86±0,3 2,75±0,2 ph 6,4±0,1 6,4±0,1 Acidez* 2,16±0,3 2,16±0,3 * ml de NaOH/100g base úmida

86 69 De acordo com a Tabela 7, observa-se que os teores encontrados podem ser comparados com resultados obtidos por Cereda (2002), onde foram encontrados valores de: umidade 65,16% na matéria úmida e, proteína 3,0%, matéria graxa 0,30%, fibra 2,6%, cinzas 2,4%, açúcar total 8,2% e amido 83,5% na matéria seca. Tornando esta matéria-prima interessante para o processo de hidrólise para obtenção de açúcares fermentescíveis. A presença de baixas concentrações de proteína e matéria graxa favorece o processo de fermentação diminuindo consideravelmente a formação de espumas. 4.2 Primeiro Ensaio - Determinação do parâmetro tempo para a etapa de sacarificação Numa primeira etapa dos trabalhos foi realizado um ensaio para conhecer o comportamento do material, polpa de raiz de mandioca, no reator piloto dos futuros ensaios. Os resultados obtidos neste primeiro ensaio foi avaliado o tempo de funcionamento do processo de sacarificação utilizando as enzimas Termamyl 120 L na liquefação e AMG 400L na sacarificação. Os resultados estão apresentados na Tabela 8 e Figura 15. Tabela 8 Concentração de glicose produzida durante processo de sacarificação Tempo (horas) Glicose (g.l -1 ) 0 0,7 2 58,4 4 73, , , , , , , , , , ,9 Como representado (Tabela 8 e Figura 15), percebe-se aumento gradativo de glicose, conforme o aumento do tempo de ação da enzima, fato este devido à quebra das ligações glicosídicas e conseqüentemente a formação de glicose. Os ensaios realizados para indicar o melhor tempo de sacarificação indicaram que o teor de glicose aumentou significativamente até as 16 horas, não ocorrendo mais diferença

87 70 significativa após este período, portanto foi determinado como parâmetro fixo o tempo de sacarificação de 16h, trazendo menor consumo em termos de energia e tempo de permanência nos reatores de sacarificação. A Figura 15 mostra os resultados obtidos para a fixação do tempo de sacarificação. Figura 15 Gráfico com o perfil da concentração de glicose durante o processo de sacarificação da polpa de mandioca 4.3 Ajuste dos modelos estatísticos e influência das variáveis de processo sobre as respostas em estudo O planejamento experimental para a produção de hidrolisado foi realizado a fim de se avaliar a influência das variáveis independentes (concentração de matéria seca, concentração de α-amilase e concentração de amiloglucosidase) sobre cada uma das respostas em estudo (concentração de glicose). Já o planejamento experimental no processo fermentativo foi realizado a fim de se avaliar a influência das variáveis independentes (concentração de levedura e tempo) sobre cada uma das respostas em estudo (concentração de etanol).

88 71 Nesses estudos realizou-se uma análise individual para cada resposta. No processo de hidrólise enzimática para a produção de glicose e para o processo de fermentação a produção de etanol. 4.4 Segundo Ensaio - Produção de hidrolisado Os resultados obtidos no segundo ensaio no qual se avaliou o efeito da combinação das enzimas Termamyl, AMG 400L e a concentração de matéria seca, de acordo com o planejamento experimental proposto, encontram-se na Tabela 9. Tabela 9 - Valores experimentais das variáveis dependentes (respostas) para os hidrolisados produzidos a partir de mandioca in natura. Variáveis independentes Variáveis dependentes Ensaio Matéria Seca (%) Conc. Enzima dextrinização (KNU.4g 1 ) Conc. Enzima Sacarificação (AGU.4g 1 ) Glicose (g.l -1 ) Maltose (g.l -1 ) Maltotriose (g.l -1 ) Maltotetraose (g.l -1 ) 1 28(-1) 2(-1) 2(-1) 208,58 1,53 3, (+1) 2(-1) 2(-1) 259,91 7,94 1, (-1) 4(+1) 2(-1) 214,71 0,36 4, (+1) 4(+1) 2(-1) 261,02 7,65 9,26 0, (-1) 2(-1) 4(+1) 219,91 6,82 0, (+1) 2(-1) 4(+1) 258,94 0 1, (-1) 4(+1) 4(+1) 216,58 0 1, (+1) 4(+1) 4(+1) 258,31 2,83 1, ,5(-1,68) 3(0) 3(0) 200,31 3,43 4,79 0, ,5(+1,68) 3(0) 3(0) 274,08 5,48 4,21 0, (0) 1,3(-1,68) 3(0) 235,89 0 3,25 0, (0) 4,7(+1,68) 3(0) 238,95 5,17 5,89 0, (0) 3(0) 1,3(-1,68) 201,4 0 7,27 1, (0) 3(0) 4,7(+1,68) 239,76 7, (0) 3(0) 3(0) 238,17 10,7 13,75 1, (0) 3(0) 3(0) 237,09 10,36 13, (0) 3(0) 3(0) 238,02 10,37 9,65 0, (0) 3(0) 3(0) 241,23 0 0, (0) 3(0) 3(0) 240,6 6,07 7,34 0, (0) 3(0) 3(0) 239,83 6,62 4, (0) 3(0) 3(0) 238,04 1,57 2, (0) 3(0) 3(0) 237,78 6,73 3,65 0, (0) 3(0) 3(0) 239,38 3,64 0 0

89 72 Uma das grandes dificuldades em se usar a polpa das raízes como matéria-prima seria o efeito da viscosidade, devido à presença de outros compostos como saponinas, pectinas que demandam o acréscimo de água na polpação para diminuir seu valor. Acreditava-se que esta alta viscosidade pudesse interferir na gelatinização do amido nas fases de liquefação e sacarificação, entretanto não ocorreu, pois o rendimento em glicose encontrada nos ensaios variou de 69,52 a 84,72%, com média de 82,13% como mostram as Tabelas 9 e 10. Valores estes semelhantes ao encontrado pelos autores Surmely et al. (2003), que produziram glicose de massa ralada de mandioca com teor de glicose de 86,4%. Após a realização dos ensaios no reator conforme especificado no item 3.7.3, as análises permitiram a construção da Tabela 10. Os valores encontrados mostram uma alta conversão a todos os ensaios, já que segundo a literatura um dos problemas encontrados seria a viscosidade que poderia interferir durante o processo de transformação do amido em glicose. Devido a essa alta conversão (média de 82,13%), reforça-se a idéia de que a produção de hidrolisado a partir de polpa de raízes de mandioca com elevado teor de matéria seca permitiu uma conversão satisfatória quanto ao teor de glicose.

90 73 Tabela 10 Rendimento da conversão em glicose no processo de hidrólise Ensaios Concentração de glicose hidrolisada g.l -1 Concentração de glicose teórica g.l -1 Conversão (%) ,58 270,5 77, , , ,71 270,5 79, , , ,91 270,5 81, , , ,58 270,5 80, , , ,31 217,5 92, ,08 323,5 84, ,89 289,7 81, ,95 289,7 82, ,4 289,7 69, ,76 289,7 82, ,17 289,7 82,46 A Tabela 10 demonstra os valores de rendimento em função das concentrações de matéria seca, Termamyl 120L e AMG 400L utilizadas, caracterizando maior conversão quando as concentrações de matéria seca são menores (26,5 e 28%), porém maiores concentrações de glicose foram encontradas nos ensaios onde a concentração de matéria seca é maior (32 e 33,5%), isto ocorreu devido a alta concentração de amido existente nestes ensaios. No entanto, considerando o equilíbrio entre a conversão e a formação de glicose é possível observar que as melhores condições de trabalho seriam as de concentrações entre 32 e 33,5% de matéria seca Glicose De acordo com o planejamento experimental definido no item 3.7, os resultados do rendimento da hidrólise, ou seja, a conversão do amido pode ser observada na Tabela 10.

91 74 Segundo Franco et al. (2001), a taxa de hidrólise depende principalmente da origem botânica do amido, do sistema enzimático utilizado, da temperatura e agitação, entre outros fatores. No processo completo de hidrólise, o amido é convertido em uma mistura de vários oligossacarídeos e dextrinas diferentes pelo uso da α-amilase. Essas maltodextrinas e oligossacarídeos, ligeiramente doces, são submetidas a mais uma conversão pela adição de outras enzimas promotoras do desdobramento total dessas moléculas que ao se romperem transformam-se em carboidratos cada vez mais simples e finalmente em glicose (ENZIMAS, 2009). Os valores apresentados na Tabela 9 para a glicose foram tratados estatisticamente, considerando um intervalo de confiança de 95 % (p< 0,05). A Tabela 11 mostram os coeficientes de regressão e a análise de variância (ANOVA) do modelo completo codificado para a glicose produzida. De acordo com Barros Neto et al.(2007), uma regressão, embora significativa do ponto de vista do teste F, pode não ser útil para realizar previsões por cobrir uma faixa de variação pequena dos fatores estudados.segundo Box & Wetz (1973), diz que uma regressão para não ser apenas significativa do ponto de vista estatístico, mas também apresentar valor preditivo, necessita que o valor de F calculado seja de 4 a 5 vezes maior do que o F tabelado. Portanto, neste caso, o valor do Fcalculado para a regressão é significativo (14,39), ou seja, o valor do Ftabelado (3,13) mostra que o modelo obtido neste ensaio é preditivo. Tabela 11 - Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para a glicose produzida. Coeficientes de regressão Erro padrão GL p valor Média Matéria Seca (L) AMG(L) AMG(Q) R ANOVA GL SQ QM F valor Pr > F Regressão <,0001 Resíduos Total Onde: GL = grau de liberdade.

92 75 Analisando estatisticamente a glicose verificou-se que este foi influenciado significativamente pelas concentrações de matéria seca e amiloglucosidase. Através da Tabela 9 é possível observar ainda que os ensaios 2, 4, 6, 8, 10 onde tinha as maiores concentrações de matéria seca (32 e 33,5(%p/p)) e as concentrações médias de amiloglucosidase (2, 3, 4 (AGU.4g -1 )) a produção foi de aproximadamente 262,45 g.l -1. Já em relação às concentrações de α-amilase não houve diferença significativa para a produção de glicose. A equação do modelo ajustado para o rendimento de glicose esta descrito na equação (22): G = 235,72+ 24,98 * Ms + 26,79 * AMG 18,55 * AMG 2 eq. (22) onde: G = Glicose; Ms = Matéria Seca; AMG = Amiloglucosidase A partir do modelo obtido foi possível a construção do gráfico que permitiu visualizar as melhores condições para a variável dependente, glicose, conforme mostrou a Figura 16. Na Figura 16 é possível observar que a condição de maior teor de glicose é a que utiliza maiores concentrações de matéria seca e concentração média de amiloglucosidase. A ação sinérgica da α-amilase e amiloglucosidase no processo de hidrólise vêm sendo estudada por diversos pesquisadores em amidos de diferentes origens. Monna et al. (1989) estudaram a eficiência do uso destas duas enzimas em grânulos de amido de arroz, sagu e batata e concluíram que esta combinação apresenta bons rendimentos na conversão do amido a glicose em todos os substratos. Baseado nesses resultados, os autores sugeriram que a existência de amilose no amido pode impedir a digestão no grânulo pela amiloglucosidase sozinha, enquanto a presença de α-amilase propicia a hidrólise desse componente evitando a inibição da amiloglucosidase.

93 76 Figura 16- Gráfico de superfície de resposta e curvas de contorno para produção de glicose para as variáveis de (%) matéria seca e (AGU. 4g -1 ) amiloglucosidase Maltose A maltose é dissacarídeo formado por duas moléculas de glicose,onde, durante o processo de hidrólise do amido forma-se inicialmente maltose e depois glicose. Os valores de maltose variaram de 0,0 g.l -1 a 10,7 g.l -1, sendo estes mínimos e máximos respectivamente, conforme demonstrado na Tabela 9. Através da análise de regressão foi observado efeito significativo (p<0,05) do fator concentração de AMG e Termamyl sobre este parâmetro (Tabela 12 e Apêndice 3 e 4). O modelo ajustado deu origem a equação 23 que determina o rendimento de maltose em relação à concentração de α-amilase e a concentração de amiloglucosidase sendo: M = 7,13 1,84 * T 2 1,44 * AMG 2 eq. (23) onde: M = Maltose; T = Termamyl(α-amilase); AMG = Amiloglucosidase; A Tabela 12 mostra a ANOVA e o coeficiente de regressão ajustado e significativo do efeito da interação entre matéria seca, Termamyl e Amiloglucosidase para produção de maltose. O valor de FTabelado para este caso é de 3,13 e o valor de Fcalculado foi de 5,92 o que mostra que o modelo obtido pela análise de regressão apesar de ser significativo não pode ser considerado preditivo.

94 77 Tabela 12 - Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para produção de maltose na hidrólise enzimática Coeficientes de regressão Erro padrão GL p valor Média Termamyl (Q) AMG (Q) Matéria seca * AMG R ANOVA GL SQ QM F valor Pr > F Regressão Resíduos Total Onde: GL = grau de liberdade. Figura 17 - Gráfico de superfície de resposta e curvas de contorno para produção de maltose para as variáveis (KNU. 4g -1 ) Termamyl e (AGU.4g -1 ) Amiloglucosidase. Na Figura 17 foi possível observar que a ação da Termamyl e Amiloglucosidase causou algumas diferenças entre os tratamentos quanto ao teor de maltose, principalmente nas concentrações de 3 KNU.4g -1 de Termamyl e de 3AGU.6g -1 de AMG fato este devido as concentrações de matéria seca ser maior nesses tratamentos.

95 78 As concentrações centrais testadas de Termamyl 120L e AMG 400L levaram segundo o modelo ajustado a obtenção de maior teor de maltose. De acordo com Novo, (1995) durante a hidrólise do amido eliminam-se gradualmente as unidades de glicose da extremidade não redutora da molécula do substrato. Sendo que a velocidade de hidrólise depende do tipo (linear ou ramificada) e da extensão da cadeia: as ligações α-1,4 se hidrolisam mais facilmente que as ligações α-1,6, porém a maltotriose, e especialmente a maltose, hidrolisam-se mais lentamente que os oligossacarídeos. Ainda para o fator maltose verificou-se através da análise de regressão efeito significativo (p<0,05) do fator concentração de AMG e concentração de matéria seca sobre este parâmetro (Tabela 12 e Apêndice 3 e 4). A equação do modelo ajustado para o rendimento de maltose em relação à porcentagem de matéria seca e a concentração de amiloglucosidase é: M = 7,13 1,44 * AMG 2 2,21 * AMG * Ms eq. (24) onde: M = Maltose; Ms = Matéria Seca; AMG = amiloglucosidase Observando-se os parâmetros das Equações 23 e 24, percebe-se que para as maiores concentrações de matéria seca e valores médios de Termamyl e AMG, obteve-se uma maior quantidade de maltose residual, que indica proporcionalidade na composição dos hidrolisados em função da matéria seca. A maltose e outras oligodextrinas existentes no hidrolisado e na presença de enzimas remanescentes, durante o processo fermentativo são ainda transformadas em glicose aumentando o rendimento na produção de etanol.

96 79 Figura 18 - Gráfico de superfície de resposta e curvas de contorno para produção de maltose para as variáveis de (%) Matéria Seca e (AGU.4g -1 ) Amiloglucosidase. Os resultados da Figura 18 mostraram que a ação da Termamyl, neste caso não causou diferenças significativas no grau de hidrólise entre as amostras, mas a concentração de matéria seca e amiloglucosidase influíram na formação de maltose. Visando-se identificar condições melhores de produção de glicose e de maior rendimento, definiu-se através da construção e análise das superfícies de resposta para a maltose (Figura 18) que é interessante que se adote, dentro da região experimental trabalhada, a concentração de matéria seca de 33,5%, Termamyl de 3 KNU.4g. -1 e a concentração de AMG de 3 AGU.4g Maltotriose Através da análise de regressão pode-se observar efeito significativo (p<0,05) dos fatores concentração de matéria seca e da AMG sobre este parâmetro. Os valores de maltotriose produzida variaram de 0,0 g.l -1 a 13,7 g.l -1, sendo estes mínimos e máximos respectivamente, conforme demonstrado na Tabela 9. A Tabela 13 e Apêndice 5 e 6 representam os coeficientes de regressão estimados para o rendimento do processo de hidrolise.o valor de Fcalculado foi de 8,09, já o Ftabelado é de 2,93, sendo o modelo ajustado

97 80 considerado preditivo dando origem à equação 25 que determina o rendimento de maltotriose no processo. Tabela 13 - Coeficientes de regressão estimados para o modelo ajustado para produção de maltotriose durante a hidrólise enzimática Coeficientes de regressão Erro padrão GL p valor Média AMG(L) Matéria seca(q) Termamyl(Q) AMG(Q) R ANOVA GL SQ QM F valor Pr > F Regressão Resíduos Total Onde: GL = grau de liberdade. A equação do modelo ajustado para o rendimento de maltose em relação à % de matéria seca e a concentração de amiloglucosidase é: Mt = 8,54 1,97 * AMG - 1,64 * Ms 2 1,95 * AMG 2 eq. (25) onde: Mt = Maltotriose; Ms = Matéria Seca; AMG = Amiloglucosidase Na Figura 19 é possível observar a ação da amiloglucosidase e da concentração de matéria seca na formação de maltotriose, percebe-se que para os valores médios (28 a 32%) de matéria seca e concentração de 2 a 3 AGU.4g -1 de amiloglucosidase tem-se uma maior quantidade de maltotriose restante, o que mostra que a ação da amiloglucosidase nesses pontos teve uma velocidade de ação menor comparado aos outros pontos.

98 81 Figura 19 - Gráfico de superfície de resposta e curvas de contorno para produção de maltotriose para as variáveis de (%) Matéria Seca e (AGU.4g -1 ) Amiloglucosidase. A análise de regressão mostrou ainda o efeito significativo (p<0,05) dos fatores concentração de Termamyl e da AMG sobre este parâmetro. A Tabela 13 e Apêndice 5 e 6 representam os coeficientes de regressão estimados para o rendimento do processo de hidrólise. A equação (26) do modelo ajustado para o rendimento de maltose em relação à concentração de α-amilase e a amiloglucosidase é: Mt = 8,54 1,97 * AMG - 1,62 * T 2 1,95 * AMG 2 eq. (26) onde: Mt = maltotriose; T = termamyl(α-amilase); AMG = amiloglucosidase De forma bem semelhante às variáveis analisadas anteriormente (matéria seca e amiloglucosidase) para a formação de maltotriose, o mesmo acontece para as variáveis Termamyl e AMG, como mostra a Figura 20, onde tem-se uma maior quantidade de maltotriose restante, nas concentrações de 2 a 3 KNU.4g -1 de Termamyl e 2 a 3 AGU.4g -1 de AMG.

99 82 Figura 20 - Gráfico de superfície de resposta e curvas de contorno para produção de maltotriose para as variáveis de (KNU.4g -1 ) termamyl e (AGU.4g -1 ) amiloglucosidase. Ainda para o fator maltotriose verificou-se através da análise de regressão com efeito significativo (p<0,05) do fator concentração de Termamyl e concentração de matéria seca sobre este parâmetro (Tabela 13 e Apêndice 5 e 6). A equação (27) do modelo ajustado para o rendimento de maltose em relação à % de matéria seca e a concentração de α- amilase é: Mt = 8,54 1,64 * Ms 2 1,6 2 * T 2 eq. (27) onde: Mt = maltotriose; Ms = matéria seca; T = termamyl(α-amilase) A partir da Figura 21 é possível visualizar a semelhança ao fato ocorrido às variáveis analisadas anteriormente (matéria seca e amiloglucosidase) para a formação de maltotriose, onde se tem uma maior quantidade de maltotriose restante, nas concentrações de 2 a 3 KNU.4g -1 de Termamyl e de 28 a 32% de matéria seca.

100 83 Figura 21 - Gráfico de superfície de resposta e curvas de contorno para produção de maltotriose para as variáveis de (%) matéria seca e (KNU.g -1 ) termamyl. Pode-se afirmar ainda que visando a formação de glicose como objetivo deste experimento a quantidade de maltotriose formada não interferiu na produção de glicose Maltotetraose De acordo com os resultados observados na Tabela 9, os valores obtidos para maltotetraose não foram significativos estatisticamente, o que mostra que houve uma boa conversão de amido em glicose, restando apenas alguns traços de outros açúcares como é o caso da maltotetraose. Esse resultado indica ainda que não foi necessário que a sacarificação fosse prolongada. Os modelos ajustados deram origem a equações que estabelecem modelos preditivos usados no diagnóstico para estabelecer qual tratamento foi o mais eficiente, quando todos os parâmetros são avaliados em conjunto. Assim, o Tratamento 10, onde foram utilizados 33,5%p/p de matéria seca, 3 KNU.4g -1 de Termamyl e 3AGU.4g -1 de AMG 400L, demonstrou ser o mais eficiente.

101 Caracterização dos resíduos do hidrolisado A Tabela 14 apresenta os resultados da análise físico-química do resíduo fibroso do hidrolisado de mandioca, utilizado como matéria-prima na fabricação de bioetanol. Tabela 14 Análise físico-química em base úmida do resíduo sólido do processo de fabricação do hidrolisado Análises Teores(%) Umidade 86,3±0,4 Amido 0,44±0,3 Fibras 3,10±0,3 Açúcares totais 3,23±0,2 Cinzas 0,04±0,2 Segundo Surmely et al (2003), na prensagem da suspensão de massa hidrolisada ocorre uma perda de quase 15% do hidrolisado, o que é explicado pelo fato da fibra reter muita água e, neste caso, muita solução do meio de sacarificação. Um aumento na pressão na prensagem diminuiu levemente esta perda, mas não permite uma recuperação integral do hidrolisado. Outra solução para diminuir esta perda, é realizar a lavagem deste resíduo com água, o que ajuda a aumentar a remoção do hidrolisado presente nas fibras. Porém a quantidade de água utilizada não pode ser grande para que a concentração de sólidos solúveis não saia da quantidade requerida para posterior fermentação. 4.5 Terceiro Ensaio FERMENTAÇÃO Este ensaio teve por objetivo avaliar o efeito da concentração de inóculo, do tempo de fermentação sobre o teor de etanol, metanol, glicerol, teores de açúcares residuais e porcentagem de conversão de glicose em etanol Valores experimentais das variáveis dependentes (respostas) para os fermentados produzidos a partir do hidrolisado obtido anteriormente

102 85 Na fermentação alcoólica, o açúcar que se encontra no mosto é utilizado pela levedura em seu metabolismo para obtenção de energia e gerar etanol, gás carbônico, massa celular, ácidos succínico e acético, glicerol, alcoóis superiores, ésteres, aldeídos, entre outros produtos. Os dados experimentais para teor de etanol, glicose, metanol, glicerol e a porcentagem de conversão de glicose em etanol após o processo de fermentação, de acordo com o planejamento experimental proposto, encontram-se na Tabela 15.

103 86

104 87 Segundo Horii (1978), dentre as variáveis que exercem efeito significativo sobre o rendimento ou eficiência da fermentação estão a qualidade da matéria-prima, as condições fisiológicas do inóculo e fatores ambientais como ph, nível inicial de contaminantes, temperatura, concentração do substrato no mosto, composição nutricional do mosto e concentração do álcool produzido. Figura 22 Fermentação em batelada alimentada Srikanta et al. (1987), produziram etanol a partir de farelo de mandioca e obtiveram uma eficiência total do processo da ordem de 65,5 % quando fermentaram o xarope, e de 57,3% quando a fermentação ocorreu simultânea a sacarificação tendo sido o mosto acrescentado de 10 % (v/v) de fermento e suplementado com 0,1 % (NH 4 ) 2 SO 4, 0,05 % KH 2 PO 4 e 0,02 % de extrato de levedura ao mosto Glicose Para o teor de glicose residual no vinho delevurado observou-se uma variação de 0,09g.L -1 a 11,49 g.l -1 nas diferentes condições experimentais testadas, fato este decorrente ao tempo de fermentação, principalmente no tratamento 7 por ser insuficiente para a metabolização das leveduras. Nos outros tratamentos foi possível verificar que praticamente toda glicose presente no mosto de fermentação foi metabolizado pelas leveduras. A análise de regressão mostrou efeito quadrático positivo do tempo de fermentação, conforme apresentado na Tabela 16 e Apêndice 9 e 10. O modelo ajustado obtido pela análise de regressão apesar de significativo não pode ser considerado preditivo, já que o valor de F