ANALISE DA VARIAÇÃO DA INTENSIDADE ESPECTRAL DE PROTEÍNA E ÁGUA NA DERME APÓS EXPOSIÇÃO À RADIAÇÃO DE INFRAVERMELHO

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1 ANALISE DA VARIAÇÃO DA INTENSIDADE ESPECTRAL DE PROTEÍNA E ÁGUA NA DERME APÓS EXPOSIÇÃO À RADIAÇÃO DE INFRAVERMELHO Aline Priscila C. Pereira, Michely Glenda Pereira da Silva, Fernanda R. Moraes, Taciana D. M. Alva, Airton A. Martin Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB) - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) allinneferrara@gmail.com Resumo - A irradiação da luz infravermelha diminui o conteúdo de carotenoides, β-caroteno e licopeno, favorece a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e metalo proteinases de matriz (MMP), com isso influenciando na formação dos radicais livres, diminuição de proteínas e conteúdo hídrico na pele. Diante disto, o objetivo desse estudo é analisar a variação da intensidade espectral de proteína e água na derme após exposição à radiação de infravermelho por meio de doses de 50 e 150 mw. Foram realizadas medidas por meio da técnica de espectroscopia Raman Confocal com laser de excitação 671nm na região do antebraço de participantes com idade de 20 a 40 anos e com fototipo I e II. Observou-se que em geral houve diminuição na intensidade do pico de proteína para as duas doses de irradiação, quanto à água não houve diminuição para um participante. Conclui se que a espectroscopia Raman confocal é uma ferramenta imortante para análise das alterações dos arranjos quimicos presentes na pele após irradiação da luz infravermelha. Palavras-chave: Água Corporal; Análise Espectral Raman; Derme; Pele; Radiação. Área do Conhecimento: Engenharia Biomédica; Engenharia química. Introdução A pele humana é formada por tecidos que se arranjam em três camadas: epiderme, derme e hipoderme. Atua como protetora do organismo contra agentes externos e evitando a perda de água transepidérmica (EKLOUCH-MOLINIER; et al, 2015). A derme é formada principalmente por fibras de colágeno e elastina inclusas na substância fundamental amorfa produzida pelos fibroblastos, possui também vasos, nervos, músculos eretores do pêlo, anexos cutâneos e 18 a 20% da água total do corpo (MADISON, 2003; PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008). Esta região é dividida em duas porções: papilar e reticular (COSTA, 2012). A pele sofre exposição à radiação solar constantemente, que varia no comprimento de onda de 290 a 4000nm, o que incluim luz ultravioleta (UV) ( nm), a luz visível ( nm) e radiação infravermelha (IR) ( nm) (KIM, 2006). A energia da radiação solar que atinge a superfície da terra é formada por 6.8% de ultravioleta, 38,9% de luz visível e 54,3% de infravermelho (AKHALAYA; et al, 2014). A radiação infravermelha quando em contato com a pele é absorvida e convertida em calor, penetrando nas camadas profundas da pele, podendo aumentar a temperatura em até 40 C causando vasodilatação e eritema (LEE; et al, 2006). Estudos mostram que a radiação IR pode penetrar da epiderme até o tecido subcutâneo, e a exposição crônica ao calor pode causar enrugamento pela modificação de proteínas estruturais da derme, induzir a angiogênese, para formar vasos sanguíneos imaturos, alteração dos mastócitos, a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mitocôndria pela diminuição da atividade de enzimas antioxidantes, a ativação de fatores de transcrição celular que causam lesão da matriz extracelular, bem como a indução de proteinases, como as metalo proteinases de matriz (MMP), conhecido como dano oxidativo, o que pode

2 desencadear alterações no DNA, assim contribuindo para o processo de envelhecimento prematuro da pele (YANO, 2002; KIM, 2006). A irradiação da luz infravermelha também provoca a diminuição do conteúdo de carotenóides β-caroteno e licopeno na pele humana (DARVIN; et al, 2009). Logo a mudança na conformação ou desnaturação das proteínas presentes na pele resultaria também em mudanças no conteúdo hídrico devido o fotoenvelhecimento (BAGATIN, 2008). É padrão que a quantidade de água aumente progressivamente com a profundidade no estrato córneo e se torne constante a partir de 60 a 70 µm em toda a derme, estando em torno de 70% (NAKAGAWA; MATUMOTO; SAKAI, 2010). De acordo com a lei Grotthus-Draper apenas 10-12% da radiação incidente é absorvida na derme in vivo (PIAZENA; KELLEHER, 2008). Diante do exposto a espectroscopia Raman confocal tem sido utilizada recentemente para fornecer de uma forma não invasiva as alterações dos arranjos químicos da pele humana resultantes dos efeitos da idade, do envelhecimento intrínseco e extrínseco, da permeação e ação de ativos na pele (CASPERS; et al, 2001; CASPERS; LUCASSEN; PUPPELS, 2003). Esta ferramenta também tem sido aplicada com sucesso nos estudos dos efeitos danosos dos radicais livres na pele (FLUHR; et al, 2011; LADEMANN; et al, 2009). Neste contexto, o objetivo deste estudo é analisar a variação da intensidade espectral de proteína e água na derme após exposição à radiação de infravermelho por meio de doses de 50 e 150 mw, por meio da técnica de espectroscopia Raman Confocal com laser de excitação 671nm, correpondente a região de alta frequência ( cm -1 ). Metodologia Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP), seguindo a resolução 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde (BRASIL, 2012), onde os participantes receberam informações detalhadas sobre os procedimentos adotados e em sequência assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Trata se de um estudo experimental, no qual foram realizadas medidas in vivo, na pele do antebraço de participantes com idade entre 20 a 40 anos, com fototipo I e II, por meio da técnica de espectroscopia Raman Confocal (Rivers Skin Composition Analyzer modelo 3510), com laser de excitação 671nm, correspondente a região de alta frequência com intervalo espectral de 2500 a 4000 cm -1, ilustrado na figura 1. Figura 1 - Sistema Raman Confocal da Rivers diagnostics Foi utilizado o aparelho da Philips IR 1521 radiador, que emite uma radiação infravermelho a uma região de comprimento de onda larga a partir de 600 nm, mostrado na figura 2. A pele foi irradiada com doses medias de 50 e 150 mw, visto que não há uma dose padrão estabelecida

3 (BAROLET; CHISTIAENS; HAMBLIN, 2015), estas doses foram avaliadas utilizando um medidor de potência da Field Master GS (Coherent) com o sensor (cabeça) modelo LM-3 HTD. Figura 2 - Aparelho da Philips IR 1521 radiador sobre o braço do participante, área delimitada de 1cm 2 indicada pela seta. Os espectros foram coletados antes e após a exposição à irradiação de infravermelho, sob uma região delimitada de 1cm 2. O tempo de irradiação foi de 30 minutos cada, em uma distância de 15 cm do centro da lâmpada. As doses de irradiação foram divididas entre braço direito (dose de 50mW) e esquerdo (dose de 150mW), e alternadas entre os braços das participantes, em conformidade a figura 2. As medidas foram feitas em ambiente com controle de temperatura (20 C ±2 C) e umidade (50% ±2%). A potência do laser (671nm) na amostra foi de 18 mw. Foram coletados dados no tempo zero (T0) antes da irradiação, logo após a irradicação correspondente a T30 minutos e por fim foi realizado uma medida com vinte e quatro horas depois da irradiação (chamado de T24horas). O protocolo utilizado para obtenção dos foram em profundidade de µm divido em três etapas: inicialmente de 0-25 µm, com passo de 2 µm, tempo de exposição de 2s (etapa 1), em sequência etapa 2 correspondente a µm, com passo de 15 e tempo de exposição de 2s, e por fim a 3 etapa com µm, com passo de 2 µm e tempo de exposição de 4s, totalizando duração de 3 minutos cada. Foram selecionados 10 espectros para análise correspondente a região da derme ( µm). Os espectros passaram por correção da linha de base por meio programa labspec 6, posteriormente foi feito uma média espectral para cada tempo e uma análise da área integrada através software Skin Tolls e Origin 8.5, das bandas espectrais correspondente ao conteúdo a banda de proteína (entre 2910 e 2960 cm -1 ) e água (entre 3350 e 3550 cm -1 ) resultante das vibrações de estiramento de CH e OH respectivamente (CASPERS; et al, 2000). Resultados Na figura 3 e 4 é possível observar que tanto com irradiação de 50 quanto 150mW, segundo o pico correspondente a proteína a diminuição em geral na intensidade nos tempos (T30) e (T24h). O quadro 1 traz valores percentuais obtidos por meio da análise de integração da área dos picos de água e proteína, nos tempos T30 e T24h, de cada voluntário (vol.) onde (+) representa aumento e (-) a diminuição da intensidade, considerando a medida controle (T0) como 100%.

4 Figura 3 - Região de alta frequência (2500 a 4000 cm -1 ) resultante das vibrações de estiramento de C-H e O-H correspondentes a protína (2910 a 2960 cm -1 ) e água (3350 a 3550 cm -1 ) na profundidade da derme com irradiação de 50mW e 150mW. Quadro 1 - Percentual de variações da intensidade dos picos de água e proteína. 150mW/cm² Área em (%) 50mW/cm² Área em (%) Água T30 T24h Água T30 T24h Voluntário 1 1,48+ 7,48+ Voluntário 1 1,04+ 1,41+ Discussão Voluntário 2 3,21+ 1,75+ Voluntário 2 1,50-1,50+ Voluntário 3 1,75+ 2,66- Voluntário 3 1,51+ 6,13- Proteína T30 T24h Proteína T30 T24h Voluntário 1 12,70-18,85- Voluntário 1 2,63-5,70- Voluntário 2 20,13-20,80- Voluntário 2 2,86-20,16- Voluntário 3 23,22-1,18+ Voluntário 3 0,84-22,88+ Em diversos estudos as doses de irradiação usadas são distintas tanto para estudos in vitro

5 quanto in vivo, em alguns, muito altas, isso tem causado controvérsia quanto ao efeito deletério dessa radiação em relação às doses administradas visto que não há uma dose padrão estabelecida (BAROLET; CHISTIAENS; HAMBLIN, 2016), portanto foram usadas doses diferentes para identificar a variação da intensidade espectral dos picos, entretanto os resultados se mantêm parecidos para as duas doses. Então foi encontrado aumento de 22,88% em T24h com 150mW e de 1,88% em (T30) para voluntária 3 com 50mW. Já para o pico correspondente a água houve um ligeiro aumento de aproximadamente 2% em geral, exceto para o vol,1 em (T24h) que houve um aumento de 7,48% e 3,21% para a vol,2 em (t30) na dose de 150mW, e diminuição de 2,66% para o vol, 3 em (T24h) com 150mW. Enquanto que para a dose de 50mW houve diminuição de 6,13% para o vol,3 em sua intensidade, o que corrobora com estudos anteriores que citam mudanças na conformação de estruturas químicas pela exposição à radiação infravermelha (YANO, 2002; KIM, 2006; BAGATIN, 2008). Porém não houve diminuição do conteúdo hídrico, mas um ligeiro aumento para todos as voluntárias de aproximadamente 2%, exceto para o vol,3 no tempo de 24h para as duas doses administradas o que difere da literatura pesquisada. Estudiosos ressaltam maior concentração de água na pele fotoenvelhecida por possui reduzida interação entre água e proteínas, devido à superfície das moléculas se tornarem hidrofóbicas, do que na pele envelhecida cronologicamente (GNIADECKA; et al., 1998). Conclusão Por meio da espectroscopia Raman confocal foi possível identificar as alterações na intensidade dos picos de proteína e água na profundidade da derme após a irradiação, mostrando-se um método eficaz para o estudo da pele humana. Finalmente é possível compreender a existência de uma relação inversamente proporcional entre água e proteína. Referências AKHALAYA, M.Y; et al. Molecular action mechanisms of solar infrared radiation and heat on human skin. Ageing Res Rev., v.16, p.1-11, jul, BADIN, A.Z.D.; MORAES, L.M; ROBERTS, T. L. Rejuvenescimento facial a laser. Rio de Janeiro, RJ: Revinter, BAGATIN, E. Envelhecimento cutâneo e o papel dos Cosmecêuticos. Boletim Dermatológico Unifesp, n. 17, p.1-4, jan./mar, BAROLET, D; CHISTIAENS F; HAMBLIN, R.H. Infrared and skin: Friend or foe. J photochemistry Photobiology, v.155, p.78-85, fev, BRASIL. Conselho Nacional de Saúde. Comissão nacional de ética em pesquisa. Resolução nº 466, de 12 de dezembro de Ministério da saúde. 16 p. Disponível em: < Acesso 04 abr, CASPERS, P.J.; et al. Automated depth-scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. J Raman Spectroscopy, v.31 n.8-9, p.813-8, ago, 2000.

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