INCT DO CAFÉ- Processo CNPq Nº: / RELATÓRIO DE RESULTADOS PARCIAIS. PERÍODO: 2/3/2009 a 30/8/2010

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1 INCT DO CAFÉ- Processo CNPq Nº: / RELATÓRIO DE RESULTADOS PARCIAIS PERÍODO: 2/3/2009 a 30/8/2010 Comitê Gestor Mário Lúcio Vilela de Resende, UFLA (Coordenador) Laércio Zambolim, UFV (Vice-coordenador) Alan Carvalho Andrade, EMBRAPA (Membro) Edila V. Resende Von Pinho, UFLA (Membro) Sara Maria Chalfoun, EPAMIG (Membro) Lavras MG Agosto de 2010

2 Sumário RELATÓRIO DE RESULTADOS PARCIAIS RELATIVOS AO PERÍODO INDICADO NO FORMULÁRIO DE ACOMPANHAMENTO E AVALIAÇÃO, EM PORTUGUÊS, DE NO MÁXIMO 50 PÁGINAS, CONTENDO:... 1 a) Comitê Gestor reuniões realizadas e decisões... 1 Comitê Gestor... 1 Reuniões realizadas e decisões... 1 b) Atividades de cooperação entre os grupos de participantes do INCT... 1 c) Atividades de cooperação entre INCT s e com outras instituições (empresas, ongs, instituições governamentais, etc)... 3 d) Principais resultados técnico-científicos... 4 Linha de Pesquisa 1 - Melhoramento genético visando resistência a fatores bióticos e abióticos e a qualidade de frutos e bebida Linha de Pesquisa 2 Caracterização de genes induzidos durante a interação entre o cafeeiro e Hemileia vastatrix Linha de Pesquisa 3 Mapeamento físico e genético de marcas e localização de QTLs que possam ser utilizados em atividades de seleção assistida e na clonagem posicional de genes Linha de Pesquisa 4 Caracterização da variabilidade fenotípica e molecular de populações para fins de mapeamento e localização de QTLs para tolerância à seca e qualidade de bebida Linha de Pesquisa 5 Avaliação genética da qualidade fisiológica de sementes de café Linha de Pesquisa 6 Análises fonológicas, bioquímicas, metabolômicas e proteômicas relacionados à qualidade da bebida do café Linha de Pesquisa 7 Criopreservação a partir de diferentes explantes de cultivares de Coffea ssp Linha de Pesquisa 8 Produção de mudas de café por embriogênese somática, visando a multiplicação comercial de plantas matrizes de café arábica Linha de Pesquisa 9 Otimização de protocolos para transformação genética de Coffea arabica Linha de Pesquisa 10 Métodos alternativos na indução de resistência contra doenças, qualidade do café e tratamento de águas residuárias Linha de Pesquisa 11 Manejo integrado das principais pragas do cafeeiro visando a preservação do meio ambiente Linha de Pesquisa 12 - Dinâmica e o destino de pesticidas e metais pesados, e a emissão de CO 2 e N 2 O em solos cultivados com café após a adição de lodo de esgoto Linha de Pesquisa 13 - Propriedades físico-hídricas e químicas do solo e modelos de capacidade de suporte de carga do solo sob sistemas de controle do mato em cafezais Linha de Pesquisa 14 - Manejo diferenciado do fósforo em lavouras cafeeiras Linha de Pesquisa 15 - Plataforma tecnológica para comercialização online de café (ecafebr) e) Eventos nacionais e internacionais: apresentação de trabalhos, organização de cursos, seminários; palestras; mesas redondas f) Atividades de formação e capacitação de recursos humanos g) Perspectivas e futuros desdobramentos... 46

3 RELATÓRIO DE RESULTADOS PARCIAIS RELATIVOS AO PERÍODO INDICADO NO FORMULÁRIO DE ACOMPANHAMENTO E AVALIAÇÃO, EM PORTUGUÊS, DE NO MÁXIMO 50 PÁGINAS, CONTENDO: a) Comitê Gestor reuniões realizadas e decisões Comitê Gestor Mário Lúcio Vilela de Resende, UFLA (Coordenador) Laércio Zambolim, UFV (Vice-coordenador) Alan Carvalho Andrade, EMBRAPA (Membro) Edila V. Resende Von Pinho, UFLA (Membro) Sara Maria Chalfoun, EPAMIG (Membro) Reuniões realizadas e decisões - Reunião com todos os coordenadores de linhas de pesquisa para a implantação do projeto e discussão sobre a distribuição dos recursos financeiros; - Reunião com todos os coordenadores de linha de pesquisa para distribuição de bolsas e inclusão de novos membros no projeto; - Reunião com todos os coordenadores de linha de pesquisa para acompanhamento do projeto e confecção de relatório parcial; - Reunião do Comitê Gestor com a reitoria da Universidade Federal de Lavras (UFLA) para solicitar a contratação de técnicos para operar equipamentos de última geração a serem adquiridos para o INCT-Café; - Reunião do Comitê Gestor com a diretoria do Pólo de Excelência em Café (Governo de MG), para viabilizar a expansão da sede do INCT-Café no Setor de Cafeicultura da UFLA (recursos conseguidos junto ao Governo do Estado de Minas Gerais); - Reunião para decisão de compra e alocação de dois veículos adquiridos para o INCT-Café. b) Atividades de cooperação entre os grupos de participantes do INCT O INCT-Café possui quinze linhas de pesquisa com forte cooperação interdisciplinar e inter-institucional. Esta parceria existe no que tange ao melhoramento genético do cafeeiro, onde interagem pesquisadores da EPAMIG, UFV, UFLA, IAC e IAPAR, nas linhas de pesquisa relacionadas ao manejo de pragas e doenças, onde interagem pesquisadores da EPAMIG, EMBRAPA, UFV e UFLA, nas linhas de pesquisa relacionadas à cultura de tecidos, criopreservação de explantes e clonagem, onde interagem EMBRAPA, UFLA, IAC e a Fundação Pró-Café, de Varginha, MG. Nos estudos de biotecnologia do cafeeiro participam principalmente o IAC, IAPAR, EMBRAPA, UFV, UFLA e INCAPER, e assim por diante, 1

4 conforme resumido nos Quadros 1 e 2. Recentemente pesquisadores da área de biologia molecular tem se unido para se adotar protocolos comuns, a exemplo de esforços coletivos para o sequenciamento de fragmentos de DNA do genoma do cafeeiro, por exemplo. Os interesses por sequenciamento são relativamente diversos, a exemplo dos pesquisadores da UFV /UFLA voltados para estudos de expressão gênica sob estresse biótico, dos pesquisadores do INCAPER e UFLA/EMBRAPA nas questões de estresse abiótico (déficit hídrico) e o IAC/IAPAR interessados em gerar SNPs para fins de mapeamento genético e seleção genômica (Quadro 2). Quadro 1. Interação das estruturas em linha e matricial do Instituto Nacional e Ciência e Tecnologia do Café. 2

5 Quadro 2. Interação entre os pesquisadores das instituições participantes do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia do Café, nas 15 linhas de pesquisa acima designadas. c) Atividades de cooperação entre INCT s e com outras instituições (empresas, ongs, instituições governamentais, etc) Desde seu início, o INCT-Café tem desenvolvido atividades em cooperação com o Pólo de Excelência do Café, envolvendo a participação em eventos técnico-científicos e exposições para a divulgação do trabalho de ambos. O Pólo de Excelência do Café é uma agência do Governo de Minas Gerais/ Secretaria de Ciência, Tecnologia e Ensino Superior SECTES, e assim como o INCT-Café, está sediado no Setor de Cafeicultura da Universidade Federal de Lavras, UFLA. Os representantes do Setor de Cafeicultura, juntamente com o Pólo de Excelência do Café e o INCT-Café tem feito gestões junto à reitoria da UFLA, visando a expansão da sede do INCT-Café, tendo sido já alocados recursos para a construção de um 3

6 laboratório central de biotecnologia do Café, que servirá de suporte para as atividades com enfoque biotecnológico, predominantes dentro do INCT-Café. Em se tratando de biotecnologia, cooperação recente está também sendo firmada com o Laboratório de Genética e Expressão da UNICAMP, buscando suporte técnico em bioinformática, para os trabalhos de biologia molecular realizados no âmbito do INCT-Café. Parceria com outro INCT: INCT em Interação Planta-Praga: Estudantes de pósgraduação, bolsistas do INCT-Café/Capes tem interagido com pesquisadores do INCT-Interação Planta-praga, para o desenvolvimento de pesquisas sobre a ferrugem do cafeeiro em Viçosa, MG (sede do INCT em Interação Planta-Praga). Outra parceria do INCT-Café foi firmada com a empresa Agrichem do Brasil Ltda. Pesquisas conjuntas têm sido realizadas no que se refere à Linha de Pesquisa 10 (Indução de resistência no controle de doenças do cafeeiro). A Agrichem tem disponibilizado ao INCT-Café, alguns equipamentos de nanotecnologia em seu laboratório (Ribeirão Preto, SP), para a realização de pré-testes de novas formulações à base de subprodutos da lavoura cafeeira e micronutrientes, capazes de ativar o sistema de defesa de plantas à patógenos. Estas formulações estão sendo processadas em uma das biofábricas pré-incubadas na UFLA. Parcerias com Universidades no exterior: alunos/bolsistas do INCT-Café têm realizado parte de seus trabalhos de tese, principalmente nos EUA (Texas Tech University) e na Hollanda (Wageningen University). Atividades rotineiras de pirosequenciamento de DNA e formação de contigs serão realizadas no âmbito da North Carolina State University, Raleigh, USA. d) Principais resultados técnico-científicos O INCT-Café tem como missão a geração de tecnologias apropriadas, competitivas e sustentáveis, por meio da integração de competências institucionais, capacitação de recursos humanos, estímulo à capacidade de inovação e geração de negócios de alto valor agregado na cadeia produtiva do café. Neste contexto, a estratégia de ação do INCT-Café foi distribuída em 15 linhas de pesquisa, incluindo desde o melhoramento genético da lavoura, passando pela otimização de sistemas de produção, até a pós-colheita (qualidade da bebida) e pela viabilização do comércio online do café. Convém ressaltar que a maioria das linhas de pesquisa do INCT- Café possui enfoque biotecnológico, conforme discriminado no relatório por linha de pesquisa, a seguir: 4

7 Linha de Pesquisa 1 - Melhoramento genético visando resistência a fatores bióticos e abióticos e a qualidade de frutos e bebida. Estão envolvidas nessa Linha de pesquisa a Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais (EPAMIG), a UFLA, a Universidade Federal de Viçosa (UFV) e a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA Café). O objetivo desta Linha de pesquisa é caracterizar indivíduos em populações segregantes de cafeeiros de forma a selecioná-los visando à obtenção de plantas com características agronômicas desejáveis com ênfase para resistência a fatores bióticos (doenças) e abióticos e para qualidade de frutos e bebida. Dentre as doenças que acomentem o cafeeiro, a ferrugem causada por Hemileia vastatrix Berk. & Br. é considerada a mais importante e encontra-se disseminada por todas as regiões produtoras do país. No Brasil estima-se que as perdas devidas apenas a ferrugem sejam da ordem de 30% da produção quando na ausência de medidas de controle, principalmente devido à predominância de plantas de café (Coffea arabica L.) susceptíveis à maioria das raças de H. vastatrix, incluindo a raça II, predominante no país. A severidade da ferrugem e os prejuízos ocasionados na produção do cafeeiro, de modo geral, variam de região para região e de ano para ano, em decorrência da carga pendente dos cafeeiros e das condições climáticas prevalecentes. Os principais danos causados pela doença são ocasionados pela queda precoce das folhas e seca dos ramos produtivos, que por consequência não produzem no ano seguinte, diminuindo a produtividade e a longevidade das lavouras. A busca por cultivares resistentes sido dificultada pelo aparecimento destas novas raças fisiológicas do patógeno, que levam a quebra da resistência das cultivares melhoradas. Nos experimentos de campo realizados em Machado e São Sebastião do Paraíso, MG, entre as progênies F 4 obtidas por cruzamentos da cultivar Icatu com cultivares elites Catuaí Amarelo IAC 62, Catuaí Vermelho IAC 99, Topázio MG 1190 e Rubi MG 1192, destacaram-se nas primeiras colheitas H e H Estas progênies apresentaram potencial produtivo acima da média na região Sul de Minas Gerais. Em outro experimento realizado nas regiões cafeeiras do Alto Paranaíba e Sul de Minas Gerais, com genótipos de cafeeiro (C. arabica) resistentes à ferrugem (Hemileia vastatrix) derivados de Catuaí com Icatu e Híbrido de Timor, observou-se grande variabilidade entre as progênies estudadas, evidenciando a importância do estudo para o melhoramento genético do cafeeiro. No entanto, as progênies H MS cv. 02, H MS cv. 03, H MS cv. 05, H MS cv. 02 e H MS cv. 03 se destacaram em relação às demais, devendo ser utilizadas como progenitoras e/ou lançadas como uma nova cultivar em ações futuras. Contudo, o estudo orienta o planejamento e estratégias de 5

8 melhoramento, na recomendação de futuras cultivares, além de ser importante na questão da determinação da estabilidade fenotípica dos genótipos, para as diferentes regiões. Através dos dados obtidos no presente projeto de pesquisa, foi possível determinar o potencial de cultivares do grupo Bourbon que melhor se adaptam às diferentes regiões produtoras do Estado de Minas Gerais, em termos de produtividade e principalmente qualidade. Esse destaque de algumas cultivares possibilita a produção sustentável de cafés de excelente qualidade de bebida, evidenciando a capacidade competitiva de cultivares há muito tempo taxadas como menos produtivas. Para a região do Alto Paranaíba, MG, as cultivares que se destacaram em todos os atributos avaliados e que devem ser indicadas para a produção de cafés especiais são as cultivares de Bourbon Amarelo oriundas das seguintes fazendas: Fazenda Experimental da EPAMIG de Machado, Toriba, Castro, Nogueira, Paixão, Samambaia e do Instituto Agronômico de Campinas (IAC); além do Bourbon Amarelo LCJ 10, também oriundo do IAC. Para a região do Sul de Minas, as cultivares indicadas para a obtenção de elevadas produtividades que mantém as características de cafés especiais são: Bourbon Amarelo oriundas das fazendas: Fazenda Experimental da EPAMIG de Machado, Boa Vista, Castro, Fundação Procafé e do IAC; Bourbon Vermelho oriunda da Fazenda São João Batista. Visando gerar produtos tecnológicos baseados nos diferentes ensaios, ressalta-se um expressivo desenvolvimento inicial da progênie derivada da cultivar Topázio denominada de Travessia (Figura 1). Essa nova cultivar apresentou desempenho semelhante ou até melhor que as cultivares tradicionais, evidenciando a possibilidade de utilização da mesma em cultivo comercial. Além da cultivar mencionada, duas progênies encontram-se em fase de registro como cultivar, são elas: H , oriunda do cruzamento entre Icatu e Catimor, e a progênie H , oriunda do cruzamento entre Catuaí e Mundo Novo. Essas progênies encontramse no campo na Fazenda Experimental da Epamig em Três Pontas, MG, com lançamento programado para O trabalho tem sido realizado com muito entusiasmo e dedicação o que tem refletido na qualidade dos resultados até aqui alcançados. Os dados coletados na presente Linha de pesquisa são relevantes para a cafeicultura, principalmente em Minas Gerais, principal estado produtor. Acreditamos que com um maior período de avaliação a qualidade dos resultados será ainda melhor. Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que existe grande variabilidade entre as progênies estudadas tanto nos ensaios em produção quanto nos ensaios recém-implantados, evidenciando a possibilidade de seleção de progênies com características agronômicas desejáveis, resistentes à ferrugem e adaptadas às diversas regiões cafeeiras. 6

9 Figura 1. Vista geral do talhão da cultivar Travessia. A seleção de cultivares adaptadas aos diferentes ambientes permite aumentar a produtividade de forma a garantir maior sustentabilidade à atividade cafeeira e consequentemente do agronegócio café. Portanto, espera-se no final desse projeto a possibilidade de indicação de cultivares resistentes e/ou tolerantes às pragas e doenças com ampla adaptabilidade regional, desempenhando um papel importante na melhoria da qualidade, no aumento da produtividade, diminuição de custos de produção e garantia de maior sustentabilidade do sistema de produção. Linha de Pesquisa 2 Caracterização de genes induzidos durante a interação entre o cafeeiro e Hemileia vastatrix. Estão envolvidas nessa Linha de pesquisa a UFLA, UFV e a EMBRAPA. A análise da expressão de genes envolvidos na interação planta-patógeno favorece o entendimento das moléculas e rotas metabólicas associadas à resposta de suscetibilidade ou defesa da planta ao patógeno, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de cultivares com resistência duradoura. Assim, este Linha de pesquisa propõe a identificação, caracterização e quantificação da expressão de genes induzidos na interação Hemileia vastatrix e cafeeiro. A estratégia consistirá em: i) identificação e quantificação de genes diferencialmente expressos por H. vastatrix ao longo do processo de infecção em hospedeiros susceptível e resistente; ii) 7

10 identificação de genes envolvidos na resistência do cafeeiro à ferrugem por meio de metodologias de genômica e transcriptômica. Após definição de dois genótipos de cafeeiro cultivar Oeiras, um resistente e outro susceptível à raça II de H. vastatrix, e ambos susceptíveis à raça XXXIII, foram definidas duas interações para a reação compatível (Oeiras resistente versus raça XXXIII e Oeiras susceptível versus raça II), e uma para a reação incompatível (Oeiras resistente versus raça II). Destas, foram selecionadas plantas com fenótipos de resistência/susceptibilidade mais evidentes. Nas figuras 2, 3 e 4 são apresentadas diferenças histológicas (penetração e colonização) de reações compatíveis e incompatíveis dos genótipos selecionados. Figura 2. Análise histológica do processo de infecção de H. vastatrix em folhas de cafeeiro Oeiras, às 12, 24, 36 e 48 horas após inoculação. As estruturas do fungo são apontadas pelas setas. A- Apressório. B- Hifa de penetração. C- Hifa de penetração e haustório. D- Célula âncora. 8

11 Figura 3. Análise histológica da colonização intercelular de H. vastatrix em folhas de cafeeiro Oeiras na reação incompatível (A e B) e compatível (C e D), aos 14 dias após inoculação. As setas em A e B mostram a ausência de colonização intercelular, com as estruturas do fungo (hifa de penetração, célula âncora e hifas) restritas ao ponto de infecção. Em C e D são apontadas as hifas nos espaços intercelulares, crescendo em direção ao parênquima paliçádico. Figura 4. Análise histológica do processo de infecção de H. vastatrix em folhas de cafeeiro Oeiras na reação compatível, aos 21 dias após inoculação, ilustrando a presença de haustórios (apontados pelas setas). Após uma extensiva busca na literatura e reuniões em relação às técnicas de sequenciamento de nova geração, optou-se pelo uso do pirosequenciamento com a plataforma 454/Roche, como a técnica mais adequada para esse trabalho. No momento, estão sendo definidos os protocolos de extração de RNA, síntese e normalização de biblioteca de cdna e estabilização do RNA para o envio das bibliotecas para a Roche. 9

12 Outra estratégia a ser utilizada na interação compatível para a construção de bibliotecas de cdna será a análise quantitativa de genes-alvo expressos pelo haustório a partir de folhas de café inoculadas com ferrugem. Após o sequenciamento dos clones, serão selecionados os genes para o estudo quantitativo da expressão, por meio de PCR em Tempo Real. Para identificação de genes envolvidos na resistência do cafeeiro à ferrugem por meio de metodologias de genômica e transcriptômica foram construídas bibliotecas subtrativas a partir do mrna extraído de folhas do cafeeiro Híbrido de Timor CIFC 832/2 (resistente a todas as raças de Hemileia vastatrix identificadas até o momento) e da cultivar Catuaí Vermelho UFV-2144 (susceptível a maioria das raças encontradas no Brasil) inoculadas com H. vastatrix (raça II, isolado monopostular). Foram obtidas oito bibliotecas, constituídas de 684 clones. Parte dos clones positivos (com inserto) foram sequenciados e comparados, por meio do programa BLAST, com a base de dados NR do GenBank. Das bibliotecas obtidas, foram identificados como produtos gênicos a catalase (bibliotecas HT 12F, HT 24F e HT 24R), quitinase (bibliotecas HT 12F e HT 24F), metalotioneína (biblioteca HT 12F), germin-like (biblioteca HT 12R), miraculina (biblioteca HT 12R), entre outros. Utilizando diferentes estratégias de mineração e as duas plataformas de bioinformática do Projeto Brasileiro do Genoma Café foram identificadas sequências potencialmente envolvidas na resistência do cafeeiro a doenças. A partir dessas sequências, primers foram desenhados e testados em genótipos resistentes e susceptíveis à H. vastatrix. Destes, 37 primers amplificaram bandas bem definidas, sendo que 36 foram monomórficos tanto em gel de agarose quanto em poliacrilamida. Estes estão sendo sequenciados, e em seguida, será realizada a verificação para diferenças em nível de nucleotídeos entre os indivíduos resistentes e susceptíveis a ferrugem, visando a identificação de marcadores do tipo SNPs. Dos 37 primers que amplificaram bandas bem definidas apenas um (CARF 005) resultou em fragmentos polimórficos detectáveis diretamente em gel de agarose, sendo possível a diferenciação entre indivíduos resistentes e susceptíveis a ferrugem. O fragmento de 400 pb gerado pela amplificação com o primer CARF 005 corresponde a uma porção do gene de resistência com anotação gi emb CAC disease resistance-like protein de C. arabica (Alvarenga, 2007). O primer CARF 005 está sendo utilizado para realizar o screening de uma biblioteca BAC de C. arabica Híbrido de Timor CIFC 832/2, com clones, obtida pelo Laboratório de Biotecnologia Vegetal do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Os clones foram agrupados em 592 pools, onde cada pool é constituído de 96 clones. Até o momento o processo de screening permitiu reduzir o número de pools para 24, onde cada pool contém 16 clones. Após a identificação do clone, será realizada a extração do 10

13 DNA plasmidial, que posteriormente será sequenciado. A sequência obtida será analisada e caracterizada por programas de bioinformática. Novas análises de bioinformática das ESTs mineradas do Projeto Brasileiro do Genoma Café serão realizadas com o objetivo de identificar genes envolvidos com a resistência do cafeeiro a H. vastatrix. Nessas análises serão investigados os produtos dos genes, seus respectivos domínios conservados, os processos biológicos nos quais estão envolvidos, as funções moleculares que desempenham e a sua provável localização celular. Análises de bioiformática também serão realizadas nessas ESTs visando obter o perfil qualitativo de expressão gênica in silico. Os demais clones das bibliotecas subtrativas serão sequenciados e analisados. A avaliação de redundância será realizada com base na comparação das bibliotecas Forward e Reverse. As mesmas análises de bioinformática usadas nas ESTs do Projeto Brasileiro do Genoma Café serão utilizadas nos clones diferencialmente expressos identificados nas bibliotecas subtrativas. Alguns genes potenciais identificados no banco de dados do Projeto Brasileiro do Genoma Café, nas bibliotecas subtrativas e no pirosequenciamento serão validados por PCR em tempo real. Para isso, cafeeiros submetidos às mesmas condições de cultivo, porém, que apresentem resistência ou suscetibilidade a H. vastatrix, serão clonados por meio de estaquia e conduzidos em casa de vegetação. Serão utilizados genótipos do programa de melhoramento da UFV/EPAMIG. Os cafeeiros serão inoculados com diferentes raças de H. vastatrix, a fim de se obter interação compatível e incompatível, e o RNA coletado em diferentes tempos após a inoculação. Todos os produtos de amplificação dos 36 primers monomórficos em eletroforese serão sequenciados e os SNPs identificados por análise de bioinformática. Os SNPs serão validados em outros genótipos do programa de melhoramento da UFV/EPAMIG. Linha de Pesquisa 3 Mapeamento físico e genético de marcas e localização de QTLs que possam ser utilizados em atividades de seleção assistida e na clonagem posicional de genes. Esta linha de pesquisa integra instituições relevantes de pesquisa com café, como o IAC, IAPAR, EMBRAPA e UFV, com produção de resultados de grande aplicação tecnológica, seja na forma de marcadores ligados a genes de qualidade de bebida ou no desenvolvimento de cafés de bebida superior e, consequentemente, a geração de negócios de maior valor agregado, o que representaria importante contribuição ao agronegócio do café. Esta Linha de pesquisa tem por objetivo realizar o mapeamento físico e genético de híbridos arabustas e de uma população de C. arabica procedentes da Etiópia, bem como o mapeamento físico de C. arabica, com interesse em localizar marcas para características de 11

14 qualidade de bebida e localização de QTLs que possam ser utilizados em atividades de seleção assistida e na clonagem posicional de genes de interesse dos programas de melhoramento do cafeeiro. A pesquisa está sendo desenvolvida em consonância entre IAPAR e IAC. Cada instituição está focada numa população de mapeamento diferente, de onde são obtidos os dados agromorfológicos que as caracterizam. As estratégias de mapeamento genético, bem como os marcadores genéticos adotados para mapeamento são comuns e desenvolvidos por ambos os grupos. O IAPAR desenvolve atividades de construção de bibliotecas de BAC para mapeamento físico e de caracterização bioquímica das plantas e o IAC de caracterização citogenética dos BACs e da população de arabustas. Resultados relevantes (Linha de pesquisa 3) As análises do perfil nutriômico de genótipos selvagens de C. arabica (coleção Etiópia) realizada em folhas e frutos revelou diferença estatisticamente significativa para as médias das concentrações de potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), enxofre (S) e boro (B) nas folhas. Para os nutrientes nos frutos, houve diferença estatisticamente significativa para K, Ca, Mg, S, Cu e Mn. Os estudos do nutrioma em plantas são geralmente conduzidos utilizando-se as folhas. Porém, dentre os nutrientes nos frutos, observou-se uma correlação positiva de K e Mg com o vigor e negativa de B, mostrando a importância da caracterização do nutrioma de frutos de café em conjunto com a de folhas. Analisados em conjunto, os resultados demonstram que há um grande potencial de utilização da análise do perfil de acumulação de nutrientes para identificação de genótipos de café possivelmente mais eficientes no uso de nutrientes. Esses grupos de genótipos de perfil nutriômico contrastante poderão servir como base para identificação de genes envolvidos em diversos processos que governam a utilização de um nutriente (absorção, translocação, assimilação, compartimentalização etc.) assim como apontar quais seriam os nutrientes-alvos para melhoria da performance de cultivares de café em solos de baixa fertilidade. Em relação às atividades de genotipagem para fins de mapeamento genético, estamos completando a seleção de mais 185 marcadores microssatélites através de uma estratégia de pooling dos genótipos estudados, o que vem acelerando o processo de identificação dos polimorfismos. A partir das marcas polimórficas será possivel dar início a estudos relacionados à caracterização da diversidade genética e posteriormente estudos de mapeamento associativo na coleção de C. arabica. Além dos marcadores microssatélites, foram desenvolvidas atividades de obtenção de marcadores AFLP para fins de mapeamento da população F2 de arabusta. Vinte e cinco combinações EcoRI+3 e MseI+3 produziram um total de 174 marcas em 90 indivíduos F2 e seus genitores. 12

15 As atividades de mapeamento físico de seqüências gênicas relacionadas à qualidade de bebida do café através de FISH de alta resolução encontram praticamente no início. Foram realizadas diversas viagens para coleta de ramos florais em condições ideais de desenvolvimento para preparações cromossômicas visando mapeamento com a técnica FISH de alta resolução. Foram feitas cerca de 500 preparações citológicas que serão utilizadas posteriormente na aplicação da técnica FISH. O prosseguimento das análises está na dependência do recebimento, pelo IAC, de um microscópio de fluorescência com acessórios apropriados para análise dos sinais de localização/mapeamento de seqüências com FISH (em processo de importação no CNPq). A caracterização fenotípica das populações F2 e RC1 de arabusta utilizadas para mapeamento genético em relação a características agronômicas de interesse visando à localização de QTLs voltados para a qualidade de bebida (ácidos clorogênicos, cafeínas, folato, fitatos, açúcares, aromas, qualidade de xícara, etc) vem sendo realizada na Estação Experimental de Mococa, SP, que consta com 1100 covas de plantas segregantes. Estas plantas vêm sendo conduzidas com tratos culturais para sua manutenção, como pulverizações, capinas e adubação. Uma avaliação fenotípica das plantas foi feita em março de Já a colheita do ano agrícola 2009/2010 foi iniciada em maio deste ano, devendo prorrogar-se até o mês de agosto. Uma grande variabilidade genética vem sendo observada para praticamente todos os descritores agromorfológicos adotados para a caracterização das plantas, a exemplo dos dados de altura das plantas, produção, vigor e maturação. Os principais produtos a serem gerados são os mapas genéticos e físicos de café com alta saturação para regiões relacionadas com características de qualidade de bebida e a localização física de genes relacionados com qualidade de bebida nos cromossomos do genoma de café. Esses resultados terão interesse imediato para obtenção de novas variedades produtoras de cafés que poderão ser protegidas por lei e de boa qualidade de bebida com agregação de valor às mesmas, bem como ao produto gerado. Linha de Pesquisa 4 Caracterização da variabilidade fenotípica e molecular de populações para fins de mapeamento e localização de QTLs para tolerância à seca e qualidade de bebida. Nesta linha de pesquisa estão envolvidos EMBRAPA, IAC e o Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (INCAPER). Os danos potenciais dos estresses abióticos tais como seca, salinidade e temperaturas extremas, na produção agrícola mundial é alarmante, tendo em vista as constantes alterações climáticas observadas nas últimas décadas, ao redor do globo. Desta forma, a ampliação do conhecimento científico acerca dos fatores genéticos envolvidos na tolerância do cafeeiro a 13

16 esses estresses, com vistas a acelerar o melhoramento genético destas características é prioritário. Os avanços recentes na genômica do cafeeiro tornam possível a realização desses estudos e abrem novas perspectivas de métodos inovadores aplicados aos programas de melhoramento. O grupo de pesquisa envolvido é interdisciplinar, constando de melhoristas genéticos, biologistas moleculares e fisiologistas vegetais e já vem atuando a alguns anos, na temática da tolerância à seca em cafeeiro, contando inclusive com parcerias internacionais. Com o apoio e a integração do INCT-Café, espera-se a consolidação deste grupo de pesquisa na temática de tolerância à seca, além de propiciar as bases para o estabelecimento de um programa de melhoramento genômico em cafeeiro, direcionado para outras características de interesse agronômico. Diante do exposto e com vistas ao desenvolvimento sustentável da cafeicultura, os trabalhos de pesquisa que visam estudar a variabilidade natural e os mecanismos biológicos associados à tolerância à seca, são essenciais. Neste sentido, a presente linha de pesquisa tem como objetivo caracterizar a variabilidade fenotípica e molecular de populações já disponíveis e outras a serem geradas no INCAPER, para fins de mapeamento e localização de QTLs para tolerância à seca e qualidade de bebida. A equipe integrante já vem desenvolvendo pesquisas neste tema, inclusive com a participação em projetos de cooperação internacional. Vale ressaltar o Projeto de Cooperação Técnica iniciado em 2006, com a parceria do CIRAD (Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement - França) aprovado pela Agência Brasileira de Cooperação, intitulado Estudo dos Mecanismos de Tolerância à Seca no Cafeeiro (ABC/DCTEC/DE-I/DEMA/DIPI/053/ETEC-Bras-Fran). Além disto, a equipe executora atua no projeto intitulado Plasticidade Fenotípica das Plantas Perenes ao Estresse Hídrico em Campo, com financiamento francês (ATP Cirad/Ambassade de France au Brésil-DCSUR- BRE-4C5-008). Finalmente, a equipe ainda participa ativamente do International Coffee Genome Sequencing Consortium (Brasil, França, Itália, USA, Canadá, Índia e Austrália), atuando inclusive, na Coordenação do Consórcio Internacional. Resultados relevantes (Linha de Pesquisa 4) A geração das populações segregantes e as caracterizações fisiológicas ainda estão em andamento, tendo em vista que o café é uma planta perene e demanda tempo para o estabelecimento das plantas em campo. Vários genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro já foram identificados e alguns mecanismos fisiológicos elucidados. Estudos de polimorfismos desses genes candidatos em genótipos contrastantes para a tolerância à seca já foram concluídos e análises da variabilidade natural desses genes encontram-se em andamento. Mais importante, espera-se a conclusão do sequenciamento do genoma completo do cafeeiro até 14

17 meados de 2011, provendo a comunidade científica atuante no tema, seqüências de referência para a realização de estudos avançados de melhoramento genômico. Linha de Pesquisa 5 Avaliação genética da qualidade fisiológica de sementes de café. Nesta Linha de Pesquisa estão envolvidos a UFLA, EMBRAPA, INCAPER e IAC. Em sementes de cafeeiro tem sido observado baixo potencial de armazenamento, provavelmente em função da sensibilidade das sementes à dessecação. Em função deste baixo potencial, objetivou-se nesta Linha ampliar o conhecimento sobre a expressão de genes durante o florescimento e o desenvolvimento do fruto e da semente do cafeeiro, bem como avaliar as mudanças ocorridas durante o processo de indução da tolerância à dessecação, secagem e armazenamento, visando correlacioná-las com a qualidade da semente das duas principais espécies de cafeeiro, C. arabica e C. canephora. Sementes de frutos colhidos no estádio cereja foram submetidas a duas taxas de secagem: rápida, em recipiente hermético contendo sílica gel, e lenta, em recipiente hermético contendo soluções salinas até atingirem 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 40% de teores de água e 50% como controle não submetidas à secagem. Amostras de sementes, submetidas à diferentes taxas de secagem, e em diferentes teores de água, foram armazenadas em câmara fria (10ºC) e freezer (-20ºC). A qualidade fisiológica das sementes foi avaliada através da germinação e índice de velocidade de germinação (IVG). Embriões de sementes foram imersas em solução fixativa para avaliação ultra-estrutural em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Para os estudos moleculares vinte genes associados com tolerância/sensibilidade à dessecação de sementes e plantas, descrito em banco de dados foram utilizados para desenhar primers (Tabela 1). Estes primers serão utilizados posteriormente em estudo da expressão gênica durante a secagem e armazenamento das sementes de C. arabica e C. canephora. Resultados relevantes (Linha de Pesquisa 5) A viabilidade de sementes de C. arabica e C. canephora é afetada negativamente por secagem rápida ou lenta, sendo a lenta a menos prejudicial. Pelas imagens de MEV foram observadas diferenças nas sementes com diferentes teores de água, como presença de espaços intercelulares e diminuição da turgidez celular naquelas com baixos teores de água, e presença de glândulas de óleo em sementes com altos teores de água. Após três e seis meses de armazenamento foram observados valores de IVG e germinação superiores em sementes submetidas à secagem rápida e lenta com teores de água entre 15% a 25% e armazenadas em câmara fria para ambas as espécies estudadas. Com relação aos estudos moleculares o trabalho encontra-se em andamento, sendo que os primers desenhados (Tabela 1) serão utilizados, posteriormente, para o estudo da expressão gênica em sementes de C. arabica e C. canephora. 15

18 17 Tabela 1. Genes e primers forward e reverse utilizados para a confecção de primers. Gene Forward Reverse Produto ABI3 NYCTGCARAARGTGTTGAAGC CTATGAAATCMCCYTCTTGGAGTC 277 Ald. Dehyd. RTTYTGTTYGCTGCTGTTGG ACATTCACAATRCCACARTCAC 500 BADH - betaine aldehyde dehydrogenase TGGYTGYTTYTGGACAAATGG MCCYTCACTCTTWGCHGTTG 217 CAT1 catalase 1 YTGGCCTGARGAYATYTTGC GRTCAWACCTYGAAGGGAAG 320 CSD2 - GGTCCWACAACWGTGAATGTTC TTGCCTCWGCYACTCCATC 214 ELIP - thylakoid membrane associated early light induced protein GGAAGRYTRGCYATGATTGG RCATAGCAAWTCTYCCRTTCC 229 (Mn)SOD F GCAGAGCGCCATCAAGTTC CCRAGCCACACCCATCC 210 PER1 Peroxiredoxin RASAAGMGAGGCGTGAAG CCTGMGGGAACATCTTCTTG 452 RD28 Water channel GTGGCATGATCTTCRTCCTTG TGGTCCMACCCAGAADATCC 503 SC514 Lipoxygenase TTGAAYTAAGYYTGCCACATCC CCATCAACAGCATAWGGRTAGTC 499 PM25 - Seed maturation protein GWVACAARCCGGTGGATC RCCACYCCYTCVGCATC 245 SPS1 - Sucrose phosphate syntase GGAGCTTGGWCGKGATTCTG AGTGCACCATCAACAAATTCAG 309 Transketolase ATYGGKCTTGGAGARGATGG GYTTGTTGCCWGWAGAGTTG 259 ABI5 GAGSAITTYYTIGTIARRGCIGG GCIGCIGAYTCICKRTTYTTKATC - shsp Small heat shock protein GAYTGGARRGARACICMIGARGC TRACMGWIARMACICCRTTYTCC - PKABA GGNAGATTYAGYGARGAYGAGG CCRCAWGACCAMACRTCDGC - Lec-1 GCACCNRTDGAYACTMAGCC AAMCCWATCCTYACCCACTC - EM6 CCNGGYGGNACBSGHGG CCDCCYTTNYKYCCCATYTS - ABI3 2 AAGAARMGVATGGCKARRC YCTGCTYTTRTTRTTDGGCC - Prx Peroxiredoxin CCHGGNGAYTTCACNCC ACYTCVTCCATGTTHCKYCC - * Programa utilizado: GeneFisher (

19 Linha de Pesquisa 6 Análises fonológicas, bioquímicas, metabolômicas e proteômicas relacionados à qualidade da bebida do café. Estão envolvidos nessa Linha de pesquisa a UFLA, EMBRAPA, EPAMIG e IAC, além de entidades do setor privado como a COCARIVE (Cooperativa Regional dos Cafeicultores do Vale do Rio Verde LTDA.) e APROCAM (Associação dos Produtores de Café da Mantiqueira). A biotecnologia aplicada à qualidade da bebida do café é uma proposta original e inovadora. Em linhas gerais, a biotecnologia com ênfase no Metaboloma e Proteoma do café objetiva descobrir o maior número possível de metabólitos e proteínas em um extrato, utilizando diversas análises químicas de alta precisão para a obtenção de uma avaliação imparcial do metabolismo e do perfil protéico de um sistema biológico, permitindo elucidar fenômenos biológicos ainda não compreendidos bem como a encontrar novos bioindicadores para descrever e controlar processos, além de novos descritores relacionados aos precursores do sabor e aroma do café. Essas informações também poderão ser usadas na construção de uma base científica e tecnológica para ser aplicada em programas de melhoramento tendo em vista a obtenção de novos materiais com sabores diferenciados. Assim, o objetivo desta linha de pesquisa é desenvolver uma base científica e tecnológica fundamentada dos fenômenos fenológicos, bioquímicos, metabolômicos e proteômicos relacionados à qualidade da bebida do café, considerando as interações do genótipo, ambiente e processamento. Resultados relevantes (Linha de Pesquisa 6) Durantes a primeira etapa do projeto foram realizadas a caracterização e mapeamento do clima, do ambiente físico (solo, relevo, declividade, altitude, exoposição de vertentes) e o uso/ocupação das terras na microrregião da Serra da Mantiqueira (MG e SP); aplicação de questionários para o levantamento dos dados sócio-econômicos e dos sistemas de produção; determinação da qualidade sensorial dos cafés da microrregião safra 2009; estratificação da região em ambientes homogêneos para a definição do plano de amostras da safra 2010; e definição do plano amostral e coleta das amostras na safra As análises, metabolomicas, proteomicas, fisiológicas e bioquímicas estão previstas pra realização partir de agosto de Na segunda etapa, pretende-se criar mapas de florescimento e qualidade da serra da Mantiqueira de Minas; identificar bioindicadores da qualidade e moléculas relacionadas aos precursores de novos sabores e aroma; buscar ferramentas para a criação de políticas públicas que darão suporte a projetos de produção de cafés com identificação geográfica e denominação de origem. 18

20 Linha de Pesquisa 7 Criopreservação a partir de diferentes explantes de cultivares de Coffea ssp. Nesta linha de pesquisa estão envolvidas a UFLA e a EMBRAPA Café. Pesquisas na área de criobiologia estão sendo conduzidas com objetivo de compreender os mecanismos biológicos envolvidos em todas as etapas da conservação de explantes de Coffea obtidos in vitro. Do ponto de vista prático, maiores informações sobre os níveis mínimos admissíveis de viabilidade são necessárias e precisam ser definidas para facilitar a aplicação desta técnica, e nas projeções futuras para a implementação do criobanco de cultivares da espécie. No contexto tecnológico, a criopreservação é uma ferramenta promissora e atual para a preservação da diversidade genética do cafeeiro agregando valor as variedades nacionais e possibilitando o intercâmbio de germoplasma para cruzamentos genéticos. Diante deste contexto e da diversidade de respostas em Coffea para o sucesso da criopreservação, ou mesmo entre diferentes tecidos da mesma espécie, torna relevante o desenvolvimento de pesquisas para o estabelecimento de protocolos de criopreservação, direcionadas a conservação in vitro, limitada sobremaneira pela dificuldade de desenvolvimento de um protocolo de caráter universal. Tradicionalmente, as espécies de Coffea vêm sendo conservadas ex situ, como plantas vivas mantidas em coleções de germoplasma a campo. A manutenção de germoplasma vegetal em coleções no campo apresenta uma série de problemas tais como erosão genética das espécies e variedades devido a pouca adaptação às condições ambientais de alguns locais, pragas e doenças, além de envolverem um grande custo financeiro e de mão de obra. Assim, o desenvolvimento de técnicas alternativas de conservação a longo prazo de recursos genéticos é proposta desta linha de pesquisa levando em consideração a relevância na preservação de cultivares de Coffea com qualidade de bebida. Resultados relevantes (Linha de Pesquisa 7) Foram obtidas sementes de diferentes cultivares (Mundo Novo IAC 379/19, Rubi MG 1192, Topázio, Acaiá IAC , Catuaí Vermelho IAC 144, Catuaí Vermelho IAC 99, Catuaí Amarelo IAC 62 e Acauã) no Setor de Sementes do Departamento de Agricultura da UFLA. Foi estabelecido o protocolo mais viável para assepsia e germinação in vitro das sementes. Para estabelecimento do material in vitro, sementes de todas as cultivares foram cultivadas in vitro para posterior utilização no estabelecimento dos demais explantes. Por meio da utilização de folhas cotiledonares de plantas estabelecidas in vitro foram obtidos embriões somáticos diretos, utilizando diferentes reguladores de crescimento. Os embriões somáticos obtidos através de embriogênese direta foram transferidos para meio de 19

21 germinação (Figura 5 e 6) com objetivo de analisar a taxa de formação de plântulas normais, antes da aplicação das técnicas de criopreservação do material in vitro. a Figura 5. Porcentagem de germinação dos embriões somáticos formados. Figura 6. Formação dos embriões a partir de embriogênese direta (à esquerda) e germinação destes (à direita). Linha de Pesquisa 8 Produção de mudas de café por embriogênese somática, visando a multiplicação comercial de plantas matrizes de café arábica. Estão envolvidos nesta Linha de Pesquisa a UFLA, a EMBRAPA e a Fundação Pro- Café, de Varginha, MG. O objetivo proposto nesta Linha foi desenvolver tecnologia para a produção em larga escala de mudas de café por embriogênese somática, visando à multiplicação comercial de plantas matrizes de café arábica. A embriogênese somática permite também a multiplicação em larga escala de híbridos e de genótipos superiores de café que ainda estão segregando para características de interesse. 20

22 Esta técnica, associada ao melhoramento genético, possibilita reduzir o tempo para lançamento de novas cultivares de café, de aproximadamente 30 anos, para cerca de 10 anos. Na primeira etapa do projeto foi possível a otimização dos protocolos de indução e multiplicação de calos embriogênicos e regeneração de embriões globulares visando a produção de mudas clonais em escala comercial (Figura 7). Vários ensaios estão em andamento para otimizar o desenvolvimento e a maturação de embriões em biorreatores de imersão temporária e a aclimatização de embriões pré-germinados. Os principais resultados desses ensaios são apresentados abaixo. Figura 7. Calos e plântulas de café obtidos por embriogênese somática. Varginha, MG, Ensaio 1. Efeito do sistema de cultivo e do meio de cultura sobre o crescimento de calos embriogênicos de cafeeiro. A multiplicação de calos embriogênicos é uma etapa importante para a produção em larga escala de mudas clonais de café por embriogênese somática, pois geralmente é necessário aumentar a quantidade de calo disponível antes de se iniciar o processo de regeneração de embriões. O crescimento dos calos pode ser realizado mediante dois sistemas de cultivo: meio líquido ou meio gelificado. Neste trabalho comparou-se a produção de calos embriogênicos em meio líquido com a de meio gelificado usando-se dois meios de cultura recomendados para café arábica: CP (Van Boxtel & Berthouly, 1996) e SM (Teixeira et al. 2004). Calos embriogênicos foram obtidos a partir de explantes foliares de progênies de café da população Siriema. Utilizaram-se 200 mg de calo por placa de Petri, com 9 cm de diâmetro e 35 ml de meio de cultura e 200 mg de calo/ erlenmeyer de 125 ml contendo 20 ml de meio. As culturas foram mantidas no escuro e subcultivadas a cada 15 dias e a massa fresca de calos foi determinada aos 51 dias após o início dos tratamentos. O meio líquido foi mantido sob 21

23 agitação de 110 rpm. O ensaio foi instalado em delineamento inteiramente casualizado com 10 repetições por tratamento. Verificou-se que o crescimento em massa fresca de calos foi estatisticamente o mesmo para os meios T3 e SM, tanto no sistema líquido, quanto no gelificado. Todavia, a massa fresca de calos produzida no meio líquido foi significativamente maior que no meio gelificado, com um aumento de massa de calo de 6,7 vezes no meio líquido e, de cerca de 3,0, no meio gelificado. Ensaio 2. Efeito do período de subcultivo sobre a indução de calos embriogênicos em explantes foliares de cafeeiro. A primeira etapa do processo de embriogênese somática é a indução de calos embriogênicos. Em geral, a indução de calos embriogênicos é feita a partir de explantes foliares por um período de quatro a seis meses, utilizando-se dois meios de cultura: um primeiro meio, denominado de meio de condicionamento, em geral, por 20 a 30 dias, e um segundo, o meio de indução de calos embriogênicos friáveis, por quatro a cinco meses. Nesse segundo meio a concentração de 2,4-D pode aumentar (van Boxtel & Berthouly, 1996), diminuir (Teixeira et al. 2004) ou permanecer constante (Rezende, 2008). Neste ensaio avaliou-se o efeito do subcultivo sobre a indução de calos embriogênicos friáveis a partir de explantes foliares de plantas matrizes de café arábica com resistência à ferrugem e ao bicho-mineiro. A indução de calos embriogênicos foi realizada em placas de Petri, contendo nove explantes foliares com cerca de 1 cm 2, usando-se um único meio com 20uM de 2,4-D e 20 um de 2-iP para a produção de calos (Rezende et al. 2008). Foram avaliados três tratamentos: 1) Sem subcultivo, ou seja, os explantes foliares foram plaqueados e mantidos sem subcultivo por seis meses; 2) subcultivo 30 dias após o plaqueamento dos explantes e, 3) subcultivo dos explantes a cada 30 dias. Aos 180 dias após o início dos tratamentos foi avaliada a percentagem de explantes com calos embriogênicos e o peso dos calos, usando-se plantas da população Siriema para a coleta dos explantes. Utilizou-se delineamento experimental inteiramente casualizado, com parcelas constituídas por uma placa de Petri e 40 repetições. Não houve diferença significativa para a percentagem de explantes com calo embriogênico, a qual variou de 47,0 a 66,6%, e nem para peso de calo por explante, variando de 35,7 a 46,5%. Esses resultados indicam que nos primeiros seis meses não há necessidade de fazer subcultivo para a indução de calos embriogênicos a partir de explantes foliares de cafeeiro arábica. 22

24 Ensaio 3. Reguladores de crescimento no desenvolvimento de embriões somáticos de Coffea arabica. Na cultura de tecidos, a adição de reguladores de crescimento ao meio nutritivo é de suma importância. Objetivando avaliar o efeito de IBA e de BAP na fase final de desenvolvimento de embriões somáticos de Coffea arabica, foi conduzido um experimento no Laboratório de Cultura de Tecidos da Fundação Procafé, em Varginha, MG. Os tratamentos constituíram-se de variações no meio de crescimento (PRM) de Teixeira et al. (2004) descritos a seguir: meio PRM (tratamento 1), meio PRM sem BAP (tratamento 2), meio PRM acrescido de 1,47µM de IBA (tratamento 3) e meio PRM sem BAP acrescido de 1,47µM de IBA (tratamento 4). Para as análises estatísticas, foi isolado o efeito do BAP e do IBA e os tratamentos foram arranjados em um esquema fatorial 2 x 2 (presença e ausência de BAP, presença e ausência de IBA). Utilizou-se delineamento experimental inteiramente casualizado, com 20 repetições. Os frascos foram mantidos em sala de crescimento com irradiância, temperatura de 25 C ± 2 C e fotoperíodo de 16 horas. A avaliação do experimento foi realizada três meses após a instalação, por meio do comprimento da parte aérea, porcentagem de plântulas normais e porcentagem de plântulas com raízes. Verificou-se que, no protocolo empregado, não há necessidade da adição de IBA e BAP para a conversão de embriões somáticos em estádio cotiledonar para plântulas de Coffea arabica. Foi avaliada a percentagem de indução de calos embriogênicos em explantes foliares de 12 plantas matrizes a partir de uma coleta de explantes realizada em dezembro de A percentagem de explantes com calos embriogênicos em cada planta matriz foi a seguinte: planta 5/14 (43,2%), 10/6 (44,3%), 19/3 (0,0%), 19/7 (0,0%), 14/32 (1,1%), 8/10 (6,5%), 6/38 (2,6%), 10/1 (57,1%), 11/13 (20,0%), 7/14 33,3%), 13/36/ (2,7%) e 12/6 5,4%). Dois novos ensaios estão em andamento com coletas realizadas em fevereiro e maio de Em 2009 foi instalado um ensaio em Varginha, MG, para avaliação de comportamento dos clones 03, 05, 14 e 18 e, em fevereiro de 2010 outro ensaio foi instalado em Coromandel, MG, região do Cerrado mineiro com clones das plantas matrizes 3, 10/6, 13/36 e 842. Atualmente estão sendo produzidos calos embriogênicos e embriões somáticos a partir de outras nove plantas matrizes visando o plantio dos ensaios restantes. Linha de Pesquisa 9 Otimização de protocolos para transformação genética de Coffea arabica. Nesta Linha de Pesquisa estão envolvidos a UFLA, EMBRAPA-Recursos Genéticos e Biotecnologia, IAC e IAPAR. A propagação de espécies arbóreas como o café requer a formação de mudas de boa qualidade a partir de linhagens produtivas, bem adaptadas, sadias e vigorosas. Atualmente, o 23

25 uso de técnicas de cultura de tecidos tem se apresentado como alternativa para obtenção de mudas de cafeeiros, possibilitando a multiplicação de grande número de plantas, com uniformidade genética, em curto espaço de tempo e em qualquer época do ano. Além disso, o estabelecimento de protocolos eficientes de cultura de tecidos in vitro permite a implementação dos procedimentos de transformação genética, que visam à obtenção de plantas mais resistentes a pragas e doenças, bem como mais produtivas e com melhor qualidade de bebida. Dentre as técnicas de cultura de tecidos, a micropropagação via embriogênese somática tem apresentado excelentes resultados para inúmeras espécies. No entanto, essa técnica é cultivar dependente, o que a torna dispendiosa. Muitos fatores são limitantes na cultura in vitro do cafeeiro, entres eles, luminosidade, umidade do ar, temperatura, equilíbrio hormonal, aclimatização, etc. Os trabalhos pioneiros com cultura de tecidos de café foram publicados por Staristsky, em 1970, que teve êxito na indução de calos e na obtenção de embriões a partir de explantes foliares de C. canephora e por Herman e Hass, em 1975, a partir de explantes de C. arabica. Depois disso, muitos trabalhos foram realizados, entre os quais, o desenvolvimento de protocolos eficientes por Bertholy e Etienne (2000) e Teixeira et al (2004), os quais também possibilitaram o início da transformação genética da espécie. Entretanto, apesar dos significantes avanços nos últimos 15 anos, a transformação do café é ainda muito trabalhosa, e por conta disso, somente alguns genes foram transferidos para genótipos de café. E com o desenvolvimento recente da análise genômica do cafeeiro, numerosos genes envolvidos em processos biológicos agronomicamente importantes, serão identificados e poderão ser utilizados nos processos de transformação (Lashermes et al., 2008). Diante do exposto, o objetivo desta Linha de Pesquisa é desenvolver protocolos de cultura de tecidos para a obtenção de cultivares geneticamente modificados com genes prospectados do banco de dados do genoma Café (GenoCafé) e de outras espécies. Neste primeiro momento, os objetivos dos trabalhos desenvolvidos no Laboratório Central de Biologia Molecular (LCBM) da UFLA foram testar e modificar protocolos de regeneração in vitro em quatros cultivares de C. arabica, via embriogênese somática e a obtenção e multiplicação de células em suspensão desses cultivares. Resultados relevantes (Linha de Pesquisa 9) a) Obtenção de calos embriogênicos Diversos experimentos para a obtenção de calos embriogênicos foram e estão sendo conduzidos com o intuito de se avaliar qual dos protocolos melhor se adapta às cultivares e condições in vitro. 24

26 Dois experimentos, em andamento, têm o objetivo de avaliar a formação de calos embriogênicos a partir de folhas provenientes de plantas in vitro e do viveiro. Por avaliação quantitativa e qualitativa dos calos será possível preconizar as melhores condições de obtenção e desenvolvimento de calos embriogênicos para as cultivares Catiguá e Bourbon. Na Figura 8 é possível observar como os calos vêm sendo classificados quanto ao seu tamanho. Foram estabelecidas diferentes porcentagem de ocupação dos calos na superfície da folha: 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% e 95%. Dessa forma, a cada 30 dias os calos são classificados e descritos quanto ao seu aspecto. No primeiro mês de desenvolvimento, visualmente, é possível notar a diferença morfológica dos calos provenientes dos diferentes explantes. Calos originados em folhas vindas de plantas estabelecidas em viveiro são maiores, esbranquiçados e com aspecto aquoso (Figura 9 à esquerda), os calos das plantas in vitro são menores, mais compactos e com tonalidade marrom (Figura 9 à direita). Figura 8. Calos avaliados de acordo com o tamanho de desenvolvimento. Figura 9. Explante foliar com calo de aspecto aquoso branco (à esquerda) e calo compacto e marrom (à direita). 25

27 Levando-se em conta que as condições para obtenção de calos embriogênicos descritas na literatura são diversas, outra avaliação que está em andamento é a do desenvolvimento de calos embriogênicos em meio MS sem suplementação hormonal após a indução primária, como descrita nos protocolos testados. Esse trabalho tem como hipótese que a ausência de hormônios vegetais também pode favorecer o desenvolvimento de calos embriogênicos por estresse. Cada explante foliar está sendo avaliado quanto ao aspecto e tamanho (porcentagem / Score). Na Figura 10, pode-se notar a presença de calos com os mais diferentes aspectos, desde os mais desenvolvidos de tonalidade branca e aquosos (seta verde) aos menores de cor marrom e compactos (seta amarela). Figura 10. Explantes foliares com calos de diferentes aspectos; seta amarela: calo marrom compacto e seta verde: calo branco aquoso. b) Obtenção de células em suspensão Calos embriogênicos obtidos a partir de folhas das quatro cultivares foram inoculados em meio de multiplicação líquido descrito nos protocolos. Inicialmente, setores embriogênicos (região dos calos que apresentam cor amarela e são friáveis) foram separados e colocados em frascos erlenmeyer de 10 ml contendo 3 ml de meio. Ao longo de uma semana, todos os dias, foram analisados e células mortas ou outras suspensões não desejáveis foram retiradas. Após esse período, o meio com as células em suspensão foi renovado a cada sete dias e repicado eventualmente para dar início a uma nova suspensão. Até o momento já foram obtidas células em suspensão de todas as cultivares de interesse, Catiguá, Catuaí, Catucaí e Bourbon (Figura 11). Em seguida o objetivo passou a ser estabelecer a regeneração de plantas in vitro de C. arabica cv. Catiguá a partir de diferentes concentrações de células em suspensão em dois 26

28 diferentes meios de cultura (MS suplementado com BAP e ANA+BAP). Avaliou-se nesse trabalho o número de embriões com presença/ausência de radícula. A B C D Figura 11. Células em suspensão. A) Catuaí, B) Catucaí, C) Catiguá e D) Bourbon. Outro trabalho concluído estabeleceu a melhor condição para multiplicação de células em suspensão (CS) de C. arabica cv. Catiguá. Neste experimento, diferentes densidades iniciais de CS, 1g/L, 4g/L, 8g/L e 12g/L, foram inoculadas em dois diferentes meios MS/2 líquido suplementado com: BAP (meio MT3) e 2,4-D, IBA e 2-iP (meio MM). Para tanto, foram utilizados frascos de erlenmeyer 125 ml com 50 ml de meio, incubado a temperatura ambiente em agitador orbital (100 rpm), no escuro. A multiplicação celular foi avaliada por medição do volume das CS utilizando-se tubos graduados estéreis ao final de 30 e 45 dias de cultivo. O meio MM apresentou multiplicação de células em suspensão cerca de duas vezes maior que o meio MT3 em todas as densidades inicias, exceto 1g/L. Aos 30 dias de cultivo, as CS apresentaram maior multiplicação nas densidades de 8g/L e 12g/L em ambos os meios. A maior multiplicação ocorreu na densidade inicial de 4g/L em meio MM, aos 45 dias após a inoculação. Células em suspensão com mais de seis meses de inoculação (Figura 12 à esquerda) e que não vinham tendo seu meio renovado foram inoculadas em meio de regeneração a fim de se analisar seu potencial embriogênico. Ao final de dois meses, como preconizado pelos protocolos seguidos, não foi visualizado nenhuma formação de embriões (Figura 12 à direita). Figura 12. Células em suspensão inoculadas e sem renovação de meio há mais de 6 meses (à esquerda) e células em suspensão em meio de regeneração após dois meses de inoculação. Nota-se a ausência de embriões (à direita). 27

29 Diante desse resultado, foi montado um experimento que visa à renovação do potencial embriogênico dessas células a partir da renovação periódica do meio líquido e os resultados serão analisados com sucessivas inoculações de células em meio de regeneração, análise da expressão do gene SERK e análise morfológica das mesmas. c) Regeneração in vitro de plantas Com o intuito de se conhecer qual a melhor condição para se obter embriões, calos embriogênicos das cultivares Catuaí, Catucaí e Catiguá foram submetidos aos dois diferentes protocolos, em meio líquido (Figura 13 à esquerda) e sólido (Figura 13 à direita). Esse experimento encontra-se em andamento, e ao final do segundo mês de regeneração os embriões serão contados, qualificados quanto ao seu aspecto de desenvolvimento em globular, coração e torpedo. Além disso, alguns embriões, em diferentes estágios de desenvolvimento, serão analisados histologicamente. Em seguida, os demais embriões serão colocados nos respectivos meios de maturação e germinação a fim de se verificar o número e a qualidade das plântulas formadas. Figura 13. Calos embriogênicos em meio de regeneração líquido (à esquerda) e sólido (à direita). As setas mostram a formação de alguns embriões após 30 dias de inoculação. d) Crescimento e desenvolvimento de plantas Até o presente momento, foram obtidas plantas, via embriogênese somática indireta, das cultivares Catiguá (Figura 14 A), Bourbon (Figura 14 B) e Catucaí (Figura 14 C), as quais são mantidas em frascos do tipo majenta contendo meio MS suplementado com BAP/ANA ou ANA. As plantas são repicadas constantemente e transferidas a cada 21 dias para meio novo. Trabalhos que avaliaram a influência do balanço hormonal sobre o crescimento enraizamento das plantas cv Catiguá foram conduzidos e estão em fase final de avaliação. Neste experimento, três meios foram testados, dois MS e um DKW, constituídos por diferentes 28

30 concentrações de hormônios vegetais. Como o balanço hormonal influencia no enraizamento, plantas de C. arabica cv. Catiguá foram inoculadas sem raiz em diferentes meios com concentrações variáveis de auxina e citocinina, com o objetivo de avaliar qual combinação favorece o enraizamento. A B C Figura 14. Plantas in vitro de C. arabica cv. Catiguá (A), C. arabica cv. Bourbon (B) e C. arabica cv. Catiguá (C). e) Análise morfológica dos calos obtidos Calos provenientes de explantes foliares de C. arabica (cv. Catiguá) foram analisados quanto à viabilidade e o potencial embriogênico. Para estudo da viabilidade celular e do potencial embriogênico empregou-se os testes do cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio (CTT) e de dupla coloração com carmim-acético e azul-de-evans, respectivamente. Estudos da morfologia celular foram realizados através de microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. Foram obtidos tipicamente dois tipos de calos morfologicamente distintos: calo amarelo e friável e calo transparente e aquoso. O calo amarelo e friável apresentou maior viabilidade celular e maior potencial embriogênico (Figura 15). A B C D Figura 15. (A) e (B) Massas celulares do calo amarelo e friável corados com carmim-acético e azul-de-evans; (C) e (D) Massas celulares do calo transparente e aquoso coradas com os referidos corantes. 29

31 Através de microscopia eletrônica de varredura foi possível observar características embriogênicas nas células do calo amarelo friável, que se apresentaram pequenas e isodiamétricas, enquanto que no calo transparente e aquoso verificou-se a presença de células alongadas (Figura 16). A B C D Figura 16. Eletromicrografia de varredura de células obtidas de calos. (A) Calo amarelo e friável dispostos em cachos. (B) Calo amarelo e friável com formato arredondado. (C) e (D) Calo transparente e aquoso com formato alongado. Linha de Pesquisa 10 Métodos alternativos na indução de resistência contra doenças, qualidade do café e tratamento de águas residuárias. Nesta Linha de pesquisa estão envolvidos a UFLA e a EPAMIG. No desenvolvimento da pesquisa tem participado pesquisadores e professores, sendo que no caso dos professores da UFLA, o projeto tem contado com contribuição de representantes de vários Departamentos entre eles Fitopatologia, Ciência dos Alimentos e Microbiologia. Com o objetivo de avaliar bioindutores de resistência, caracterizar os mecanismos bioquímicos e moleculares de defesa ativados em plantas de cafeeiro contra patógenos como H. vastatrix, agente causal da ferrugem do cafeeiro, foram desenvolvidas pesquisas para a determinação de formulações, concentração, aditivos e estabilidade destes produtos. Nesta primeira etapa do projeto, duas biofábricas foram pré-incubadas no Sistema de Incubadoras da UFLA, através do Programa de Incentivo à Inovação, P.I.I., buscam desenvolver soluções tecnológicas que possibilitem a inserção desses produtos no mercado. A primeira tecnologia consistiu na produção de diferentes formulações a base de extratos de folhas e cascas de frutos de café, capazes de induzir resistência em plantas. Estas formulações estimulam o sistema de defesa de vários cultivos e contra vários patógenos. Após vários experimentos no Brasil e no exterior, a eficácia destas formulações foi comprovada contra doenças fúngicas e bacterianas em vários cultivos, conforme detalhado nas Figuras 17, 18 e

32 A segunda tecnologia em desenvolvimento no INCT do Café, refere-se a formulações produzidas a partir do fungo Cladosporium cladosporioides, as quais melhoram a qualidade da bebida do café (Figura 20). Microrganismos têm sido selecionados com potencial para bioproteção da qualidade, produtores de enzimas que aceleram a degradação da mucilagem, microrganismos que adsorvem metais reduzindo o impacto da larga utilização de fungicidas à base de cobre na cafeicultura e microrganismos com potencial para a solubilização de fosfatos. É importante esclarecer que a mesma estrutura será utilizada para a continuidade de pesquisas em andamento visando o desenvolvimento de biofiltros para tratamento de água residuárias resultantes do processamento do café e uma formulação de agente biológico capaz de solubilizar fosfato com base em microrganismos já selecionados para tais finalidades. 31

33 Figura 17. Controle da ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix). Vista das parcelas pulverizadas com fungicida triazol (A), cúprico (B) e com a formulação baseada em extrato de folhas de café (C). 1 após a colheita 2009 e 2 antes da colheita Lavras, MG,

34 Figura 18. Controle do oídio (Oidium sp.) em eucalipto. Plantas pulverizadas com formulação baseada em extrato de folhas de café (1) e testemunha pulverizada com água (2). Campo Belo, MG, Figura 19. Controle da mancha bacteriana em tomateiro (Xanthomonas vesicatoria). Plantas pulverizadas com formulação baseada em extrato de folhas de café (A), comparado com acibenzolar-s-metil (Bion ) (B) e testemunha (C). Resultados obtidos no Brasil e na Texas Tech University, EUA,

35 Figura 20. Frutos de café pré-colonizados pelo agente de controle biológico Cladosporium cladosporioides. Lavras, MG, Linha de Pesquisa 11 Manejo integrado das principais pragas do cafeeiro visando a preservação do meio ambiente. Integram esta Linha de Pesquisa pesquisadores da EPAMIG e da EMBRAPA Café. A linha de pesquisa 11 tem como objetivo o estudo de métodos e associações de métodos de controle das principais pragas do cafeeiro, tendo em vista a eficiência, a economia e a preservação do meio ambiente. Dentre as pragas do cafeeiro, as mais limitantes são: a broca-do-café (Hypothenemus hampei), prejudicial em todos estádios do fruto; o bicho-mineiro (Leucoptera coffeella), que causa drásticas desfolhas em viveiro de mudas e nas lavouras em produção; a cigarra-docafeeiro (Quesada gigas), que suga a seiva das plantas através das raízes; as cochonilhas da raíz e das folhas que também sugam a seiva das plantas, depalperando-as; e os ácaros-praga, que se alimentam da seiva da planta e podem também transmitir viroses. De modo geral, todas as referidas pragas causam grandes prejuízos diretos ou indiretos à cultura do cafeeiro se não controladas de forma eficiente. Neste primeiro ano do projeto foram realizados experimentos com o intuito de avaliar a influência de quebra-ventos e da cobertura vegetal na incidência de pragas e seus inimigos naturais, avaliar a influência da diversidade de ácaros entre fragmentos florestais de vegetação nativa adjacentes as lavouras cafeeiras, e avaliar a eficiência de produtos fitossanitários e extratos vegetais no controle das pragas do cafeeiro. Alguns destes experimentos ainda estão sendo conduzidos e/ou estão na fase de identificação e quantificação dos insetos. No entanto, são apresentados os resultados parciais. Resultados relevantes (Linha de Pesquisa 11) Em experimento realizado na Fazenda Experimental da EPAMIG em São Sebastião do Paraíso, MG, ainda em andamento, foi avaliada a influência de quebra-ventos sobre a incidência 34

36 de pragas e seus inimigos naturais. Neste, observou-se que aléias de leguminosas arbóreas favorecem a população de ácaros predadores de ácaros-praga nos cafeeiros. As coletas já foram finalizadas, mas a identificação e quantificação dos ácaros estão em andamento. Outros experimentos foram conduzidos no município de Coqueiral e Alfenas, MG. Os trabalhos com controle químico da broca-do-café (H. hampei) mostraram que o produto cyantraniliprole, do grupo das diamidas antranílicas, é altamente eficiente, igualando-se ao padrão de controle endosulfan (hoje com restrições de uso), sendo, portanto, um candidato com potencial para substituição do endosulfan, o que há muito tempo tem sido pesquisado sem sucesso. O mesmo produto, pesquisado sob o ponto de vista de seletividade a ácaros predadores (Phytoseiidae), mostrou apresentar seletividade fisiológica, e que, portanto, sendo utilizado não causará desequilíbrio biológico. Já inseticidas do grupo dos neonicotinóides, com seletividade ecológica, ou seja, aplicados no solo sem afetar outros organismos benéficos existentes na parte aérea, apresentaram sucesso no controle da cigarra-do-cafeeiro (Q. gigas) e bicho-mineiro (L. coffeella). Outros resultados relevantes foram obtidos com o estudo de inseticidas e acaricidas botânicos, ou seja, extrato de plantas, que podem ser preparados por pequenos produtores, reduzindo o custo de controle de pragas. Para a obtenção destes resultados, três experimentos foram realizados. No primeiro, o óleo de Azadirachta indica L. e os extratos de folhas de Annona squamosa L., Capsicum baccatum e Agave Americana L. (concentração de 4,0% peso/volume) apresentaram seletividade ao ácaro predador Amblyseius herbicolus, o que possibilita a implementação destes em programas de MIP em plantações de café, controlando a praga e preservando os inimigos naturais. No segundo experimento verificou-se que onze extratos aquosos mostraram eficiência acima de 60% no controle do ácaro-praga O. ilicis, são eles: Albezia polycephala (100%), Mentha sativa (94%), Aloe vera (88%), Helianthus annus (88%), Thymus vulgares (88%), Pneumus boldus (81%), Persea americana (81%), Ruta graveolens (69%), Ricinus communis (63%), Dieffenbachia picta (63%). No terceiro experimento avaliou-se a eficiência do extrato de nim (A. indica) e enxofre no controle do ácaro-praga O. ilicis. Neste, verificou-se que o óleo de nim mais enxofre e enxofre mostraram 100% de eficiência, seguidos do óleo de nim (92%) e dos extratos de folhas de nim na concentração de 2, 4 e 6% mais enxofre apresentaram 92%, 100% e 97% de eficiência, respectivamente. Os extratos de folhas de nim na concentração de 2, 4 e 6% apresentaram eficiências de 32%, 57% e 73%, respectivamente. Linha de Pesquisa 12 - Dinâmica e o destino de pesticidas e metais pesados, e a emissão de CO 2 e N 2 O em solos cultivados com café após a adição de lodo de esgoto. Participam desta linha de pesquisa a UFLA e a EPAMIG. 35

37 O objetivo desta Linha de Pesquisa foi avaliar a dinâmica e o destino de pesticidas e metais pesados, bem como a emissão de CO 2 e N 2 O em solos cultivados com café após a adição de lodo de esgoto, visto que a aplicação de lodo de esgoto promove considerável incremento de matéria orgânica ao solo, sendo que uma fração dessa matéria orgânica é solúvel e se movimenta juntamente com a água de percolação. O destino de herbicidas e inseticidas aplicados ao solo, após o efeito desejado no controle de plantas daninhas ou pragas, tem sido amplamente estudado para diferentes culturas. Neste contexto, destaque tem sido dado ao potencial de contaminação de camadas mais profundas do solo e do lençol freático por esses produtos. Da mesma forma, grande enfoque tem sido dado à aplicação de lodo de esgoto no solo e à preocupação com o movimento de metais pesados, geralmente associados à matéria orgânica dissolvida proveniente desse material. No Brasil, alguns relatos apontam o potencial de contaminação de solo e água pelo inseticida tiametoxam, o efeito residual e contaminação pelo herbicida fomesafen e a contaminação por constituintes de lodo de esgoto. O uso de pesticidas na cultura do café, em muitas situações, pode estar contribuindo significativamente para contaminar o solo e a água. Com relação ao lodo de esgoto, a lavoura teria o benefício do aporte de nitrogênio e outros nutrientes, mas, por outro lado, pode ser fonte de poluição pelos metais que normalmente estão presentes no lodo. Análises iniciais têm apontado o risco de contaminação por cromo. Dessa forma, sorção, dessorção e deslocamento miscível de pesticidas utilizados na lavoura cafeeira e dos metais chumbo, cádmio, zinco, cromo e cobre presentes no lodo contribuirão para o ganho de conhecimento e eventual recomendação de uso, de forma a minimizar os impactos no ambiente. Pelas atividades realizadas até o momento, verificou-se que a aplicação de lodo de esgoto na cultura do café não teve influência no crescimento em altura e diâmetro de mudas até o momento. As análises iniciais realizadas na água percolada detectaram a presença de cromo. Já as análises da concentração de tiametoxam na água percolada estão em andamento. Amostras do efluente das colunas estão armazenadas em câmara fria, aguardando as análises de teores de cátions, ânions e material orgânico dissolvido no lixiviado das colunas. Esses resultados são preliminares. Portanto, nenhuma conclusão poderá ser tirada dos mesmos antes de se analisar o restante das análises químicas e físicas do solo. Linha de Pesquisa 13 - Propriedades físico-hídricas e químicas do solo e modelos de capacidade de suporte de carga do solo sob sistemas de controle do mato em cafezais. Nesta linha de pesquisa estão envolvidas a EPAMIG e a UFLA. O controle de plantas invasoras é uma das práticas de manejo mais intensivas na condução de lavouras cafeeiras, podendo causar impacto no ambiente. Alterações estruturais, 36

38 causadas pelo manejo inadequado de plantas invasoras, tornam o cafeeiro mais suscetível aos veranicos, por alterarem o fluxo de água, promovendo inadequada aeração e deficiência nutricional, causando redução do crescimento radicular e potencializando a erosão do solo. Vários estudos sobre degradação da estrutura dos solos, do ponto de vista de física do solo, utilizam principalmente as seguintes propriedades físicas: densidade do solo, porosidade total, resistência mecânica e condutividade como indicadoras de degradação da estrutura do solo. Apesar dos avanços obtidos nestes estudos, Dias Junior (1995) mostrou que nem toda variação na densidade do solo e, por conseguinte na porosidade total, poderiam ser consideradas como degradação da estrutura do solo, visto que quando estas deformações ocorrem na curva de compressão secundária, elas são elásticas e recuperáveis não sendo, portanto qualquer variação destas propriedades adequadas para caracterizar a degradação da estrutura do solo. Assim sendo, a degradação da estrutura do solo só passaria a acontecer quando as variações destas propriedades ocorressem na região de deformações plásticas e não recuperáveis. A partir de 1995, principalmente no Brasil, estudos sobre compactação do solo, que é a forma mais degenerativa da estrutura do solo, passaram a considerar a pressão de preconsolidação para separar as deformações recuperáveis das não recuperáveis e, portanto delimitar o ponto onde a estrutura do solo passa a sofrer degradação não recuperável. Considerando que a degradação da estrutura do solo pode ocorrer em qualquer condição de umidade e que a pressão de preconsolidação é função da variação da umidade do solo (Modelos de Capacidade de Suporte de Carga) ficou evidente então, que estudos de monitoramento da degradação física da estrutura do solo precisavam de uma propriedade que considerasse estas deformações. Assim sendo, vislumbrou-se a possibilidade do uso destes modelos em estudos de monitoramento da degradação estrutural devido aos diferentes sistemas de controle de plantas invasoras na cultura do cafeeiro. Neste contexto, este estudo foi realizado com os objetivos de: i) avaliar como diferentes manejos de plantas invasoras em uma lavoura cafeeira influenciam a capacidade de suporte de carga do solo em relação ao solo sob mata nativa; ii) desenvolver modelos de capacidade de suporte de carga para um Latossolo Vermelho distroférrico sob mata nativa e cultivado com cafeeiros, submetido a diferentes sistemas de manejo de plantas invasoras, na entrelinha ; iii) determinar a tensão máxima aplicada ao solo pelo trator cafeeiro Valmet 68. A tensão máxima exercida pelo trator cafeeiro Valmet 68 foi de 220 kpa, para o pneu dianteiro 6-16, na pressão de inflação de 172 kpa e de 120 a 140 kpa para o pneu traseiro 12.4 R28 na pressão de inflação de 124 kpa. As tensões exercidas por este trator podem causar compactação severa do solo até as profundidades de cm para os manejos sem revolvimento do solo sem capina, herbicida de pós-emergência, roçadeira e herbicida de préemergência e até as profundidades de cm, para os manejos com revolvimento do solo 37

39 capina manual, enxada rotativa e grade de discos. O solo sob mata apresentou menor capacidade de suporte de carga nas três profundidades em relação ao solo cultivado com cafeeiros. No centro das entrelinhas dos cafeeiros, os manejos grade de discos e herbicida de pré-emergência proporcionam elevados valores de capacidade de suporte de carga, na profundidade de 0-3 cm, indicando degradação da estrutura do solo nesta profundidade. Linha de Pesquisa 14 - Manejo diferenciado do fósforo em lavouras cafeeiras. Participam desta linha de pesquisa a UFLA e a EPAMIG. O objetivo desta Linha de Pesquisa foi investigar os efeitos do manejo diferenciado do fósforo em lavouras cafeeiras visando proporcionar um melhor desenvolvimento, enchimento dos grãos, crescimento de novos ramos e internódios para a próxima safra e redução da bienalidade da planta. Através de viagens a Luis Eduardo Magalhães-BA, Planaltina-DF e Cabo Verde-MG foram realizados levantamentos do histórico das áreas escolhidas para o estudo, anotando-se os tratos culturais, adubações anteriores, idade das plantas, espaçamentos, cultivares, dados climáticos, produções anteriores, etc. Posteriormente foram feitas amostragens de solo e material vegetal (folhas e grãos de café) para serem realizadas análises diversas em laboratório com a finalidade de investigar o comportamento da dinâmica do nutriente fósforo no sistema solo-planta. Além de um experimento com doses de fósforo na Embrapa Cerrados (Planaltina- DF) num Latossolo Vermelho muito argiloso foram escolhidas duas áreas sob manejo irrigado num Latossolo Vemelho-Amarelo textura média em Luis Eduardo Magalhães-BA, noroeste baiano e duas áreas sob sequeiro num Argissolo Vermelho argiloso em Cabo Verde-MG, sul de Minas, sendo que todas as áreas vêm recebendo adubações fosfatadas pesadas a mais de três anos consecutivos. Até o presente momento foram feitas amostragens de solo nos anos de 2009 e 2010 antes da adubação fosfatada para o próximo ciclo de cultivo. Também foram realizadas amostragens de material vegetal em dois períodos, no momento da colheita e no estádio de enchimento de grãos (folhas), no ano de 2009 e na colheita do ano de 2010 (folhas e grãos de café). Todas as amostras estão devidamente acondicionadas nos laboratórios do Departamento de Ciências do Solo da UFLA para posterior análise. Perspectivas e futuros desdobramentos- Linha de Pesquisa 14 Um melhor conhecimento dos compartimentos de fósforo, bem como sua dinâmica, aliado à determinação de alguns atributos do solo em áreas de cafeicultura já implantadas e a sua interação avaliada por diferentes extratores poderiam auxiliar o entendimento dos processos 38

40 envolvidos na dinâmica do nutriente. Esses conhecimentos auxiliariam na tomada de decisão quanto ao melhor manejo da adubação fosfatada para a cultura do cafeeiro. Após serem realizadas todas as análises de laboratório e tabulados os dados espera-se esclarecer o comportamento do fósforo no sistema agrícola após a aplicação de doses elevadas do nutriente, permitindo inferir sua permanência no solo em formas mais ou menos lábeis, bem como sua absorção e exportação pelo cafeeiro. Dessa maneira espera-se obter informações, a curto prazo, dos efeitos da aplicação de doses elevadas de fósforo tanto em relação aos atributos do solo quanto em relação à produtividade e bienalidade de cafeeiros e também aprimorar as recomendações de doses de fósforo para a cultura do cafeeiro com o objetivo de se obter maiores produtividades e minimizar a bienalidade da cultura. Linha de Pesquisa 15 - Plataforma tecnológica para comercialização online de café (ecafebr). Participam desta linha de pesquisa os pesquisadores da UFLA, que têm como objetivo desenvolver uma plataforma tecnológica para viabilizar o comércio online de café, através de um plano de negócios vislumbrando uma estrutura de certificação de produto que gere credibilidade ao sistema. A comercialização do café, a última operação da produção para o cafeicultor, é uma operação arriscada, dada a sua complexidade em termos da incompreensão do sistema de preços na hora da venda, e dos vários atores envolvidos neste processo. Devido a esta complexidade do mercado de café, é importante que se crie um mecanismo ou um ambiente de negociação que possa trazer transparência, confiabilidade e visibilidade para ambas as pontas deste processo: o comprador e o vendedor. Neste relatório é apresentada a Plataforma de Comercialização Online de Café - ecafé Brasil (Figura 21). Trata-se de uma iniciativa ousada de incorporar os avanços da tecnologia da informação em um setor tradicional, onde as questões de confiança mútua entre os compradores e vendedores já imperam desde longa data. A lógica desta arquitetura está pautada na inovação de valores. Inovação, por se tratar do uso de ferramentas da tecnologia da informação num setor de uma forma que ainda não existe; e criação de valores, pois a idéia não é replicar um valor já existente, mas sim criar uma proposição de valor totalmente nova, o que irá conferir ao processo de comercialização de café uma maior rapidez, liquidez, visibilidade e capilaridade de mercado, além de todo o conjunto de informações disponíveis por meio do ambiente web. 39

41 Figura 21. Plataforma de Comercialização Online de Café - ecafé Brasil. A principal produção desta linha de pesquisa é a criação de uma plataforma de comércio eletrônico de café ecafé Brasil, sistema computacional desenvolvido em Web 2.0 que será utilizado para gerenciar a rede de comercialização física dos cafés do Brasil (Coffee Trading Network) (Figura 22). O sistema esta em processo de registro no INPI. Como impacto tecnológico o sistema viabilizará a inserção dos cafés brasileiros no mercado mundial via rede web. Dessa forma, como resultado a tecnologia será utilizada para ampliar os mercados para o produto brasileiro. Do lado econômico, a contribuição é centrada no aumento de competitividade dos produtores brasileiros, que poderão mostrar os seus cafés para potenciais compradores do mundo inteiro. Dessa forma, os ganhos estão associados à melhoria na logística e à redução dos custos de transação, uma vez que o número de intermediários pode ser reduzido; e também na obtenção de melhores preços na venda. Deve-se ressaltar que o sistema irá contribuir sobremaneira com a ampliação dos mercados para os cafés diferenciados (certificados, especiais) que atualmente sofrem com a falta de visibilidade e consequentemente não são valorizados como deveriam. 40

42 Figura 22. Rede de comercialização física dos cafés do Brasil (Coffee Trading Network). Organização estrutural e lógica da arquitetura da plataforma Carta convite para o cadastramento no ecafé Brasil O cadastro é a porta de entrada para o uso da plataforma. O mesmo ocorrerá mediante uma carta convite enviada ao endereço de , visando, em primeira instância dar credibilidade ao sistema, adotando-se como seus usuários iniciais aqueles já atuantes na cadeia agroindustrial do café (Figura 23). Objetiva-se com isto, não meramente adotar uma medida de seleção dos novos entrantes na plataforma, mas sim evitar que a plataforma seja povoada por usuários aventureiros sem experiência neste mercado, tanto na ponta compradora como na ponta vendedora da plataforma. Os administradores do sistema são responsáveis por verificar a manutenção de novos entrantes através do procedimento de convites. Assim, o procedimento de convites seguirá a seguinte lógica: Categorias de cadastro dos usuários na ecafé Brasil Há três categorias de cadastro para possíveis usuários na ecafé Brasil: 1 - Categoria Negociador ( Vendedores/Compradores ) de café: estes usuários serão a base de entrada e saída dos produtos na plataforma. Estes usuários podem ser classificados como sendo os Produtores Rurais, as Cooperativas, as Corretoras, os Exportadores, as Indústrias de transformação do café e demais agentes de transação. 41

43 2 - O laboratório de análise de qualidade: os laboratórios de análise de qualidade do café terão acesso à plataforma através de um cadastro diferenciado para postar o resultado da análise das amostras. 3 - As transportadoras: as transportadoras fornecerão serviços de transporte às negociações de café que já foram devidamente encerradas na plataforma. As transportadoras terão outro cadastrado diferenciado das demais bases de entrada, sendo também convidadas a princípio, pelos próprios usuários através de um em nome da plataforma. Uma vez inseridas no sistema, as transportadoras ficarão disponíveis aos negociadores que, através do acesso à transportadora, poderão entrar em contato e solicitar o serviço. 4 - Administrador do sistema: o administrador terá acesso a todos os módulos do sistema, permitindo que, a qualquer momento, possa avaliar o andamento das transações, gerar relatórios diversos e levantar a estatística da utilização da plataforma como lhe convier. Figura 23. Carta convite para o cadastramento no ecafé Brasil (superior) e categorias de cadastro dos usuários (inferior). 42

44 Estas 4 categorias formarão a base da plataforma. As categorias negociador e transportadora são definidas no momento do envio do convite (Figura 23). O cadastro dos usuários Negociadores - Vendedores/Compradores Uma vez enviada a carta-convite por meio de s, o cadastro consistirá no preenchimento de alguns campos com informações simples. O usuário poderá se cadastrar como pessoa física ou pessoa jurídica (Figura 24). Figura 24. Cadastro dos usuários Negociadores - Vendedores/Compradores. O cadastro dos usuários Laboratório Os laboratórios terão acesso à plataforma através de uma carta convite emitida pela administração. Os laboratórios são pré-cadastrados pelos administradores, de forma que serão enviados apenas o login (que poderá ser modificado posteriormente) e a senha provisória. Os administradores da plataforma deverão preencher o formulário para cadastrar um laboratório (Figura 25). Um responsável técnico do laboratório também tem seus dados cadastrados e se torna encarregado do acesso à plataforma. 43

45 Figura 25. Cadastro dos usuários Laboratório. O cadastro dos usuários Transportadoras A visualização de transportadoras será um módulo de suporte agregado ao ecafé Brasil e consistirá numa listagem de serviços de transporte de cargas para auxiliar os compradores de café no contato com as transportadoras potencias, após a efetivação do negócio. As transportadoras poderão ser cadastradas por meio de convites enviados pelos usuários ou pela administração da plataforma. O cadastramento das transportadoras consistirá no preenchimento de alguns campos com informações simples. A página de escolha de Transportadoras pelo negociador. Após a conclusão da transação de compra e venda de café, o negociador (comprador e/ou vendedor) poderá acessar o módulo de transportadoras para buscar possíveis transportadoras que ofereçam serviços em sua região (Figura 26). 44

46 O usuário poderá listar todas transportadoras em ordem alfabética ou fazer uma busca considerando estados e cidades de origem e destino. Além disso, é possível acessar diretamente todas as rotas de atendimento cadastradas por uma transportadora. Figura 26. Página de escolha de Transportadoras pelo negociador. e) Eventos nacionais e internacionais: apresentação de trabalhos, organização de cursos, seminários; palestras; mesas redondas O INCT - Café esteve presente em Vitória, ES, em junho de 2009, durante a realização do VI Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, onde inclusive foi realizada uma reunião do Comitê Gêstor com os coordenadores das linhas de pesquisa. Neste evento foram apresentados trabalhos realizados no contexto do INCT-Café e divulgado o Instituto aos demais pesquisadores e instituições de pesquisa. O INCT Café também esteve presente durante a realização da Expocafé 2009 e 2010, realizadas nos meses de junho na cidade de Três Pontas, MG. Durante as exposições, foi realizada a divulgação do Instituto e dos produtos desenvolvidos nas biofábricas situadas junto ao INCT Café, aos produtores e empresas atuantes na cafeeicultura. 45

47 Os resultados de pesquisa obtidos durante a execução do projeto foram apresentados em congressos, simpósios e dias de campo, realizados nos anos de 2009 e 2010, conforme citados a seguir: - VI Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, Vitória, ES, junho de º Congresso Brasileiro de Pesquisas Cafeeiras, realizado em Araxá-MG, em outubro de 2009; - Dia de campo realizado em Patrocínio, São Sebastião do Paraíso e Machado; - III Semana Acadêmica da Universidade Federal de Lavras UFLA, realizado em Lavras-MG, em maio de 2009; - V Semana Tecnológica do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia IFET, Campus de Machado, realizado em Machado-MG, em maio de 2009; - XXXII Congresso Brasileiro de Ciência do Solo, realizado em Fortaleza-CE, em agosto de 2009; - XVIII Congresso de Pós-Graduação da UFLA, realizado em Lavras-MG, em outubro de f) Atividades de formação e capacitação de recursos humanos Durante a execução do projeto INCT-Café foram trinados sete bolsistas DTI-nível 1 (CNPq), três bolsistas DTI-nível 2 (CNPq), três bolsistas DTI-nível 3 (CNPq), 12 bolsistas de mestrado (CAPES), um bolsista de doutorado (CAPES) e 11 bolsistas IC (CNPq). eles: Três bolsistas DTI-nível 1 são egressos, pois conseguiram empregos permanentes. São a) Edvaldo Aparecido Amaral da Silva - nomeado como Professor em concurso público na UNESP, Botucatu-SP; b) Fernanda Carvalho Lopes de Medeiros - contratada pela Syngenta Proteção de Cultivos LTDA, para o setor de suporte técnico; c) Tatiana Tozzi Martins Souza Rodrigues - nomeada como Professora em concurso público no IFET-Januária-MG. g) Perspectivas e futuros desdobramentos O INCT Café tem como missão a geração de tecnologias apropriadas, competitivas e sustentáveis, por meio da integração de competências institucionais, capacitação de recursos humanos, estímulo à capacidade de inovação e geração de negócios de alto valor agregado na cadeia produtiva do café. Neste contexto e até então, três produtos estão sendo pesquisados e desenvolvidos, os quais certamente agregarão valor ao agronegócio do café. O primeiro refere- 46

48 se à produção de plântulas por embriogênese somática, considerada a alternativa mais adequada para a multiplicação em larga escala, de plantas híbridas superiores (vide Linha de Pesquisa 8). Mudas obtidas a partir de plantas com características de grande interesse, como resistência ao bicho mineiro e ferrugem, boa qualidade da bebida e alta produtividade estarão disponíveis comercialmente no curto prazo. A segunda tecnologia consiste na produção de diferentes formulações a base de extratos de folhas e cascas de frutos de café, capazes de induzir resistência em plantas. Estas formulações estimulam o sistema de defesa de vários cultivos e contra vários patógenos. Após vários experimentos no Brasil e no exterior, a eficácia destas formulações foi comprovada contra doenças fúngicas e bacterianas em vários cultivos, conforme detalhado na Linha de Pesquisa 10. A terceira tecnologia em desenvolvimento no INCT do Café, refere-se a formulações produzidas a partir do fungo Cladosporium cladosporioides, as quais preservam ou melhoram a qualidade da bebida do café (vide Linha de Pesquisa 10). Outro produto desenvolvido dentro do INCT é a Plataforma Tecnológica para Comercialização Online de Café (ecafebr), que viabilizará o comércio online de café, através de um plano de negócios vislumbrando uma estrutura de certificação de produto que gere credibilidade ao sistema (vide Linha de Pesquisa 15). Pesquisas básicas também têm sido conduzidas no INCT do Café, buscando-se caracterizar e selecionar, fenotipicamente e molecularmente, populações de cafeeiros com características agronômicas desejáveis com ênfase à resistência a fatores abióticos, bióticos e à qualidade da bebida, além de otimizar o manejo integrado de doenças e pragas importantes na cultura do café. Recentemente foi aprovado junto ao Governo do Estado de Minas Gerais, um projeto de construção da Agência de Referência do Café (Figura 27), fruto de uma parceria do INCT-Café, do Polo de Excelência do Café, do Centro de Inteligência do Café (CIM) e da Universidade Federal de Lavras. O novo prédio terá amplas instalações (inclusive laboratoriais) e será construído no Campus da UFLA, onde sediará o INCT-Café, o Polo de Excelência do Café e o CIM. 47

49 Figura 27. Planta da Agência de Referência do Café, a ser construída na Universidade Federal de Lavras UFLA, onde será instalada a nova sede do INCT-Café. 48