UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS LOURENÇO CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL CAPRINO COMO FERRAMENTA PARA O ISOLAMENTO DE LENTIVÍRUS EM CULTIVO CELULAR FORTALEZA - CEARÁ 2016

2 2 GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS LOURENÇO CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE CORDÃO UMBILICAL CAPRINO COMO FERRAMENTA PARA O ISOLAMENTO DE LENTIVÍRUS EM CULTIVO CELULAR Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes. Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira. FORTALEZA CEARÁ 2016

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4 GABRIELLE ROSEMBLIT MARTINS LOURENÇO 4

5 5 Dedico a minha família, em especial aos meus pais Rita Maria e Eguimar, e ao meu marido Ismael, por todo apoio durante minha caminhada para conquista desse título.

6 6 AGRADECIMENTOS Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), da Faculdade de Veterinária (FAVET), da Universidade Estadual do Ceará (UECE). A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro. A Profª. Drª. Maria Fátima da Silva Teixeira por todo apoio e ensino, sempre disposta a lutar pelos sonhos e conquistas, pessoa que admiro pela garra e talento para lecionar e pesquisar, muito obrigada. A Profª. Drª. Lilia Maria Carneiro Câmara pelos ensinamentos e por abrir as portas do seu laboratório com todo carinho e paciência, apresentando o mundo da citometria de fluxo. Ao Senhor Silva, gestor responsável pela Fazenda parceira por colaborar com o projeto através da disponibilização de animais para coleta. Aos meus amigos do Laboratório de Virologia, em especial a Rebeca e Junior, por todo apoio e ajuda, principalmente disponibilidade para ajudar nas coletas, mesmo em feriados e finais de semana, facilitando a execução desse experimento. Aos meus pais, Rita Maria Rosemblit Martins e Eguimar Araujo Martins, que sempre me apoiaram em toda a minha caminhada acadêmica, sempre orgulhosos das conquistas. Ao meu marido, Ismael Aires, por toda paciência durante esse período do experimento, e acima de tudo disposição para acompanhar e ajudar nas coletas, mesmo em finais de semana, feriados e férias. A minha avó e tias, em especial a Rosaly, pelo apoio e orações para que tudo desse certo nesse doutorado. Aos demais que contribuiram de alguma forma, e aqui não foram citados, meu sincero agradecimento. A Deus, sem Ele esse sonho não poderia ter se concretizado. Aprendi que devemos sempre agradecer por tudo que acontece em nossas vidas, nunca sabemos o que Deus tem para nos dar, mas Ele conhece nossos corações, nossos medos e nossas necessidades.

7 7 RESUMO Células-tronco são células não diferenciadas de embriões, fetos ou tecidos adultos, com potencial para gerar diversos tipos celulares sob o estímulo bioquímico, hormonal e mecânico adequado. Dentre elas figuram as células-tronco mesenquimais (CTM), tipo celular que tem particular importância na pesquisa científica, utilizadas principalmente em terapias celulares. No entanto, o seu potencial é bem mais amplo, podendo ser utilizadas como insumo para o isolamento viral em cultivo celular. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar células-tronco mesenquimais provenientes do cordão umbilical caprino, investigar o seu potencial de diferenciação, e produzir monocamada celular para o isolamento de lentivírus em cultivo celular. Para tanto, foram coletadas amostras de tecido e sangue do cordão umbilical caprino, submetidas a protocolos de transporte, separação, isolamento e cultivo das CTM, para a obtenção da monocamada celular. Essas células foram caracterizadas através da imunofenotipagem por citometria de fluxo e submetidas à diferenciação em linhagens mesodermais. As monocamadas obtidas foram utilizadas para isolamento dos lentivírus de pequenos ruminantes, através da infecção experimental com os vírus da artrite encefalite caprina (CAEV-Cork) e Maedi Visna (MVV K1514), visando testar sua permissibilidade aos efeitos citopáticos causados por esses vírus, e seu potencial para o uso no diagnóstico de lentiviroses em cultivo celular. A padronização do isolamento e cultivo dessas células, tanto de amostras de tecido como sangue do cordão umbilical, permitiu o isolamento das células-tronco mesenquimais, bem como obtenção de monocamada celular com potencial de diferenciação nas linhagens mesodermais de condrócitos, adipócitos e osteoblastos. Essas monocamadas se mostraram permissíveis à infecção pelos lentivírus de pequenos ruminantes, apresentando efeito citopático de lise e sincício celular. Esses resultados contribuem para evolução do diagnóstico das lentiviroses em cultivo celular, apresentando nova alternativa de obtenção de células, e dão base para maiores estudos com células-tronco mesenquimais caprinas. Palavras-chave: CAEV. MVV. Cultivo Celular. CTM. Citometria de fluxo.

8 8 ABSTRACT Stem cells are undifferentiated cells of embryos, fetuses or adult tissues, with the potential of generate cells of several tissues in the biochemical, hormonal and mechanical stimulation suitable. Among them, the mesenchymal stem cells (MSC), a cell type that has particular importance in scientific research, used mainly in cellular therapies. However, its potential is much broader, and can be used as element material for virus isolation in cell culture. Thus, the objectives of this work were to isolate and characterize mesenchymal stem cells from the goat umbilical cord, to investigate its differentiation potential, and to produce cell monolayer for the isolation of lentivirus in cell culture. For this purpose, tissue and blood samples from the goat umbilical cord were collected, submitted to protocols for transport, separation, isolation and culture of the MSC, to obtain the cellular monolayer. These cells were characterized by immunophenotyping by flow cytometry and submitted to differentiation in mesodermal lines. The obtained monolayers were used to isolate lentiviruses from small ruminants through experimental infection with Caprine Arthritis Encephalitis virus (CAEV-Cork) and Maedi Visna virus (MVV K1514), in order to test their permissibility to the cytopathic effects caused by these viruses and their potential for use in the diagnosis of lentiviruses in cell culture. The standardization of the isolation and culture of these cells, both tissue samples and umbilical cord blood, allowed the isolation of mesenchymal stem cells, as well as obtaining a cell monolayer with differentiation potential in the mesodermal lines of chondrocytes, adipocytes and osteoblasts. These monolayers were shown to be permissible for infection by lentiviruses of small ruminants, presenting cytopathic effect of lysis and cellular syncytium. These results contribute to the evolution of the diagnosis of lentiviruses in cell culture, presenting a new alternative to obtain cells, and provide a basis for further studies with mesenchymal stem cells. Key-words: CAEV, MVV, Cell Culture, MSC, Flow Cytometry.

9 9 LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 2 Figure 1 - Morphological features of MSC derived from goat UCB. (A) Primary culture after 4-5 days. (B) Short or long spindles, with uniform fibroblast-like morphology. (C) Typical fibroblast-like morphology with 80-85% confluence. Figure 2 - (A) Positive staining of Alcian Blue showed the chondrogenic differentiation. (B) Positive Alizarin Red stain showed osteogenic differentiation. (C) Sparsely small lipid droplets or even no lipid droplets in the cytoplasm, showed lower adipogenic potential. Figure 3 - Comparison of cell surface marker profiles between two types of MSC. (A) Large fibroblastic MSC. (B) Small fibroblastic MSC. Both types of MSC at passage 3 were analyzed by flow cytometry with antibodies against the indicated antigens. Calibrated histogram representing standard number of events in the Y-axis; and fluorescent intensity on X-axis. Negative control was shown in the graph area with fluorescent intensity less than 10¹. CAPÍTULO 3 Figure 1 -Primary culture of cgucs: morphological features and cell monolayers formed. (A) Epithelial cell-like phenotype. (B) Typical fibroblastoid shape. (C) cgucs exhibiting a large, flattened fibroblast-like morphology after the third passage. Figure 2 - Cytopathic effects caused by MVV and CAEV. (A) Cell lysis and syncytia caused by MVV. (B) Giant multinucleated cells caused by CAEV. (C) Negative control for the viral infectivity assay. Figure 3 - FACS analysis of Vimentin and CD90, in vitro culture, third passage cgucs. (A) Vimentin PE. (B) CD90 FITC. Calibrated histogram representing the number of events on the Y-axis and fluorescent intensity on the X-axis. The red area histogram indicate negative control. Figure 4 - Mesodermal lineage differentiation. Adipogenic Differentiation. (A) Chondrogenic Differentiation. (B) Osteogenic Differentiation. (C)

10 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADSCs - Goat Adipose-derived Stem Cells AIEV Vírus da Anemia Infecciosa Equina APC - Allophycocyanin BME - Meio Basal de Eagle CTM Células-tronco Mesenquimais CAEV - Artrite Encefalite Caprina caf-mscs - Caprine Mesenchymal Stem Cells derived from Amniotic Fluid CAPES Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior cgucs - Cells from Goat Umbilical Cords CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO2 Dióxido de carbono DMEM Meio Essencial Mínimo modificado por Dulbeccos EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético FACS - Fluorescence Activated Cell Sorter FBS Fetal Bovine Serum FITC - Fluorescein Isothiocyanate FIV Vírus da Imunodeficiência felina HIV-1 - Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 HIV-2 Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 2 HSC - Hematopoietic Stem Cells ICTV - Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus ISCT - International Society for Cytotherapy LVPR - Lentivírus de Pequenos Ruminantes MEM Meio Essencial Mínimo MEM-E - Minimum Essential Medium with Earle s salt and L-glutamine Mg2+ - Magnésio MO - Missouri MOI Multiplicidade de infecção MSC - Mesenchymal Stem Cells MVV - Vírus Maedi-Visna NY New York

11 11 PBS - Phosphate buffered saline PE - Phycoerythrin ph Potencial hidrogeniônico PPGCV Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias RNA - Ácido Ribonucleico RPMI - Roswell Park Memorial Institute Medium SFB Soro Fetal Bovino SIV Vírus da Imunodeficiência Símia SRLV - Small Ruminant Lentivirus SS Saline Solution TGF-β Fator de crescimento de transformação β VSEL - Very small embryonic/epiblast-like stem cells UCB - Umbilical cord blood UFC Universidade Federal do Ceará UFC-F Unidade formadora de colônia fibroblástica USA United States of America USSC - Unrestricted somatic stem cells

12 12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA CÉLULAS-TRONCO CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO LENTIVIROSES DE PEQUENOS RUMINANTES JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 80

13 13 1. INTRODUÇÃO A célula-tronco é uma célula indiferenciada com capacidade de autorrenovação, que pode originar diferentes tipos celulares. As células-tronco totipotentes, presentes no embrião, podem originar os diversos tipos celulares do organismo. Em contraste, as células-tronco multipotentes, como as células-tronco mesenquimais e células-tronco hematopoiéticas, podem se diferenciar em apenas algumas linhagens celulares (ORBAY et al., 2012). A célula-tronco mesenquimal representa um tipo de célula-tronco adulta, caracterizada por baixa imunogenicidade, multipotência, facilidade de isolamento, purificação, expansão in vitro e a possibilidade de criopreservação (PROSPER et al., 2003). Essas características favorecem o seu uso em diversos campos da pesquisa científica, sendo capazes de se diferenciar e produzir vários tipos celulares necessários como osteoblastos, condroblastos, hepatócitos, neurônios, células epiteliais, renais, cardíacas, musculares, dentre outras (PITTENGER et al., 1999; SALEM e THIEMERMANN, 2010). Estudos com células-tronco mesenquimais buscam isolar, cultivar e caracterizar esse tipo celular a partir de amostras de diversos tecidos e espécies animais, visando utilizá-las em terapias celulares. As terapias baseadas em células visam reparar e substituir tecidos lesados ou senescentes, oferecendo uma abordagem terapêutica promissora tanto na medicina humana como na medicina veterinária (FORTIER e TRAVIS, 2011; STOLTZ et al., 2012). Porém, o potencial de utilização desse tipo celular pode ser bem mais amplo, contribuindo para avanços em outros ramos da pesquisa científica, como estudos microbiológicos, através do isolamento viral em cultivo celular, produção de antígenos e vacinas. Essa nova possibilidade de aplicação pode contribuir para o diagnóstico, e consequente prevenção de diversas doenças. O sucesso da produção animal depende da aplicação de um bom manejo, que inclui cuidados com nutrição, reprodução e sanidade animal. O manejo sanitário de pequenos ruminantes inclui o controle e prevenção das lentiviroses de pequenos ruminantes, doenças crônicas que afetam consideravelmente a produção desses animais. Os lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR), que compreendem o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) e o vírus Maedi-Visna (MVV), são um conjunto

14 14 genético de espécies lentivirais que foram inicialmente isoladas de cabras e ovelhas, respectivamente (LEROUX et al., 1997). Após longo período de incubação, esses vírus são responsáveis por uma infecção persistente que induz a doença crônica degenerativa das articulações, pulmões, úbere e sistema nervoso central dos hospedeiros infectados (RAVAZZOLO et al., 2006). O diagnóstico dessas infecções é de suma importância em termos de investigação epidemiológica e controle do comércio internacional de pequenos ruminantes, de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde Animal (OIE). A variedade biológica dos lentivírus de pequenos ruminantes dificulta a utilização de uma ferramenta diagnóstica única, rápida e precisa, mas, em geral, são eficientemente detectados através de métodos sorológicos que podem ser complementados por técnicas moleculares (ANDRÉS et al., 2005). Entretanto, o isolamento viral em cultivo celular representa a técnica padrão-ouro de detecção dessa doença em um rebanho, comprovando a presença dos vírus a partir da observação dos efeitos citopáticos em monocamadas celulares co-cultivadas com amostras (sangue, lavado bronco-alveolar, leite, entre outros) coletadas dos animais infectados (CORK e NARAYAN, 1980; HÖTZEL et al., 1993; CALLADO, 1999). Considerando-se o potencial das células-tronco mesenquimais, e a possibilidade de cultivo de diversos tipos de células, tanto para obter linhagens como para auxiliar no diagnóstico de doenças, o objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar fenotipicamente e investigar o potencial de diferenciação das células-tronco mesenquimais provenientes do cordão umbilical caprino, visando obter monocamada de células para uso no diagnóstico das lentiviroses de pequenos ruminantes no cultivo celular, bem como padronizar protocolo de isolamento e cultivo desse tipo celular em caprinos, contribuindo para avanços nesse campo de pesquisa.

15 15 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 CÉLULAS-TRONCO As células-tronco possuem como características a capacidade de diferenciação celular, o que as permitem originar os mais diversos tecidos a partir de resposta a estímulos externos, gerando linhagens celulares mais especializadas como tecido muscular esquelético, ósseo, cartilaginoso e adiposo (SOUZA et al., 2003, PEREIRA, 2008; YARAK e OKAMOTO, 2010). Além disso, possuem o poder de autorrenovação e diferenciação (WATT e HOGAN, 2000). Quanto a sua potencialidade podem ser classificadas em totipotentes, multipotentes, oligopotentes e unipotentes. As totipotentes apresentam como característica a capacidade de gerar todos os tecidos do organismo e do folheto embrionário; as classificadas como multipotentes apresentam a capacidade de gerar diversas linhagens celulares; por sua vez, as oligopotentes originam células do próprio tecido isolado e diversas células de tecidos somáticos (SOUZA et al., 2003) e as células-tronco unipotentes originam apenas um tipo celular do folheto (FRIEL et al., 2005; YARAK e OKAMOTO, 2010). Outra classificação é realizada de acordo com a sua origem em células-tronco embrionárias (CTE) e as células-tronco somáticas (CTS). As CTE são obtidas da massa interna do blastocisto. As células-tronco somáticas são consideradas células multipotentes que possuem potencial de se diferenciarem em múltiplas linhagens celulares, sendo classificadas em células hematopoiéticas e mesenquimais. São consideradas relevantes no uso da terapia celular devido sua facilidade de isolamento de quase todos os tecidos adultos, cultivo e formação de banco de células (DOMINICI et al. 2006, DEL CARLO et al. 2008, NERY et al. 2013). Anexos fetais como o fluído amniótico, cordão umbilical e membrana amniótica são fontes promissoras de célulastronco mesenquimais com grande potencial de aplicação na medicina regenerativa (ZUCCONI et al. 2010). As células-tronco mesenquimais apresentam grande plasticidade, originando tecidos mesodermais e não mesodermais (ZAGO e COVAS, 2004; MEIRELLES et al., 2006). São células multipotentes, com alta capacidade de se renovar e diferenciar em células de diversas linhagens de tecido conjuntivo (BITTENCOURT et al., 2006) como osteoblastos, condrócitos e adipócitos (KADIYALA et al., 1997).

16 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS As células-tronco mesenquimais (CTM), também chamadas de células progenitoras mesenquimais (KARAHUSEYINOGLU et al., 2007), representam um arquétipo das células-tronco somáticas multipotentes. Essas células são uma promessa para aplicação na medicina regenerativa em humanos (WAGNER et al., 2005) e também em animais domésticos (CREMONESI et al., 2011), principalmente devido a sua capacidade intrínseca de autorrenovação e diferenciação em vários tipos celulares funcionais (BAKSH et al., 2004). As CTM tem particular importância na medula óssea, sendo responsáveis pela manutenção do nicho da célula-tronco hematopoiética, regulando sua autorrenovação e diferenciação in vivo (WILSON e TRUMPP, 2006). A comprovação da existência desse tipo de célula na medula óssea ocorreu após os estudos de Friedenstein et al. (1966), caracterizadas pela capacidade de aderir ao plástico, formar colônias em formato de fuso e semelhante a fibroblastos, sendo estas colônias derivadas de uma única célula precursora, designada Unidade Formadora de Colônia Fibroblástica (UFC- F) (PROCKOP, 1997). Os critérios mínimos para se caracterizar esse tipo celular são sua característica plástico aderente quando mantidas sob condições de cultivo; apresentar padrões de expressão de antígenos de superfície incluindo CD29, CD44 (WAGNER et al., 2005), CD73, CD90 e CD105 (DE MATTOS CARVALHO et al., 2009); e não apresentar expressão dos marcadores da linhagem hematopoiética e HLA-DR (WAGNER et al., 2005). Ainda devem ter capacidade de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro (PITTENGER et al., 1999). Essa linhagem de células-tronco somáticas pode ser encontrada em pequenas quantidades em regiões perivasculares de todos os tecidos adultos, incluindo a medula óssea, tecido adiposo, muscular e os órgãos parenquimatosos (MAMBELLI et al., 1999; MEIRELLES et al., 2008; ZUCCONI et al., 2009). Uma vez isoladas, independente do tecido de origem, podem ser utilizadas, principalmente, em terapias celulares. A forma mais antiga de terapia celular é a transfusão de componentes sanguíneos, um dos procedimentos terapêuticos mais executados em todo o mundo. No entanto, o foco atual da terapia celular é a medicina regenerativa, que busca a substituição de células ou tecidos lesados, senescentes ou perdidos para restaurar sua função. As formas de terapia

17 17 celular que despertam as maiores esperanças da comunidade científica e da sociedade em geral são as terapias com células-tronco (ZAGO, 2005). Por apresentar alta plasticidade, possibilidade de isolamento a partir de tecidos adultos, adaptação no cultivo celular in vitro, além de sua baixa imunogenicidade, essas células apresentam um potencial bem mais amplo de utilização, podendo ser exploradas por outros campos da pesquisa cientifica, não só o da medicina regenerativa. Para tanto, necessita-se padronizar protocolos de isolamento e cultivo celular, proporcionando o seu uso em diferentes experimentos, como os relacionados com a microbiologia, que podem aproveitar os benefícios da técnica de cultivo celular in vitro, e auxiliar no diagnóstico e prevenção de diversas doenças. 2.3 CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO O cultivo celular é um conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora do organismo, e tem como objetivo a expansão do número dessas células. Baseia-se na capacidade de as células multiplicarem-se numa placa de cultura em condições adequadas, mantendo suas características próprias. A cultura de células implica numa prévia desagregação mecânica ou enzimática do tecido original e o cultivo de tais células é feito em uma camada aderente, em uma placa ou garrafa de cultivo, em um substrato sólido ou cultura em suspensão. Esta técnica deve ser feita em condições ótimas de temperatura e ph, conforme o tipo de células em estudo (FRESHNEY, 2010). A nutrição com meios suplementados com aminoácidos e carboidratos deve ser fornecida para que as células se mantenham vivas e se comportem como se estivessem no organismo vivo (ALBERTS et al., 2009). Meios como o Meio Essencial Mínimo (MEM), Meio Essencial Mínimo modificado por Dulbeccos (DMEM), RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium) e Meio Basal de Eagle (BME), acrescidos de Soro Fetal Bovino (SFB), normalmente na concentração de 10-20%, têm sido utilizados para manutenção das células-tronco mesenquimais in vitro, sendo a escolha do meio uma variável importante para o sucesso do crescimento e diferenciação dessas células (TAPP et al., 2009). A principal função do soro nas culturas celulares é fornecer fatores hormonais que estimulem o crescimento celular e suas funções, fatores de adesão e expansão e transporte de proteínas carregadoras de hormônios, minerais,

18 18 lipídeos. O papel mais importante do soro está na promoção de adesão e expansão de uma linhagem através de fatores como o colágeno e fibronectina (BASTOS et al., 2007). As células-tronco isoladas e destinadas ao cultivo celular são mantidas em incubadora a 37ºC com atmosfera com 5% CO 2, o que facilita a manutenção do ph do meio, permitindo que as trocas das células com o meio sejam mais eficientes (FRESHNEY, 2005). Culturas preparadas diretamente de tecidos de um organismo, com ou sem um passo inicial de fracionamento das células, são chamadas culturas primárias. Na maioria dos casos, células em culturas primárias podem ser retiradas da placa de cultura e usadas para formar um número razoável de culturas secundárias; elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses (MANI et al., 2008). As CTM podem ser cultivadas em meio de cultivo completo, em frascos ou placas de cultura, nos quais elas se aderem, começam a se proliferar e formam as UFC- F (KRAMPERA et al., 2006). Essas células se tornam uma população aderente cada vez mais homogênea e de acordo com estudos de caracterização com CTM humanas, tem potencial para se proliferarem sem se diferenciarem por até 40 passagens (HORWITZ et al., 1999; PITTENGER et al., 1999). Em determinadas circunstâncias podem passar por diferenciação celular, transformando-se em células com função mais especializadas (ALBERTS et al., 2009). A caracterização dessas células baseia-se na sua propriedade de adesão ao plástico, morfologia fibroblástica e padrão característico de marcadores de superfície (MARTIN et al., 2002). Esses critérios, juntamente com a habilidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, sendo os principais adipócitos, condrócitos e osteoblastos, são suficientes para defini-la como células-tronco mesenquimais (PITTENGER et al., 1999). A técnica de cultivo proporciona o isolamento, cultivo e diferenciação desse tipo celular, bem como sua aplicação em diversos campos da medicina veterinária. Associada a técnica de citometria de fluxo proporciona uma caracterização completa, identificando a presença de marcadores de superfície e intracelulares específicos.

19 IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO A citometria de fluxo é um método moderno do estudo de células, através do qual podem ser determinadas múltiplas propriedades físicas e biológicas de uma célula. A linhagem celular e suas subpopulações podem ser determinadas pelo número e tipo de antígeno de superfície, intracitoplasmático ou mesmo intranuclear, o que propicia a quantificação e classificação ontogênica (imunofenótipo) das células. A citometria permite, além do rastreamento rápido de inúmeras populações celulares, a quantificação de pequenas populações com extrema especificidade (BACAL e FAULHABER, 2003). Na caracterização de células-tronco mesenquimais, obtidas da medula óssea, cordão umbilical, ou outro tecido de origem são utilizados anticorpos conjugados a fluorocromos excitáveis, os quais reconhecem antígenos específicos de membrana, e são analisados em citômetro de fluxo. A citometria de fluxo é um recurso importante na Veterinária, permitindo uma análise rápida, objetiva e quantitativa de células em suspensão (FALDYNA et al., 2001). As células, em suspensão, são marcadas com anticorpos específicos, conjugados com fluorocromos para detecção de moléculas de superfície e são introduzidas em uma câmara de fluxo. O fluxo de células que atravessa a câmara está suspenso em uma solução tampão, sendo que 500 a 4000 células ou partículas passam em fila única, por segundo, através do sensor eletrônico. O fluxo é iluminado por laser argônio, que tem uma energia de luz incidente de 488 nm. Cada célula é avaliada com relação ao tamanho (feixe de luz frontal) e granularidade e complexidade interna (feixe de luz lateral), bem como para a intensidade de fluorescência para detecção de diferentes marcadores de superfície (imunofenotipagem). A técnica de citometria de fluxo permite, portanto, identificar e quantificar células em suspensão com base no tamanho ( Forward scatter - FSC), na granularidade ( Side scatter - SSC) e na intensidade da fluorescência dessas células (ROITT et al., 2003). Todas as células do organismo apresentam um conjunto de marcadores de superfície que caracterizam a singularidade biológica e a marca das células que os contêm (COVAS, 2006). Contudo, as CTM apresentam poucos marcadores imunofenotípicos específicos (ALHADLAQ e MAO, 2004; MEIRELLES et al., 2006), sendo sua caracterização estabelecida pela identificação de um perfil de marcadores específicos e não específicos. Essa imunofenotipagem é realizada com a utilização de

20 20 anticorpos monoclonais que reconhecem esses antígenos de superfície da membrana celular (MEIRELLES et al., 2006; LOJUDICE, 2008). A população de CTM isoladas da medula óssea de humanos e camundongos expressa em sua superfície marcadores moleculares como: CD44 (receptor de hialuronato), CD105 (endoglina, marcador angiogênico), CD106 (VCAM-1, molécula de adesão vascular), CD166 (ALCAM, moléculas de adesão de leucócitos ativados), CD29 (integrinas, VLA-ß), CD73 (SH3 e SH4), CD90 (Thy-1), Stro-1(estroma de suporte da hematopoese) e Sca-1 (GRONTHOS et al., 2003; KOLF et al., 2007; PHINNEY e PROCKOP, 2007). KOLF et al. (2007) afirmaram que o marcador Stro-1 é o melhor marcador a se investigar quando se deseja pesquisar a presença de CTM. Entretanto, esse marcador é gradualmente perdido durante a expansão em culturas. Uma vez isoladas e caracterizadas essas células podem ser utilizadas em experimentos biológicos, dentre eles no diagnóstico de lentiviroses, através do cocultivo de amostras de animais infectados com monocamadas de células-tronco mesenquimais, no caso em questão, derivadas do cordão umbilical caprino. 2.5 LENTIVIROSES DE PEQUENOS RUMINANTES Os pequenos ruminantes podem ser infectados por um grupo de lentivírus, genericamente denominados de Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR), que compreende vários isolados distribuídos, basicamente, em dois grupos filogenéticos, cujos protótipos são os vírus Maedi-Visna (MVV) e Artrite encefalite Caprina (CAEV) (Valas et al. 1997, Castro et al. 1999a, Valas et al. 2000). Os LVPR compartilham similaridades genéticas, mecanismo molecular de replicação, morfologia e interações biológicas em seus hospedeiros. Os membros deste grupo compõem um grupo taxonômico espécie-específicos, tem tropismo por células da linhagem monocíticafagocitária e são caracterizados pela infecção persistente in vivo (Narayan et al. 1997). São pertencentes à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e ao gênero Lentivirus (CORK et al., 1974; ICTV, 2015). A artrite-encefalite caprina é uma enfermidade infecciosa, multissistêmica, incurável e de caráter crônico que afeta caprinos em várias fases do desenvolvimento etário, independente do sexo, raça e produção (CORK et al., 1974; LARA et al., 2005). O CAEV é um RNA vírus, não oncogênico, que foi inicialmente descrito por Cork et al.

21 21 (1974) como agente causal de encefalite em caprinos jovens, sendo posteriormente identificado como um retrovírus por Crawford et al. (1980) em animais adultos que apresentavam artrite crônica. O vírus Maedi-Visna infecta, preferencialmente, ovinos causando infecção multissistêmica, como em caprinos, porém com maior predileção pelos pulmões e sistema neurológico. Os sinais clínicos da enfermidade deram origem à denominação da doença. Primeiramente o quadro de dificuldade respiratória deu origem ao termo maedi, que significa dispneia, decorrente de pneumonia intersticial progressiva crônica. Logo depois, a doença que levava os ovinos á paralisia atáxica deu origem ao termo visna que significa desorientação, causada por leucoencefalomielite (STRAUB, 2004). Posteriormente descobriram que embora a enfermidade Maedi-Visna acometesse diferentes sistemas do organismo e parecesse ser duas doenças bastante distintas, os vírus causadores das duas formas clínicas eram semelhantes em sua estrutura física, química e biológica (incluindo as propriedades de reações sorológicas). Estudos comparativos revelaram que tanto Maedi quanto Visna eram doenças causadas pelo mesmo vírus, originando a denominação Maedi-Visna (THORMAR e HELGADOTTIR, 1965). Outros vírus pertencentes ao gênero Lentivirus são os vírus das imunodeficiências felina (FIV), bovina (BIV), símia (SIV) e humana (HIV-1, HIV-2); o vírus da anemia infecciosa equina (AIEV) e o lentivirus Puma (ICTV, 2015). Os lentivírus são partículas esféricas, envelopadas com aproximadamente 100nm de diâmetro com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas moléculas idênticas de RNA fita simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg 2+ e proteínas do nucleocapsídeo (GONDA et al., 1986). O envelope está associado covalentemente com as glicoproteínas transmembranárias e de superfície. Outra estrutura presente na partícula viral é a matriz que está situada entre o capsídeo e o envelope (PEPIN et al., 1998). A infecção é caracterizada por um período prolongado de latência, na ausência de transformação oncogênica nas células hospedeiras e tropismo principalmente por monócitos/macrófagos e as células dendríticas (HUSO et al., 1988). O estudo de lentivirus animais in vitro através do cultivo celular é considerado o padrão ouro para isolamento de lentivirus de pequenos ruminantes. E para que isto seja possível é necessário o uso de células de pequenos ruminantes para a replicação viral. O

22 22 isolamento e identificação do vírus por meio do co-cultivo de células do colostro, leite, lavado brônquio-alveolar, sanguíneas e líquido cerebrospinal com células de membrana sinovial de cultivo primário caprino representa um diagnóstico determinante (CORK e NARAYAN, 1980; HÖTZEL et al., 1993; CALLADO, 1999), sendo as culturas primárias de células de membrana sinovial as mais usadas para o isolamento e caracterização biológica do LVPR (CRAWFORD et al., 1980; NARAYAN et al., 1980). No entanto, barreiras éticas dificultam a obtenção de células derivadas da membrana sinovial, devido à necessidade de utilização de tecidos fetais. Cultivos primários podem ser instituídos, porém a rápida senilidade das células dificulta a manutenção de um banco de células continuo para o diagnóstico e isolamento viral. As células-tronco mesenquimais se apresentam como alternativa promissora para a evolução dessa técnica, podendo ser obtidas de tecidos adultos, com capacidade de autorrenovação, baixa imunogenicidade e proliferação in vitro por diversas passagens.

23 23 3. JUSTIFICATIVA As células provenientes do cordão umbilical representam uma alternativa potencial de uso no diagnóstico de lentiviroses, com riscos reduzidos de contaminação com agentes infecciosos, principalmente quando a colheita é feita de forma asséptica, além de não utilizar embriões ou fetos, em geral por ocasião do parto este cordão seria descartado e pode constituir um material excelente rico em células multipotentes com possibilidade de gerar diversos tipos celulares. As células-tronco têm sido utilizadas com finalidades diversas tais como reconstrução de tecidos, correção de defeitos genéticos, transplantes em pessoas e animais imunossuprimidos, obtenção de células reprodutivas, entre outros. Porém, com a finalidade precípua de obtenção de monocamada de células visando o uso como ferramenta destinada ao cultivo para isolamento viral ainda não tinha sido utilizada. O cultivo de vírus constitui uma técnica padrão ouro para o diagnóstico por isolamento viral, ampliação de estoques virais, confecção de antígenos diagnósticos e vacinas; para a multiplicação viral a condição indispensável é a obtenção de monocamadas celulares. Células primárias e secundárias de diversos tecidos têm sido utilizadas, algumas linhagens celulares foram obtidas, contudo não existe uma disponibilidade comercial para uso de rotina. Os cultivos primários apesar de custo relativamente baixos, oferecem inúmeras dificuldades para sua obtenção, como a utilização de tecidos fetais ou embrionários para sua confecção, riscos de contaminação, além da senescência, depois de reduzido número de passagens. A obtenção e caracterização de células-tronco mesenquimais multipotentes provenientes do cordão umbilical caprino pode contribuir para o diagnóstico de diversas doenças, a partir do isolamento de agentes patogênicos no cultivo celular, podendo constituir linhagens de células com potencial para disponibilidade comercial.

24 24 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS 1- Células-tronco mesenquimais podem ser isoladas do tecido e sangue do cordão umbilical caprino. 2- Monocamadas de células-tronco mesenquimais provenientes do cordão umbilical caprino constituem ferramenta para diagnóstico e isolamento de lentivírus de pequenos ruminantes em cultivo celular.

25 25 5. OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL Isolar, caracterizar fenotipicamente e investigar o potencial de diferenciação das células-tronco mesenquimais provenientes do cordão umbilical caprino, visando obter monocamada celular para uso no diagnóstico das lentiviroses de pequenos ruminantes no cultivo celular. 5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Testar protocolos de transporte de amostras de tecido do cordão umbilical ao laboratório; Padronizar protocolo de separação de células-tronco mesenquimais a partir de amostra de tecido e sangue do cordão umbilical; Cultivar as células-tronco mesenquimais de cordão umbilical caprino em dois meios de cultivo específicos para obtenção de monocamadas de células; Testar concentrações de soro fetal bovino acrescida ao meio de cultivo das células-tronco mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical caprino; Caracterizar imunofenotipicamente por meio de citometria de fluxo as célulastronco mesenquimais provenientes de cordão umbilical caprino, pós-cultivo; Testar a susceptibilidade das células-tronco mesenquimais de cordão umbilical caprino para a cepa padrão do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV Cork) e do vírus Maedi Visna (MVV K-1514); Investigar o potencial de diferenciação das células-tronco mesenquimais em linhagens mesodermais de adipócitos, condrócitos e osteoblastos.

26 26 6. CAPÍTULO 1 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS: CARACTERÍSTICAS, CULTIVO E USO NA MEDICINA VETERINÁRIA MESENCHYMAL STEM CELLS: CHARACTERISTICS, CULTIVATION AND USE IN VETERINARY MEDICINE Periódico: Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, v. 08, n. 2, p , abr-jun, 2014

27 27 RESUMO As células-tronco mesenquimais são células adultas indiferenciadas com grande plasticidade, capazes de originar tecidos mesodermais e não mesodermais, produzindo qualquer tipo celular necessário num processo de reparação. Devido a essas características essas células vêm ganhando muito atenção das pesquisas voltadas tanto para humanos como para animais, buscando-se protocolos padrões de separação, cultivo e diferenciação das mesmas para que possam ser utilizadas em diversas terapias celulares. O principal foco atual de interesse da terapia celular é a medicina regenerativa, em que se busca a substituição de células ou tecido lesado, senescentes ou perdidos para restaurar sua função, sendo as terapias com células-tronco, as que despertam mais interesse na sociedade. Atualmente, as pesquisas em Medicina Veterinária têm utilizados camundongos, ratos, gatos, cães, cavalos, ovelhas e cabras, isolando esse tipo celular, principalmente, da medula óssea, tecido adiposo, cordão umbilical e fluido amniótico.

28 28 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS: CARACTERÍSTICAS, CULTIVO E USO NA MEDICINA VETERINÁRIA Gabrielle Rosemblit Martins¹*, Maria Fátima da Silva Teixeira 2, Rosivaldo Quirino Beserra Junior 3, Ronaldo Pereira Dias 4, Tereza D ávila de Freitas Aguiar 5, Rebeca Cavalcante Marinho 6, Ana Raquel Almeida Pinheiro 7. Resumo: As células-tronco mesenquimais são células adultas indiferenciadas com grande plasticidade, capazes de originar tecidos mesodermais e não mesodermais, produzindo qualquer tipo celular necessário num processo de reparação. Devido a essas características essas células vêm ganhando muito atenção das pesquisas voltadas tanto para humanos como para animais, buscando-se protocolos padrões de separação, cultivo e diferenciação das mesmas para que possam ser utilizadas em diversas terapias celulares. O principal foco atual de interesse da terapia celular é a medicina regenerativa, em que se busca a substituição de células ou tecido lesado, senescentes ou perdidos para restaurar sua função, sendo as terapias com células-tronco, as que despertam mais interesse na sociedade. Atualmente, as pesquisas em Medicina Veterinária têm utilizados camundongos, ratos, gatos, cães, cavalos, ovelhas e cabras, isolando esse tipo celular, principalmente, da medula óssea, tecido adiposo, cordão umbilical e fluido amniótico. Palavras-chave: Medula óssea, animais, terapias, multipotentes. MESENCHYMAL STEM CELLS: CHARACTERISTICS, CULTIVATION AND USE IN VETERINARY MEDICINE Abstract: The mesenchymal stem cells are undifferentiated adult cells with high plasticity, capable of causing tissue mesodermais and not mesodermais, producing any cell type needed in the repair process. Due to such characteristics these cells have been gaining much attention from research directed both to humans and to animals, seeking standards protocols to separation, cultivation and differentiation of the same so that they can be used in various cell therapies. The main current focus of interest in the cell therapy is regenerative medicine, which seeks to replace damaged cells or tissue, senescent or lost to restore their function, and therapies with stem cells, those that arouse more interest in society. Currently, research in veterinary medicine have used mice, rats, cats, dogs, horses, sheep and goats, isolating this cell type, mainly bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and amniotic fluid. Keywords: Bone marrow, animals, therapies, multipotent Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), rmgabrielle@hotmail.com, junior_medvet2009@hotmail.com, ronaldodias01@yahoo.com.br, davilavet@gmail.com 2 Doutora responsável pelo Laboratório de Virologia do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), orientadora, mfteixeira@hotmail.com, Médica Veterinária 6 Mestre pelo Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), , beca.marinho@hotmail.com, Médica Veterinária 7 Aluna de iniciação cientifica do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE), kel_almeida92@hotmail.com, curso: Medicina Veterinária

29 29 Introdução Células-tronco são células indiferenciadas que possuem capacidade de autorrenovação, sendo capazes de se multiplicar mantendo o seu estado indiferenciado, proporcionando uma reposição ativa de sua população nos tecidos; além de ter capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, possuindo, desta forma, um papel regenerativo quando estes sofrem uma lesão ou injúria (BLAU et al., 2001; FODOR, 2003). A proliferação das células-tronco (autorrenovação) ocorre por meio de mitoses sendo responsável por garantir um número adequado de células-tronco em determinado local do organismo. Com relação à regeneração de tecidos esta ocorre quando as células-tronco presentes em diversos locais do organismo recebem sinais específicos para que ocorram divisão e reposição de células perdidas, como no caso de uma lesão tecidual. A diferenciação é a capacidade particular que estas células apresentam de gerar tipos celulares distintos, sob o estimulo bioquímico, hormonal e mecânico adequado, in vitro ou in vivo (CSAKI et al., 2007). Tomando-se como referencial os aspectos relativos ao potencial de diferenciação das células-tronco estas podem ser classificadas em: pluripotentes - podem gerar todos os diferentes tipos celulares, como as células da massa celular interna do blastocisto, e multipotentes - precursoras de diferentes tipos celulares de uma mesma linhagem do tecido onde se insere, como por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas. As célulastronco ainda podem ser classificadas como oligopotentes, que podem originar células de diferentes linhagens celulares de um mesmo tecido, como as células-tronco neurais. Existem também aquelas que originam apenas um tipo celular, com função repositora, como as células-tronco da epiderme, chamadas unipotentes (FRIEL et al., 2005). Essa série de características particulares das células-tronco determina o seu importante papel na terapia de diversas doenças, sendo utilizadas tanto na medicina humana, como na medicina veterinária, e em sua maioria obtidas, pós-natal, de amostras da medula óssea (BYDLOWSKI et al., 2009). Existem dois tipos de células-tronco potencialmente úteis para medicina: células-tronco embrionárias e células-tronco adultas. O potencial de diferenciação das primeiras está bem caracterizado em camundongos e em humanos, no entanto seu uso em terapia celular e em pesquisa tem sido dificultado por questões de histocompatibilidade, segurança e ética. Em contraste, as células-tronco adultas não

30 30 apresentam estes empecilhos, apesar da extensão de sua plasticidade ainda estar sob investigação (PEREIRA, 2008). As células-tronco embrionárias são classificadas como totipotentes ou pluripotentes, sendo encontradas durante o desenvolvimento do pré-embrião. Já as células-tronco adultas ou células-tronco somáticas, são multipotentes, não especializadas e já foram identificadas em diferentes órgãos e tecidos, como sangue periférico, tecido adiposo, sistema nervoso central, músculo, epitélio intestinal, pele, dente e medula óssea, onde participam da homeostase tecidual, gerando novas células devido à renovação fisiológica ou injúria sofrida (BJORNSON et al., 1999; CLARKE et al, 2000; CSAKI et al., 2007). As primeiras células-tronco adultas identificadas foram às precursoras hematopoiéticas, responsáveis pela produção das células sanguíneas na medula óssea (ZAGO, 2005). Atualmente, dentre as células-tronco adultas estudadas, as células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam maior plasticidade, originando tecidos mesodermais e não mesodermais (ZAGO & COVAS, 2004; MEIRELLES et al., 2006). São células multipotentes, com alta capacidade de se renovar e diferenciar em células de diversas linhagens de tecido conjuntivo (BITTENCOURT et al., 2006) como osteoblastos, condrócitos e adipócitos (KADIYALA et al., 1997a), além de poderem ser obtidas de diferentes tecidos como medula óssea e tecido adiposo (REBELATTO et al., 2008). Células-tronco mesenquimais (CTM) As CTM tem particular importância na medula óssea, sendo responsável pela manutenção do nicho da célula-tronco hematopoiética, regulando sua autorrenovação e diferenciação in vivo (WILSON & TRUMPP, 2006), estas CTM são formadas por um grupo heterogêneo de células não hematopoiéticas, que inclui fibroblastos, adipócitos, precursores osteogênicos e células reticulares (LAZZAROTTO-SILVA, 2009). A presença de células-tronco não hematopoiéticas na medula óssea foi primeiramente sugerida pelo patologista alemão Julius Clonheim, em 1867, quando sugeriu que a medula óssea pudesse ser a fonte de fibroblastos que depositam fibras colágenas como parte do processo normal de reparo (BYDLOWSKI et al., 2009). Porém, a comprovação da existência desse tipo de célula na medula óssea só ocorreu após os estudos de (FRIEDENSTEIN et al., 1966), através da demonstração de uma cultura de células da medula óssea que tinha capacidade de aderir ao plástico,

31 31 formar colônias em formato de fuso e semelhante a fibroblastos, sendo estas colônias derivadas de uma única célula precursora, designada Unidade Formadora de Colônia Fibroblásticas (UFC-F) (PROCKOP, 1997). As CTM são consideradas uma linhagem de células-tronco somáticas e estão presentes em pequenas quantidades em regiões perivasculares de todos os tecidos adultos, incluindo a medula óssea, o tecido adiposo, o periósteo, o tecido muscular e os órgãos parenquimatosos (MAMBELLI et al., 1999; MEIRELLES et al., 2008; ZUCCONI et al., 2009). A medula óssea constitui um dos principais sítios doadores dessas células, assim como de células-tronco hematopoiéticas e endoteliais (PITTENGER et al., 1999; MINGUELL et al., 2000). Inicialmente as CTM foram isoladas do baço e timo. Subsequentemente, aspirados da medula óssea foram considerados amostras de eleição, por serem mais acessíveis e apresentarem fontes ricas em CTM. Atualmente, essas vêm sendo isoladas de vários locais do organismo humano e animal, incluindo cartilagem, periósteo, sinóvia, líquido sinovial, músculos e tendões (FRIEDENSTEIN et. al., 1966), cérebro (UCHIDA et al., 2000), tecido adiposo (ZUK et al., 2001), sangue do cordão umbilical (LEE et al., 2004), e em tecidos fetais como sangue, fígado, medula óssea e do rim (MIAO et al., 2006). Todavia, apresentam pouca quantidade desse tipo celular comparado com a medula óssea, além de ainda não estarem bem estabelecidas às condições ideais de cultivo (WEXLER et. al., 2003). As CTM caracterizam-se por ser uma população de células multipotentes capazes de se diferenciar e produzir qualquer tipo celular necessário num processo de reparação, como osteoblastos, condroblastos, hepatócitos, neurônios, células epiteliais, renais, cardíacas, dentre outras (PITTENGER et al., 1999). Tais características de plasticidade sugerem que esse tipo celular é o responsável pela manutenção de todos os tecidos do organismo (CAPLAN, 2009). As CTM expressam um grande número de moléculas bioativas como as moléculas de adesão, as proteínas de matriz extracelular, as citocinas e os receptores para fatores de crescimento, permitindo interações com demais células (HUSS, 2000; BOBIS et al., 2006). Essas moléculas atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (WAN et al., 2008; CAPLAN, 2009).

32 32 As CTM, uma vez isoladas, independente do tecido de origem, podem ser utilizadas principalmente em terapias celulares. A forma mais antiga de terapia celular é a transfusão de componentes sanguíneos, um dos procedimentos terapêuticos mais amplamente utilizados no mundo todo. Porém, o principal foco atual de interesse da terapia celular é a medicina regenerativa, em que se busca a substituição de células ou tecidos lesado, senescentes ou perdidos para restaurar sua função. As formas de terapia celular que despertam as maiores esperanças da comunidade científica e da sociedade em geral são as terapias com células-tronco (ZAGO, 2005). Cultivo de células-tronco O cultivo celular é um conjunto de técnicas que permitem cultivar ou manter células isoladas fora do organismo, e tem como objetivo a expansão do número dessas células. Essa expansão é realizada pela manutenção das células em frascos ou placas de cultivo, em meio apropriado, suplementado com diversos fatores, até que estas atinjam 80-85% de confluência, quando são submetidas à tripsinização, processo no qual são transferidas e expandidas para mais frascos ou frascos maiores, técnica denominada de passagem celular, que permite a ampliação do estoque celular e sua utilização em pesquisas cientificas (FRESHNEY, 2005). As células isoladas e destinadas ao cultivo celular são mantidas em incubadora a 37ºC com 5% CO2, o que facilita a manutenção do ph do meio, permitindo que as trocas das células com o meio sejam mais eficientes (FRESHNEY, 2005). Diversos meios de cultivo já foram testados para manutenção das CTM, dentre eles MEM, Meio Essencial Mínimo modificado por Dulbeccos (DMEM), RPMI-1640, Meio Basal de Eagle (BME), dentre outros, acrescidos de Soro Fetal Bovino (SFB), normalmente na concentração de 10-20%, sendo a escolha do meio uma variável importante para o sucesso do crescimento e diferenciação das CTM em cultivos celulares in vitro (TAPP et al., 2009). As CTM podem ser cultivadas em meio de cultivo completo, em frascos ou placas de cultura, nos quais elas se aderem, começam a se proliferar e formam as UFC- F (KRAMPERA et al., 2006). Essas células se tornam uma população aderente cada vez mais homogênea e de acordo com estudos de caracterização com CTM humanas, tem potencial para se proliferarem sem se diferenciarem por até 40 passagens (HORWITZ et al., 1999; PITTENGER et al., 1999).

33 33 A separação de células para o cultivo pode ser efetuada através de diversos gradientes de densidade de alto peso molecular. Dentre eles estão o Ficoll-Hypaque, Histopaque, Isolymph e Nycomed, os quais apresentam a função de isolar linfócitos e células mononucleares do sangue periférico e da medula óssea (ISLAM, 1995). O gradiente de densidade Ficoll tem merecido destaque, por ser de fácil aplicabilidade, rápido e favorecer a concentração de células mononucleares, atingindo altos níveis de rendimento celular (OLIVEIRA, 2009). O princípio da técnica de separação baseia-se na densidade do gradiente em relação aos linfócitos, monócitos e plaquetas, os quais não conseguem penetrar pelo gradiente. Esses se depositam na interface entre o Ficoll e o plasma, formando o chamado anel celular. A migração celular durante o processo de centrifugação com o Ficoll resulta na formação de camadas contendo diferentes tipos celulares (Amersham BIOSCIENCES, 2002). Nos primeiros estudos para separação de células-tronco foi utilizado Percoll, que apresenta o mesmo funcionamento dos outros gradientes de densidade apresentados. Com o mesmo propósito, WAGNER et al. (2005) utilizaram Biocoll, com sucesso, para isolamento da medula óssea de humanos e DVORAKOVA et al. (2008) utilizaram Ficoll-paque. Sung et al. (2008) realizaram isolamento das CTM da medula óssea de camundongos com Histopaque. Em uma variação do protocolo original de separação e isolamento de célulastronco, a medula óssea coletada de camundongo é centrifugada e as células resultantes são lavadas com meio de cultivo e então semeadas em frasco de cultivo (TROPEL et al., 2004; Lennon & Caplan, 2006). Nesse caso, as células não aderentes são removidas após três dias, removendo-se dessa forma as células sanguíneas e excluindo-se o uso de um separador por gradiente de densidade. O cultivo de CTM é feito selecionando-se as células com propriedade de adesão ao plástico, sendo que as células que permanecem em suspensão são facilmente removidas. Os outros tipos celulares contaminantes como os macrófagos, são eliminados após um determinado número de passagens em cultura (JAVAZON et. al., 2004). Estas células aderentes são heterogêneas e ficam inativas por dois a quatro dias, quando começam a proliferar rapidamente. Após várias passagens em cultura, as células aderentes se tornam fibroblastóides (BYDLOWSKI et al., 2009). Toda CTM não diferenciada exibe morfologia fibroblástica e padrão característico de marcadores de superfície (MARTIN et al., 2002). Esses critérios,

34 34 juntamente com a habilidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, têm sido usados para definição de um protótipo de fenótipo para CTM que seja consistente entre as diferentes espécies (MARTIN et al., 2002), incluindo rato (WOODBURY et al., 2000), camundongo (PHINNEY et al., 1999), cão (KADIYALA et al., 1997b) e humano (PITTENGER et al., 1999). O padrão ouro para a identificação das CTM foi estabelecido por PITTENGER et al. (1999) como fibroblastos capazes de se diferenciarem em três linhagens principais: osteoblástica, adipocítica e condrocítica. Essa definição funcional permite a afirmação da natureza de uma população das CTM na ausência de marcadores específicos. Além desses tipos, as CTM podem ser expandidas ex vivo e induzidas in vitro a se diferenciar em diferentes tipos celulares esqueléticos encontrados em vários estágios do desenvolvimento, assim como em sítios anatômicos específicos. Tais tipos celulares incluem osteoblastos (osso), condrócitos (cartilagem), adipócitos (estroma medular), fibroblastos (periósteo), e células reticulares (estroma medular) (BIANCO et al. 2008). Além de sofrer diferenciação não convencional tanto in vitro como in vivo, formando células do tipo neural, endodermal, e cardiomiócitos, derivadas, portanto, de folhetos embrionários diferentes do mesenquimal. Laboratorialmente, as células mesenquimais isoladas e posteriormente expandidas podem ser conduzidas a diferenciação em múltiplas linhagens fenotípicas, quando cultivadas em meios específicos contendo fatores de crescimento ou outras substâncias como dexametasona, indometacina, hidrocortisona e fatores de crescimento de transformação (TGF-β) (JONES et. al., 2002). Apesar dos avanços obtidos no emprego de células-tronco como auxiliares no tratamento de inúmeras enfermidades, muitos questionamentos ainda não foram esclarecidos. Assim, é possível argumentar que a grande preocupação acerca dos fatores de sucesso e insucesso dos procedimentos de cultura celular tem relação com o número de células obtidas nas colheitas, sua diferenciação e viabilidade nos meios utilizados (PEREIRA et al., 2008), principalmente, quando se trata das células com potencial reparador, as chamadas células-tronco mesenquimais (PROCKOP et al., 2003). Uso das CTM na Medicina Veterinária Diversos estudos vêm sendo realizados na Medicina Veterinária com o intuito de isolar e caracterizar as CTM a partir de amostras de vários tecidos celulares, e de

35 35 diferentes animais. Essas pesquisas têm como objetivos elaborar protocolos padrões para separação, isolamento, cultivo e caracterização destas células, de forma a contribuir para o seu uso em terapias humanas e animais, principalmente no tocante a tratamentos visando à recuperação de lesões, sejam elas ósseas, epiteliais, dentre outras. Inicialmente, os trabalhos envolvendo animais como ratos e camundongos foram realizados, principalmente, com objetivo de utilizar um modelo animal para pesquisas com humanos, como os trabalhos de BARROS et al. (2001) que utilizaram célulastronco na reparação de falhas experimentais em rádio de coelhos, e de ARGÔLO NETO (2009) e MONTEIRO (2009) que utilizaram culturas de CTM marcadas pela proteína fluorescente verde em aplicações autógenas in situ, no tratamento de lesões epiteliais de pacientes diabéticos e de lesões ósseas na calota craniana, demonstrando cicatrização das feridas cutâneas em camundongos diabéticos e reparação de defeitos ósseos críticos, respectivamente. Atualmente, as pesquisas em Medicina Veterinária têm utilizado felinos, caninos, equinos, ovinos e caprinos. Em gatos, MARTIN et al. (2002) realizaram o isolamento e caracterização de CTM provenientes de amostras da medula óssea. Estudos realizados com cães isolaram estas células da medula óssea (CSAKI et al., 2007), tecido adiposo e medula óssea (Silveira et al., 2009) e do cordão umbilical (LEE et al., 2013). Em equinos já foi comprovado o isolamento deste tipo celular em tecido adiposo (CARVALHO et al., 2009), cordão umbilical (REED & JONHSON, 2012), e medula óssea (Seo et al., 2012), sendo realizadas diversas pesquisas voltadas para o uso de células-tronco na reparação de lesões como de tendões, articulações e ligamentos (PACINI et al., 2007; GODWIN et al., 2012; SOLE et al., 2012; FERRIS et al., 2013). Isolamento de células-tronco também foram realizados em ratos (KADIYALA et al., 1997ª; LENNON & CAPLAN, 2006), camundongos (BITTENCOURT et al., 2006; YAMAMOTO et al., 2007; SUNG et al., 2008), ovinos, sendo utilizadas amostra de tecido adiposo e cordão umbilical (FADEL et al., 2011) e em tecido adiposo e fluido amniótico de caprinos (REN et al., 2012; PRATHEESH et al., 2013). Considerações finais A capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares das células-tronco mesenquimais é de grande interesse da comunidade cientifica devido, principalmente, a

36 36 sua importância para o sucesso das terapias celulares, reestabelecendo de maneira mais rápida o funcionamento normal de tecidos lesados. Atualmente, com o avanço do conhecimento sobre células-tronco e das técnicas moleculares, a ciência conseguiu gerar informações importantes para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças. Dessa forma, os avanços nas pesquisas sobre terapias celular têm colaborado para o bem-estar animal, proporcionando uma melhor qualidade de vida, redução da dor e do período de recuperação dos mesmos. Considerando a vasta capacidade das CTM, pesquisas mais abrangentes, destinadas a outros interesses médico-veterinários, poderiam ser realizadas com o intuito de ampliar a utilização e importância destas células. A implementação de linhagens de células-tronco como ferramenta para o isolamento de patógenos em cultivo celular se apresenta como potencial alternativa as pesquisas com células indiferenciadas, não se restringindo apenas ao seu uso em terapias regenerativas. Referências Bibliográficas AMERSHAM BIOSCIENCES. Ficoll-Paque Plus. For in vitro isolation of lymphocytes. New Jersey, 18 p, ARGÔLO-NETO, N. M. Tratamento de feridas cutâneas experimentais em camundongos (Mus musculus C57BL/6) diabéticos com células-tronco mesenquimais aplicadas de forma isolada e associadas ao plasma autólogo rico em plaquetas. Tese de Doutorado em Medicina Veterinária, Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, MG, 121p, BARROS, S.V.G.; DEL CARLO, R. J.; VIROLIA, M. I.; GALVÃO, S. R.; MAIA FILHO, A.; OLIVEIRA, D. R. Auto-enxerto percutâneo de medula óssea. II - Reparação de falhas segmentares produzidas no rádio de coelhos. Ciência Rural. 31: , BIANCO, P.; ROBEY, P. G.; SIMMONS, P. J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2: , BITTENCOURT, R.A.C.; PEREIRA, H.R.; FELISBINO, S.L.; MURADOR, P.; OLIVEIRA, A.P.E.; DEFFUNE, E. Isolamento de células tronco mesenquimais da medula óssea. Acta Ortopédica Brasileira, 14(1):22-24, BJORNSON, C. R.; RIETZE, R. L.; REYNOLDS, B. A.; MAGLI, M. C.; VESCOVI, A. L. Turning Brain

37 37 into Blood: A Hematopoietic Fate Adopted by Adult Neural Stem Cells in Vivo. Science, 283(5401): , BOBIS, S.; JAROCHA, D.; MAIKA, M. Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications. Folia Histochemica et Cytobiological. 44: , BLAU, H. M.; BRAZELTON T. R.; WEIMANN J. M. The evolving concept of a stem cell: entity or function? Cell. 105(7):829-41, BYDLOWSKI, S. P.; DEBES, A. A.; MASELLI, L. M. F.; JANZ, F. L. Características biológicas das células-tronco mesenquimais. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. São Paulo, 31(Supl. 1): 25-35, CAPLAN, A.I. Why are MSCs therapeutic? New data: new insight. Journal of Pathology. 217: , CARVALHO, A. M.; ALVEZ, A. L. G.; GOLIM, M. A.; MOROZ, A.; HUSSINI, C. A.; OLIVEIRA, P. G. G.; DEFFUNE, E. Isolation and immunophenotypic characterization of mesenchymal stem cells derived from equine species adipose tissue. Veterinary Immunology and Immunopathology. 132: , CLARKE, D. L.; JOHANSSON, C. B.; WILBERTZ, J.; VERESS, B.; NILSSON, E.; KARLSTROM, H.; LANDAHL, U.; FRISÉN, J. Generalized Potential of Adult Neural Stem Cells. Science, 288(5471): , CSAKI, C.; MATIS, U.; MOBASHERI, A.; YE, H.; SHAKIBAEI, M. Chondrogenesis, osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells: a biochemical, morphological and ultrastructural study. Histochemistry and Cell Biology. 128(6): , DVORAKOVA, J.; HRUBA, A.; VELEBNY, V.; KUBALA, L. Isolation and characterization of mesenchymal stem cell population entrapped in bone marrow collection sets. Cell Biology International. 32: , FADEL, L. Caracterização morfológica de células-tronco mesenquimais de sangue umbilical e de tecido adiposo coletados por via intra-abdominal e uterina em ovinos. Dissertação de mestrado, Universidade de São Paulo, 57 p, FERRIS, D.J.; FRISBIE, D.D.; KISIDAY, J.D.; MCILWRAITH, C.W.; HAGUE, B.A.; MAJOR, M.D.; SCHNEIDER, R.K.; ZUBROD, C.J.; KAWCAK, C.E.; GOODRICH, L.R. Clinical followup of thirty-three horses treated for stifle injury with bone marrow derived mesenchymal stem cells intra-articularly. Veterinary Surgery, in press

38 38 FODOR, W. L. Tissue engineering and cell based therapies, from the bench to the clinic: the potential to replace, repair and regenerate. Reprod Biol Endocrinol. 1:102, FRESHNEY, R.I. Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique. 5 ed. Editora John Wiley & Sons. Nova Jersey. 672 p, FRIEDENSTEIN, A. J. P. I.; PETRAKOVA, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. The Journal of Embryological Experimental Morphology. 16: , FRIEL E, SAR S, MEE JP. Embryonic stem cells: understanding their history, cell biology and singnalling. Adv Drug Deliv Rev. 57: , GODWIN, E.E.; YOUNG, N.J.; DUDHIA, J.; BEAMISH, I.C.; SMITH, R.K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44:25 32, HORWITZ, E. M.; PROCKOP, D. J.; FITZPATRICK, L. A.; KOO, W. W.; GORDON, P. L.; NEEL, M.; SUSSMAN, M.; ORCHARD, P.; MARX, J. C.; PYERITZ, R. E.; BRENNER, M. K. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfect. Nat Med.5: , HUSS, R. Cells from various sources isolation of primary and immortalized CD34 hematopoietic and mesenchymal stem. Stem Cells. 18(1):1-9, ISLAM, A. A new, fast and convenient method for layering blood or bone marrow over density gradient medium. Journal of Clinical Pathology. Londres, 48(7): , JAVAZON, E.H.; BEGGS, K.J.; FLAKE, A.W. Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging. Experimental Hematology. Copenhagen, 32(5): , JONES, E. A.; KINSEY, S. E.; ENGLISH, A.; JONES, R. A.; STRASZYNSKI, L.; MEREDITH, D. M.; MARKHAM, A. F.; JACK, A.; EMERY, P.; MCGONAGLE, D. Isolation and characterization of bone marrow multipotential Mesenchymal progenitor cells. Arthritis Rheum. 46: , KADIYALA, S.; JAISWAL, N.; BRUDER, S. P. Culture-expanded, bone marrowderived mesenchymal stem cells can regenerate a critical-sized segmental bone defect. Tissue engineering. 3(2): , 1997a.

39 39 KADIYALA, S.; YOUNG, R.G.; THIEDE, M.A.; BRUDER, S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell transplant. 6(2): , 1997b. KRAMPERA, M.; COSMI, L.; ANGELI, R.; PASINI, A.; LIOTTA, F.; ANDREINI, A.; SANTARLASCI, V.; MAZZINGHI, B.; PIZZOLO, G.; VINANTE, F.; ROMAGNANI, P.; MAGGI, E.; ROMAGNANI, S.; ANNUNZIATO, F. Role for Interferon-g in the Immunomodulatory Activity of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells.24: , LAZZAROTTO-SILVA C.; BINATO R.; ROCHER B. D.; COSTA J.A.; PIZZATTI L.; BOUZAS L. F.; ABDELHAY E. Similar proteomic profiles of human mesenchymal stromal cells from different donors. Cytotherapy. 11(3):268-77, LEE, R. H.; KIM, B.; CHOI, I.; KIM, H.; CHOI, H. S.; SUH, K; BAE, Y. C.; JUNG, J. S. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cellular Physiology and Biochemistry. 14: , LEE, K. S.; NAH, J.-J.; LEE, B.-C.; LEE, H.T.; LEE, H.-S.; SO, B.-J.; CHA, S.-H. Maintenance and characterization of multipotent mesenchymal stem cells isolated from canine umbilical cord matrix by collagenase digestion. Research in Veterinary Science 94: , LENNON, D.P. & CAPLAN, A.I. Isolation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Hematology. 34: , MAMBELLI, L.I.; SANTOS, E. J.; FRAZÃO, P. J.; CHAPARRO, M. B.; KERKIS, A.; ZOPPA, A. L.; KERKIS, I. Characterization of equine adipose tissue derived progenitor cells before and after cryopreservation. Tissue Engineerin.15(1):87-94, MARTIN, D.R.; COX, N.R.; HATHCOCK, T.L.; NIEMEYER, G.P.; BAKER, H.J. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. Experimental hematology. 30: , MEIRELLES, L.S.; CAPLAN, A. L.; NARDI, N. B. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 26: , MEIRELLES, L. S., CHAGASTELLES, P. C., NARDI, N. B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of Cell Science, 119: , MIAO, Z.; JIN, J.; CHEN, L.; ZHU, J.; HUANG, W.; ZHAO, J.; QIAN, H.; ZHANG, X. Isolation of mesenchymal stem cells from human placenta:

40 40 Comparison with human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Biology International. 30: , MINGUELL, J.J.; CONGET, P.; ERICES, A. Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells. Brazilian. Journal of Medical and Biological Research. 33(8): , MONTEIRO, B.S. Tratamento de defeitos críticos em calvária de camundongos com células-tronco mesenquimais associadas ou não ao plasma rico em plaquetas. Tese (Doutorado Medicina Veterinária) Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, MG, 109p, OLIVEIRA, B.J.N.A. Enxerto osteocondral alógeno, associado á inoculação de células mononucleares da medula óssea e proteína morfogenética óssea no reparo do sulco troclear de coelhos. Dissertação de Mestrado em Ciências Veterinárias, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 53p, PACINI, S.; SPINABELLA, S.; TROMBI, L.; FAZZI, R.; GALIMBERTI, S.; DINI, F.; CARLUCCI, F.; PETRINI, M. Suspension of bone marrow-derived undifferentiated mesenchymal stromal cells for repair of superficial digital flexor tendon in race horses. Tissue Engineering. 13: , PEREIRA, L. P. A importância do uso das células-tronco para saúde pública. Ciência & Saúde Coletiva. 13(1): 7-14, PEREIRA, I.S.O.; PONTES, P.; EÇA, L.P.; FERREIRA, A.T.; MAZZETTI, P.M.V.; SILVA, L.; SOUZA, F.C. Protocolo piloto de separação e quantificação de célulastronco de tecido adiposo de coelhos para posterior uso em laringe. Acta ORL. São Paulo, 26(3):11-16, PHINNEY, D. G.; KOPEN, G.; RIGHTER, W.; WEBSTER, S.; TREMAIN, N.; PROCKOP, D. J. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells. J Cell Biochem. 75: , PITTENGER, M.F.; MACKAY, A.M.; BECK, S.C.; JAISWAL, R.K.; DOUGLAS, R.; MOSCA, J.D.; MOORMAN, M.A.; SIMONETTI, D.W.; CRAIG, S.; MARSHAK, D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284(5411): , PRATHEESH, M.D.; GADE, N. E.; KATIYAR, A. N.;. DUBEY, P. K.; SHARMA, B.; SAIKUMAR, G.; AMARPAL; SHARMA, G.T. Isolation, culture and characterization

41 41 of caprine mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid. Research in Veterinary Science. 94: , PROCKOP, D. J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. Pennsylvania, 276(5309):71-74, PROCKOP, D.J.; GREGORY, C.A.; SPEES, J.L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 100(1): , REBELATTO, C. K.; AGUIAR, A. M.; MORETÃO, M. P,; SENEGAGLIA, A. C.; HANSEN, P.; BARCHIKI, F.; OLIVEIRA, J.; MARTINS, J.; KULIGOVSKI, C.; MANSUR, F.; CHRISTOFIS, A.; AMARAL, V. F.; BROFMAN, P. S.; GOLDENBERG, S.; NAKAO, L. S.; CORREA, A. Dissimilar differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue. Experimental Biology and Medicine. 233: , REED S. A.; JOHNSON S. E Refinement of Culture Conditions for Maintenance of Undifferentiated Equine Umbilical Cord Blood Stem Cells. Journal of Equine Veterinary Science. 32: , REN, Y.; WU, H.; ZHOU, X.; WEN, J.; JIN, M.; CANG, M.; GUO, X.; WANG, Q.; LIU, D.; MA, Y. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93: , SEO, J.-P.; TSUZUKI, N.; HANEDA, S.; YAMADA, K.; FURUOKA, H.; TABATA, Y.; SASAKI, N. Proliferation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells in gelatin/b-tricalcium phosphate sponges. Research in Veterinary Science. 93: , SILVEIRA, A. C. C.; LIMA, R. S.; PENHA, E. M.; MACAMBIRA, S. G.; SOARES, M. B. P.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, R.; BARROUIN-MELO, S. M.; AGUIAR, P. H. P. Harvest and characterization of mesenchymal canine stem cells from adipose tissue and bone marrow. In: 8th International Veterinary Immunology Symposium, Ouro Preto. Veterinary Immunology and Immunopathology. 128:342, SOLE, A.; SPRIET, M.; GALUPPO, L.D.; PADGETT, K.A.; BORJESSON, D.L.; WISNER, E.R.; BROSNAN, R.J.; VIDAL, M.A. Scintigraphic evaluation of intraarterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived

42 42 mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99 m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, , SUNG, J.H.; YANG, H.-M.; PARK, J.B.; CHOI, G.-S.; JOH, J.-W, KWON, C.H.; CHUN, J.M., LEE, S.-K.; KIM, S.-J. Isolation and characterization of mouse mesenchymal stem cells. Transplantation proceedings. 40: , TAPP, H.; HANLEY, E. N.; PATT, J. C.; GRUBER, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Experimental Biology and Medicine. 234:1-9, TROPEL, P.; NÖEL D.; LEGRAND P.; BENABID, A.; BERGER, F. Isolation and characterization of mesenchymal stem cell from adult mouse bone marrow. Experimental cell research. 295: , UCHIDA, N.; BUCK, D. W.; HE, D.; REITSMA, M. J.; MASEK, M.; PHAN, T. V.; TSUKAMOTO, A. S.; GAGE, F. H.; WEISSMAN, I. L. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97(26): , WAGNER, W.; WEIN, F.; SECKINGER, A.; FRANKHAUSER, M.; WIRKNER, U.; KRAUSE, U.; BLAKE, J.; SCHWAGER, C.; ECKSTEIN, V.; ANSORGE, W.; HO, A.D. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Experimental Hematology. 33: , WAN, C.D.; CHENG, R.; WANG, H. B.; LIU, T. Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells derived from adipose tissues in a rat orthotopic liver transplantation model. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 7:29-33, WEXLER, S.A.; DONALDSON, C.; DENNING-KENDALL, P.; RICE, C.; BRADLEY, B.; HOWS, J.M. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. British Journal of Haematology. London, 121(2): , WILSON A. & TRUMPP A. Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat Rev Immunol. 6:93-106, WOODBURY, D.; SCHWARZ, E.J.; PROCKOP, D.J.; BLACK, I.B Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61(4): , 2006.

43 43 YAMAMOTO, N.; AKAMATSU, H.; HASEGAWA, S.; YAMADA, T.; NAKATA, S.; OHKUMA, M.; MIYACHI, E.-I.; MARUNOUCHI, T.; MATSUNAGA, K. Isolation of multipotent stem cells from mouse adipose tissue. Journal of Dermatological Science. 48(1):43-52, ZAGO, M. A., COVAS, D. T. Pesquisas com células-tronco: aspectos científicos, éticos e sociais. Seminário Instituto Fernando Henrique Cardoso, 1:1-20, ZAGO, M. A. Terapia com células-tronco: fundamentos, oportunidades e obstáculos. Revista da sociedade brasileira de hipertensão. 8(4): , ZUCCONI, E.; VIEIRA, N. M.; BUENO, D. F.; SECCO, M.; JAZZEDJE, T.; AMBROSIO, C. E.; PASSOS-BUENO, M. R.; MIGLINO, M. A.; ZATZ, M. Mesenchymal stem cells derived from canine umbilical cord vein - a novel source for cell therapy studies. Stem Cells and Development, in proof, 1-33, ZUK, P. A.; ZHU, M.; MIZUNO, H.; HUANG J.; FUTRELL, J. W.; KATZ, A. J.; BENHAIM, P.; LORENZ, H. P.; HEDRICK, M. H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7(2): , Recebido em 10/03/2014 Aceito em 14/05/2014

44 44 7. CAPÍTULO 2 ISOLATION, CULTURE AND CHARACTERIZATION OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STEM CELLS FROM GOAT UMBILICAL CORD BLOOD Periódico: Pesquisa Veterinária Brasileira, aceito para publicação em 13 de outubro de 2016.

45 45 ABSTRACT Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these cells. However, it has not been demonstrated the MSC isolation from the goat UCB. Therefore, the aims of the present study were to isolate, culture and characterize goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10% or 20% FBS. It was performed FACS analysis and induction lineage differentiation for characterize these cells. These cells exhibited two different populations in flow cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but negative staining for CD34 in larger cells; and positive stained for CD90 and CD105, but negative for CD44 and CD34, in the smaller cells. MSC from goat UCB showed capability to differentiate in chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific differentiation medium. Present study establishes that goat mesenchymal stem cells can be derived successfully from umbilical cord blood.

46 46 Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells from goat umbilical cord blood Gabrielle R. Martins 2 *, Rebeca C. Marinho 2, Rosivaldo Q. Bezerra-Junior 2, Lilia M. C. Câmara 3, Luiz C. Albuquerque-Pinto 3, Maria F. S. Teixeira 2,4 ABSTRACT - Gabrielle R. Martins2*, Rebeca C. Marinho2, Rosivaldo Q. Bezerra- Junior2, Lilia M. C. Câmara3, Luiz C. Albuquerque-Pinto3, Maria F. S. Teixeira2, Isolation, culture and characterization of multipotent mesenchymal stem cells from goat umbilical cord blood. Laboratório de Virologia, Núcleo de Pesquisa em Sanidade Animal, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Av. Dr. Silas Munguba, 1700, CEP , Fortaleza, CE, Brazil. corresponding author: rmgabrielle@hotmail.com. Mesenchymal stem cells (MSC) reside in small numbers in many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow, adipose tissues and amniotic fluid. Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of these cells. However, it has not been demonstrated the MSC isolation from the goat UCB. Therefore, the aims of the present study were to isolate, culture and characterize goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MSC were isolated from UCB by Ficoll-Paque density centrifugation and cultured in DMEM supplemented with 10% or 20% FBS. It was performed FACS analysis and induction lineage differentiation for characterize these cells. These cells exhibited two different populations in flow cytometry, and revealed the positive expression of CD90, CD44 and CD105, but negative staining for CD34 in larger cells; and positive stained for CD90 and CD105, but negative for CD44 and CD34, in the smaller cells. MSC from goat UCB showed capability to differentiate in chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific differentiation medium. Present study establishes that goat mesenchymal stem cells can be derived successfully from umbilical cord blood. INDEX TERMS: MSC, caprine, flow cytometry, stem cell, lineage differentiation. 1- Received on June 06, Accepted for publication on October 13, Laboratório de Virologia, Núcleo de Pesquisa em Sanidade Animal; Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Av. Dr. Silas Munguba, 1700, Itapery, Fortaleza, CE, CEP , Brazil. * corresponding author: rmgabrielle@hotmail.com. 3- Laboratório de Imunologia, Programa de Pós-graduação em Microbiologia Médica, Universidade Federal do Ceará, Rua Alexandre Baraúna, 994, Rodolfo Teófilo, Fortaleza, CE, CEP , Brazil. 4- Bolsista Produtividade em Pesquisa-CNPq RESUMO. [Isolamento, cultura e caracterização de células tronco mesenquimais multipotentes provenientes do sangue do cordão umbilical caprino.] As células tronco mesenquimais (MSC) residem em pequenas quantidades em muitos tecidos e órgãos adultos, desempenhando um papel ativo na homeostase destes locais. O isolamento de MSC já foi demonstrado em amostras de medula óssea, tecido adiposo e fluido amniótico de cabras. O sangue de cordão umbilical é considerado uma fonte importante

47 47 desse tipo de células. No entanto, até o presente momento, não foi demonstrado o isolamento de MSC provenientes do sangue de cordão umbilical de cabras. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi isolar, cultivar e caracterizar células tronco mesenquimais provenientes do sangue do cordão umbilical caprino. As MSC foram isoladas utilizando o gradiente de densidade Ficoll-Paque e cultivadas em DMEM suplementado com 10% ou 20% de FBS. A caracterização desse tipo celular foi realizada através de análise por citometria de fluxo e diferenciação em linhagens celulares mesodermais. A analise no citômetro de fluxo demonstrou a presença de duas populações distintas, um grupo com células maiores e outro com células menores; observando expressão positiva de CD90, CD44 e CD105, e negativa para CD34 nas células maiores; enquanto que as menores foram positivas para CD90 e CD105, mas negativas para CD44 e CD34. As células isoladas demonstraram capacidade de se diferenciar em condrócitos e osteoblastos quando incubadas com meio de diferenciação específico. O presente estudo demonstrou que células tronco mesenquimais podem ser obtidas com sucesso do sangue do cordão umbilical caprino. TERMOS DE INDEXAÇÃO: MSC, caprino, citometria de fluxo, células tronco, diferenciação em linhagens. INTRODUCTION Mesenchymal stem cells (MSC), first obtained from bone marrow aspirate, have a great plasticity and are able to differentiate into bone, cartilage, fat tissue and even muscle (Pountos and Giannoudis, 2005). MSC was originally described for Friedenstein et al. (1968) in bone marrow as a component of the marrow stromal cell population that collectively supports hematopoietic stem cell persistence and differentiation. However, since this initial description, it is now recognized that MSC reside in small numbers in many adult tissues and organs, and play an active role in the homeostasis of these sites. These cells can be isolated from others different tissues, such as the umbilical cord blood and matrix, adipose tissue, synovial membranes, embryonic tissue, and amniotic fluid (Chang et al. 2006; Lee et al. 2013; Orbay et al., 2012; Pratheesh et al., 2013; Ren et al., 2012; Reed and Jonhson, 2012). Umbilical cord blood (UCB) is considered an important source of many types of stem cells, including hematopoietic stem cells (HSC), endothelial progenitors, mesenchymal stem cells (MSC), very small embryonic/epiblast-like (VSEL) stem cells, and unrestricted somatic stem cells (USSC), potentially suitable for use in regenerative medicine (Pelosi et al., 2012). Researches with UCB stem cells still face some difficulties, mainly during the isolation process (Mareschi et al., 2001; Wexler et al., 2003). MSC was isolated from umbilical cord of human (Chang et al., 2006; Lee et al.,

48 ), sheep (Fadel et al., 2011), equine (Reed and Johnson, 2012) and canine (Lee et al., 2013). Minimum criteria for the characterization of human MSC were created. These should present adherence to the plastic, positive expression for the surface markers CD105, CD73 and CD90, negative expression for the markers CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79a or CD19 and the HLA-DR surface molecules, and present the capability to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes in vitro (Dominici et al., 2006). However, one major difficulty in characterizing MSC in veterinary medicine is due to the low number of specific monoclonal antibodies available and evidence that certain markers from human and mouse do not present a cross-reaction with others species (Taylor et al., 2007). There is a large number of a positive marker described, but each group of investigators using different markers, none specific or single. Perhaps the differences between studies may be attributed to variations in culture methods or stage of cells differentiation (Bydlowski et al., 2009). Mesenchymal stem cells have low immunogenicity, thus allowing their potential use in regenerative medicine. Human MSC (hmsc) are characterized by the low expression of the major histocompatibility complex class I and are described by their immunomodulatory effect on immune system cells. Additionally, hmsc fail to induce proliferation of allogeneic or xenogeneic lymphocytes, causing effects on B lymphocyte function, inhibiting its differentiation into plasma cells, and showed to interfere with dendritic cell differentiation, maturation, and function (Krampera et al., 2003; Jiang et al., 2005). In equines, preliminary studies examining the use of umbilical cord and placentally derived MSC have suggested that such cells do not incite a cellular immune response, even after repeated injections (Carrade et al., 2011a,b). It is important to recognize that MSC from neonatal sources are likely more immune-privileged than those derived from adult sources. MSC are remarkable potential as a cell mediate repair and regenerative medicine for fatal or incurable diseases, such as spinal cord injury, arthritis, and ischemic heart injury, has been demonstrated in the field of stem cell therapy (Hatami et al., 2009; Pittenger and Martin, 2004; Sharp et al., 2010). Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow (Zhang et al., 2012), adipose tissues (Ren et al., 2012), and amniotic fluid (Pratheesh et al., 2013). However, it has not demonstrated the isolation of mesenchymal stem cells from the goat umbilical cord blood. Therefore, the aims of the experiments in this study were

49 49 to isolate, phenotypically characterize and investigate the differentiation potentials of goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells. MATERIALS AND METHODS Animals and samples. All experiments were approved by the Ethics Committee for Animal Use at the State University of Ceará, protocol number For this study, mongrel pregnant goats were used, aged between two and three years and free of infection by SRLV. Blood samples were collected during calving. After birth, the goat umbilical cord was clamped in the end next to the fetus, and the umbilical cord blood (UCB) was harvested by syringe aspiration and packed in sterile tube with EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid). The samples were transported within 2h to the laboratory, packed in isothermal box with ice. Isolation and culture. Mesenchymal stem cells were isolated from goat UCB by Ficoll-Paque density centrifugation (600g for 10 min) and cultured in low glucose DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco, Grand Island, NY, USA). The cells were seeded in A25 cell culture flasks and cultured at 37 C in a CO2 incubator (5% CO2). After 4-5 days growth, fibroblast-like plastic-adherent cells were observed. The media was changed after 5 days to avoid any mechanical stress, and thereafter, it was replenished every third day until obtain confluent cell monolayer. It was observed slow growth, due to this; it was increased FBS concentration for 20%, promoting a better cell growth. At 80% confluence, cells were trypsinized (0,25% Trypsin-EDTA, Gibco, Grand Island, NY, USA) and reseeded in new cell culture flask for expand the cell stock. For all the experiments, mesenchymal stem cells were taken from third passage, whereas rest of the cells was allowed to grow further. Chondrogenic differentiation. Chondrogenic differentiation was induced in micromass cultures by seeding 5 μl droplets of cell solution ( viable cells/ml) in the center of 24-well plate. The cells were incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS for 2 hours. Afterward, the cells were fed with a specific chondrogenesis differentiation medium (StemPro, Gibco, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced

50 50 every 2-3 days. After 14 days, chondrogenic differentiation was confirmed by staining for Alcian Blue (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA). Osteogenic differentiation. To induced osteogenic differentiation, the cells from the confluent monolayer of the third passage (5 x 103 cells/cm²) were seeded in to a 24-well plate and incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS. After 24h, the medium was discarded, and cells were cultured in StemPro Osteocyte Differentiation Basal Medium (StemPro, Gibco, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced every 2-3 days. After 14 days of culture, osteogenic differentiation of stem cells was confirmed by Alizarin Red S staining (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA). Adipogenic differentiation. For adipogenic differentiation, trypsinized cells (1 x 104 cells/cm²) were seeded into a 24-well plate and incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS. After 24 h, the medium was discarded, and the cells were incubated with StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Medium (Gibco, Grand Island, NY, USA). The differentiation medium was replaced every 3-4 days. After 14 days of culture, the cells were fixed with 10% formalin at room temperature, washed with PBS, and stained with 0,5% Oil-Red O (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA) for 15 min and Mayer s Hematoxylin (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA) for 5 min to visualize lipid droplets. FACS analysis. FACS analysis was performed to investigate the expression of the surface markers CD90 FITC, CD105 APC, CD44 PE and CD34 APC in goat umbilical cord blood derived MSC after the third passage. The cells were harvested and aliquoted at a density of 3,2 x 106 cells/ml for each marker assay. These cells were incubated with antibodies against surface markers [mouse anti-human CD90 FITC, CD105 APC, CD44 PE and CD34 APC (BD Biosciences, USA)] for 30 min at 4 C in the dark. Thereafter, the cells were washed twice with FACS buffer washes, fixed with formaldehyde buffer (PBS with formaldehyde 1%) and analyzed using a flow cytometer (FACS Calibur BD, BD Biosciences ). The negative control was processed in similar manner but without antibodies. The data obtained was analyzed using Flowjo software and plotted as single parameter histogram.

51 51 RESULTS Growth and culture characteristics of MSC MSC from goat umbilical cord blood began to adhere after 4-5 days of culture, first with a small, round, polygons and fibroblast-like cells, with some others types of blood cells (Fig. 1A). Gradually, they extended into small or large spindles, with uniform fibroblast-like morphology (Fig. 1B). Initially, the cells were being grown in DMEM supplemented with 10% FBS, however, the cells showed slow growth, not reached confluence, even after 15 days of incubation. In order to provide the best growth of these cells, the FBS concentration was changed for 20%. Cells culture in 20% FBS reached to 80-85% confluence faster about 8 days than those in 10% FBS in the same inoculation condition (Fig. 1C). MSC showed a typical fibroblast-like morphology after passage, with mix of short and long spindles. Cells at passage 3 were used in the differentiation and FACS analysis tests, whereas rest of the cells were allowed to grow further, and it observed that the growth and proliferation activity reduced with aging. Chondrogenic differentiation The chondrogenic potential of MSC from goat umbilical cord blood was evaluated by in vitro micromass cultures of these cells in a specific differentiation medium. After 14 days of incubation, the accumulation of sulfated proteoglycans was visualized by positive Alcian Blue staining (Fig. 2A). Osteogenic differentiation In osteogenic differentiation, cells proliferated and reached to complete confluence after 8-10 days of incubation with differentiation medium. The cellular aggregates were then observed and were characterized by calcium deposits, which demonstrated by positive Alizarin Red stain (Fig. 2B). Adipogenic differentiation Adipogenic differentiation of goat umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells was not confirmed. After incubated these cells with adipogenic-inducing medium for 14 days, sparsely small lipid droplets or even no lipid droplets were observed in the cytoplasm by Oil Red-O staining (Fig. 2C). Surface antigen profile by FACS analysis The study of cells by flow cytometry revealed the presence of two distinct populations of cells. The populations differed in size, being characterized as small or

52 52 large cells according to the characteristics of size and granularity observed. It evaluated the immunophenotypic characteristics through presence of surface molecules comparing both groups to negative control group. FACS analysis revealed the positive expression of CD90 (52%), CD44 (19%) and CD105 (15%), but negative staining for CD34 (2%) in larger cells. The smaller cells were positive for CD90 (32%) and CD105 (12%), but negative for CD44 (3%) and CD34 (1%). It observed difference about the fluorescent intensity in the groups. The larger cells showed major fluorescent intensity to CD90 than small cells. Negative control group of cells, which was processed in similar manner but without antibodies in the incubation, didn t show any expression of surface molecules analyzed. Negative control wasn t shown expression, It was represented in the graph area with fluorescent intensity less than 10¹ (Fig.3). DISCUSSION Umbilical cord blood represents a potentially important source of mesenchymal stem cells. These cells can be defined as multipotent stem cells capable of differentiating into different tissue cell types, including adipocytes, osteocytes, chondrocytes, myocytes and neuron-like cells. The main source of MSC is represented by marrow; however, UCB represents an important alternative source for generation of MSC (Lee et al., 2004). The umbilical cord is composed of several different parts (amniotic membrane, umbilical cord matrix, umbilical cord vein, and umbilical cord blood) that are available as source of MSC (Lee et al., 2013). In this study, MSC was isolated from goat umbilical cord blood and first, cultured in DMEM supplemented with 10% FBS, however, the cells showed slow growth. In order to provide the best growth of these cells, the FBS concentration was changed for 20% that demonstrated high efficiency to maintenance the culture, and contributed for quick amplification of cell stock. Several culture media have been tested for maintenance of MSC as MEM, DMEM, RPMI-1640 and Basal Medium Eagle (BME), supplemented with FBS, generally at concentration of 10-20%. The choice of the medium culture is important to success of MSC growth in the in vitro cell culture (Tapp et al., 2009). MSC were highly dependent on serum for growth. Cells cultured in 20% FBS reached to 80 85%

53 53 confluence faster than those in 10% FBS in the same inoculation density (Im et al., 2005). This is a first study that isolated MSC from goat UCB. It was observed different morphologic phenotypes in primary culture of MSC from goat UCB, but, gradually the cells exhibited uniform fibroblast-like morphology. Goat derived multipotent MSC have been established from bone marrow (Zhang et al., 2012), adipose tissues (Ren et al., 2012), and amniotic fluid (Pratheesh et al., 2013) that observed similar morphology in the same culture conditions. Phenotypic characterization was performed by flow cytometry. The general strategy for identifying in vitro cultivated mesenchymal stem cells as per ISCT (International Society for Cytotherapy) is to analyze the expressions of cell-surface markers such as CD-73, CD-44, CD-90 and CD-105 (Dominici et al., 2006; Donzelli et al., 2007). During the FACS analysis was observed two different populations, small and large MSC. Large MSC are positive for CD90, CD105 and CD44, whereas negative for CD34 surface marker. Small MSC are positive for CD90, CD105, but negative for CD44 and CD34. Differences in fluorescent intensity were observed, and large cells showed more intensity than small cells, mainly in CD90 marker expression. This result can be compared with others studies, Ren et al. (2012) described MSC from goat adipose stained positively for vimentin, CD49d and CD13, and negatively for CD34 and CD106. Caprine mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid were positive for CD90, CD105, CD73, and negative for CD34 (Pratheesh et al., 2013). Fadel et al. (2011) isolated MSC of ovine umbilical cord that were positive for CD44 and negative for CD38, CD41/61 and CD45. Lee et al. (2013) demonstrated by FACS analysis that canine umbilical cord matrix derived MSC were positive for CD44, CD90, CD 105, and CD184, whereas negative for the other CD markers such as CD29, CD33, CD34 and CD45. CD90 has been known as a negative regulator for hematopoietic proliferation (Mayani and Lansdrop, 1994), its expression associate CD34 negative staining confirm that there was no evidence of hematopoietic precursors in this culture. The levels expression of surface markers are also different in others studies. Chang et al. (2006) isolated cells from human UCB, and observed two different morphologic phenotypes: flattened fibroblastic clones and spindle-shaped fibroblastic clones. CD90 was differently expressed by these two cell populations. Spindle-shaped clonogenic MSC

54 54 expressed a high level of CD90, while flattened clonogenic MSC showed negative expression of CD90. CD105 is usually express in mesenchymal stem cells. CD34 is a surface marker of hematopoietic stem cells (HSC) and is expressed in lymph nodes, bone marrow HSC, and various endothelial cells. CD34 negative staining demonstrated that cells were not derived from circulating stem cells (Peng and Huard, 2004; Pittenger et al., 1999). CD44 is a hyaluronate receptor. The positive staining for CD44 antibody in flow cytometry argued with that published by Barry et al. (1999) and Martínez et al. (2009). These studies showed that CD44 is an antibody that characterizes mesenchymal cells for human and sheep fat tissue derived cells. In case of rabbits, CD44 is negative, according to researches published by Martínez et al. (2009). The differentiation potentials of MSC from goat UCB were investigated. These cells showed capability to differentiate in chondrocytes and osteoblasts when incubated with specific differentiation medium. Pratheesh et al. (2013) demonstrated that MSC from goat amniotic fluid, like their marrow counterparts, were able to differentiate into adipose cells in addition to osteogenic and chondrogenic lineages. Goat adipose-derived stem cells showed the same differentiation potential (Ren et al., 2012). Chang et al., 2006 investigated the same capability in MSC from human UCB and results showed that both types of clonogenic MSC (flattened fibroblastic clones and spindle-shaped fibroblastic clones) could differentiate into osteogenic and chondrogenic lineages under appropriate conditions. However, in adipogenic induction, the spindle shaped MSC exhibited many typical neutral lipid vacuoles within the cells as mature adipocytes, while the flattened MSC only contained sparsely small lipid droplets or even no lipid droplets at all. It was reported that UCB-derived MSC showed a reduced capability to undergo adipogenesis (Bieback et al., 2004). Recently, we have also found that UCBderived MSC have lower adipogenic potential than bone morrow-derived MSC in vitro (Chang et al., 2006). In this study, it was observed similar results, the MSC from goat UCB have lower adipogenic potential. However, the cell showed high capability to undergo chondrogenesis and osteogenesis. CONCLUSION Present studies establishes that goat mesenchymal stem cells can be derived successfully from umbilical cord blood, which exhibit morphology, growth characters,

55 55 immunophenotype and lineage differentiation potential similar with MSC of other origins. These results collaborate to advances in research and treatments using stem cells, demonstrating the potential and isolation as protocol of this cell type in goats. MSC have low immunogenicity, thus allowing their potential use in regenerative medicine. Acknowledgements.- This work was supported by the National Council of Scientific and Technological Development (CNPq), grant numbers / and /2013-9, and by Personnel Improvement Coordination higher level (CAPES), which provided a PhD scholarship. The authors are thankful to the Post Graduate Program in Veterinary Science (PPGCV) of the State University of Ceará for supporting the implementation of the experiments; to the Federal University of Ceará, particularly to Lilia Maria Carneiro Câmara, PhD, for unconditional support in performing the FACS analysis; and to Marcos Fábio Gadelha Rocha, PhD, and Júlio Sidrim, PhD (Post Graduate Medical Microbiology UFC). The authors also express their gratitude to owners of the farms that allowed the use of their animals for this study. Conflict of interest statement.- The authors have no competing interests. REFERENCES Barry F.P., Boynton R.E., Haynesworth S., Murphy J.M. & Zaia J The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD105). Biochem. Biophys. Res. Commun. 265: Bieback K., Kern S., Kluter H. & Eichler H Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Stem Cells 22: Bydlowski S.P., Debes A.A., Maselli L.M.F. & Janz F.L.L Características biológicas das células-tronco mesenquimais. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. 31(Supl. 1): Carrade D.D., Affolter V.K., Outerbridge C.A., Watson J.L., Galuppo L.D., Buerchler S., Kumar V., Walker N.J. & Borjesson D.L. 2011a. Intradermal injections of equine allogeneic umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are well tolerated and do not elicit immediate or delayed hypersensitivity reactions. Cytotherapy 13: Carrade D.D., Owens S.D., Galuppo L.D., Vidal M.A., Ferraro G.L., Librach F., Buerchler S., Friedman M.S., Walker N.J. & Borjesson D.L. 2011b. Clinicopathologic findings following intra-articular injection of autologous and allogeneic placentally derived equine mesenchymal stem cells in horses. Cytotherapy 13:

56 56 Chang Y.J., Tseng C.P., Hsu L.F., Hsieh T.B. & Hwang S.M Characterization of two populations of mesenchymal progenitor cells in umbilical cord blood. Cell Biology International. 30: Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Krause D.S., Deans R.J., Keating A., Dj Prockop & Horwitz E.M Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8: Donzelli E., Salvade A., Mimo P., Viganò M., Morrone M., Papagna R., Carini F., Zaopo A., Miloso M., Baldoni M. & Tredici G Mesenchymal stem cells cultured on a collagen scaffold: In vitro osteogenic differentiation. Archives of Oral Biology. 52: Fadel L., Viana B.R., Feitosa M.L.T., Ercolin A.C.M., Roballo K.C.S., Casals J.B., PieriI N.C.G., Meirelles F.V., Martins D.S., Miglino M.A. & Ambrósio C.E Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileira 26(4): Friedenstein A., Petrakova K., Kurolesova A. & Frolova G Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation 6: Hatami M., Mehrjardi N.Z., Kiani S., Hemmesi K., Azizi H., Shahverdi A. & Baharvand H Human embryonic stem cell-derived neural precursor transplants in collagen scaffolds promote recovery in injured rat spinal cord. Cytotherapy 11(5): Im GI., Shin Y.W. & Lee K.B Do adipose tissue-derived mesenchymal stem cells have the same osteogenic and chondrogenic potential as bone marrow-derived cells? Osteoarthritis and Cartilage 13: Jiang X.X., Zhang Y., Liu B., Zhang S.X., Wu Y., Yu X.D. & Mao N Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood 105(10): Krampera M., Glennie S., Dyson J., Scott D., Laylor R., Simpson E. & Dazzi F Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood 101(9): Lee O.K., Kuo T.K., Chen W.M., Lee K.D., Hsieh S.L. & Chen T.H Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood 103: Lee K.S., Nah J.J., Lee B.C., Lee H.T., Lee H.S., So B.J. & Cha S.H Maintenance and characterization of multipotent mesenchymal stem cells isolated from canine umbilical cord matrix by collagenase digestion. Res. Vet. Sci. 94:

57 57 Mareschi K., Biasin E., Piacibello W., Aglietta M., Madon E. & Fagioli F Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica 86: Martínez-Lorenzo M., Royo-Canãs M., Alegre-Aguarón E., Desportes P., Castiella T., Garcia-Alvarez F. & Larrad L Phenotype and chondrogenic differentiation of mesenchymal cells from adipose tissue of different species. J. Orthop. Res. 27: Mayani H. & Lansdrop P.M Thy-1 expression is linked to functional properties of primitive hematopoietic progenitor cells from human umbilical cord blood. Blood 83: Orbay H., Tobita M. & Mizuno H Mesenchymal Stem Cells Isolated from Adipose and Other Tissues: Basic Biological Properties and Clinical Applications. Stem Cells International 2012, Article ID , 9 pages. Pelosi E., Castelli G. & Testa U Human umbilical cord is a unique and safe source of various types of stem cells suitable for treatment of hematological diseases and for regenerative medicine. Blood Cells Mol. Dis. 49: Peng H. & Huard J Muscle-derived stem cells for musculoskeletal tissue regeneration and repair. Transpl. Immunol. 12: Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S. & Marshak D.R Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284(5411): Pittenger M.F. & Martin B.J Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res. 95(1):9-20. Pountos I. & Giannoudis P.V Biology of mesenchymal stem cells. Injury 36 Suppl 3:S8-S12. Pratheesh M.D., Gade N.E., Katiyar A.N., Dubey P.K., Sharma B., Amarpal G.S. & Sharma G.T Isolation, culture and characterization of caprine mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid. Res. Vet. Sci. 94: Reed S.A. & Johnson S.E Refinement of Culture Conditions for Maintenance of Undifferentiated Equine Umbilical Cord Blood Stem Cells. Journal of Equine Veterinary Science 32: Ren Y., Wu H., Zhou X., Wen J., Jin M., Cang M., Guo X., Wang Q., Liu D. & Ma Y Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Res. Vet. Sci. 93(1):

58 58 Sharp J., Frame J., Siegenthaler M., Nistor G. & Keirstead H.S Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants improve recovery after cervical spinal cord injury. Stem Cells. 28: Tapp H., Hanley E.N., Patt J.C. & Gruber H.E Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Experimental Biology and Medicine 234:1-9. Taylor S.E., Smith R.K.W. & Clegg P.D Mesenchymal stem cell therapy in equine musculoskeletal disease: scientific fact or clinical fiction? Equine Vet. J. 39: Wexler S.A., Donaldson C., Denning-Kendall P., Rice C., Bradley B. & Hows J.M Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. British Journal of Haematology 121: Zhang Y., Fan Y., Wang Z., Wan Y., Zhou Z., Zhong B., Wang L. & Wang F Isolation, characterization, and gene modification of dairy goat mesenchymal stem cells from bone marrow. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 48(7):

59 Fig.1. Morphological features of MSC derived from goat UCB. (A) Primary culture after 4-5 days. (B) Short or long spindles, with uniform fibroblast-like morphology. (C) Typical fibroblast-like morphology with 80-85% confluence. 59

60 Fig.2. (A) Positive staining of Alcian Blue showed the chondrogenic differentiation. (B) Positive Alizarin Red stain showed osteogenic differentiation. (C) Sparsely small lipid droplets or even no lipid droplets in the cytoplasm, showed lower adipogenic potential. 60

61 Fig.3. Comparison of cell surface marker profiles between two types of MSC. (A) Large fibroblastic MSC. (B) Small fibroblastic MSC. Both types of MSC at passage 3 were analyzed by flow cytometry with antibodies against the indicated antigens. Calibrated histogram representing standard number of events in the Y-axis; and fluorescent intensity on X-axis. Negative control was shown in the graph area with fluorescent intensity less than 10¹. 61

62 62 8. CAPÍTULO 3 GOAT UMBILICAL CORD CELLS ARE PERMISSIVE TO SMALL RUMINANT LENTIVIRUS INFECTION IN VITRO Periódico: Brazilian Journal of Microbiology, volume 48, págs , 2017.

63 63 ABSTRACT Small ruminant lentiviruses isolated from peripheral blood leukocytes and target organs can be propagated in vitro in fibroblasts derived from goat synovial membrane cells. These cells are obtained from tissues collected from embryos or fetuses and are necessary for the establishment of the fibroblast primary culture. A new alternative type of host cells, derived from goat umbilical cord, was isolated and characterized phenotypically with its main purpose being to obtain cell monolayers that could be used for the diagnosis and isolation of small ruminant lentiviruses in cell culture. To accomplish this goal, cells were isolated from umbilical cords; characterized phenotypically by FACS analysis; differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage; and submitted to viral challenge. The proliferation of goat umbilical cord cells was fast and cell monolayers formed after 15 days. These cells exhibited morphology, immunophenotype, growth characteristics, and lineage differentiation potential similar to MSCs of other origins. The goat umbilical cord derived cells stained positive for vimentin and CD90, but negative for cytokeratin, CD34 and CD105 markers. Syncytia and cell lysis were observed in cell monolayers infected by CAEV- Cork and MVV-K1514, showing that the cells are permissive to small ruminant lentivirus infection in vitro. These data demonstrate the proliferative competence of cells derived from goat umbilical cords and provide a sound basis for future research to standardize this cell lineage.

64 64 GOAT UMBILICAL CORD CELLS ARE PERMISSIVE TO SMALL RUMINANT LENTIVIRUS INFECTION IN VITRO Gabrielle R. Martins¹, Rebeca C. Marinho¹, Rosivaldo Q. Bezerra Junior¹; Antoniel de O. Alves¹, Lilia M. C. Câmara², Luiz C. Albuquerque-Pinto², Maria F. da S. Teixeira¹ 1- Laboratório de Virologia, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil 2- Laboratório de Imunologia, Programa de Pós-graduação em Microbiologia Médica, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, CE, Brazil Abstract Small ruminant lentiviruses isolated from peripheral blood leukocytes and target organs can be propagated in vitro in fibroblasts derived from goat synovial membrane cells. These cells are obtained from tissues collected from embryos or fetuses and are necessary for the establishment of the fibroblast primary culture. A new alternative type of host cells, derived from goat umbilical cord, was isolated and characterized phenotypically with its main purpose being to obtain cell monolayers that could be used for the diagnosis and isolation of small ruminant lentiviruses in cell culture. To accomplish this goal, cells were isolated from umbilical cords; characterized phenotypically by FACS analysis; differentiate into osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage; and submitted to viral challenge. The proliferation of goat umbilical cord cells was fast and cell monolayers formed after 15 days. These cells exhibited morphology, immunophenotype, growth characteristics, and lineage differentiation potential similar to MSCs of other origins. The goat umbilical cord derived cells stained positive for vimentin and CD90, but negative for cytokeratin, CD34 and CD105 markers. Syncytia and cell lysis were observed in cell monolayers infected by CAEV- Cork and MVV-K1514, showing that the cells are permissive to small ruminant lentivirus infection in vitro. These data demonstrate the proliferative competence of cells derived from goat umbilical cords and provide a sound basis for future research to standardize this cell lineage. Key-words: CAEV, MVV, CELL CULTURE, MSC, FLOW CYTOMETRY Introduction The small ruminant lentivirus (SRLV) comprises two types of viruses, the Caprine Arthritis Encephalitis virus (CAEV) and the Maedi Visna virus (MVV); both of which are widely distributed throughout the world. CAEV and MVV share genetic similarities, molecular mechanisms of replication, morphology and similar biological interactions in their hosts. These lentiviruses cause persistent infections, including encephalitis, arthritis, progressive pneumonia, and mastitis in goats and sheep. Like other lentiviruses, CAEV and MVV infect cells of the monocyte/macrophage lineage and dendritic cells. 1,2

65 65 CAEV and MVV can replicate in primary fibroblasts derived from synovial membranes or from choroid plexus cultures, 3,4 and can also replicate in the immortalized TIGEF cell line (T Immortalized Goat Embryonic Fibroblast). 5 These cells are obtained from the tissues collected from embryos or fetuses and are necessary for the establishment of the fibroblast primary culture. An alternative method would involve using cells derived from goat umbilical cords, which is an invaluable tool that does not use embryos or fetuses. Generally, the umbilical cord would be discarded after calving. However, it is an excellent source material, rich in cells that are able to originate several cell types. The umbilical cord is a well-known source of mesenchymal stem cells (MSCs), which have been isolated and characterized in umbilical cord samples from canine, 6 equine 7 and ovine 8 species. MSCs are a multipotent adult stem cell. 9 Undifferentiated MSCs exhibit fibroblast-like morphology and are characterized phenotypically by the expression of surface markers; however, the characterization of these cells has not yet been fully defined. There are several positive markers described, and there is a consensus that undifferentiated MSCs should be positive for CD29, CD44, CD90, CD105, CD73 and negative for CD34, CD45, CD14 and CD3. 10,11 MSCs are multipotent stromal cells capable of differentiating to mesenchymal lineages, including tissues such as adipose tissue, bone, cartilage and muscle. 9,12 The aims of the experiments in this study were to isolate, phenotypically characterize and investigate the differentiation potentials of cells from goat umbilical cords (cgucs), with the main purpose being to obtain cell monolayers for use in the diagnosis of small ruminant lentiviruses via isolation in cell culture. Materials and methods Samples All experiments were approved by the Ethics Committee for Animal Use at the State University of Ceará, protocol number For this study, mongrel pregnant goats were used, aged between two and three years and free of infection by SRLV. Three umbilical cord samples were collected during calving. After birth, the goat umbilical cords were clamped at both ends, i.e., next to the fetus and the goat, and then cut and packed in the transport medium. The solutions used during transport were low

66 66 glucose DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) (Gibco, Grand Island, NY, USA), MEM-E (Minimum Essential Medium with Earle s salt and L-glutamine) (Gibco, Grand Island, NY, USA), PBS (phosphate buffered saline) and saline solution 0,9% (SS), supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS. The samples were transported within 2 h to the laboratory, packed in an isothermal box with ice. Isolation and culture of cgucs The tissue samples were processed in a laminar flow cabinet. The umbilical cord was washed with PBS to remove blood. The amniotic epithelium surrounding the umbilical cord was dissociated using sterile scissors and forceps. Tissue samples of umbilical cord matrix were cut into pieces of 0,5 1 cm (explants) and were plated in A25 cell culture flasks and 6-well culture plates using DMEM-low glucose or MEM-E supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS and cultured at 37 C in a CO 2 incubator (5% CO 2 ). The cell cultures were observed in an inverted microscope every day, until proliferation of the first cells from the explants had occurred. The media was changed after 5 days to avoid any mechanical stress, and thereafter, it was replenished every third day. At 80% confluence, cells were trypsinized (0,25% Trypsin-EDTA, Gibco, Grand Island, NY, USA) and reseeded in new cell culture flasks. Virus infectivity assay The cells from the confluent monolayer after the third passage were infected with either the CAEV-Cork or MVV-K1514 strains, provided by Dr. Roberto Soares de Castro (Federal Rural University of Pernambuco - UFRPE). These strains originated from the Institut National de la Recherche Agronomique, Lyon-France. The virus infectivity assay was performed in duplicate for each of three separate experiments. The cells were incubated with viral suspension 10 5 TCID50 at a MOI of 1 for 1 h at 37 C in a 5% CO 2 incubator. Thereafter, the supernatant was discarded and the growth medium was added (DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 2% FBS).

67 67 The cell monolayers were observed in an inverted microscope every day until the cytopathic effect caused by the virus was evident, proving that the cells were permissive for infection by SRLV. FACS analysis FACS analysis was performed to investigate the expression of the surface markers CD90, CD105, CD34, and the intracellular markers vimentin and cytokeratin in cgucs after the third passage. The cells were harvested and aliquoted at a density of 10 6 cells/ml for each marker assay. First, these cells were incubated with antibodies against surface markers [mouse anti-human CD90 FITC, CD105 APC and CD34 APC (BD Biosciences, USA)] for 30 min at 4 C in the dark. Then, the cells were permeabilized with fixation/permeabilization solution (BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit, BD Biosciences, USA) for 20 min at 4 C in the dark. Permeabilized cells were incubated with antibodies against intracellular markers [mouse anti-human vimentin PE and cytokeratin PE (BD Biosciences, USA)] for 30 min at 4 C in the dark. Thereafter, the cells were washed twice with BD perm/wash buffer (BD Biosciences, USA), fixed with formaldehyde buffer (PBS with 1% formaldehyde) and analyzed using a flow cytometer (FACS Calibur BD, BD Biosciences ). A gate was defined and the minimum number of events constituting was set to 10,000. The negative control was processed in a similar manner but without antibodies. The data obtained was analyzed using Cell Quest Pro software and plotted as a histogram. Adipogenic Differentiation For adipogenic differentiation, trypsinized cells (1 x 10 4 cells/cm²) were seeded into a 24-well plate and incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS. After 24 h, the medium was discarded, and the cells were incubated with StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Medium (Gibco, Grand Island, NY, USA). The differentiation medium was replaced every 3-4 days. After 14 days of culture, the cells were fixed with 10% formalin at room temperature, washed with PBS, and stained with 0,5% Oil-Red O (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA) for 15 min and Mayer s Hematoxylin (Sigma- Aldrich,St. Louis, MO, USA) for 5 min to visualize lipid droplets.

68 68 Chondrogenic Differentiation Chondrogenic differentiation was induced in micromass cultures by seeding 5 μl droplets of cell solution ( viable cells/ml) in the center of a 24-well plate. The cells were incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS for 2 hours. Afterward, the cells were fed with a specific chondrogenesis differentiation medium (StemPro, Gibco, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced every 2-3 days. After 14 days, chondrogenic differentiation was confirmed by staining for Alcian Blue (Sigma- Aldrich,St. Louis, MO, USA). Osteogenic Differentiation To induce osteogenic differentiation, the cells from the confluent monolayer of the third passage (5 x 10 3 cells/cm²) were seeded into a 24-well plate and incubated with DMEM supplemented with 300 U/mL penicillin, 300 µg/ml streptomycin, 0,5 mg/ml amphotericin and 10% FBS. After 24 h, the medium was discarded, and cells were cultured in StemPro Osteocyte Differentiation Basal Medium (StemPro, Gibco, Grand Island, NY, USA). The medium was replaced every 2-3 days. After 14 days of culture, the osteogenic differentiation of stem cells was confirmed by Alizarin Red S staining (Sigma-Aldrich,St. Louis, MO, USA). Results Growth and culture characteristics Goat umbilical cord cells started to migrate out of explants after 3 6 days of culture, and the cells gradually grew into small colonies. In the samples transported in DMEM and MEM-E, cell proliferation started 3 days after beginning the incubation, whereas samples transported in PBS started proliferating after 5 days and the samples packed in SS after 6 days. These data demonstrated that DMEM and MEM-E enable better preservation of the samples and, consequently, enable better acquisition of cells. During the initial days of incubation, cells displayed a non-fibroblastic, rounded, epithelial cell-like phenotype (Fig. 1A). Later, cells attained a typical fibroblast-like spindle-shaped structure (Fig. 1B). As growth continued, adjacent colonies interconnected with each other, and a confluent monolayer was obtained (Fig. 1C). Cell

69 69 monolayers derived from goat umbilical cords were used in viral challenge assays, for immunotyping by flow cytometry, and in mesodermal lineage differentiation assays. The growth media used in this study (DMEM or MEM-E supplemented with 10% FBS) were highly suitable to sustaining the cells, resulting in high rates of growth and expansion of the cell stock. After 15 days, cells had grown to 80% confluence, at which time the first passage was performed. In later passages, cultured cells reached 80-90% confluence faster, in approximately 3-4 days. Figure 1 - Primary culture of cgucs: morphological features and cell monolayers formed. (A) Epithelial cell-like phenotype. (B) Typical fibroblastoid shape. (C) cgucs exhibiting a large, flattened fibroblast-like morphology after the third passage. Cytopathicity of SRLV in cgucs The cgucs are highly permissive to SRLV infection in vitro. The cytopathic effects appeared 7 days after inoculation. Classical giant multinucleated cells (syncytia) were observed in the monolayers infected with CAEV-Cork virus (Fig. 2B). The cells infected with MVV-K1514 virus underwent syncytia formation and cell lysis. The cytopathic effects progressed, resulting in the progressive destruction of the cell monolayer (Fig. 2A). The negative control for the viral infectivity assay is shown in figure 2C. Figure 2 - Cytopathic effects caused by MVV and CAEV. (A) Cell lysis and syncytia caused by MVV. Giant multinucleated cells caused by CAEV. (C) Negative control for the viral infectivity assay. (B)

70 70 Immunophenotypic characterization by flow cytometry In vitro cultured, third-passage cgucs were analyzed by FACS. FACS analysis revealed that these cells were positive for the expression of vimentin (91,6%) and CD90 (23%) but were negative when staining for CD105 (3,66%), CD34 (2,95%) and cytokeratin (1,67%) (Figure 3). Figure 3 - FACS analysis of Vimentin and CD90, in vitro culture, third passage cgucs. (A) Vimentin PE. (B) CD90 FITC. Calibrated histogram representing the number of events on the Y-axis and fluorescent intensity on the X-axis. The red area histogram indicate negative control. Mesodermal lineage differentiation Adipogenic differentiation of cgucs was confirmed by Oil Red-O staining. After incubating these cells with adipogenic-inducing medium for 14 days, small lipid droplets were present in the cytoplasm (Fig. 4A). The chondrogenic potential of cgucs was evaluated by in vitro micromass culture of these cells in a specific differentiation medium. After 14 days of incubation, the accumulation of sulfated proteoglycans was visualized by Alcian Blue staining (Fig. 4B). In the osteogenic differentiation assay, the cells proliferated and reached complete confluence after 8-10 days of incubation with differentiation medium. The cellular aggregates were then observed and were characterized by calcium deposits, which were demonstrated by positive Alizarin Red staining (Fig. 4C). Figure 4 - Mesodermal lineage differentiation. Adipogenic Differentiation. (A) Chondrogenic Differentiation. (B) Osteogenic Differentiation. (C)