TESTE DE CITOTOXICIDADE IN VITRO DE ARBUTINA E APIGENINA, ISOLADAS EM EXTRATO ETANÓLICO DE Turnera diffusa

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1 77 TESTE DE CITOTOXICIDADE IN VITRO DE ARBUTINA E APIGENINA, ISOLADAS EM EXTRATO ETANÓLICO DE Turnera diffusa Ely Eduardo Saranz Camargo 1 Bruna Basso Camargo 2 RESUMO: Turnera diffusa é comercializada não só no Brasil mas no mundo todo, devido as propriedades estimulantes e afrodisíacas. Estudo fitoquímico levou ao isolamento de flavonoides glicosilados, arbutina, esteroides. Contudo pouco se sabe sobre a citotoxicidade dos metabólitos presentes em T.diffusa. Atualmente, testes in vitro são utilizados na triagem inicial da toxicidade de substâncias químicas. Algumas técnicas para determinação da citotoxicidade utilizam substâncias que são incorporadas ou transformadas em produtos coloridos apenas por células vivas, mas não por células mortas ou pelo próprio meio de cultivo. A formação desses produtos reflete o endpoint tóxico e quantifica o número de células viáveis, mostrando uma relação linear entre esses dois parâmetros. Pode-se afirmar que as moléculas polares apigenina-7-o- -D p-coumaroil (1 6) glucopiranosídeo e p-arbutina não apresentaram citotoxicidade, o que é um fator positivo para o emprego dessa espécie. Palavras Chave: Citotoxicidade, Damiana, Fitoterápicos. 1 INTRODUÇÃO A Turnera diffusa, Willd, pertencente a família Turnerácea, é descrita botanicamente como um arbusto aromático perene, apresentando altura máxima de 2 metros, folhas simples pecioladas e lanceoladas, medindo aproximadamente 2,5cm de comprimento, coloração verde amarelada, apresentando na parte inferior a presença de venação saliente. Flores pequenas, amarelas, que florescem no final do verão, apresentando, na sequência, um fruto capitular, pequeno que contém muitas sementes (CAMARGO, 2010). É uma planta predominantemente de regiões áridas e semi-áridas, que se estende desde a Califórnia e México até América do Sul. Também é encontrada na Índia (GRIEVE, 2017). No México e em Cuba, principalmente os povos asteca e indígenas, usavam o extrato aquoso de Turnera difusa como expectorante, diurético, afrodisíaco dentre outras patologias 1 Professor Doutor do Curso de Farmácia da Faculdade Panamericana de Ji-paraná UNIJIPA Rodovia RO 135 KM 1. Ji-Paraná RO CEP , elycamargo@bol.com.br. 2 Farmacêutica Pesquisadora do Instituto de Pesquisa em Ciências da Saúde IPCS/LAQUANATURIS São José do Rio Preto SP.

2 78 (ALCARAZ-MELENDEZ, et. al., 2004). O decoto de folhas de T. difusa também é usado para curar distúrbios digestivos (LEITE, 2017). Dentre os metabólitos secundários encontrados na Turnera difusa, observa-se principalmente os flavonoides. Alguns são considerados como marcadores para a espécie. O emprego de flavonóides em terapêutica é bastante comum, sendo a prática de uso mais antiga que o desenvolvimento de análises farmacológicas modernas (SIMÕES, 2000). Apesar da literatura apontar diversos manuscritos apresentando efeitos benéficos dos flavonóides para a saúde humana, um número apreciável de diferentes classes desses compostos, demonstraram possuir atividade citotóxica (HARBORNE ; WILLIANS, 2000). Atualmente, testes in vitro são utilizados na triagem inicial da toxicidade de substâncias químicas. Algumas técnicas para determinação da citotoxicidade utilizam substâncias que são incorporadas ou transformadas em produtos coloridos, apenas por células vivas, mas não por células mortas ou pelo próprio meio de cultivo. A formação desses produtos reflete o endpoint tóxico e quantifica o número de células viáveis, mostrando uma relação linear entre esses dois parâmetros (WILSON, 1992). Essas técnicas foram consideradas, tempos atrás, pela Convenção Farmacopeia dos Estados Unidos como um dos componentes alternativos para os testes de toxicidade in vivo (GOLDBERG ; STARK, 1987). Nas últimas duas décadas, estudos com flavonóides apontaram suas possíveis contribuições medicinais para a saúde humana. Por exemplo, a atividade sedativa de dois flavonóides glicosilados, quercetina e isoquercetina (quercetin-3-o-b-d-glicopiranoside e quercetin-3-o-alfa-l-rhamnopyraboside), sendo que nenhum desses compostos apresentaram efeito letal ou alteração de comportamento em ratos tratados com dose de 0,1 mg/kg (KANG, 2000); a atividade estrogênica de flavonóides que possuem hidroxilas localizadas na posição 7 e 4 do núcleo flavona ou 4,4 da molécula calcona; a capacidade da apigenina mimetizar atividade do 17-B-estradiol estimulando a proliferação de células MCF7 (linhagem tumoral de mama humana estrógeno-dependente). A atividade antioxidante também tem sido relatada para alguns derivados de ácidos fenólicos, sugerindo que doenças causadas pelas reações oxidativas em sistema biológicos podem ser retardadas pela ingestão de antioxidantes naturais encontrados na dieta, principalmente de compostos fenólicos (SOARES, 2008).

3 79 As plantas são fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais constituíram-se em modelos para a síntese de um grande número de fármacos. A utilização de metabólitos com atividade biológica é, sem dúvida, uma atividade multidisciplinar, onde os estudos sobre eficácia, mecanismos de ação, potencial tóxico e genotóxico dependem de bioensaios farmaco-toxicológicos in vitro e in vivo para que essas substâncias possam ser validadas como fitofármacos. O objetivo deste estudo foi determinar o índice citotóxico basal in vitro (IC 50 ) sobre células McCoy, através da técnica do vermelho neutro dos compostos: apigenina-7-o-β-d-pcoumaroil (1 6) glucopiranosídeo (flavonóide) e p-arbutina (hidroquinona), isolados em extratos etanólicos de Turnera diffusa. 2 MATERIAIS E MÉTODOS A planta utilizada para o isolamento dos compostos, foi fornecida pelo Departamento de Fisiologia do Instituto de Biociências da Universidade de Campinas - UNICAMP, onde foram identificadas macro e microscopicamente. Os extratos foram preparados por maceração a partir de folhas secas e moídas de Turnera diffusa em Etanol 96% por 7 dias, após filtrou-se e concentrou-se em evaporador rotativo a 50 C até completa evaporação do solvente. O isolamento e identificação dos compostos se deram por TLC de Sephadex LH-20 em modo isocrático com metanol, onde foram coletados 230 frações de 5mL, as quais foram submetidas a análise de CCCD, onde após confirmação da pureza foram elucidadas por Ressonância Magnética Nuclear de próton e carbono 13 (CAMARGO, 2001). Os compostos isolados, foram encaminhados ao Laboratório para cultivo celular, pesados e dissolvidos em DMSO (dimetilsulfóxido - Sigma cod. D ) na concentração de 10mg/mL. A concentração máxima de DMSO utilizada como solvente foi 4%, concentração essa que não influencia o crescimento celular (DEVIENNE, 2000). A cultura celular consistiu em manter as células McCoy B (ATCC 1696) em meio Eagle. Após tripsinização, 2mL de solução de tripsina 0,2% + Versene 0,02%, as células foram contadas em câmara de Neubauer e 200 L do meio, contendo aproximadamente

4 células/ml, foram inoculados em microplacas (96 orifícios) para cultura de tecido (Corning cod ) as quais foram incubadas a 35-37ºC. Após 24 horas, o meio foi removido e cada orifício tratado com diferentes concentrações das substâncias teste, substância de referência (Cisplatex - 50mg solução injetável - Eurofarma - lote 016/99A) e solvente. Após incubação por 24 horas, as placas foram preparadas para o teste do Vermelho Neutro (cloridrato de 3-amino-m-dimetilamino-2-metilfenazina) (MOSMANN, 1983; BORENFREUND ; PUERNER, 1985). Os ensaios foram acompanhados de crescimento controle, realizados em triplicata. No desenvolvimento da técnica, tomou-se 200 L de solução de VN (50 g/ml, Neutralrot, Redox-indikator-Riedel-De-Haën, AG Seelze-Hannover-cod ) foram adicionados aos orifícios das microplacas, as quais foram incubadas a 35-37ºC, por 3 horas. Após esse período, os orifícios foram lavados rapidamente com solução tampão PBS e 200 L da mistura ácido acético/etanol foram adicionados a cada orifício. As placas foram deixadas em repouso por 10 minutos para extração do corante, homogeneizadas e lidas em espectrofotômetro multicanal Spectra (Shell) & Rainbow (Shell) Readers da Tecan Áustria Ges.m.b.H, em comprimento de onda de 540 nm e filtro de referência 620 nm (BORENFREUND ; PUERNER, 1985). O IC 50 significa a concentração do agente que diminui em 50% a absorbância espectrofotométrica. RESULTADOS E DISCUSSÃO No extrato polar da Turnera diffusa, foram isolados p-cumoroil apigenina glicosilada (flavonóide) (Figura 1) e p-arbutina (hidroquinona) (Figura 2), que, por cromatografia liquida de alta performance (HPLC), confirmou-se como marcador por não serem encontrados em outras espécies da família Turneracea. A elucidação dos compostos, foi possível, primeiramente pela análise por cromatografia em camada delgada comparativa (CCCD), que, de acordo com resultados, permitiu-se reunir frações semelhantes dos dois compostos para isolamento das substâncias. A elucidação estrutural dos compostos foram baseadas na interpretação de espectros de RMN 1 H, COSY, RMN 13 C, HMBC, HMQC, em 500 MHz usando DMSO-d 6 como solvente.

5 81 Figura. 1- apigenina-7-o-β-d-p-coumaroil (1 6) glucopiranosídeo Figura 2 - p-arbutina Na determinação da citotoxicidade as curvas dose-resposta para os compostos p- cumoroil apigenina glicosilada, p-arbutina são apresentadas nas Figuras 3 e 4, respectivamente. De acordo com o observado nos gráficos, pode-se verificar que as substâncias em análises não apresentam índice de citotóxicos significativos, as concentrações dos dois compostos em análises foram maiores que 400µg/mL para verificar diminuição de 50% da absorbância. Dessa forma, o uso desses compostos, encontrados na espécie Turnera diffusa, conferem grande segurança para uso em terapêutica, como também o extrato da respectiva planta medicinal, de onde se extraiu os compostos, como fitoterápico. As substâncias em estudo, representam os marcadores para a espécie, uma vez que são encontrados somente nessa espécie do mesmo gênero, sendo que outros flavonóides isolados no extrato polar da Turnera diffusa, não apresentam qualquer tipo de efeito citotóxico. Ainda, em função dos valores observados nos gráficos, não foi possível determinar o IC 50 dos compostos teste, uma vez que os valores citotóxicos estão acima das concentrações

6 absorbância (540 nm) 82 ensaiadas. O IC 50 da cisplatina, obtido pela reta de regressão linear, é de 41,24ug/mL, usada como substância de referência, o que confirma a segurança do teste de citotoxicidade in vitro. O teste de citotoxicidade é importante, pois, contribui para o uso segura da substância analisada, como também no uso da espécie vegetal, principalmente de forma empírica, o qual se enquadra no uso racional de plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos. Em contra partida, não está descrito na literatura o teste de citotoxicidade para o composto apigenina-7-o-β-d-p-coumaroil (1 6) glucopiranosídeo, somente para outros flavonoides encontrados na espécie que não estão classificados como marcadores. É bastante conhecido o uso de compostos fenólicos, os quais contribuem para o sabor, odor e coloração de diversos vegetais, sendo muito usados como flavonizantes e corantes de alimentos e bebidas. Atividade antioxidante tem sido relatada para alguns derivados de ácidos fenólicos, como apigenina, sugerindo que doenças causadas pelas reações oxidativas em sistemas biológicos possam ser retardadas pela ingestão de antioxidantes naturais encontrados na dieta. A p-arbutina é encontrada na literatura como fármaco usado para despigmentação do tecido epitelial, no tratamento do vitiligo. Apesar de não apresentar índices citotóxicos significativos, seu uso na terapêutica do vitiligo deve ser acompanhada por profissional qualificado. A limitação de certos medicamentos, como os antibióticos, bem como a busca incansável por novas drogas para as recentes doenças, intensificou a busca de novas intervenções terapêuticas, que coloca os compostos: apigenina-7-o-β-d-p-coumaroil (1 6) glucopiranosídeo e p-arbutina, como sugestão de uso seguro em terapêutica de forma segura e eficaz. 0,90 0,75 0,60 0,45 0,30 0,15 0, concentração de arbutina (ug/ml) Figura 3- Curva dose-resposta da p-arbutina sobre células McCoy pela técnica do vermelho neutro.

7 Absorbância (540nm) 83 0,90 0,75 0,60 0,45 0,30 0,15 0, concentração apigenina (ug/ml) Figura 4- Curva dose-resposta da apigenina-7-o-β-d-p-coumaroil (1 6) glucopiranosídeo sobre células McCoy pela técnica do vermelho neutro. Grande número de substâncias de origem vegetal com atividade antimicrobiana estão descritas na literatura, mas poucas possuem valor medicinal ou comercial. A droga antimicrobiana ideal mata o microrganismo nocivo sem prejudicar o hospedeiro sendo este o princípio da toxicidade seletiva. O conceito de verdadeira toxicidade seletiva aplica-se às substâncias que atuam somente contra bactérias. Em decorrência da baixa toxicidade das substâncias ensaiadas e para dar continuidade aos estudos quanto a possível aplicação dos compostos apigenina-7-o-β-d-p-coumaroil (1 terapêutica, o potencial como drogas antimicrobianas deve ser avaliado. 6) glucopiranosídeo e p-arbutina na REFERÊNCIAS ALCARAZ-MELENDEZ, L., DELGADO-RODRIGUEZ, J., and Real-Cosio, S. Analysis of essential oils from wild and micropropagated plants of damiana (Turnera diffusa). Fitoterapia 2004;75(7-8): BORENFREUND, E., PUERNER, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicol. Letters, v.24, p , CAMARGO, E.E.S. Perfil químico e controle de qualidade de Turnera difusa, Wild p. Dissertação (Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista, Araraquara -São Paulo.

8 84 CAMARGO, E.E.S., et. al., Controle de qualidade dos extratos polares de Turnera diffusa Willd. ex Schult., Turneraceae. Rev. bras. Farmacogn. vol.20 no.2 Curitiba Apr. /May 2010, p DEVIENNE, K. F. Avaliação da atividade biológica in vitro de isocumarinas naturais e semi-sintéticas obtidas de Paepalanthus bromelioides. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara. 127f GOLDBERG, A. M., STARK, D. M. Pharmacopeial Forum, nov-dec, p , HARBORNE, J.B.; WILLIAMS,C.A. Advances in flavonoid research since Phytochemistry, Oxford, v. 52, p , KANG, T.H., JEONG, S.J., KIM, N.Y., HIGUCHI, R. KIM, Y.C. Sedative activity of two flavonol glycosides isolated from the flowers of Albizzia julibrissin Durazz. J. Ethnopharmacology, v. 71, p , SIMÕES, C.M.O., et al. Farmacognosia da planta ao medicamento. 2 a edição, Editora da UFSC.Florianópolis, SOARES, M.; WALTER, L.; KUSKOSKI, E. M.; GONZAGA, L.; FETT, R.. Phenolic compounds and antioxidant activity in skin of Niagara and Isabel grapes. Rev. Bras. Frutic. vol.30 no.1. P WILSON, A. P.; FRESHNEY, R. I. Cytotoxicity and viability assays. In: Animal cell culture: a pratical aprroach. 2. ed. New York: Oxford University Press, cap.8, p