EFEITO DO TIPO DE SEGMENTO NODAL E TAMANHO DO RECIPIENTE NO CRESCIMENTO DE PLANTAS DE Pfaffia glomerata IN VITRO

Transcrição

1 EFEITO DO TIPO DE SEGMENTO NODAL E TAMANHO DO RECIPIENTE NO CRESCIMENTO DE PLANTAS DE Pfaffia glomerata IN VITRO FERNANDO TEIXEIRA NICOLOSO 1 ALAN CRISTIANO ERIG 2 RESUMO Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen é uma das espécies de ginseng brasileiro usada comumente na medicina popular. Com o presente trabalho objetivou-se avaliar o efeito do tipo de segmento nodal e do tamanho do recipiente de cultivo no crescimento dessa espécie in vitro. Realizaram-se dois experimentos: no primeiro, os tratamentos consistiram de uma combinação bifatorial completa (5x3), representados por cinco posições diferentes ocupadas pelo segmento nodal na brotação, partindo-se do ápice para a base da maior brotação, e três tamanhos de recipientes de cultivo, designados em função do seu comprimento em: grande (25 cm altura x 2 cm, volume interno = 157,1 cm 3 ), médio (20 cm altura x 2 cm, volume interno = 125,7 cm 3 ) e pequeno (15 cm altura x 2,5 cm, volume interno = 147,3 cm 3 ); no segundo experimento, os tratamentos consistiram de sete posições diferentes ocupadas pelo segmento nodal na brotação, do ápice para a base da maior brotação. O meio de cultura utilizado foi o MS, tanto para o cultivo das plantas matrizes como para o cultivo dos segmentos nodais. O tipo de segmento nodal, definido pela posição que ocupa na maior brotação, influencia marcadamente o crescimento das plântulas de P. glomerata cultivadas in vitro, e os segmentos basais proporcionam a maior taxa de mu ltiplicação e plantas maiores em biomassa, altura, número de raízes e brotações. Tubos de cultivo de tamanho médio proporcionam o melhor crescimento das plântulas em biomassa, e o de tamanho pequeno, o pior. TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Micropropagação, ginseng brasileiro, Amaranthaceae, espécie medicinal, cultura de tecidos. EFFECT OF TYPE OF NODAL SEGMENT AND SIZE OF VESSEL ON GROWTH OF Pfaffia glomerata IN VITRO PLANTS ABSTRACT Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen is one of the Brazilian ginseng species commonly used in the folk medicine. The aim of this work was to evaluate the effect of type of nodal segment and size of cultured vessel on growth of P. glomerata in vitro plants. Two experiments were carried out. On the first one, the treatments followed a 5 x 3 complete factorial scheme, involving five types of nodal segments, which were obtained from the top to the base of the highest sprout, and three sizes of culture vessel, named according its length as: big (25cm high x 2cm, 157.1cm 3 of internal volume), medium (20cm high x 2cm, 125.7cm 3 of internal volume), and small (15cm high x 2,5 cm, 147.3cm 3 of internal volume). On the second experiment, the treatments were represented by seven types of nodal segments, which were obtained from the top to the base of the highest sprout. The MS medium (full strength) was used to obtain donor plants as well as to grow the nodal segments. The type of nodal segment, defined by its position in the highest sprout, markedly affect the growth of in vitro cultured plants of P. glomerata, with the basal segments giving the highest multiplication rate and greater plant biomass, height, number of roots and sprouts. Medium culture vessel gives the best plant biomass growth, and the small size the worst. INDEX TERMS: Micropropagation, brazilian ginseng, Amaranthaceae, medicinal specie, tissue culture. 1. Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Adjunto, Departamento de Biologia, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), , Santa Maria, RS. nicoloso@base.ufsm.br. (autor para correspondência). 2. Engenheiro Agrônomo, Aluno do PPGA, Fruticultura de Clima Temperado, FAEM, Universidade Federal de Pelotas, bolsista CAPES.

2 1500 INTRODUÇÃO As raízes de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, bem como de Pfaffia paniculata (Mart.) O. Kuntze, ambas pertencentes à família Amaranthaceae e conhecidas como ginseng brasileiro, são de grande interesse comercial na forma de fitomedicamentos e suplementos alimentares, em virtude de seus usos populares como antitumorais, antidiabetes e tônicos afrodisíacos. Em razão disso, tem ocorrido uma intensa exploração predatória das reservas naturais dessas espécies, justificando a elaboração de planos de manejo ou projetos de cultivo (Montanari et al., 1999). Considerando a limitação potencial da estaquia como método de produção de mudas de P. glomerata em larga escala (Nicoloso et al., 1999; 2001a), Nicoloso et al. (2001b) desenvolveram um protocolo de micropropagação para essa espécie, em que, a partir de um único segmento nodal, em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 30 g L -1 de sacarose, foi possível obter plantas em um período de seis meses. Segundo Grattapaglia & Machado (1998), ao contrário do que se acredita, a composição do meio de cultura não é a variável determinante do sucesso da micropropagação ou o segredo de um protocolo comercial. Para esses autores, a capacidade de regeneração e crescimento in vitro parece estar associada não apenas ao genótipo, mas também à atividade fisiológica da plantamatriz, sob o controle de diversos fatores endógenos. Além disso, apontam que diversos tipos de explantes podem ser utilizados na propagação in vitro de uma planta, mas para fazer seleção desses, devem ser considerados aspectos como o nível de diferenciação do tecido utilizado e a finalidade da micropropagação. O uso de segmentos nodais de origem basal e a- pical sem prévia subdivisão, em estudos de multiplicação in vitro, pode provocar uma fonte de variação na resposta final para várias espécies vegetais (Pereira & Fortes, 1999). Murashige (1974) observou em explantes de seções de caule de Nicotiana tabacum L. que aqueles de regiões mais próximas do ápice produziram maior número de brotos e raízes do que aqueles localizados mais perto da região basal, demonstrando um progressivo declínio nas características organogênicas à medida que se afasta do ápice. Por outro lado, San José et al. (1988) verificaram que explantes de segmentos nodais basais produziram mais partes aéreas do que explantes de segmentos de ápices em diversos clones de Quercus robur L. Em porta-enxertos de macieira, Pereira & Fortes (1999) constataram que na cultivar Marubakaido o uso de explantes de origem basal proporcionou a formação de maior número de brotações (12 por explante) em relação ao uso de explantes de origem apical (7 brotos por explante), enquanto na cultivar MM-111, não houve diferenças significativas no número de brotações formadas (aproximadamente 4 brotos por explante) entre explantes basais e apicais. Os fatores que influenciam o desenvolvimento de segmentos nodais originados de diferentes posições da brotação ainda não foram completamente identificados. Peres et al. (2001) observaram que o desbalanço do crescimento entre a parte aérea e as raízes de Catasetum fimbriatum (E. Morren) Lindl. & Paxton esteve relacionado ao desequilíbrio hormonal entre as citocininas e o ácido indolacético nos explantes. Já na propagação vegetativa via estaquia, tem sido sugerido que os maiores teores de carboidratos na base dos ramos podem contribuir para o enraizamento e sobrevivência das estacas basais (Fachinello et al., 1994; Nicoloso et al., 1999; 2001a). O tipo de frasco e a quantidade de meio de cultura utilizado são variáveis que têm merecido pouca a- tenção, embora afetem diretamente a área superficial da interface meio de cultura-atmosfera, o volume de ar sobre o meio de cultura e a profundidade desse. Tais fatores também afetam a composição da fase gasosa do frasco e, conseqüentemente, o crescimento e desenvolvimento das culturas (Grattapaglia & Machado, 1998). Monette (1983) verificou maior proliferação de partes aéreas de videira (Vitis vinifera L.) em frascos de 438 ml quando comparados com aqueles de 125 e 250 ml. Em Kiwi (Actinidia deliciosa (A. Chev.) C. F. Linag & A. R. Ferguson), o maior número de partes aéreas foi obtido usando-se frascos de 125 ml em comparação àqueles de 50, 250 e 500 ml (Monette, 1986). Com o presente trabalho objetivou-se avaliar o efeito do tipo de segmento nodal e do tamanho do recipiente de cultivo no crescimento de plantas de Pfaffia glomerata cultivadas in vitro. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Biotecnologia Vegetal pertencente ao Departamento de Biologia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), RS. O protocolo utilizado para a micropropagação da P. glomerata seguiu aquele descrito por Nicoloso et al. (2001b).

3 1501 Foram realizados dois experimentos para testar o efeito do tipo de segmento nodal, mediante sua posição na brotação e tamanho de recipiente: Experimento 1 Segmentos nodais originados da maior brotação de plantas já estabelecidas in vitro e possuindo 40 dias de idade foram utilizados. Os tratamentos consistiram de uma combinação bifatorial completa (5x3), representados por cinco posições diferentes ocupadas pelos segmentos nodais na brotação, designados por tipos A, B, C, D e E, respectivamente, partindo-se do ápice para a base da brotação, e três tamanhos de recipientes de cultivo, designados em função do seu comprimento em: grande (25 cm altura x 2 cm, volume interno = 157,1 cm 3 ), médio (20 cm altura x 2 cm, volume interno = 125,7 cm 3 ) e pequeno (15 cm altura x 2,5 cm, volume interno = 147,3 cm 3 ). Como parcela experimental, utilizou-se um segmento nodal de 1 cm de comprimento e sem folhas por tubo de ensaio (contendo 10 ml de meio MS solidificado com 0,6% de ágar). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com 20 repetições. Aos 41 dias após a inoculação (DAI), foram avaliados o número médio de brotações, número médio de segmentos nodais por brotação, número de segmentos nodais da maior brotação, altura média das brotações, altura da maior brotação, número total de segmentos nodais, massa seca das raízes, da parte aérea e total por plântula, bem como a relação entre a massa seca de raízes e da parte aérea. Experimento 2 Os tratamentos consistiram de sete posições diferentes ocupadas pelos segmentos nodais na brotação, designados por tipos A, B, C, D, E, F e G, respectivamente, partindo-se do ápice para a base da maior brotação, obtidas de plantas (49 dias de idade) já estabelecidas in vitro originadas exclusivamente de segmentos nodais da posição apical (posição A), cultivados em tubos de tamanho médio (20 cm altura x 2 cm, volume interno = 125,7 cm 3 ). O delineamento exp erimental foi o inteiramente casualizado com 30 repetições por tratamento. A parcela experimental consistiu de um tubo de ensaio de tamanho pequeno (15 cm altura x 2,5 cm, volume interno = 147,26 cm 3 ) contendo 10 ml de meio MS, solidificado com 0,6% de ágar, e um segmento nodal de 1 cm de comprimento e sem folhas, com exc e- ção do segmento nodal tipo G, que apresentou tamanho médio de 0,8 cm. Aos 15 DAI, foi avaliado o número médio de raízes por plântula, e aos 39 dias após a inoculação, foram avaliados o número médio de brotações, número médio de segmentos nodais por brotação, número de segmentos nodais da maior brotação, altura média das brotações, altura da maior brotação, número total de segmentos nodais por plântula e a massa seca da parte aérea. Nos dois experimentos, o ph do meio de cultivo foi ajustado para 5,8 antes da adição do ágar e da autoclavagem (1 atm, 120 C, 15min). O cultivo dos explantes foi realizado em sala de crescimento com temperatura de 25±2 C e fotoperíodo de 16 h, sob intensidade luminosa de lux fornecida por lâmpadas fluorescentes branca-frias. Os recipientes de cultivo foram fechados com folha de papel-alumínio e uma película de polivinilcloreto. Para a análise dos dados, utilizou-se o Software SOC/EMBRAPA Campinas, SP. RESULTADOS E DISCUSSÃO Posição do segmento nodal na brotação Plântulas originadas do segmento nodal tipo A apresentaram o menor número médio de brotações, tanto no experimento 1, média de 1,37 (Tabela 1), como no experimento 2, média de 1,04 (Tabela 2), demonstrando, portanto, que o segmento nodal apical possui um balanço hormonal que induz forte dominância apical na formação da planta (Taiz & Zeiger, 1998). Por causa disso, essas plantas apresentaram, em geral, maior número médio de segmentos nodais por brotação (Tabelas 1 e 2) e, também, no experimento 1, maior número de segmentos nodais na maior brotação (Tabela 1), fato que demonstra a compensação na distribuição da biomassa produzida, em conseqüência de as plantas originadas desse segmento nodal apresentarem menor número de brotações (Tabelas 1 e 2). Em geral, o menor número médio de segmentos nodais por brotação foi observado em plantas originadas de segmentos nodais do tipo B e C (Tabelas 1 e 2). Esse fato talvez seja uma decorrência da menor altura média das brotações (Tabelas 1 e 2), e, também, como observado no experimento 1, do maior número médio de brotações das plantas originadas por esses segmentos (Tabela 1). As plantas originadas de segmentos nodais do tipo A, B e C, no experimento 1 (Tabela 1), e do tipo A e B, no experimento 2 (Tabela 2), apresentaram a menor altura da maior brotação, fato que se refletiu, no experimento 2, em parte, na altura média das brotações. Desse modo, nessas plantas o tamanho dos segmentos nodais pode ficar menor do que o adequado para as subculturas sucessivas de um processo de micropropagação, diminuindo o aproveitamento do número total de explantes produzidos por plântula. Esse fato agrava-se ainda mais,

4 1502 se se considerar que o segmento nodal mais basal geralmente apresenta menor comprimento, como observa- al. (2000). do em P. tuberosa (Spreng.) Hicken citado por Martins et TABELA 1 Efeito da posição do segmento nodal na brotação sobre o número médio de brotações, número total de segmentos nodais, número de segmentos nodais da maior brotação, número médio de segmentos nodais por brotação, altura da maior brotação e altura média das brotações por plântula de Pfaffia glomerata cultivada in vitro aos 41 dias após a inoculação. UFSM, Posição do Segmento Nodal Nº médio de brotações Nº total de segmentos nodais por plântula Nº de segmentos nodais da maior brotação Nº médio de segmentos nodais por brotação Altura da maior brotação (cm) Altura média das brotações (cm) A 1,37 d* 8,63 b 8,22 a 7,18 a 14,48 b 12,40 a B 2,33 ab 10,83 a 7,04 b 4,88 d 14,54 b 8,48 b C 2,44 a 11,57 a 7,13 b 5,17 cd 15,39 b 9,67 b D 2,11 bc 11,11 a 7,28 b 5,47 bc 17,31 a 11,60 a E 1,98 c 11,15 a 7,03 b 5,73 b 17,02 a 12,33 a Tamanho do Recipiente Grande 2,12 a 10,71 a 7,23 a 5,54 a 16,63 a 11,32 a Médio 1,95 a 10,55 a 7,38 a 5,71 a 16,42 a 11,09 ab Pequeno 2,09 a 10,81 a 7,38 a 5,76 a 14,25 b 10,23 b Média 2,07 10,69 7,34 5,67 15,76 10,88 C.V. (%) 33,7 17,0 10,4 23,7 15,8 29,9 * Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Duncan. TABELA 2 Efeito da posição do segmento nodal na brotação sobre o número de raízes (aos 15 dias após a inoculação), número médio de brotações, número total de segmentos nodais por plântula, número de segmentos nodais da maior brotação, número médio de segmentos nodais por brotação, altura da maior brotação, altura média das brotações e massa seca da parte aérea por plântula de Pfaffia glomerata cultivada in vitro aos 41 dias após a inoculação. UFSM, Posição do Segmento Nodal Nº médio de raízes Nº médio de brotações Nº total de segmentos nodais por plântula Nº de segmentos nodais da maior brotação Nº médio de segmentos nodais por brotação Altura da maior brotação (cm) Altura média das brotações (cm) Massa seca da parte aérea (mg) A 7,3 c * 1,04 b 4,39 c 4,36 c 4,30 a 5,10 d 5,10 bc 14,8 e B 9,8 b 1,86 a 6,35 b 4,48 bc 3,48 d 6,15 c 4,27 c 16,3 e C 9,8 b 1,93 a 6,77 b 4,80 a 3,55 cd 8,44 ab 5,26 b 20,6 d D 11,7 ab 1,97 a 7,59 a 4,45 bc 3,91 bc 7,87 b 5,98 ab 24,9 c E 12,9 a 1,93 a 7,97 a 4,70 ab 4,15 ab 9,09 a 6,64 a 28,3 b F 11,3ab 1,90 a 7,62 a 4,52 bc 4,07 ab 8,69 ab 6,72 a 32,5 a G 6,4 c 1,97 a 7,50 a 4,47 bc 3,82 bcd 7,65 b 5,37 b 28,1 b Média 9,9 1,81 6,9 4,54 3,89 7,60 5,63 23,6

5 1503 C.V. (%) 35,5 15,0 18,3 12,5 17,5 25,6 31,7 21,2 * Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Duncan. Embora as condições fisiológicas do segmento dais basais possuem maior biomassa. Considerando-se nodal tipo A tenham induzido a manifestação de desenvolvimento monopodial, que é uma expressão da relação de raízes (Tabela 2) também foram maiores nas plantas que a altura da maior brotação (Tabelas 1 e 2) e o número advinda, principalmente, entre o ácido indolacético originadas desses segmentos, sugere-se a existência de (AIA) e citocininas (Taiz & Zeiger, 1998), com apenas uma alta correlação entre esses fatores. Nicoloso et al. uma brotação (Tabelas 1 e 2), verificou-se que a altura da (1999), avaliando a influência de quatro posições da estaca no ramo sobre o enraizamento ex vitro da P. glome- maior brotação foi maior nas plantas originadas a partir dos segmentos nodais mais basais, ou seja, a partir do rata, também observaram que a massa seca de raízes e segmento tipo D no experimento 1 e do tipo C no experimento 2. Isso sugere que os explantes basais apresentato, comprimento de raízes e o número de folhas por bro- das brotações, bem como a porcentagem de enraizamenvam no momento da inoculação outros fatores endógenos, além daquele conhecido em relação ao balanço entanto, tanto em condições ex vitro (Nicoloso et al., 1999) tação, foram maiores nas estacas basais e medianas. Portre esses fitohormônios, que favorecem o incremento em como in vitro constata-se que quanto mais próximo da altura das plantas originadas desses segmentos. Um base da brotação os segmentos nodais forem retirados, desses fatores deve ser a biomassa do explante, que é maiores são as condições fisiológicas para a formação maior nos segmentos basais (dados não apresentados), da muda. e que pode estar associado ao maior teor de carboidratos (Fachinello et al., 1994). Além disso, como observado tipo A, B e C possuem uma distribuição de biomassa, a- As plantas originadas de segmentos nodais do no experimento 2, há uma tendência de as plântulas originadas de segmentos nodais basais apresentarem maior parte aérea, favorecendo a parte aérea (Tabela 3), po- través do quociente entre a massa seca de raízes e da número médio de raízes (Tabela 2), com exceção do comportamento observado para o segmento nodal tipo G plantas que serão menos favorecidas durante a aclimatidendo, desse modo, serem os explantes que produzem que, provavelmente, esteja relacionado a sua menor biomassa, devido ao menor tamanho, no momento da inotória. Nesse aspecto, sugere-se realizar pesquisas objezação, devido a exposição de maior superfície transpiraculaçãotivando verificar quais são as características mais adequadas de distribuição de biomassa entre os órgãos das Tanto no experimento 1, em que se testaram cinco tipos de segmentos nodais, como no experimento 2, em plântulas para a formação de uma boa muda a ser levada que se utilizaram sete tipos de segmentos nodais, constatou-se que o número total de segmentos nodais pro- O desbalanço do crescimento entre a parte aérea a campo. duzidos por plântula foi menor naquelas plantas originadas de segmentos nodais do tipo A. A diferença de ren- de outros parâmetros, como o número de raízes (Tabela e as raízes, quanto à produção de biomassa (Tabela 3) e dimento entre os dois experimentos, média de 10,7 e 6,9, 2), número e altura das brotações (Tabelas 1 e 2), pode respectivamente nos experimentos 1 e 2, deve-se, principalmente, aos diferentes processos de seleção das plannas e o AIA nos explantes. Um exemplo dessa situação ser devido ao desequilíbrio hormonal entre as citocinitas matrizes. O número total de segmentos nodais por foi observado em orquídeas (Catasetum fimbriatum) plântula foi dependente da interação entre o número médio de brotações por plântula e a altura da maior brota- CFC1 em direcionar a produção da massa seca à parte aé- cultivadas in vitro, em que a tendência do genótipo ção (Tabelas 1 e 2), em virtude de os efeitos desses parâmetros serem aditivos. tocininas pelas raízes, a qual foi responsável pelo cresrea pareceu estar relacionada a sua alta produção de ci- No experimento 1, os segmentos basais do tipo D cimento da parte aérea. O padrão inverso do genótipo e E originaram plantas com maior produção de massa seca da parte aérea, de raízes e total da plântula (Tabela 3). pode ter sido uma conseqüência da baixa produção de CFC4, ou seja, acumulação de massa seca nas raízes, Comportamento semelhante foi constatado no experimento 2, em que as plantas originadas dos segmentos crescimento da parte aérea e menor produção de AIA citocininas por esse órgão e, conseqüentemente, menor nodais mais basais, do tipo E, F e G, apresentaram maior derivada dela. Além disso, pelos resultados, sugere-se produção de massa seca da parte aérea (Tabela 2), demonstrando que plantas originadas de segmentos no- pode ser devida a sua relativa baixa capacidade de que a alta acumulação de AIA-livre em raízes de CFC4 con-

6 1504 jugação do AIA e/ou a sua grande biossíntese de AIA (Peres et al., 2001). Desse modo, o comportamento observado no desenvolvimento da P. glomerata cultivada in vitro, em dois experimentos, sugere que a metodologia apresentada pode ser considerada como um modelo interessante para estudos do desenvolvimento vegetal. Além disso, os resultados, quanto aos vários parâmetros de crescimento analisados, demonstram que o uso de segmentos nodais originados de posições distintas da maior brotação são de relevante importância na (i) precisão da estimativa do número de explantes na fase de multiplicação, (ii) no rendimento de crescimento esperado e, possivelmente, (iii) no sucesso do processo de aclimatização das mudas, (iv) bem como um fator de variação em testes experimentais se não forem levados em conta uma distribuição igualitária dos tipos de segmentos nodais utilizados como fonte de explantes. Esse comp ortamento diferencial das plantas de P. glomerata originadas de diferentes segmentos nodais corrobora as observações registradas para outras espécies como: Nicotiana tabacum (Murashige, 1974), Quercus robur (San José et al., 1988), nos porta-enxertos de macieira cv. Marubakaido e cv. MM- 111 (Pereira & Fortes, 1999) e na Pfaffia tuberosa (Martins et al., 2000). Tipo de recipiente de cultivo O tipo de recipiente não afetou o número médio de brotações, número total de segmentos nodais por plântula, número de segmentos nodais da maior brotação e o número médio de segmentos nodais por brotação (Tabela 1). Pasqual et al. (1992), avaliando oito tamanhos de recipientes na micropropagação da amora-preta (Rubus idaeus L.), observaram que o maior número de brotos (média = 2,28) com comprimento entre 0,5 e 1 cm foi obtido no tubo de ensaio de 100 x 13 mm, e o tubo de ensaio mais comumente usado em trabalhos de cultura de tecidos (150 x 25 mm) teve um comportamento inferior. Desse modo, fica demonstrado que o rendimento esperado do cultivo in vitro depende do programa de desenvolvimento inerente a cada espécie vegetal. A altura da maior brotação e a altura média das brotações foram menores no recipiente de cultivo de TABELA 3 Efeito da posição do segmento nodal na brotação e do tamanho do recipiente de cultivo sobre a massa seca da parte aérea, de raízes e total das plântulas, bem como a relação entre a massa seca de raízes e da parte aérea da Pfaffia glomerata cultivadas in vitro, aos 41 dias após a inoculação. UFSM, Posição do Segmento Nodal Massa seca da parte aérea Massa seca de raízes...(mg/plântula)... Massa seca total da plântula Relação de massa seca de raízes/p. aérea A 46,05 c* 18,00 c 64,04 c 0,36 c B 47,70 c 21,46 c 61,60 c 0,43 b C 46,10 c 20,21 c 66,30 c 0,43 b D 58,39 b 34,33 b 92,70 b 0,58 a E 69,97 a 42,60 a 112,57 a 0,60 a Tamanho do Recipiente Grande 53,50 b 28,09 b 81,6 b 0,50 a Médio 63,25 a 34,28 a 97,5 a 0,53 a Pequeno 44,86 c 20,22 c 65,1 c 0,42 b Média 53,74 27,44 81,2 0,48 CV (%) 19,4 36,16 24,04 23,26

7 1505 *Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Duncan. tamanho pequeno (Tabela 1), resultado associado em parte, possivelmente, à altura do tubo, que imp ediu o crescimento das brotações. Aos 41 dias após a inoculação, em torno de 50% das plântulas apresentavam a maior brotação atingindo a altura máxima do tubo. O recipiente de tamanho médio apresentou a maior produção de massa seca da parte aérea, de raízes e total da plântula, sendo o recipiente pequeno o mais desvantajoso ao acúmulo de biomassa pelas mudas (Tabela 3). Isso demonstra que a acumulação de biomassa pelas plantas cultivadas no recipiente pequeno foi limitada pelo crescimento em altura das brotações (Tabela 1). Já as diferenças observadas na biomassa de plantas cultivadas nos recipientes de tamanho grande e médio são difíceis de serem explicadas, uma vez que elas apresentaram o mesmo número médio de brotações, número total de segmentos nodais por plântula, número de segmentos nodais da maior brotação, número médio de segmentos nodais por brotação, altura da maior brotação e altura média das brotações (Tabela 1). O recipiente pequeno também foi o que mostrou o menor quociente entre a massa seca de raízes e da parte aérea (Tabela 3). Esse parâmetro tem sido utilizado como um importante fator na produção de mudas de espécies florestais, sendo o valor 0,5 considerado o adequado (Daniel et al., 1997); portanto, as plântulas obtidas pelo uso de tubos grandes e médios apresentaramse com índices muito próximos do recomendado para outras espécies. Um fator importante na escolha de um recipiente de cultivo é a praticidade de manuseio durante as fases da micropropagação; desse modo, mesmo que a P. glomerata seja um espécie em que as fases de produção de brotos e de enraizamento ocorram numa única etapa, os tubos de tamanho grande e médio apresentam-se pouco práticos, principalmente pela necessidade do uso de pinças longas para o manuseio dos explantes. Portanto, visando à produção de mudas em larga escala, é recomendado o uso do recipiente de tamanho pequeno tendo em vista o seu melhor manuseio. CONCLUSÕES O tipo de segmento nodal influencia marcadamente o crescimento das plântulas de Pfaffia glomerata cultivadas in vitro. Segmentos basais proporcionam a maior taxa de multiplicação e plantas maiores em biomassa, altura, número de raízes e brotações. Tubos de cultivo de tamanho médio (20 cm altura x 2 cm ) proporcionam o melhor crescimento das plântulas em biomassa, e o de tamanho pequeno (15 cm altura x 2,5 cm ), o pior. AGRADECIMENTOS À FAPERGS, CNPq e FIPE/UFSM, pelo financiamento deste trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DANIEL, O.; VITORINO, A. C. T.; ALOVISI, A. A.; MAZZOCHIN, L.; TOJURA, A. M.; PINHEIRO, E. R.; SOUZA, E. F. de. Aplicação de fósforo em mudas de Acacia magnum Willd. Revista Árvore, Viçosa, v. 21, n. 2, p , FACHINELLO, J. C.; HOFFMAN, A.; NACHTIGAL, J. C.; KERSTEN, E.; FORTES, G. R. de L. Propagação de plantas frutíferas de clima temperado. Pelotas: UFPEL, p. GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI/Embrapa-CNPH, v. 1, p MARTINS, C. F.; NICOLOSO, F. T.; RUSSOWSKI, D.; FORTUNATO, R. P. Micropropagação de ginseng brasileiro (Pfaffia tuberosa (Spreng.) Hicken): II Efeito da posição do segmento nodal na brotação. In: CONGRESSO NACIONAL DE BOTÂNICA, 51., 2000, Brasília. Resumos... Brasília, SBB, MONETTE, P. L. Influence of size of culture vessel on in vitro proliferation of grape in a liquid medium. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hague, v. 2, p , MONETTE, P. L. Micropropagation of Kiwifruit using non-axenic shoot tips. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hague, v. 6, p , 1986.

8 1506 MONTANARI JUNIOR, I.; MAGALHÃES, P. M.; QUEIROGA, C. L. Influence of plantation density and cultivation cycle on root productivity and tenors of β- ecdysone in Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen. Acta Horticulturae, Wageningen, v. 3, n. 502, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p , MURASHIGE, T. Plant propagation through tissue culture. Annual Review of Plant Physiology, California, v. 25, p , NICOLOSO, F. T.; FORTUNATO, R. P.; FOGAÇA, M. A. F. Influência da posição da estaca no ramo sobre o enraizamento de Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen em dois substratos. Ciência Rural, Santa Maria, v. 29, n. 2, p , NICOLOSO, F. T.; CASSOL, L. F.; FORTUNATO, R. P. Comprimento da estaca de ramo no enraizamento de ginseng brasileiro (Pfaffia glomerata). Ciência Rural, Santa Maria, v. 31, n. 1, p , 2001a. NICOLOSO, F. T.; ERIG, A. C.; MARTINS, C. F.; RUSSOWSKI, D. Micropropagação do ginseng brasileiro [Pfaffia glomertata (Spreng.) Pedersen]. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 3, n. 2, p , 2001b. PASQUAL, M.; RIBEIRO, V. G.; BARROS, I. de; RAMOS, J. D. Propagação in vitro da amora-preta (Rubus idaeus L.) cv. Ébano: influência do fotoperíodo e tamanho do recipiente. Ciência e Prática, Lavras, v. 16, n. 2, p , PEREIRA, J. E. S.; FORTES, G. R. de L. Efeito do uso de segmentos basais e apicais na multiplicação in vitro da macieira. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FISIOLOGIA VEGETAL, 7, 1999, Brasília. Resumos... Brasília, SBFS, p. 90. PERES, L. E.P.; MAJEROWICZ, N.; KERBAUY, G. B. Dry matter partitioning differences between shoots and roots in two contrasting genotypes of orchids and their relationship with endogenous levels of auxins, citokinins and abscisic acid. Brazilian Journal of Plant Physiology, Londrina, v. 13, n. 2, p , SAN JOSÉ, M. C., BALLESTER, A., VIEITEZ, A. M. Factors affecting in vitro propagation of Quercus robur L. Tree Physiology, Victoria, v. 4, p , TAIZ, L.; ZEIGER, E. Plant Physiology. Massachusetts: Sinauer Associates, p.