Hibridação e Clonagem

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1 Hibridação e Clonagem CAPÍTULO 5 Teotônio Francisco de Assis 1 Reginaldo Gonçalves Mafia 2 1 Engenheiro Florestal, M.S. e Consultor em melhoramento e propagação de plantas da Assistech Ltda. assisteo@terra.com.br 2 Engenheiro Florestal, D.S. e Pesquisador do Centro de Pesquisa e Tecnologia da Aracruz Celulose S.A.. rgoncalves@aracruz.com.br 93

2 94 Biotecnologia Florestal

3 Introdução A hibridação interespecífica tem se constituído na forma mais rápida e eficiente de obtenção de ganhos genéticos no melhoramento de espécies de Eucalyptus, com reflexos diretos e significativos na indústria de base florestal. A busca de complementaridade nas características tecnológicas da madeira, a tolerância a estresses bióticos e abióticos, bem como a manifestação de heterose, verificada em vários cruzamentos híbridos, constituem os principais caminhos para se produzir indivíduos superiores em crescimento, adaptação e qualidade da madeira. Em um segundo momento, no programa de melhoramento genético, o emprego da clonagem, em vez dos métodos sexuados de produção de mudas, permite a transferência da variância genética total (Zobel, 1982), resultando na obtenção de ganhos máximos, sejam de produtividade volumétrica, sejam relacionados a propriedades tecnológicas da madeira ou à resistência a fatores bióticos e abióticos. A clonagem possibilita ainda a produção de matériaprima mais uniforme, o que, do ponto de vista industrial, apresenta significativos benefícios, tanto na minimização dos custos do processo industrial quanto na qualidade dos produtos. Assim, se por um lado a hibridação interespecífica em Eucalyptus é a forma mais rápida de obtenção de ganhos genéticos para a indústria, a clonagem é, por outro lado, a forma mais rápida e eficiente de se incorporar esses ganhos ao processo de produção industrial. Dessa forma, atualmente, a clonagem constitui o processo ideal para maximizar os benefícios da hibridação no contexto da formação de florestas altamente produtivas para finalidades industriais. O aproveitamento comercial da heterose em híbridos de Eucalyptus, por intermédio da clonagem, é um dos grandes responsáveis pela rápida evolução da produtividade florestal nos últimos anos e é um dos exemplos mais bem-sucedidos do uso de híbridos em espécies florestais. Além dos benefícios para a produção de florestas industriais, a clonagem deverá desempenhar, no futuro, papel importante na multiplicação de indivíduos geneticamente modificados. Os métodos atuais de propagação vegetativa são perfeitamente adequados como complemento necessário à viabilização da transferência dos benefícios da engenharia genética para os sistemas operacionais de produção de florestas, inclusive com maior segurança quanto ao fluxo gênico. Hibridação Um grande número de espécies de Eucalyptus é compatível entre si quanto ao cruzamento genético, o que permite inúmeras combinações e, assim, atende às exigências dos mais diferentes ambientes de plantio e às finalidades de usos. A grande diversidade interespecífica deste gênero facilita a busca de combinações desejáveis nos programas de melhoramento genético para distintas finalidades industriais. Além disso, a grande diferenciação entre as espécies, em termos de crescimento e propriedades tecnológicas da madeira, é um fator importante na produção de combinações complementares, capazes de proporcionar ganhos simultâneos em crescimento e qualidade da madeira. Crescimento A maioria dos benefícios proporcionados pelo uso de híbridos, principalmente quanto à produtividade florestal, é creditada à manifestação de heterose para crescimento e à complementaridade que certas espécies apresentam em relação às características necessárias para adaptação. Apesar disso e de várias evidências de sua ocorrência em Eucalyptus (Martin, 1989; Assis, 1996; Nikles, 1992; Denison e Kietzka, 1992; Campinhos e Ykemori, 1980), a manifestação de heterose para crescimento é, ainda, um assunto controverso. Existem questionamentos acerca de sua real origem, se heterose per se ou complementaridade (Sedgley e Griffin, 1989; Eldridge et al., 1993; Potts e Dundgey, 2001). Por outro lado, há críticas sobre o uso de testemunhas produzidas por polinização livre, endogâmicas em proporção desconhecida, para avaliar híbridos de polinização controlada, sempre exogâmicos, o que pode levar a resultados erráticos (Sedgley e Griffin, 1989). Entretanto, apesar dos 95

4 Biotecnologia Florestal poucos estudos conclusivos sobre o assunto, há indicações de que existe suficiente variância genética não-aditiva em Eucalyptus para explicar a ocorrência de heterose em híbridos nesse gênero (Coterill, 1997; Kageyama e Kikute, 1989; Paramathma e Surendran, 1997; Zobel e Talbert, 1984; Griffin et al., 2000; Verryn, 2000; Rezende e Resende, 2000) e também para justificar sua exploração comercial por meio de técnicas de propagação vegetativa. A experiência com a produção de híbridos de Eucalyptus no Brasil mostra que a manifestação de heterose depende do local e também da afinidade genética entre as espécies. Em cruzamentos entre espécies da seção Transversaria, em Minas Gerais, não foi detectada heterose para crescimento (Assis, 2000), provavelmente porque a chance de ocorrer heterose entre espécies de mesma seção, geneticamente mais próximas, é menor do que entre espécies de seções diferentes (Kha e Cuong, 2000). Dentro de certos limites, a maior distância genética favorece a ocorrência de heterose. Nessa série de ensaios, observou-se que a superioridade de algumas famílias híbridas e, sobretudo, de indivíduos dentro de famílias, é muito maior do que nas espécies puras utilizadas como genitoras, tornando os híbridos excelentes fontes de indivíduos candidatos para programas clonais. Essa superioridade foi denominada heterose funcional por Lankey (1999). A existência de heterose funcional, em nível de famílias e de indivíduos, permite seu aproveitamento comercial com grandes vantagens em relação às espécies genitoras (Quadro 5.1, Figura 5.1). Quadro Heterose funcional em nível de família e de indivíduo, no híbrido Eucalyptus grandis x Eucalyptus camaldulensis, e em nível de indivíduo, nas espécies genitoras Volume Individual (m³/árvore) Espécies/híbridos Melhor genitor Melhor Melhor árvore Média cruzamento Eucalyptus grandis x Eucalyptus camaldulensis 0,117 0,133 0,153 0,253 E. grandis (Polinização controlada) 0, ,180 E. grandis (Pomar de sementes) 0, ,161 E. camaldulensis (Polinização livre) 0, ,141 Em outra série de cruzamentos entre espécies das seções Transversaria e Maidenaria, no Estado do Rio Grande do Sul, diferentemente do que foi verificado em Minas Gerais, na maioria dos cruzamentos houve manifestação de heterose para volume (Assis, 2000). Essa diferença de comportamento está coerente com as observações de Martin (1989), Resende e Rezende (2000) e Kha e Cuong (2000) sobre a influência que o ambiente exerce na expressão da heterose, bem como sobre o maior potencial de obtenção de heterose entre espécies de seções diferentes. Qualidade da Madeira As propriedades tecnológicas da madeira são de grande importância para a indústria, pois promovem impactos nos custos do processo, nos ganhos de produção e na qualificação tecnológica dos produtos, sendo, portanto, fundamentais nos processos de produção de matéria-prima para uso industrial. 96

5 Figura Heterose funcional no nível de famílias e de indivíduos: heterose em família híbrida de Eucalyptus grandis x E. pellita (A); heterose em indivíduo híbrido de E. urophylla x E. viminalis (B); e heterose em indivíduos híbridos de E. urophylla x E. globulus (C). 97

6 Biotecnologia Florestal Herança de Características da Madeira e da Polpa Apesar de sua importância para os processos de produção industrial, são raros os estudos sobre o tipo de herança da qualidade da madeira em cruzamentos entre espécies de Eucalyptus. Exceção se faz à densidade da madeira, característica que apresenta interação alélica do tipo aditiva (Denison e Kietzka, 1992; Tibitts et al., 1995; Assis, 1996). Em uma série de análises operacionais feitas pela Riocell S/A, dentro do programa de produção de híbridos interespecíficos de Eucalyptus, algumas características da madeira e da polpa foram avaliadas. Os resultados dessas avaliações são apresentados no Quadro 5.2. De acordo com os resultados obtidos, observa-se que, de modo geral, predomina a herança do tipo aditiva nas características avaliadas. Fica evidente que, do ponto de vista prático, cruzamentos entre espécies cujas características da madeira e da polpa são de magnitudes semelhantes pouco contribuem para aumentar a probabilidade de obtenção de indivíduos com qualidade superior em relação às espécies puras, ou seja, espécies genitoras com médias semelhantes produzem híbridos com valores semelhantes. Sendo a herança do tipo aditiva, o cruzamento de indivíduos dos extremos da variação pode ser utilizado no sentido de se obterem avanços mais significativos na direção desejada. Apesar de os híbridos assumirem valores intermediários, as faixas de variação vão desde valores inferiores à média da espécie de valor mais baixo até superiores à média da espécie de valor mais alto, permitindo explorar também essa variabilidade por intermédio da clonagem. Quadro Propriedades da madeira e da polpa em cruzamentos interespecíficos aos 5,5 anos de idade da árvore 98

7 Aparentemente, as características quantitativas que não estejam envolvidas no processo adaptativo apresentam herança aditiva. Por exemplo, esse mesmo tipo de herança foi verificado em cruzamentos feitos entre espécies com diferentes teores de óleos essenciais nas folhas (Farah et al., 2002); os híbridos resultantes apresentaram teores de óleo intermediários em relação às espécies genitoras. Hibridação x Qualidade da Madeira Celulose O principal desafio para os melhoristas tem sido conciliar a maior produtividade florestal com a melhor qualidade da madeira. Para a fabricação de celulose, o maior obstáculo à obtenção de materiais favoráveis, do ponto de vista florestal e industrial, é que as espécies mais produtivas apresentam, geralmente, limitações na qualidade da madeira, considerando-se as características superiores do gênero Eucalyptus. Por outro lado, as espécies de melhor qualidade da madeira são pouco adaptadas aos climas do Brasil. Tendo em vista que as principais características da madeira para a fabricação de celulose são herdadas de forma aditiva, E. globulus e suas subespécies adquirem grande importância no melhoramento visando às características da madeira para essa finalidade. Em algumas das propriedades de sua madeira e polpa, como densidade da madeira, teor de lignina, rendimento em celulose, teor de pentosanas, viscosidade e consumo específico, E. globulus e suas subespécies apresentam destacada superioridade em relação às espécies cultivadas no Brasil. Assim como E. globulus, outra espécie que pode se tornar importante neste aspecto, pela qualidade de sua madeira e polpa, é E. smithii (Clarke e Vessels, 1995). Eucalyptus dunnii, mesmo não estando no mesmo nível das espécies citadas, também apresenta características que são úteis em programas de hibridização visando à produção de celulose. Cruzamentos de E. dunnii x E. urophylla produzem indivíduos superiores quanto à qualidade da madeira na produção de celulose e com maiores possibilidades de adaptação nos ambientes de plantio no Brasil. Embora essas espécies de alta qualidade da madeira sejam compatíveis com a maioria das espécies cultivadas no Brasil (seção Transversaria), todas pertencem à seção Maidenaria, em cujos cruzamentos há incidência relativamente alta de plantas anormais (Griffin et al., 2000; Potts e Dundgey, 2001; Assis, 2000). Entretanto, isso não inviabiliza a realização desses cruzamentos, visto que também são formados indivíduos normais, de alta performance, os quais podem ser multiplicados para formar florestas clonais de alta produtividade e qualidade da madeira. Do ponto de vista da clonagem, uma vantagem do cruzamento entre espécies dessas duas seções é que os representantes da seção Maidenaria são recalcitrantes ao enraizamento, ao passo que a maioria das espécies da seção Transversaria apresenta maior facilidade de enraizamento adventício, o que pode resultar em híbridos possíveis de serem multiplicados vegetativamente. Carvão Vegetal As espécies adaptadas nos diferentes climas do Brasil e que são aptas à produção de carvão vegetal são, em sua maioria, pertencentes às seções Transversaria e Exertaria, sendo todas compatíveis e não apresentando problemas de anormalidades em seus cruzamentos. Geralmente, as melhores características físicas e mecânicas do carvão são encontradas em espécies da seção Exertaria, destacando-se E. camaldulensis, E. tereticornis e E. brassiana. Se, por um lado, essas espécies possuem alta densidade da madeira, alto teor de lignina e resultam na produção de carvão com excelentes propriedades físicas, sobretudo quanto à resistência mecânica e a granulometria, por outro lado, apresentam baixas produtividades volumétricas e são inferiores quanto à forma do fuste. Na seção Transversaria, onde se encontram as espécies de 99

8 Biotecnologia Florestal maior produtividade volumétrica, destacam-se: E. grandis, E. saligna, E. urophylla, E. pellita, E. resinifera e E. robusta. As espécies: E. pellita, E. resinifera e E. robusta apresentam alta densidade da madeira e alto teor de lignina, mas produzem carvão com propriedades mecânicas inferiores. Eucalyptus saligna e E. urophylla possuem densidade da madeira intermediária e E. grandis, densidade baixa, mas todas possuem boas propriedades mecânicas do carvão. Dessa forma, as espécies das seções Transversaria e Exertaria apresentam alto grau de complementaridade quando se tem por objetivo produzir cruzamentos com alto potencial para a criação de indivíduos produtivos e de alta qualidade da madeira visando à fabricação de carvão. Alguns cruzamentos, como E. grandis x E. camaldulensis e E. urophylla x E. camaldulensis, já são tradicionais nas empresas, com boas perspectivas de produtividade e qualidade. Cruzamentos dentro da seção Transversaria também podem produzir sinergia quando se deseja obter indivíduos com potencial de crescimento e qualidade da madeira para produção de carvão. Entre os cruzamentos com maior potencial estão E. grandis x E. urophylla e E. grandis x E. pellita. De modo geral, os híbridos obtidos a partir dessas espécies apresentam índices de enraizamento adequados ao seu uso em programas clonais em larga escala. Laminação e Serraria Na produção de toras para laminação e serraria, o maior diâmetro, a forma do tronco, a menor incidência de rachaduras, o menor colapso e a espiralização das fibras são as características mais importantes. A manifestação de heterose funcional, em nível de famílias e indivíduos, é uma fonte de obtenção de árvores com diâmetros superiores, e em princípio, todos os cruzamentos são potenciais nesse sentido. Há grande variabilidade entre as distintas espécies no que diz respeito às características importantes para laminação e serraria. Espécies como E. grandis e E. saligna apresentam menor tendência ao rachamento e, por isso, são as preferidas para esse tipo de utilização. Do ponto de vista de cor da madeira, característica importante para tingimentos, essas espécies têm coloração rósea. Já E. robusta, E. pellita, E. resinifera e E. urophylla têm madeira avermelhada. Por sua vez, Eucalyptus dunnii tem madeira amarelada, enquanto E. globulus e suas subespécies possuem madeira com tonalidades mais claras. Algumas combinações híbridas já são utilizadas comercialmente em laminação e serraria, como E. saligna x E. grandis, na Boise Cascade do Brasil, e E. grandis x E. urophylla, na Aracruz. Resistência a Fatores Bióticos e Abióticos Resistência a Pragas e Doenças Na Austrália, origem da maioria das espécies de Eucalyptus, os híbridos são mais susceptíveis a pragas e doenças do que suas espécies genitoras (Potts e Dundgey, 2001). Essa deve ser a razão pela qual dificilmente híbridos naturais conseguem se estabelecer nas áreas de ocorrência natural. A explicação mais provável para isso é que as espécies susceptíveis a diferentes pragas e doenças, quando intercruzadas, produzem descendentes que são, em sua maioria, susceptíveis às pragas e doenças de ambas as espécies genitoras (complementaridade negativa), o que torna difícil a sua sobrevivência e o seu posterior desenvolvimento. Entretanto, fora da Austrália, a hibridação tem sido uma excelente ferramenta para introduzir resistência a doenças. A resistência ao cancro e à ferrugem são exemplos disso. Dentre as doenças que afetam o eucalipto, aquelas que ocorrem no campo são mais importantes economicamente. Já as doenças que afetam as mudas são mais facilmente manejadas, uma vez que as condições do ambiente no viveiro são semicontroladas e, assim, é possível adotar várias medidas integradas de controle. Muitas das espécies utilizadas no Brasil são suscetíveis a doenças, sejam elas de folhas ou de tronco. Dentre as de maior importância econômica e que possuem variabilidade intra e interespecífica, destacam-se o cancro e a ferrugem do eucalipto, embora haja outras doenças que causam danos e podem se tornar problemas mais sérios em condições de campo. 100

9 O cancro do eucalipto, causado pelo fungo Chrysoporthe cubensis ( sin.: Cryphonectria cubensis) (Gryzenhout et al., 2004), foi a principal ameaça ao plantio comercial de espécies de Eucalyptus em áreas tropicais, sobretudo na década de Entre as espécies mais susceptíveis, encontram-se algumas procedências de E. grandis e E. saligna (Alfenas et al., 2004). As fontes de resistência ao cancro são: Corymbia citriodora, C. torelliana, Eucalyptus cloeziana, E. pilularis, E. paniculata, E. pellita, E. urophylla, E. robusta, E. resinifera e E. microcorys (Alfenas et al., 2004; Ferreira e Milani, 2002). Desse grupo, nos programas com híbridos predominam as espécies do subgênero Symphyomyrtus. Na prática, por limitações de compatibilidade, somente E. pellita, E. urophylla, E. robusta e E. resinifera seriam úteis para a transferência de genes de resistência ao cancro pela hibridação, cuja qualidade da madeira é considerada inferior para a fabricação de celulose. Assim, no caso de se buscar cruzamentos com essas espécies para resistência a doenças, seu efeito negativo sobre a qualidade da madeira deve ser neutralizado pela inclusão de espécies de qualidade superior da madeira, como E. dunnii, E. smithii e, sobretudo E. globulus e suas subespécies (E. pseudoglobulus, E.maidenii e E. bicostata). Dentre as doenças foliares, a ferrugem do eucalipto, causada por Puccinia psidii, é uma das mais importantes. A existência de alta variabilidade genética, inter e intra-específica, para resistência à doença permite seu controle mediante o plantio de espécies, progênies e clones resistentes (Alfenas et al., 2004). As mais importantes fontes de resistência à ferrugem são C. citriodora, C. torelliana, E. camaldulensis, E. microcorys, E. pellita, E. pilularis, E. propinqua, E. resinifera, E. robusta, E. saligna, E. tereticornis e E. urophylla (Alfenas et al., 2004; Ferreira e Milani, 2002). Mesmo nas espécies susceptíveis, há ampla variabilidade intra-específica, o que permite a seleção de genótipos resistentes para serem utilizados como genitores. Atualmente, acredita-se que é fundamental em um programa de melhoramento genético que visa obter plantas resistentes a determinação do modelo de herança e da base genética da resistência. Em E. grandis, por exemplo, Junghans et al. (2003) verificaram que a resistência à ferrugem é dominante e controlada por um gene de efeito principal denominado Ppr1 (Puccinia psidii resistance gene 1). Neste caso, a utilização de genitores homozigotos para resistência garante a obtenção de progênies híbridas resistentes. Para outras doenças importantes, como a desfolha de Cylindrocladium, a queima foliar de Rhizoctonia e as doenças vasculares, causadas por Ceratocystis fimbriata e Ralstonia solanacearum, o uso de clones resistentes tem sido preconizado como a medida mais eficiente de controle (Alfenas et al., 2004b). No caso de pragas, de modo geral, a determinação da resistência ocorre muito mais em nível de espécie do que em nível de genótipos individuais. Quando algum inseto apresenta preferência por certa espécie, dificilmente se observa variação intra-específica. Entretanto, quando se realizam cruzamentos em que uma das espécies é resistente, é possível introduzir a variabilidade individual. O psilídeo-de-concha, por exemplo, tem preferência pelas espécies E. camaldulensis e E. tereticornis. Entretanto, no Estado de São Paulo, um dos clones menos susceptíveis a ele foi originado de um híbrido entre E. grandis e E. camaldulensis (Jacyr Mesquita Alves, 2006, comunicação pessoal). Portanto, é fundamental utilizar pelo menos uma espécie resistente na composição dos híbridos. Resistência à Seca A utilização de espécies que se adaptam a regimes de baixa precipitação pluviométrica, para a produção de híbridos interespecíficos, é prática comum no melhoramento de espécies desse gênero (Verryn, 2000). As espécies introduzidas no Brasil mais importantes na formação de híbridos resistentes à seca estão na seção Exertaria ( E. camaldulensis, E. brassiana e E. tereticornis), procedências do norte Queensland, Autrália. Normalmente, as espécies resistentes à deficiência hídrica apresentam baixo crescimento. Sua dinâmica estomática, de alta sensibilidade à temperatura e umidade do ar e do solo, favorece a 101

10 Biotecnologia Florestal economia de água, prejudicando o crescimento em momentos hídricos favoráveis. Suas folhas também apresentam disposição que desfavorece a interceptação de luz e, conseqüentemente, a fotossíntese. A combinação de espécies que crescem muito, mas pouco resistentes à seca, com espécies resistentes à seca e que crescem pouco tem produzido indivíduos resistentes à seca, mas que apresentam incrementos volumétricos superiores aos de seus genitores mais resistentes ao déficit hídrico. Aparentemente, nos híbridos ocorre a formação de um aparelho fotossintético capaz de economizar água nos momentos críticos, mas capaz de proporcionar o máximo crescimento nos momentos hídricos favoráveis. Os cruzamentos mais comuns são feitos com E. grandis, E. urophylla e E. pellita. A seleção de clones híbridos resistentes à seca tem sido feita de forma indireta. Normalmente, desenvolve-se todo o programa de seleção de genitores e de indivíduos para clonagem em locais de maior precipitação. Somente após a clonagem, os indivíduos selecionados com base em outras características são avaliados em áreas sujeitas à seca. Como a expansão de projetos de plantações florestais está, cada vez mais, sendo direcionado para áreas marginais, deve-se considerar programas específicos de desenvolvimento de genitores resistentes para se obter maior efetividade na produção de híbridos resistentes à seca. Resistência ao Frio Em regiões onde a incidência de geadas severas compromete o estabelecimento e a adaptação de espécies de Eucalyptus, a resistência ao frio é uma das características de maior importância que podem ser introduzidas por meio da hibridação. Na África do Sul, o exemplo mais conhecido é o híbrido E. grandis x E. nitens, que apresenta forte resistência a geadas e crescimento superior ao das espécies paternas (Wex e Denison, 1997). Algumas das espécies mais tolerantes ao frio, como E. nitens, E. gunnii e E. regnans, por exemplo, não apresentam boa capacidade de adaptação e crescimento no Brasil. Aparentemente, a temperatura elevada durante o verão e por este ser úmido, são os principais fatores limitantes ao desenvolvimento dessas espécies. Entretanto, há outras espécies, como E. viminalis (Figura 5.2), E. badjensis, E. benthamii e E. smithii, que são boas alternativas como componentes de híbridos resistentes ao frio. Praticamente todas as espécies tolerantes ao frio são recalcitrantes ao enraizamento, dificultando o uso dessas fontes genéticas em programas clonais visando a resistência ao frio. Nesse sentido, a hibridação é uma excelente alternativa para produzir indivíduos resistentes que possam ser facilmente clonados. Há alguns cruzamentos, que combinam espécies de clima temperado (por exemplo, E. viminalis) e espécies tropicais (como, E. urophylla), com grande potencial para serem utilizados em programas de seleção clonal para resistência ao frio. O cruzamento entre as espécies E. viminalis e E. urophylla tem produzido heterose em crescimento, com muitos indivíduos candidatos a se tornarem clones potencialmente resistentes ao frio e que ainda agregam a facilidade de propagação vegetativa. Produção de Sementes Híbridas Compatibilidade entre Espécies Normalmente, há uma hierarquia na definição da probabilidade de êxito na realização de cruzamentos entre espécies de Eucalyptus (subgênero seção série). No cruzamento entre espécies de subgêneros diferentes, em princípio, não há possibilidade de produzir sementes híbridas viáveis. Entretanto, cruzamentos entre espécies de diferentes seções, dentro de um subgênero, com algumas exceções, são viáveis. Há vários exemplos de cruzamentos bemsucedidos entre espécies das seções Transversaria (ex. E. grandis, E. urophylla, E. pellita, E. robusta, E. resinifera, E. saligna, E. deanei, E. botryoidis etc.), Maidenaria (ex. E. globulus, E. maidenii, E. bicostata, E. pseudoglobulus, E. viminalis, E. dunnii, E. badjensis, E. nitens e E. benthamii) e Exertaria (ex. E. camaldulensis, E. tereticornis, E. exerta e E. brassiana). Algumas seções, como a Adnataria, por exemplo, que inclui E. paniculata, são mais isoladas 102

11 Figura Materiais genéticos resistentes ou susceptíveis à seca e à geada: à esquerda, clone susceptível, e à direita, clone resistente à seca (A); clone susceptível a geadas (B); no centro, E. globulus susceptível à geada, circundado por E. viminalis, resistente (C). Fonte: Foto (C) cortesia da Mundial Forestación. e não se cruzam facilmente com espécies de outras seções do subgênero Symphyomyrtus. O cruzamento entre espécies das seções Transversaria e Exertaria é inteiramente viável, havendo questionamentos da necessidade de separação dessas espécies em duas seções distintas (Potts e Dundgey, 2001). No Quadro 5.3, encontramse as proporções de combinações viáveis entre espécies das três principais seções do subgênero Symphyomyrtus, ao qual pertence a grande maioria das espécies de interesse comercial. Alguns tipos de incompatibilidade se manifestam em nível pré-zigótico, impedindo a fecundação ou reduzindo a quantidade de sementes produzidas. É o caso, por exemplo, do cruzamento entre espécies de flores com tamanho muito diferente. 103

12 Biotecnologia Florestal Quadro Proporção de combinações híbridas (F 1 ) viáveis entre espécies das três principais seções do subgênero Symphyomyrtus, utilizadas em plantios florestais Seção Maidenaria Exertaria Transversaria Maidenaria 80% 0% 9% Exertaria 100% 91% Transversaria 100% Fonte: Potts e Dundgey (2001). Quando espécies de flores grandes são utilizadas como genitoras femininas, em cruzamentos com espécies de flores muito pequenas, o tubo polínico formado não consegue atingir tamanho suficiente para alcançar o ovário (Potts et al., 1992). Um clássico exemplo desse tipo de incompatibilidade é o cruzamento entre E. globulus e E. nitens, quando se utiliza E. globulus como genitor feminino. Todavia, essa barreira pode ser quebrada invertendo-se os genitores. Alternativamente, o corte do estigma das flores de E. globulus pode remover essa barreira para cruzamentos com algumas espécies de flores pequenas. A incompatibilidade entre espécies de Eucalyptus também pode ocorrer em nível pószigótico, quando uma barreira fisiológica, resultante de anormalidade, impede o desenvolvimento normal dos tubos polínicos, os quais não atingem os ovários para realizar a fecundação das flores. Nesses casos, é comum conseguir resultado positivo nos cruzamentos, mas quase nenhuma semente viável é produzida. Anormalidades em Híbridos O aparecimento de plantas anormais em cruzamentos híbridos de Eucalyptus é um fenômeno comum quando se cruzam algumas espécies de seções taxonomicamente distantes, sobretudo Maidenaria e Transversaria. Os problemas de anormalidades podem ocorrer em diferentes estádios no ciclo de vida da planta. Alguns desses problemas aparecem na fase de desenvolvimento das sementes, reduzindo o número de sementes por fruto. Outros ocorrem no estádio de germinação, cujas taxas são reduzidas. Também aparecem na fase de mudas, quando as plantas anormais podem ser descartadas antes do plantio, mas, mesmo assim, plantas com aparência normal podem se tornar anormais quando plantadas no campo. Assim, as tentativas de solucionar o problema no campo, pelo refugo de plantas anormais na fase de viveiro têm se mostrado insuficientes. Em programas de hibridação desenvolvidos no Brasil (Assis, 2000), o aparecimento de plantas anormais tem comprometido o desempenho de vários cruzamentos, às vezes reduzindo a expressão da heterose, outras vezes contribuindo para que seja obtida heterose negativa (Quadro 5.4). Conforme observado por Potts et al. (1992) e Assis (2000), plantas aparentemente saudáveis desenvolvem anormalidades quando plantadas no campo. Até o segundo ano após o plantio essas anormalidades ainda se manifestam. Por essa razão, dois anos após Quadro Heterose negativa em cruzamento entre E. grandis (seção Transversaria) e E. dunnii (seção Maidenaria) Híbrido/espécie DAP (cm) Altura (m) Volume médio (m 3 ) Volume individual máximo (m 3 ) E. grandis x E. dunnii 10,8 11,5 0,052 0,459 E. grandis 18,5 19,4 0,261 0,504 E. dunnii 15,5 16,1 0,132 0,

13 o plantio, é considerada a idade mínima para realizar a seleção precoce segura em híbridos entre espécies de seções taxonomicamente distantes. As anormalidades, provavelmente defeitos genéticos (Potts et al., 2001), manifestam-se na forma de uma deficiência nutricional generalizada, além de outros distúrbios fisiológicos, como o endurecimento das folhas, a superbrotação de gemas e a perda de dominância apical. Aparentemente, ocorre uma falha, ou na absorção ou no metabolismo de nutrientes essenciais, uma vez que essa condição anormal mostra-se irreversível mesmo com a adição de doses elevadas de fertilizantes. A conseqüência é quase sempre o reduzido crescimento e a morte da árvore em idades mais avançadas. Segundo Falconer (1989), esses efeitos podem ser conseqüência da quebra de conjuntos de genes epistáticos co-adaptados, que normalmente ocorre ao se combinarem indivíduos muito divergentes. Anormalidades no cruzamento entre espécies dentro da seção Transversaria são muito raras. Esse tipo de problema tem sido verificado com mais freqüência quando há a participação de espécies da seção Maidenaria, tanto em cruzamentos dentro da seção quanto em cruzamentos com espécies de outras seções. Os híbridos E. dunnii x E. grandis e E. dunnii x E. urophylla apresentam muito menos problemas de anormalidades do que seus recíprocos, sugerindo que pode haver algum tipo de efeito extranúcleo em sua expressão. Além disso, tanto em avaliações em viveiro quanto em campo, observa-se que há variação individual quanto ao aparecimento de plantas anormais. Em cruzamentos de grande potencial, por exemplo aqueles em que participam E. globulus, E. dunnii e E. maidenii, a seleção de genitores com menos propensão a produzir plantas anormais pode ser uma estratégia adequada para eliminar ou, pelo menos, minimizar os problemas de anormalidades. Cruzamentos to tipo three-way-cross e retrocruzamentos, realizados no Brasil (Assis, 2000) e no Uruguai (Griffin et al., 2000), produziram menos descendências anormais, mesmo quando os híbridos F 1 s, utilizados como genitores, eram de famílias com alta incidência de anormalidades. Recentes Avanços nas Técnicas de Cruzamentos Controlados com Eucalyptus As flores das espécies de Eucalyptus são hermafroditas e apresentam protandria (Eldridge et al., 1993). Na antese, os grãos de pólen encontramse maduros, mas o estigma torna-se receptivo apenas entre cinco e sete dias depois. Em razão disso, para realizar os cruzamentos controlados, tornam-se necessárias várias inspeções nas flores, para que elas sejam emasculadas, isoladas e polinizadas, o que tem dificultado e desestimulado sua utilização em maior escala. Entretanto, os recentes avanços verificados na produção de sementes híbridas abrem novas perspectivas, inclusive para o uso de outras estratégias, diferentes da derivação de clones por propagação vegetativa. O desenvolvimento da OSP (One Stop Pollination) em E. globulus, no Chile (Harbard et al., 2000), trouxe importantes melhorias operacionais aos trabalhos de polinização controlada. Essa técnica se baseia no corte transversal ou longitudinal do pistilo, induzindo a receptividade da flor na antese. A polinização pode ser realizada nesse momento, facilitando a realização dos cruzamentos controlados. No entanto, embora tenha trazido melhorias operacionais, os benefícios obtidos com a OSP em E. globulus, cujas flores são grandes, não foram inteiramente replicáveis em espécies de flores pequenas, sobretudo pela dificuldade de utilizar o sistema de isolamento feito diretamente no pistilo, com tubos de plástico flexíveis. Por outro lado, a OSP implica a necessidade de emascular as flores, uma operação que exige tempo. Combinando-se a técnica de OSP desenvolvida no Chile, com a descoberta feita em Portugal de que a receptividade induzida do estigma poderia ser obtida antes da antese (Trindade et al., 2001), uma nova técnica de cruzamentos controlados em Eucalyptus foi preliminarmente desenvolvida na Riocell, em 1996 (Assis e Jardim, 1996 resultados não publicados): a PAI (Protoginia Artificialmente Induzida). Essa técnica 105

14 Biotecnologia Florestal consiste em remover o topo do opérculo do botão floral, cortando-se o terço superior do pistilo, no estádio de pré-antese, ou seja, com a flor ainda fechada, realizando-se a polinização imediatamente após a indução (Figura 5.3). Mais tarde, essa nova técnica foi simultaneamente testada no Brasil, na Aracruz Guaíba e na Austrália, no CSIRO, (Assis et al., 2005), onde foi obtido o mesmo nível de sucesso verificado anteriormente. A PAI, além de reduzir o número de visitas, elimina a necessidade de emasculação, viabilizando a obtenção de maior quantidade de sementes em cruzamentos controlados de Eucalyptus. A produtividade operacional aumentou de 35 para 400 flores polinizadas por homem/hora utilizando-se essa técnica. Quando algum tipo de contaminação é aceitável, essa técnica pode ser executada em áreas não-isoladas. Atualmente, é o método mais utilizado em cruzamentos de Eucalyptus. O desenvolvimento de conceitos de pomares de cruzamentos indoor, no interior de casas teladas, eliminou a necessidade de se realizar o isolamento de flores, umbelas ou ramos individuais, possibilitando o isolamento de plantas inteiras (Assis Figura Seqüência de cruzamentos controlados utilizando-se a PAI (Protoginia Artificialmente Induzida): flores protândricas (A); indução da receptividade do estigma por meio do corte de sua extremidade (B e C); polinização (D); flores polinizadas (E); e frutos em desenvolvimento (F). 106

15 et al., 2005) (Figura 5.4). Isso foi possível graças ao estabelecimento de tecnologias como a indução da floração precoce em plantas cultivadas em vasos. A produção de flores em plantas de pequeno porte permite o cultivo em pomares de cruzamentos indoor. O uso dessas tecnologias, em conjunto, está permitindo a realização de cruzamentos controlados em grande escala, tornando possível, inclusive, a multiplicação de famílias de irmãos completos de alta superioridade, tarefa antes considerada técnica e economicamente inviável. Isso tem grande importância no melhoramento de espécies de difícil enraizamento, pois permite capturar e multiplicar, em larga escala, a superioridade de famílias de irmãos completos, puras ou híbridas. Figura Sistema tradicional e atual de polinização controlada em Eucalyptus: pomares de cruzamentos no campo (A); polinização controlada no campo (B); pomar de cruzamentos indoor (C); polinização controlada no pomar indoor (D). Estratégias de Hibridação O processo inicial de utilização de híbridos na formação de florestas clonais foi baseado na seleção massal de híbridos espontâneos e na sua multiplicação por enraizamento de estacas. Durante as décadas de 70 e 80, prevaleceu o aproveitamento comercial, por propagação vegetativa, da heterose manifestada nesses híbridos espontâneos produzidos por polinização livre. A partir da constatação da importância dos híbridos para a melhoria da produtividade e qualidade das florestas, 107

16 Biotecnologia Florestal a hibridação se transformou na principal ferramenta utilizada no melhoramento genético de espécies desse gênero. Desde então, a estratégia mais utilizada no melhoramento por meio da hibridação passou a ser a Seleção Recorrente Simples. Mais tarde, quando foi reconhecida a ocorrência de heterose nos cruzamentos interespecíficos (Coterill, 1997; Rezende e Resende 2000), a Seleção Recorrente Recíproca tornou-se a estratégia principal nos programas de melhoramento por meio da hibridação. Vários aspectos referentes ao uso dessa estratégia são mostrados e discutidos por Resende et al. (2006). A exemplo do que ocorre com a maioria dos híbridos em florestas (Nikles, 1992), os de Eucalyptus são férteis. Essa é considerada uma das grandes vantagens desse gênero no contexto da utilização de híbridos interespecíficos. Isso permite que híbridos F 1 sejam utilizados em novos cruzamentos para a integração de genes de outras espécies (three-way e four-way crosses) ou, ainda, para aumentar a participação de genes de uma das espécies componentes do híbrido F 1, devido à recorrência no cruzamento (retrocruzamentos). A utilização de indivíduos híbridos superiores, em novos cruzamentos, é recomendada, uma vez que a superioridade apresentada pelos indivíduos tem um mérito genético (Resende e Higa, 1990; Nikles 1992). Com base nessas possibilidades, alguns programas de hibridação, em desenvolvimento no Brasil, têm utilizado clones de híbridos oriundos dos programas comerciais de clonagem para cruzamentos do tipo three-way-cross e também em retrocruzamentos. Essas combinações permitem, em muitos casos, manter a heterose já presente nos indivíduos híbridos utilizados nos cruzamentos. Tal comportamento mostra-se importante para a transferência de características da madeira, herdadas de forma aditiva, com a participação de outras espécies (three-way e four-way crosses). Indivíduos superiores em crescimento continuam a ser produzidos nesses tipos de cruzamento, ou seja, continua havendo heterose funcional. Os cruzamentos E. urophylla x (E. camaldulensis x E. grandis), E. urophylla x (E. dunnii x E grandis), E. saligna x (E. grandis x E. urophylla) e (E. grandis x E. urophylla) x E. globulus têm sido os mais efetivos na produção de indivíduos para florestas clonais do que os híbridos F 1 entre essas espécies (Quadro 5.5). Desse modo, dispondo-se de métodos eficientes de propagação vegetativa, esses cruzamentos constituem-se em excelente oportunidade para fornecer bons genótipos para a clonagem. Provavelmente, essa superioridade é resultado de complementaridade, em que a introdução de um terceiro conjunto gênico pode criar melhores condições de adaptação a condições ambientais variáveis. Desse modo, quando E. urophylla recebe pólen de E. grandis x E. camaldulensis, por exemplo, além de estar recebendo alelos de E. grandis, com os quais combina e produz heterose, recebe também alelos de E. camaldulensis, que confere alguma vantagem adaptativa à nova combinação. Além disso, Quadro Crescimento volumétrico do híbrido three-way-cross Eucalyptus urophylla x (E. camaldulensis x E. grandis), em comparação com os híbridos F 1 e as espécies genitoras Híbridos/espécies E. urophylla x (E.camaldulensis x E. grandis) Média Volume individual (m 3 /árvore) Média do melhor genitor Melhor cruzamento específico Melhor indivíduo 0,155 0,163 0,218 0,331 E. grandis x E. urophylla 0,156 0,158 0,197 0,290 E. grandis x E. camaldulensis 0,117 0,133 0,153 0,253 E. urophylla x E. camaldulensis 0,092 0,103 0,187 0,234 E. urophylla (Pomar) 0, ,229 E. grandis (Pomar) 0, ,

17 clones multiespécies são mais estáveis, pois a interação genótipo x ambiente decresce na medida em que há aumento do número de espécies no cruzamento. Os cruzamentos do tipo three-way-cross também estão sujeitos aos problemas de anormalidades verificados em vários híbridos F 1. Entretanto, a ocorrência é significativamente menos freqüente em comparação com estes. (Griffin et al., 2000; Assis, 2000). A experiência com retrocruzamentos poderá ser negativa se a espécie recorrente não for a mais adaptada ao local. Um exemplo disso são os retrocruzamentos E. urophylla x (E. grandis x E. urophylla), sempre inferiores a E. grandis x (E. grandis x E. urophylla), no Rio Grande do Sul, onde E. grandis se adapta melhor. Resende et al. (2006) discutem o uso de gerações avançadas de híbridos e apresentam alternativas de melhoramento por hibridação, com opções para inclusão de E. globulus visando melhorar, simultaneamente, o crescimento e a qualidade da madeira. Clonagem Desde os primórdios de seu desenvolvimento, na Austrália e França, nos anos 50 (Chaperon, 1987), até o seu estabelecimento como método operacional de reprodução de indivíduos superiores (Campinhos e Ikemori, 1980; Martin, 1989), a clonagem de espécies de Eucalyptus tem evoluído de forma significativa. Essa evolução tem ocorrido tanto na concepção técnica dos modelos de clonagem quanto na incorporação de novas tecnologias, equipamentos, materiais e insumos. O grande propulsor desse avanço foi o sucesso alcançado pelo uso da clonagem nas duas últimas décadas, principalmente para solucionar problemas fitossanitários, como o cancro do eucalipto, e para aumentar a produtividade florestal (Assis, 2001). Nos últimos anos, a clonagem tem sido utilizada, primordialmente, em programas de plantios para fins industriais, nos quais características da madeira, para diferentes utilizações, são muito mais valorizadas. A clonagem tem sido aceita como a forma mais eficiente de aproveitar, comercialmente, a heterose verificada no cruzamento entre espécies de Eucalyptus e tem maior alcance naquelas espécies em que árvores adultas podem ser rejuvenescidas e propagadas vegetativamente, em larga escala. Mesmo quando produzidas por cruzamentos controlados, progênies puras ou híbridas são, em sua maioria, heterogêneas, e, assim, a clonagem torna-se fundamental para tirar o maior proveito dos indivíduos superiores dessas famílias. A heterose funcional, em nível de família, também permite utilizar o conceito de florestas de famílias, por meio da clonagem de famílias superiores. Essa situação é particularmente importante em espécies ou cruzamentos em que a perda da competência para o enraizamento, provocada pelo envelhecimento ontogenético, ocorre muito rapidamente. Por meio da clonagem, as plantas podem ser multiplicadas quando estão ainda juvenis e com alta predisposição ao enraizamento. Várias espécies de interesse econômico enquadram-se nessa categoria, como C. citriodora C. maculata, E. cloeziana, E. nitens, E. viminalis, E. dunnii e E. smithii. Por outro lado, as famílias híbridas, em muitos tipos de cruzamentos, podem apresentar altos níveis de anormalidades (Assis, 2000; Griffin et al., 2000), o que torna a clonagem imprescindível no resgate e na multiplicação de indivíduos superiores encontrados nessas famílias. Do ponto de vista dos processos industriais, baseados em plantios florestais, a clonagem apresenta contribuições potencialmente importantes. Ela promove homogeneização da matéria-prima, permitindo otimizar os processos, mediante o conhecimento prévio de seu desempenho e das necessidades das indústrias. Isso contribui, principalmente, para reduzir os custos de produção. Por outro lado, imprime maior velocidade de integração de ganhos genéticos dos programas de melhoramento genético ao processo produtivo. Esse mesmo conceito se aplica à qualidade dos produtos obtidos a partir de matérias-primas produzidas em florestas clonais. Técnicas de Clonagem A técnica de clonagem que originou o conceito de florestas clonais foi desenvolvida a partir do enraizamento de estacas. O desenvolvimento de 109

18 Biotecnologia Florestal novas técnicas de clonagem de Eucalyptus ocorreu a partir da verificação, no enraizamento de estacas, de fenômenos fisiológicos, notadamente a topófise e a cliclófise, observando-se que eles eram capazes de interferir na abrangência desta técnica, limitando seu uso em relação a várias espécies e clones. Esses fenômenos fisiológicos também afetavam a qualidade do sistema radicular, provocando a variação intraclonal e também reduzindo o nível de aproveitamento das árvores selecionadas devido a problemas de enraizamento (Assis, 2001). Como conseqüência, a relação entre o número de árvores selecionadas e o número de clones recomendados era reduzida. Isso despertou o interesse por técnicas alternativas, como a micropropagação, que, apesar de se mostrar tecnicamente viável na clonagem de muitas espécies recalcitrantes, não foi viável do ponto de vista econômico para uso em larga escala. Entretanto, foi a partir da micropropagação, em virtude dos problemas relatados, que se desenvolveu a microestaquia e, mais tarde, a miniestaquia. Essas tecnologias foram um marco na evolução dos sistemas de clonagem de Eucalyptus, iniciando um novo ciclo na propagação de espécies lenhosas. Microestaquia e Miniestaquia Estas técnicas foram criadas e desenvolvidas no Brasil, na década de 90 (Assis et al., 1992; Xavier e Comério, 1996; Iannelli et al., 1996; Assis, 1997; Wendling e Xavier, 1999; Higashi et al., 2000b; Campinhos et al., 2000; Alfenas et al., 2004). Após a implantação da microestaquia em escala operacional (Xavier e Comério, 1996), a micropropagação passou a ser utilizada, em muitos casos, como etapa prévia à multiplicação clonal, ex vitro, em larga escala. Posteriormente, a partir dos resultados positivos obtidos com a microestaquia, foi desenvolvida a miniestaquia como técnica alternativa de clonagem comercial de Eucalyptus (Higashi et al., 2000a). A diferença básica da miniestaquia em relação aos sistemas tradicionais (macroestaquia), baseados em jardins clonais de campo, diz respeito à produção de brotos em plantas de menor porte (minicepas), cultivadas em casas de vegetação especiais (minijardins clonais). Com esse tipo de manejo, a juvenilidade alcançada por intermédio do rejuvenescimento in vitro (Gonçalves et al., 1986) é mais facilmente preservada em relação aos jardins clonais de campo, resultando em maiores índices de enraizamento, principalmente pela redução dos efeitos da maturação fisiológica. Na microestaquia, os propágulos vegetativos, denominados microestacas, são obtidos mediante o rejuvenescimento a partir de micropropagação in vitro, enquanto na miniestaquia os propágulos vegetativos, chamados de miniestacas, são coletados dos ápices caulinares da própria estaca enraizada, pelo método convencional de estaquia (macroestaquia), bem como de mudas produzidas por miniestaquia ou por microestaquia. A partir do estabelecimento das plantas nos minijardins clonais para a formação das minicepas, seja por qualquer via, a multiplicação é realizada pela técnica da miniestaquia (Figura 5.5). A miniestaquia apresenta vantagens importantes em relação à macroestaquia. Além de benefícios operacionais, técnicos e econômicos, há ganhos ambientais, ergonômicos e de qualidade. Operacionalmente, a microestaquia e a miniestaquia demandam menor dispêndio de mão-de-obra, pela eliminação do manejo extensivo exigido nos jardins clonais de campo, que foi substituído pelo manejo intensivo nos minijardins clonais indoor. Além disso, a colheita e o transporte de brotações no campo foram substituídos pelo manejo concentrado no próprio viveiro e a aplicação de hormônios de enraizamento tornou-se desnecessária, na maioria dos clones. Na miniestaquia, a predisposição ao enraizamento é significativamente superior à obtida pela estaquia, podendo superar em 40% os valores de enraizamento conseguidos em clones recalcitrantes, sobretudo pelo maior grau de juvenilidade das miniestacas. Além disso, as miniestacas enraízam mais rapidamente, aumentando o aproveitamento das estruturas de propagação e reduzindo as perdas por apodrecimento da base dos propágulos. A miniestaquia apresenta bons resultados em espécies de clones de fácil enraizamento, em virtude de que altos níveis de predisposição ao enraizamento podem ser obtidos pela simples indução de brotação 110

19 de gemas dormentes na base da árvore. Nesses casos, a miniestaquia é preferível, por ser mais simples e de mais baixo custo. Entretanto, em espécies e clones de difícil enraizamento, cuja maturação fisiológica, com todas as suas conseqüências, ocorre mais cedo, a micropropagação tende a ser mais eficiente no aumento do potencial de enraizamento, e, portanto, nessas situações, a microestaquia é preferível. Na miniestaquia, para alguns clones, é necessário realizar a propagação seriada para reversão à juvenilidade e Figura Microestaquia e miniestaquia: micropagação (A e B); microestaca enraizada (C); minijardim clonal (D); brotação de macroestaca enraizada (E); miniestaca enraizada (F); e minijardim clonal (G). para atingir o potencial máximo de enraizamento. Na microestaquia, esses ciclos de propagação seriada são inerentes ao processo de micropropagação e são realizados naturalmente durante sua execução. Apesar de o sucesso dessas técnicas ser creditado muito mais à obtenção de altos níveis de juvenilidade (Assis et al., 1992; Xavier e Comério, 1996), o maior potencial de enraizamento também está relacionado com a melhor condição nutricional conseguida na produção de propágulos em sistemas hidropônicos. Além disso, a superioridade dessas técnicas em relação ao enraizamento também pode estar relacionada com o menor grau de lignificação dos propágulos. Comparadas com as estacas, as micro e miniestacas podem ser consideradas mais herbáceas e, utilizando essas técnicas, o aumento da concentração de lignina nos tecidos e muitas complicações associadas com a sua formação são evitados. Uma importante mudança promovida pelo desenvolvimento da microestaquia e da miniestaquia foi quanto ao conceito das estruturas de propagação. Quando a clonagem de Eucalyptus atingiu dimensões industriais, a maioria das estruturas físicas utilizadas para enraizar estacas era de baixo nível tecnológico. Com o surgimento da miniestaquia e da adoção dessa tecnologia em ambientes subtropicais, a necessidade de maior controle do ambiente de enraizamento exigiu o uso de estufas climatizadas (Figura 5.6). Sua importância no enraizamento ficou evidente, o que motivou a generalização de seu uso em outros ambientes. Microestaquia x Miniestaquia Embora muito parecidas em seu desenvolvimento operacional, há algumas particularidades entre essas duas técnicas que devem 111

20 Biotecnologia Florestal ser levantadas. A microestaquia, por proporcionar maior grau de rejuvenescimento aos tecidos, apresenta certas vantagens técnicas em relação à miniestaquia. Para espécies e clones de fácil enraizamento, a miniestaquia tende a ser mais atrativa, principalmente por ser de mais baixo custo e não exigir investimentos em laboratórios de micropropagação. Figura Evolução dos métodos de enraizamento, estruturas de propagação e dos sistemas de produção de propágulos vegetativos na clonagem de espécies de Eucalyptus: macroestaquia (A); microestaquia (B); miniestaquia (C); casa de enraizamento sombreada (D); casa de enraizamento coberta (E); casa de enraizamento climatizada (F); banco clonal (G); jardim clonal de campo (H); e minijardim clonal (I). Rejuvenescimento/ Revigoramento de Clones pela Micropropagação As características consideradas mais importantes nos programas de melhoramento genético, para fins industriais, são expressas totalmente na idade adulta das árvores. Entretanto, o processo de envelhecimento ontogenético reduz gradativamente a capacidade natural dos tecidos em formar raízes, ocorrendo a perda total da competência para enraizamento, na maioria das espécies, quando as árvores matrizes atingem a fase adulta (Cresswel e De Fossard, 1974). Isso cria uma dificuldade de ordem prática para o desenvolvimento de programas de clonagem comercial, uma vez que os genótipos só podem ser convenientemente selecionados quando já perderam a competência ao enraizamento. Desse modo, é necessário que se disponha de métodos de rejuvenescimento capazes de restaurar a capacidade rizogênica. O efeito da propagação seriada, ou em cascata, sobretudo quando se utilizam sistemas de produção in vitro no rejuvenescimento e, ou, no revigoramento de tecidos adultos, é um fenômeno reconhecido em plantas lenhosas. O subcultivo sucessivo de tecidos adultos é capaz de restabelecer sua competência ao enraizamento e, em tecidos rejuvenescidos por outros métodos, é capaz de aumentar sua predisposição ao enraizamento, sobretudo em sistemas de 112

21 micropropagação. Neste aspecto, a microestaquia é mais eficiente do que a miniestaquia. O resultado prático do uso da micropropagação é o aumento do índice de enraizamento. Dessa forma, certos clones que apresentam dificuldade de enraizamento e são descartados quando se utilizam os métodos tradicionais podem ser propagados operacionalmente, se derivados de plantas micropropagadas. Isso pode contribuir para o aumento dos ganhos, por permitir que se atinja o potencial genético esperado mediante o uso de maior número de clones recomendados, sem descartes de clones que são superiores em outras características, mas de baixo enraizamento. Desse modo, com menor pressão de seleção, obtém-se maior proporção de árvores selecionadas que efetivamente se transformam em clones recomendados, contribuindo para assegurar os ganhos potenciais em características de interesse econômico. Esse aspecto adquire mais importância em programas baseados em espécies de difícil enraizamento, como é o caso de E. globulus. Nessa espécie e em seus híbridos, a proporção de clones com facilidade de enraizamento é muito menor, havendo maior descarte devido à seleção clonal por enraizamento. Homogeneidade Fisiológica A perda da juvenilidade é um processo inerente ao crescimento e desenvolvimento de plantas de espécies lenhosas, pois o número de divisões celulares dos meristemas determina o nível de envelhecimento ontogenético atingido pelos tecidos (Monteuuis, 1988). Dessa forma, quando os processos de multiplicação clonal se originam da macroestaquia, é possível que cada estaca mantenha a memória fisiológica do status de maturidade fisiológica que possuía quando dentro dos ramos onde foi coletada. Isso pode ter importantes conseqüências para os sistemas de clonagem comercial de Eucalyptus. Esses diferentes níveis de juvenilidade ou de maturação podem contribuir para gerar diferentes potenciais de qualidade radicular das miniestacas produzidas. Podem também promover variação intraclonal em crescimento, principalmente proporcionar sistemas radiculares deficientes e com diferentes capacidades de exploração do solo. Esse aspecto é mais proeminente em clones de difícil enraizamento, contribuindo para que o potencial genético em muitos clones não seja totalmente alcançado. Franclet et al. (1987) ressaltam que a topófise induz diferenças fisiológicas e que essas diferenças podem resultar em variação intraclonal, reduzindo ou até mesmo suprimindo as vantagens potenciais da clonagem. É fato conhecido que a micropropagação tem a propriedade de promover maior homogeneização fisiológica dos tecidos, tanto em potencial de enraizamento quanto na qualidade do sistema radicular. Com o uso da micropropagação na produção de plantas para a formação dos minijardins clonais, é possível obter melhoria dos índices de enraizamento dos clones e menor heterogeneidade no seu crescimento, obtendo-se performances próximas ao potencial genético. Nesse sentido, a microestaquia tem vantagens sobre a miniestaquia. Em clones de fácil propagação, ou naqueles em que o processo de maturação ocorre mais lentamente, esse efeito positivo da micropropagação é menos pronunciado. Identificação e Mistura de Clones A identidade de clones recém-recomendados, desde seu resgate até seu estabelecimento nos minijardins clonais, está sujeita a equívocos de numeração e mistura com outros clones, recomendados ou não. A falta de características morfológicas marcantes na fase de mudas, que permitam identificar esses equívocos, tornou-se um problema comum nos sistemas operacionais de clonagem. Não raro se plantam clones não recomendados ou, ainda, clones recomendados, mas contaminados por outros clones, devido a erros de identificação e mistura. Em virtude disso, os ganhos previstos com a recomendação de novos clones podem não ocorrer, podendo haver perdas econômicas importantes. Quando a multiplicação é feita por micropropagação, desde que não haja equívocos no resgate, os enganos de identificação e 113

22 Biotecnologia Florestal a mistura de clones ocorrem mais dificilmente. Nesse caso, os clones são manipulados separadamente, em condições mais organizadas, e os frascos podem ser identificados com facilidade, por exemplo com miçangas coloridas. Nos sistemas ex vitro, as possibilidades de mistura aumentam porque os tubetes podem cair no chão (nos sistemas de bandejas suspensas) e serem, posteriormente, recolocados em bandejas erradas. Muitas vezes, são necessários extensivos estudos com marcadores moleculares para assegurar a identidade dos clones recomendados. A nomenclatura dos clones deve, preferencialmente, seguir uma regra, de forma a evitar possíveis equívocos na troca de materiais genéticos entre empresas. Detalhes sobre essas regras e as possibilidades de identificação e caracterização morfológica (descritores morfológicos) e molecular (descritos moleculares) de clones podem ser obtidos em Alfenas et al. (2004a). Riscos de Contaminação de Minijardins Clonais Nos minijardins clonais, formados a partir de mudas propagadas do campo (macroestaquia), podem ser introduzidos patógenos que causam doenças economicamente importantes. No caso de eucalipto, maior atenção deve ser dada às doenças vasculares, causadas por Ralstonia solanacearum (murcha bacteriana) e por Ceratocystis fimbriata (murcha-deceratocystis). Surtos dessas doenças podem comprometer os cronogramas de plantio, bem como, emergencialmente, tornar necessária a utilização de clones menos produtivos. Experiências recentes têm mostrado que esses patógenos vasculares são facilmente transmitidos no processo de produção de mudas por macroestaquia e miniestaquia, a partir de cepas e minicepas infectadas. Essas mudas, quando plantadas no campo, apresentam reduções acentuadas no crescimento e alto índice de mortalidade, o que resulta em falta de uniformidade do plantio. Adicionalmente, a madeira proveniente de plantas infectadas apresenta variações em suas propriedades tecnológicas, tornando-se imprópria para serraria e produção de celulose. A utilização da microestaquia tem-se constituído em uma alternativa técnica viável para evitar a introdução de patógenos vasculares durante a formação de minijardins clonais. Neste caso, como o processo de micropropagação é asséptico por natureza, a produção de plantas completamente isentas de fungos e bactérias é assegurada. Operacionalização e Produtividade de Clones Recémrecomendados Quando um clone novo é recomendado, normalmente há um período necessário à sua multiplicação em grande escala para a produção de um número mínimo de plantas, suficiente para o estabelecimento dos minijardins clonais. As taxas de multiplicação na micropropagação são superiores àquelas obtidas nos sistemas ex vitro, o que permite mais velocidade na operacionalização de clones novos. Além disso, a introdução dos clones candidatos em laboratório pode ser feita previamente à avaliação de sua performance operacional em viveiro, o que permite sua pronta multiplicação, tão logo seu comportamento em viveiro seja aprovado. Recentemente, com a utilização de minicepas formadas a partir de plantas micropropagadas, têmse obtido maiores índices de produtividade, em virtude de as minicepas apresentarem maior produção de brotações, concomitantemente com o maior índice de enraizamento. Apesar de todas essas vantagens técnicas que a micropropagação proporciona aos sistemas de clonagem, sua utilização de forma sistemática ainda é muito pequena. Em 2005, apenas 9% das empresas utilizaram a micropropagação para estabelecer seus minijardins clonais (Assis, 2004a). Provavelmente, porque os clones mais utilizados nos plantios clonais são de híbridos entre E. grandis e E. urophylla, normalmente de fácil propagação e menos sujeitos aos problemas fisiológicos citados anteriormente. Apesar disso, aos poucos, suas vantagens começam a ser percebidas e sua adoção deverá ser ampliada 114

23 nos sistemas de clonagem de Eucalyptus em larga escala. Com a tendência de se utilizarem espécies com maior dificuldade de enraizamento, como as espécies subtropicais, é provável que a micropropagação se torne uma técnica obrigatória. Melhoria do Status Fisiológico das Minicepas por Intermédio da Seleção Fisiológica Embora os ramos colhidos de brotações basais sejam juvenis, tanto do ponto de vista morfológico quanto fisiológico, e produzam estacas enraizáveis (Hartney, 1980), os sistemas de propagação baseados nesse tipo de material dificilmente atingem todo o potencial de enraizamento dos clones em propagação. Variações fisiológicas que ocorrem entre estacas dentro da planta podem levar a diferentes comportamentos das plantas obtidas, sendo essa variação mais forte em clones e espécies com maior dificuldade de propagação. Assim, minicepas geneticamente idênticas podem apresentar comportamentos diferentes, sobretudo quanto ao potencial de enraizamento das miniestacas produzidas. Os fatores responsáveis pela produção de miniestacas com diferentes potenciais de enraizamento a partir de plantas de um mesmo clone podem estar ligados aos diferentes estádios de maturação fisiológica das estacas que originaram as diferentes minicepas. Há evidências, em alguns sistemas de propagação, de diferenças nas respostas entre plantas de um mesmo genótipo, tanto no vigor quanto no potencial de enraizamento. Normalmente, no resgate inicial das árvores matrizes, bem como na operacionalização de clones selecionados, utilizam-se brotações com várias estacas em potencial. Pelo desenvolvimento das cepas no campo, ocorre o sombreamento dos pares de folhas basais, tornando-as senescentes. Dessa forma, as melhores estacas, do ponto de vista fisiológico, tendem a ser descartadas. Acaba-se utilizando estacas de diferentes posições nos ramos, resultando em um conjunto de mudas cujas minicepas darão origem a miniestacas com diferentes capacidades de enraizamento. Aparentemente, a memória fisiológica da estaca original é preservada. A manutenção das condições fisiológicas dos propágulos originais, determinadas pela topófise e pela ciclófise ( memória fisiológica ) pode ser a responsável pelas variações no comportamento entre minicepas de um mesmo clone. A seleção de plantas que apresentam melhor desempenho, retirando-se dos minijardins as minicepas que contribuem para reduzir o índice médio de enraizamento, pode conduzir à melhoria desses sistemas. Testes preliminares, feitos na Mundial Forestación, no Uruguai, com E. globulus, espécie de difícil enraizamento, têm mostrado, consistentemente, que algumas minicepas produzem miniestacas com maior capacidade de enraizamento do que outras, indicando que é possível realizar esta seleção para obter ganhos no enraizamento de miniestacas. A avaliação prévia do comportamento individual das minicepas, verificando-se a existência de variabilidade dentro de clones e selecionando minicepas que produzem miniestacas com melhor enraizamento, pode melhorar o desempenho geral da espécie ou do clone. Os minijardins clonais devem ser estabelecidos com plantas originadas das minicepas mais responsivas, previamente selecionadas. Alternativamente, deve-se alterar o procedimento de resgate de matrizes e, na operacionalização de clones recomendados, utilizar brotações mais juvenis, tornando possível o aproveitamento das estacas com maior potencial rizogênico. Sistemas de Produção de Propágulos Vegetativos Quando a estaquia foi introduzida comercialmente (Campinhos e Ykemori, 1980), os próprios plantios comerciais eram a fonte de propágulos vegetativos para a implantação de florestas clonais. Isso fazia com que extensas áreas (bancos clonais) fossem imobilizadas, anualmente, com o único objetivo de produzir estacas para os programas comerciais de produção de mudas. Mais tarde, foram introduzidos os modelos de reprodução baseados em jardins clonais, que passaram a demandar áreas menores, por apresentarem maior produtividade de 115

24 Biotecnologia Florestal estacas por unidade de área. Entretanto, uma das mais importantes conseqüências do desenvolvimento da microestaquia e da miniestaquia foi a revolução ocorrida nos métodos de produção de propágulos vegetativos em larga escala (Assis, 2004b). Os jardins clonais, que haviam substituído o sistema original de bancos clonais, no início dos anos 80, foram substituídos pelos minijardins clonais, quando a produção de propágulos vegetativos passou a ser realizada de forma superintensiva, com o auxílio de sistemas hidropônicos, em ambientes controlados (minijardins cobertos). O desenvolvimento de novas tecnologias contribuiu para aumentar a eficiência dos sistemas existentes. O primeiro conceito de sistema hidropônico indoor para a produção de miniestacas foi baseado em canaletões com leito de areia fertirrigado por gotejamento (Higashi et al., 2000a). Usando esse mesmo conceito, Campinhos et al. (2000) desenvolveram um método baseado em subirrigação intermitente, em que os recipientes com as minicepas são imersos em solução nutritiva para a fertirrigação. Esses dois conceitos de fertirrigação, apoiados em hidroponia, fertirrigação em leito de areia e fertirrigação por inundação intermitente, são atualmente os mais utilizados nos programas comerciais de clonagem. Na Figura 5.6, é mostrada a evolução dos métodos e das estruturas de propagação, bem como dos sistemas de produção de propágulos vegetativos na clonagem de espécies de Eucalyptus. Considerações sobre os Sistemas de Produção de Propágulos Vegetativos Além de todas as considerações técnicas e de manejo sobre os diferentes tipos de minijardins clonais feitas por Alfenas et al. (2004), há alguns aspectos sobre as características de cada sistema e de seu funcionamento que devem ser considerados na eleição do sistema de produção de brotos em larga escala, independentemente da utilização da microestaquia ou miniestaquia. A título de comparação, em 2005, 22% das empresas utilizaram o sistema de fertirrigação por inundação temporária (Figura 5.7), enquanto 61% utilizaram minijardins em canaletões de areia (Figura 5.8). As comparações entre os dois sistemas de produção de propágulos devem ser feitas considerando-se, principalmente, fatores econômicos, produtivos, de nutrição, de manejo e das condições ambientais, bem como seus reflexos nos aspectos fitossanitários. Economicamente, o sistema de fertirrigação por inundação temporária envolve maior aporte de recursos para construção e manutenção das estruturas necessárias, o que deve ser, logicamente, contrabalançado com as suas vantagens. Do ponto de vista de produtividade, estimativas realizadas em uma mesma empresa, com adoção dos dois sistemas no mesmo período, apontam maior produtividade para o sistema de fertirrigação em leito de areia ( propágulos/m 2 /ano) em relação ao sistema de fertirrigação por inundação temporária (8.064 propágulos/m 2 /ano). A maior produtividade alcançada em leito de areia, provavelmente, deve estar relacionada com o maior volume de substrato passível de exploração pelo sistema radicular, uma vez que, na fertirrigação por inundação temporária, o volume de substrato explorado pelo sistema radicular fica restrito aos 55 cc do tubete. A comprovação desse fato é a maior produtividade ( propágulos/m 2 /ano) alcançada com a utilização de tubetes de maior capacidade neste mesmo sistema (160 cc) (Alfenas et al., 2004). Atualmente, as empresas têm optado por canaletões de alvenaria de maiores dimensões para permitir maior desenvolvimento do sistema radicular. Do ponto de vista de nutrição, a diferença básica entre os dois sistemas diz respeito à maior facilidade e ao maior controle no sistema de fertirrigação por inundação temporária. Entretanto, nesse sistema, como as plantas têm reduzido volume de raízes, é mais comum ocorrer problemas nutricionais, em virtude, principalmente, de alterações na demanda de nutrientes pelas plantas, geralmente entre os períodos de inverno e verão. Assim, o que se observa, normalmente, é maior estabilidade nutricional das plantas no sistema de fertirrigação em leito de areia. 116

25 Figura Distintos sistemas de produção de propágulos em fertirrigação por inundação temporária: sistema-padrão (suspenso) (A); no solo (B); tubos de PVC pequenos (horizontais) (C); tubos de PVC grandes (horizontais) (D); e tubos de PVC grandes (verticais) (E). Figura Sistemas de minijardins clonais em canaletões com leito de areia: a céu aberto (A); com teto fixo (B); e com teto retrátil (C). 117