ANÁLISE DOS POLISSACARÍDEOS DA CASCA DE CUBIU (Solanum sessiliflorum Dunal) E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE UMA FRAÇÃO PÉCTICA

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1 ANÁLISE DOS POLISSACARÍDEOS DA CASCA DE CUBIU (Solanum sessiliflorum Dunal) E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE UMA FRAÇÃO PÉCTICA C. Colodel 1, T. M. Tavares 1, C. L. O. Petkowicz 1 1-Departamento de Bioquímica Universidade Federal do Paraná, CP CEP: Curitiba PR Brasil. Fone: (55-41) (criscolod@gmail.com) RESUMO A casca de cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal), um fruto nativo da Amazônia, foi submetida a extrações sequenciais, usando como solventes: DMSO 90%, água a 25 C e a 100 C, EDTA 0,05 M, ácido cítrico ph 2,5e NaOH 2 M e 4 M, com o objetivo de obter polissacarídeos pécticos e hemicelulósicos. Pectinas de grau comercial, com teor de ácido galacturônico acima de 65%, foram obtidas empregando-se extrações com água (25 C e 100 C) e com EDTA. A fração HW, obtida por extração com água fervente, apresentou o maior rendimento (9,6%) entre as frações, contendo também o mais elevado teor de ácido galacturônico (79%) e alto grau de metil-esterificação (DM = 57%), e mostrou ser constituída por homogalacturonana e arabinogalactana tipo II. PALAVRAS-CHAVE: Casca de cubiu; extração sequencial; polissacarídeos; pectinas; hemiceluloses. 1. INTRODUÇÃO Em todo vegetal, as células são delimitadas por uma camada relativamente delgada, porém mecanicamente forte: a parede celular vegetal (Taiz; Zeiger, 2009). Os principais componentes da parede celular vegetal são polissacarídeos, sendo que os principais são a celulose, as hemiceluloses e as pectinas (Cosgrove, 2005). A celulose ocorre na forma de microfibrilas formadas por cadeias de glucanas β-d-(1 4), unidas entre si por meio de ligações de hidrogênio e encontram-se associadas, também por meio de ligações de hidrogênio, às cadeias de hemicelulose (Cosgrove, 2005), que, por definição, são aqueles polissacarídeos de parede celular vegetal solúveis em soluções alcalinas (Caffal; Mohnen, 2009). Esta rede formada pela interação entre as fibrilas de celulose e as cadeias de hemicelulose são embebidas em uma matriz de pectinas (Cosgrove, 2005), que são os mais complexos polissacarídeos vegetais. A estrutura química básica das pectinas é formada por cadeias de α-d- GalA(1 4) (homogalacturonanas), ou cadeias onde estas unidades podem estar intercaladas por unidades de α-l-rha(1 2), que por sua vez podem ser substituídas por galatactas, arabinanas e/ou arabinogalactanas na posição O-4 (ramnogalacturonanas do tipo I), e ainda há pectinas em que a cadeia principal de GalA contém cadeias laterais bastante complexas, formadas por até 12 tipos diferentes de monossacarídeos (incluindo monossacarídeos raros, como a apiose e o ácido acérico) que formam até 20 tipos diferentes de ligações (ramnogalacturonanas do tipo II) (Mohnen, 2008; Voragen et al., 2009). Devido às propriedades físico-químicas dos polissacarídeos de origem vegetal e sua capacidade de alterar a reologia de sistemas, a indústria alimentícia é uma das principais áreas de aplicação destas moléculas (Stephen; Churms, 2006). O cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal), também conhecido como maná ou tomate de índio, é uma espécie de origem amazônica (Silva Filho et al, 2012). Produz frutos de coloração entre o amarelo e o vermelho, com massa que varia de 20 a 490g (Silva Filho et al, 2012) e que possuem sabor ácido e agradável (Pires et al, 2006). Os frutos são utilizados tanto na alimentação, no preparo de sucos, geleias e molhos, como na medicina tradicional, principalmente no controle dos níveis de

2 colesterol, ácido úrico e glucose no sangue, assim como no combate à anemia (Pires et al, 2006; Yuyama et al, 2008). Embora o fruto seja majoritariamente consumido e comercializado na sua própria região de origem e seja pouco conhecido nas demais regiões do país (Silva Filho et al., 2012), vem atraindo o interesse de alguns agricultores que produzem os frutos para exportá-los para o Japão, onde são utilizados para a extração de pectinas (INPA, 2014). No entanto, não há ainda na literatura científica nenhum estudo a respeito dos polissacarídeos desta espécie. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Os frutos de cubiu foram adquiridos no CEAGESP. A casca foi separada da polpa, liofilizada e moída em um moinho analítico IKA A-11 (IKA, Alemanha). A casca moída foi tratada com etanol (1:10 m/v) por 20 min sob refluxo para a inativação das enzimas, resultando no AIR, que foi utilizado para a extração sequencial de polissacarídeos conforme o fluxograma apresentado na figura 1. Após cada extração, o extrato foi centrifugado a rpm por 20 min a 4 C e em seguida os polissacarídeos foram precipitados com a adição de etanol (3:1 v/v). Após refrigeração (4 C) overnight, os polissacarídeos foram recuperados por centrifugação, lavados três vezes com etanol e secos em estufa à vácuo. Figura 1 Fluxograma de extrações sequenciais dos polissacarídeos da casca de cubiu. Todas as frações foram caracterizadas quanto ao seu rendimento (em relação à massa inicial do AIR), composição monossacarídica. A composição dos monossacarídeos neutros foi determinada após a hidrólise do material com ácido trifluoroacético (TFA) 2 M a 100 C durante 6 h, seguida de redução com NaBH 4 e acetilação com anidrido acético piridina (1:1 v/v). Os acetatos de alditol resultantes foram analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS). O teor de ácidos urônicos foi determinado pelo método colorimétrico de Blumenkrantz e Asboe- Hansen (1973), usando GalA como padrão. Para a caracterização da fração de maior rendimento, foram também determinados: a homogeneidade, através de cromatografia de exclusão estérica de alta pressão (HPSEC) acoplada a detector de espalhamento de luz laser em multiângulos (MALLS) e a

3 detector de índice de refração (RI); a identidade do ácido urônico, por cromatografia de troca iônica com detector de pulso amperométrico (HPAEC-PAD); o teor de proteínas, pelo método colorimétrico de Bradford (1976), usando soroalbumina bovina como padrão; o teor de acetil, pelo método de Hestrin (1949), usando galactose pentaacetato como padrão; e utilizada a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹³C. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Polissacarídeos da casca de cubiu obtidos através de extrações sequenciais Os polissacarídeos da casca do cubiu foram extraídos com diferentes solventes: DMSO, água a 25 C e a 100 C, EDTA 0,05 M, ácido cítrico ph 2,5, NaOH 2 M e NaOH 4 M. O rendimento e a composição monossacarídica das frações obtidas da casca de cubiu por meio das extrações sequenciais estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1 Rendimento, composição monossacarídica e grau de metil-esterificação das frações polissacarídicas obtidas da casca de cubiu por meio de extrações sequenciais. Fração Rendimento Monossacarídeos (%) (%) Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc AU DMSO 1,6 2,0 tr 7,4 12,7 22,7 22,7 29,5 3,0 W 0,8 2,3 tr 9,4 2,5 0,8 14,8 3,2 66,9 HW 9,6 2,2 tr 4,4 0,4 0,9 11,4 1,5 79,0 EDTA 3,2 3,1 tr 6,8 0,9 0,9 20,0 1,5 66,6 CA 0,7 3,4 tr 8,0 0,5 0,4 31,4 0,8 55,3 HA2 2,9 1,9 0,9 6,4 61,5 6,3 6,9 10,0 6,1 HB2 3,8 3,2 tr 9,4 23,1 10,8 11,3 38,4 3,7 HA4 0,1 2,4 0,4 10,1 20,5 9,4 16,2 28,9 12,1 HB4 4,5 1,3 tr 8,7 17,0 14,1 16,0 37,6 5,2 Rha = ramnose; Fuc = fucose; Ara = arabinose; Xyl = xilose; Man = manose; Gal = galactose; Glc = glucose; AU = ácidos urônicos. As extrações sequenciais resultaram em quatro frações pécticas (W, HW, EDTA e CA) e quatro frações hemicelulósicas (HA2, HB2, HA4, HB4), além da fração DMSO. Os rendimentos variaram entre 0,1% e 9,6%, sendo que o maior rendimento foi observado para a fração obtida com água fervente (HW). As frações W, HW, EDTA e CA tiveram composição monossacarídica característica de pectinas, com elevado teor de ácidos urônicos e presença de ramnose, galactose a arabinose, sendo a galactose o monossacarídeo neutro mais abundante. Todas as frações pécticas mostraram teor de ácidos urônicos acima de 65%, caracterizando-as como pectinas de qualidade compatível com as exigências comerciais, de acordo com a Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives e a European Commission (Müller-Maatsch et al, 2016). As frações HA2, HB2, HA4 e HB4, obtidas por extração alcalina, tiveram em sua composição monossacarídeos típicos de hemiceluloses. A fração HA2 apresentou 61,5% de xilose, sugerindo a presença majoritária de uma xilana; a fração HB2 apresentou xilose (23,1%) e glucose (38,4%) como componentes majoritários, sugerindo a presença de uma xiloglucana; a fração HA4 apresentou como monossacarídeos principais galactose (16,2%), xilose (20,5%) e glucose (28,9%), sugerindo a presença de uma xiloglucana contendo unidades de xilose substituídas por galactose; por sua vez, a fração HB4 apresentou 14,1% de manose, 16,0% de galactose, 17,0% de xilose e 37,6% de glucose, podendo conter uma mistura mais complexa de polissacarídeos.

4 Devido ao maior rendimento e elevado teor de ácidos urônicos, que são características bastante desejáveis para pectinas visando aplicações na indústria de alimentos, a fração HW foi selecionada para uma caracterização química mais aprofundada Caracterização da fração obtida da casca de cubiu por extração com água fervente (HW) As características quantitativas da fração HW estão descritas na tabela 2. Tabela 2 Características quantitativas da fração HW, obtida por extração com água fervente da casca de cubiu. Rendimento Monossacarídeos (%) DM DA Proteínas (%) Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc AU (%) (%) (%) 9,6 2,2 tr 4,4 0,4 0,9 11,4 1,5 79,0 56,9 0,6 7,3 Rha = ramnose; Fuc = fucose; Ara = arabinose; Xyl = xilose; Man = manose; Gal = galactose; Glc = glucose; AU = ácidos urônicos; DM = grau de metil-esterificação; DA = grau de acetilação. A fração HW, tendo o maior rendimento entre todas as frações obtidas e o maior teor de ácidos urônicos entre as frações pécticas, foi selecionada para uma melhor caracterização. Análises anteriores já haviam mostrado que esta fração continha 79,0% de ácidos urônicos, que foram identificados por meio de HPAEC-PAD como GalA em sua totalidade. Análises de FT-IR demonstraram que esta fração possui DM = 57%, tendo potencial para ser aplicada como agente geleificante em alimentos com elevador teor de sacarose e ph reduzido, como geleias e doces, um vez que pectinas HM formam géis em meio ácido na presença de um co-soluto (Thakur; Singh; Handa, 1997).. O espectro de ¹³C RMN mostrou deslocamentos químicos típicos de cadeias de α-d-gala (1 4): em δ100.1 e δ99.3, C-1 das unidades esterificadas e não esterificadas, respectivamente; em e em ppm, C-6 destas unidades; em 52.9 ppm, o grupo CH3 ligado ao C-6 das unidades esterificadas (Vriesmann; Petkowicz, 2009; Vriesmann; Amboni; Petkowicz, 2011), evidenciando a presença de uma homogalacturonana (HG). Além destes sinais, foram identificados também sinais em δ104,4, atribuído ao C-1 de unidades de β-d-gal, e em δ81,1 e δ82,4 atribuídos, respectivamente, a unidades de β-d-gal C-3 e C-6 substituídas de arabinogalactanas do tipo II (Corrêa-Ferreira; Noleto; Petkowicz, 2014; Maurer et al., 2010). Arabinogalactanas do tipo II (AG-II) consistem em uma cadeia principal de β-d-gal(1 3) substituídas em O-6 por cadeias laterais de β-d-gal(1 6) e estão frequentemente ligadas a proteínas, com teor de proteína variando entre 2 e 10% (Maurer et al., 2010; Fincher; Stone; Clarke, 1983), valor que corresponde ao teor de proteínas encontrado nesta fração, de 7,3%. O perfil de homogeneidade da fração HW, mostrado na figura 3, apresentou distribuição bimodal, indicando a presença de duas famílias distintas de polímeros. Um pico de grande intensidade e polidisperso foi detectado pelo RI em 46 min, e provavelmente está relacionado à HG, que está presente em maior concentração. Outro pico de menor intensidade foi detectado pelo RI em 37 minutos, coincidentemente com um pico de grande intensidade detectado pelo MALLS, indicando a presença de moléculas de elevada massa molar em baixa concentração e provavelmente se deve à presença da AG-II.

5 Figura 2 Espectro de ¹³C RMN da fração HW. A fração foi solubilizada em D 2 O e analisada a 70 C, usando TMS (δ0,0) como referência interna. Figura 3 Perfil de eluição da fração HW por HPSEC-MALLS/RI. Além de ser um aditivo alimentar de grande aplicação na indústria alimentícia, os polímeros de α-d-gala também são de grande importância por seus efeitos biológicos, por serem consideradas prebióticos (den Besten et al., 2013). Efeitos benéficos ao sistema imune são atribuídos às AG-II (Gölner et al., 2011; Thude et al., 2006). 4. CONCLUSÃO Empregando-se extrações sequenciais, foi possível isolar frações pecticas e hemicelulosicas da casca de cubiu. As frações pécticas apresentaram elevado teor de ácidos urônicos, dentro das especificações para serem consideradas de qualidade comercial. A fração HW apresentou o maior rendimento o mais elevado teor de ácido galacturônico e grau de esterificação que a caracteriza como HM, podendo ser aplicada como agente geleificante em produtos ácidos com alto teor de açúcar. Análises demonstraram que esta fração é composta por uma HG juntamente com uma pequena porção de AG-II. Apesar de ser um fruto ainda pouco conhecido e estudado, o cubiu parece ser bastante promissor para a obtenção de pectinas de interesse na área de alimentos.

6 5. REFERÊNCIAS BLUMENKRANTZ, N.; ASBOE-HANSEN, G. (1973). New method for quantitative determination of uronic acids. Analytical Biochemistry, 54(2), BRADFORD, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, CAFFALL, K. H.; MOHNEN, D. (2009). The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research, 344, CORRÊA-FERREIRA, M. L.; NOLETO, G. R.; PETKOWICZ, C. L. O. (2014). Artemisia absinthium and Artemisia vulgaris: A comparative study of infusion polysaccharides. Carbohydrate Polymers, 102, COSGROVE, D. J. Growth of the plant cell wall. (2005). Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6, DEN BESTEN, G,. VAN EUNEN, K.; GROEN, A. K.; VENEMA, K.; REIJNGOUD, D. J.; BAKKER, B. M. (2013). The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. The Journal of Lipid Research, 54(9), FINCHER, G. B.; STONE, B. A.; CLARKE, A. E. (1983). Arabinogalactan-proteins: Structure, biosynthesis, and function. Annual Review of Plant Physiology, 34(1), GÖLLNER, E. M.; ICHINOSE, H.; KANEKO, S.; BLASCHEK, W.; CLASSEN, B. (2011). An arabinogalactan-protein from whole grain of Avena sativa L. belongs to the wattle-blossom type of arabinogalactan-proteins. Journal of Cereal Science, 53(2), HESTRIN, S. (1949). The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application. Journal of Biological Chemistry, 180, INPA. Cultivo e Uso do Cubiu. Available in < accessed on MAURER, J. B. B.; BACIC, A.; PEREIRA-NETO, A. B.; DONATTI, L.; ZAWADZKI-BAGGIO, S. F.; PETTOLINO, F. A. (2010). Arabinogalactan-proteins from cell suspension cultures of Araucaria angustifólia. Phytochemistry, 71, MOHNEN, D. (2008). Pectin structure and biosynthesis. Current Opinion in Plant Biology, 11, MÜLLER-MAATSCH, J.; BENCIVENNI, M.; CALIGIANI, A.; TEDESCHI, T.; BRUGGERMAN, G.; BOSCH, M.; PETRUSAN, J.; VAN DROOGENBROECK, B.; ELST, K.; SFORZA, S. (2016). Pectin content and composition from different food waste streams. Food Chemistry, 201, SILVA FILHO, D. F.; MACHADO, M. F.; NODA, H.; YUYAMA, L. K. O.; AGUIAR, J. P. L.; SOUZA, V. G. (2012). Cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal): aspectos agronômicos e nutricionais. 1 ed. Manaus: INPA. STEPHEN, A. M.; CHURMS, S. C. Introduction. In.: STEPHEN, A. M.; PHILLIPS, G. O.; WILLIAMS, P. A. (2006). Food Polysaccharides and Their Application. 2 ed. Boca Raton and New York: CRC Press. p TAIZ, L.; ZEIGER, E. (2009). Fisiologia Vegetal. Tradução de Eliane Romanato Santarém et al. 4 ed. Porto Alegre: Artmed. THAKUR, B. R.; SINGH, R. K.; HANDA, A. K. (1997). Chemistry and uses of pectin a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 37(1), THUDE, S.; CLASSEN, B.; BLASCHEK, W.; BARZ, D., THUDE, H. (2006). Binding studies of an arabinogalactan-protein from Echinacea purpurea to leucocytes. Phytomedicine, 13(6), VORAGEN, A. G. J.; COENEN, G. J.; VERHOEF, R. P.; SCHOLS, H. A. (2009). Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls. Structural Chemistry, 20, VRIESMANN, L. C.; PETKOWICZ, C. L. O. (2009). Polysaccharides from the pulp of cupuassu (Theobroma grandiflorum): Structural characterization of a pectic fraction. Carbohydrate Polymers, 77, VRIESMANN, L. C.; AMBONI, R. D. M. C.; PETKOWICZ, C. L. O. (2011). Cacao pod husks (Theobroma cacao L.): Composition and hot-water-soluble pectins. Industrial Crops and Products, 34, YUYAMA, L. K. O.; PANTOJA, L.; MAEDA, R. N.; AGUIAR, J. P. L.; SILVA, S. B. (2008). Desenvolvimento e aceitabilidade da geléia dietética de cubiu (Solanum sessiliflorum Dunal). Ciência etecnologia de Alimentos, 28(4),