Revista Eletrônica de Biologia

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1 REB Volume 1 (4): 17-30, 2008 ISSN Revista Eletrônica de Biologia Germinação in vitro de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. Kelly Cristina dos Santos Teixeira 1 ; Marlúcia Cruz de Santana 2 ; Paulo Augusto Almeida Santos 3. 1 Mestre em Desenvolvimento e Meio Ambiente. 2 Doutora em Botânica. 3 Mestrando em Ecologia. Departamento de Biologia e do curso de Pós- Graduação em Desenvolvimento e Meio Ambiente Prodema/Universidade Federal de Sergipe (UFS); Aracaju-SE contato: kellytx@ig.com.br Resumo Na germinação de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn foram testados os meios de cultura Y3 (Eeuwens, 1976) e MS (Murashige & Skoog, 1962), acrescidos de vitaminas de Morel & Wetmore (1951), sacarose a 3%, carvão ativado (1,5g) e ácido giberélico (AG 3 ), ph ajustado em 5.8, temperatura de 26ºC, fotoperíodo de 16 horas, 45 µmol.m -2.s -1. Os resultados experimentais foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. As plântulas in vitro de L. racemosa têm uma maior tendência ao crescimento (cm) da parte aérea em meio Y3 sem presença de AG 3. Com relação ao comprimento das raízes não foi possível detectar maior ou menor eficiência entre os meios de cultura MS e Y3. No entanto, o Y3 apresentou um crescimento mais uniforme da raiz. Houve homogeneidade entre os tratamentos Y3 com AG 3 e MS sem AG 3 tanto nas partes aérea quanto nas raízes. Palavras-chave: germinação, Laguncularia, propágulo. Abstract The culture medium Y3 and MS were tested in the germination of Laguncularia racemosa (L.) Gaertn, and it was added: vitamins of Morel & Wetmore (1951), sucrose to 3 %, activated charcoal (1,5g) and gibberelic acid (GA 3 ), ph was adjusted in 5.8, 26ºC, 16 hours photoperiod, 45 µmol.m -2.s -1, and white cold light. The experimental results were undergone to the analysis of variance and the averages compared by the test of Tukey to 5 % of significance. Seedlings in vitro of L. racemosa have a bigger tendency to the growth (cm) of the shoot in medium Y3 without the presence of GA 3. Regarding the length of the roots, it was not possible to detect bigger or lesser efficiency between the culture medium MS and Y3. However, the Y3 has shown a more uniform growth of the root. There was 17

2 homogeneity between the treatments Y3 with GA 3 and in the MS medium without GA 3, as well as in the shoot growth as in the roots. Key-words: germination, Laguncularia, seedlings. 1) Introdução As áreas de manguezais no mundo têm diminuído consideravelmente no decorrer das décadas devido à intensa exploração de seus recursos. A distribuição dos mangues no mundo concentra-se entre os Trópicos de Capricórnio e Câncer, na região Equatorial. Nesta área encontram-se as temperaturas mais altas do globo terrestre. Na costa banhada pelo Oceano Pacífico podem ser vistos mangues no Equador, Nicarágua, Panamá, México, e região sul dos Estados Unidos (Califórnia). Bosques de mangue no Caribe, Colômbia, Guianas, Brasil e parte da costa africana são banhados pelo Oceano Atlântico. Observam-se manguezais no Canal de Suêz, no sul da África banhada pelo Oceano Índico. No continente Asiático há manguezais preservados após intensos trabalhos de reflorestamento, como na Tailândia, Malásia, Indonésia, e Filipinas. Na Oceania, a região norte da Austrália concentra as ocorrências de mangues (Maia, 2005). A costa brasileira apresenta uma área de manguezal estimada em 9.802, 81 km2, estendendo-se desde o Cabo Orange (04 21 N), Amapá, até a cidade de Laguna (28 30 S), Santa Catarina (Adaime, 1987). O estado de Sergipe com uma extensão de km2 apresenta uma faixa litorânea de 163 km de linha de praia pouco recortada, interrompida pelos estuários dos rios São Francisco, Japaratuba, Sergipe, Vasa-Barris e Piauí/Real (figura 1.2). A costa sergipana tem formação de planícies litorâneas, dominando a planície marinha, que se estende da foz dos rios Piauí/Real ao sul até Pirambu foz do Japaratuba (ADEMA, 1984). O trabalho desenvolvido teve como finalidade desenvolver novas técnicas em propagação in vitro para elaboração de um protocolo para produção em larga escala de plântulas de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. 18

3 visando a recuperação de áreas degradadas de mangue impactadas pelo desmatamento e outros tensores ambientais. Objetivando com isso, um maior número de propágulos germinados, um maior tamanho de raiz e parte aérea. O termo mangue é usado para indicar um grupo florístico de árvores e arbustos de plantas associadas, de clima tropical, inseridas no ecossistema estuarino conhecido como manguezal. Há uma forte interação entre os meios abiótico e biótico neste ecossistema, e as espécies vegetais apresentam características fisiológicas e adaptações que garantem a sua persistência em áreas alagadas, solo com pouco oxigênio e substrato inconsolidado (Schaeffer- Novelli et al., 2000). Este ecossistema é descrito por Adaime (1987) como constituído por plantas de porte lenhoso, associadas a uma vegetação e fauna adaptadas a um ambiente rico em matéria orgânica, constantemente inundado e com grandes variações de salinidade. Schaeffer-Novelli (1995) descreve o manguezal como um ambiente de transição entre a terra e o mar. Sua zona de atuação são as regiões tropicais e subtropicais, com temperaturas elevadas e irradiação solar adequada. A vegetação possui adaptações às flutuações de salinidade e colonizam ambientes lodosos com baixo teor de oxigênio. As áreas mais protegidas das ações naturais são locais de reprodução de muitas espécies de animais. Há uma intensa produção de matéria orgânica que gera subsídios para a complexa cadeia alimentar. O gênero Laguncularia, família Combretaceae, em bosques maduros pode atingir cerca de 10m de altura. O pecíolo de suas folhas tem cor avermelhada e com duas glândulas de sal em sua base, o que a diferencia dos demais grupos taxonômicos. Os propágulos são pequenos cobertos por tecido piloso. A fixação das plântulas é limitada pela ação da correnteza (Olmos & Silva e Silva, 2003; Stevely & Rabinowitz, 1982). 19

4 A propagação empreendida em plantas lenhosas apresenta dificuldades quanto ao sucesso de enraizamento tempo, produção e número de raízes. As técnicas de cultura de tecidos podem induzir a formação de raízes e partes aéreas, o que auxilia na construção de pomares com plantas geneticamente uniformes para produção de mudas. As plantas lenhosas apresentam particularidades que influenciam no enraizamento variando de acordo com a espécie (Assis & Teixeira, 1998). Os fatores morfogenéticos das plantas submetidas às técnicas in vitro podem ser relacionados durante a escolha da planta-matriz fornecedora dos explantes. O estimulador para uma boa formação de raízes adventícias está no genoma da planta doadora. Há outros fatores que atuam no processo de formação de radículas, tais como o estresse hídrico em experimentos in vitro provocado pela evaporação da água do meio, que pode fragilizar o explante e impossibilitar seu desenvolvimento; o excesso de carboidratos, que pode agir inibindo o enraizamento; e a sanidade da planta e quantidade de luz e água durante a coleta do material vegetal, que podem ser relacionados como fatores limitantes de enraizamento (Assis & Teixeira, 1998). A regeneração de brotos em segmentos caulinares de plântulas in vitro de jaborandi submetidos ao efeito de BAP foi verificada uma maior emissão de brotos para seguimentos apicais, bem como crescimento médio dos brotos em concentração de 6,66 mm de BAP. Os explantes obtidos dos seguimentos nodais não apresentaram resultados significativos entre diferentes concentrações de hormônio e emissão de brotos. Nos testes não houve diferença significativa entre o tipo de explante e a concentração do hormônio de crescimento (Sabá et al., 2002). 2) Metodologia As coletas do material vegetal para a realização deste experimento foram realizadas em duas áreas de manguezal do Estado de Sergipe. Para o experimento de germinação in vitro os propágulos de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn foram retirados do manguezal presente em área metropolitana da 20

5 cidade de Aracaju-SE, bairro Coroa do Meio durante o mês de fevereiro de Os propágulos de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. foram coletados no manguezal do bairro Coroa do Meio, município de Aracaju-SE, em fevereiro de Os meios de cultura utilizados foram o proposto por de Murashige & Skoog (1962) chamado de MS, e o Y3 formulado por Eeuwens (1976), acrescidos de vitaminas de Morel & Wetmore (1951), sacarose a 3%, carvão ativado (1,5g) e ágar a 0,6%. O ph foi ajustado em 5.8, antes da autoclavagem. Os propágulos trazidos do mangue passaram por uma limpeza inicial com água corrente e detergente para retirada de sedimentos, e em seguida enxaguados com água destilada. Foram imersos em hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) por 5 minutos, enxaguados por cinco vezes em água destilada, e transportado para a sala onde se processou a inoculação. O material foi imerso em hipoclorito de sódio (2% de cloro ativo) por 25 min (T1=25) dentro da câmara de fluxo laminar para a desinfestação final, enxaguado três vezes com água destilada autoclavada. Após o período de secagem dentro da câmara de fluxo laminar, os propágulos foram seccionados para retirada dos embriões. Estes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10 ml de meio de cultura na proporção de um embrião por tubo. A seguir foram transportados para a sala de crescimento. Após 15 dias foram expostos à luz branca fria. As bandejas contendo os tubos foram armazenadas em estantes na sala de crescimento, e expostas a períodos de escuro e claro. Os embriões passaram pela fase de escuro para indução da germinação, até a emissão da radícula, a temperatura de 26ºC. Na fase de claro, houve desenvolvimento das partes aéreas das plântulas sob fotoperíodo de 16 horas, com irradiância de 45 µmol.m-2.s-1, de lâmpada branca fria. O delineamento estatístico foi inteiramente casualizado (blocos ao acaso), contendo 4 blocos de 10 unidades experimentais. Cada unidade 21

6 experimental constituída de um embrião por tubo ensaio. Os meios de cultura utilizados foram o MS (Murashige & Skoog, 1962), e o Y3 (Eeuwens, 1976). Foram propostas duas concentrações de ácido giberélico (AG3) para os meios de cultura, com 1 mgl-1 e testemunha (sem AG3). 3) Resultados e Discussão Os propágulos de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. não apresentaram sinais de oxidação após a coleta no mangue. A imersão do material vegetal em hipoclorito de sódio (2%) durante o processo de desinfestação mostrou-se eficiente para o controle fitossanitário, além de não acelerar o processo de oxidação por liberação de compostos fenólicos. Buscou-se observar a anatomia do embrião para que fosse estabelecida a melhor posição para o seu desenvolvimento no meio de cultura. Durante a dissecção do envoltório do propágulo foram analisadas as estruturas responsáveis pelo crescimento da parte aérea e raiz. O posicionamento inadequado do embrião no frasco com meio de cultura geleificado com agar pode interferir no tempo de germinação, tendo em vista que há a ação do geotropismo positivo da raiz para ter contato com o meio de cultura. A abertura das folhas cotiledonares ocorreu a partir do terceiro dia após o cultivo, bem como, a formação de raiz. Após 10 dias de observação percebeu-se que os embriões inoculados nos meios de cultura Y3 (Eeuwens, 1976) e MS (Murashige & Skoog, 1962), com adição de hormônio, apresentaram 80% das folhas abertas, enquanto a emissão de raízes correspondeu a 82 e 55%, respectivamente. Os meios Y3 e MS sem giberelina mostraram abertura mais lenta das folhas, com porcentagens de 37 e 57%, respectivamente. A formação de raízes representou 75% para o meio Y3, e 80% para o MS. Os propágulos apresentaram porcentagem média de germinação de 100% decorridos 15 dias após a inoculação em meio de cultura. Não houve contaminação durante o período observado (figura 3.1). 22

7 Figura 3.1: Germinação in vitro de Laguncularia racemos (L.) Gaertn. plântulas 30 dias após a inoculação. (foto da autora) A B A análise de variância (ANOVA) dos dados de comprimento (cm) da parte aérea das plântulas foi significativamente diferente entre os tratamentos com e sem ácido giberélico (GA3) no meio Y3 para as seis primeiras avaliações, porém não houve diferenças significativas no 57º dia (figura 3.2). No mesmo período, as médias dos comprimentos com e sem hormônio foram significativamente diferentes no meio MS (figura 3.2). Figura 3.2: Freqüência do comprimento (cm) da parte aérea de plântulas de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. após período de germinação em meio de cultura Y3 (A) e MS (B). Letras repetidas indicam médias iguais. 23

8 O comprimento (cm) da raiz não foi significantemente diferente do crescimento em meio Y3 com e sem hormônio. No entanto, no meio MS, com e sem hormônio, foram iguais nas duas primeiras avaliações e diferentes nas cinco subseqüentes (figura 3.3). Figura 3.3: Freqüência do comprimento (cm) da raiz de plântulas de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. após período de germinação em meio de cultura Y3 (A) e MS (B). Letras minúsculas iguais indicando igualdade entre médias do mesmo meio. O comprimento da parte aérea das plântulas nos meios Y3 e MS, ambos sem hormônio, mostrou um resultado contundente: nas duas primeiras observações as diferenças não foram significantes, mas nas demais análises foram diferentes. Nos meios Y3 e MS com giberelina os comprimentos das partes aéreas foram significantemente diferentes Apêndice: Tabelas 30-32). O mesmo resultado foi encontrado no meio Y3 sem hormônio e MS com giberelina (figura 3.4). Durante os primeiros 22 dias após a inoculação os embriões em cultura Y3 com giberelina e MS sem hormônio apresentaram médias significantemente diferentes de crescimento da parte aérea, porém à medida que a plântula se desenvolvia essa diferença não foi mais detectada (figura 3.4). 24

9 Figura 3.4: Freqüência do comprimento (cm) da parte aérea de plântulas de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. após período de germinação em meio de cultura Y3 sem hormônio e MS com giberelina (A); e Y3 com giberelina e MS sem hormônio (B). Letras repetidas indicam médias iguais. As diferenças entre as médias de crescimento das raízes não foram significantes nos primeiros dias de inoculação em meio de cultura Y3 e MS sem hormônio e nem nos dias subseqüentes. As comparações entre os meios de cultura Y3 e MS com hormônio mostrou um crescimento desigual das raízes: nos primeiros 15 dias o crescimento foi homogêneo. O mesmo resultado foi encontrado nos meios Y3 sem hormônio e MS com giberelina. Entre os meios de cultura Y3 com hormônio e MS sem giberelina as raízes mostraram crescimentos iguais durante os 57 dias analisados após a inoculação dos embriões. Os trabalhos desenvolvidos em cultura de tecidos vegetais atualmente visam à melhoria genética de uma planta de grande interesse para os vários ramos da Ciência. As tecnologias aplicadas para o desenvolvimento de variedades que apresentem rapidez e sucesso na germinação, também são estimuladas para o estabelecimento dos processos. Ainda são incipientes os estudos de cultura de tecidos com plantas de mangue, por isso a discussão entre autores se torna inexistente em muitos aspectos. 25

10 O cultivo in vitro de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. proposto neste trabalho apresentou um percentual de germinação de 100% para os propágulos inoculados em meios de cultura Y3 (Eeuwens, 1978) e MS (Murashige & Skoog, 1962). Esta resposta à indução de germinação em ambiente com temperatura e aporte de nutrientes controlados poderá ser usada para experimentos com bioindicadores e biorremediação. Os propágulos inoculados em meio Y3 (Eeuwens, 1978) sem hormônio alcançaram um comprimento (cm) médio da parte aérea de 4.45 decorridos 15 dias da inoculação, resultado mais expressivo que os demais tratamentos. A estrutura radicular inoculada em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) com giberelina apresentou resultado mais expressivo com uma média 3.40 no comprimento (cm). Estes dados promovem uma discussão sobre o uso da técnica in vitro para estudos farmacológicos, químicos e de biorremediação. Crapez et al. (2003) estudou a ação de bactérias hidrocarbonoclástica para degradação de óleo no solo em plântulas de Rhizophora mangle L., Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. e Avicennia schaueriana Stapf. desenvolvidas em viveiro florestal. A L. racemosa apresentou o maior índice de mortalidade, apresentando grande sensibilidade à presença de óleo no solo, revelando seu caráter bioindicador de distúrbio no ecossistema. Os resultados da pesquisa in vitro mostram que não há, estatisticamente, diferença entre as médias dos tratamentos Y3 (Eeuwens, 1978) com e sem tratamento quando analisado o crescimento (cm) das raízes de L. racemosa. No entanto, o mesmo não ocorre no meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), onde a presença do ácido giberélico agiu como inibidor do crescimento desta estrutura. Isto se deve ao fato da composição do meio Y3 (Eeuwens, 1978) ter diferentes fontes de nitrogênio (amônia e nitrato) (Caldas et al., 1990). A alta concentração de sais é fator de estresse para a maioria das plantas. No entanto, as espécies de mangue são adaptadas a estas condições acumulando sal no citosol até que o nível do potencial osmótico seja menor que o da solução do solo (Larcher, 2004). Assim, a água 26

11 é impulsionada por um gradiente osmótico, e o potencial osmótico reduzido pelos ácidos orgânicos e carboidratos solúveis presentes. O crescimento acelerado das plântulas de Laguncularia racemosa (L.) Gaertn. possibilita estudos utilizando outras técnicas, como a micropropagação. Rao et al. (1998) desenvolveu o primeiro estudo com cultura de tecidos in vitro plântulas de Excoecaria agallocha L., espécie comum na Índia. No experimento, foram utilizados explantes nodais para micropropagação in vitro inoculando-os em meios de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) e Woody Plant Médium WPM (Lloyd & McCown, 1981). Rao et al. (1998) testaram um meio modificado com alto teor de íons SO42-, NH4+, PO4- e K+ uma composição próxima a encontrada no substrato do mangue. Os dados mais significantes com a propagação in vitro de E. agallocha foram obtidos neste meio. Com isso justifica o fato do maior crescimento em altura das plântulas ter ocorrido em meio de cultura Y3 (Eeuwens, 1978) por apresentar uma maior concentração de nitrogênio. Os resultados obtidos nos tratamentos com AG3 mostram que o uso de reguladores de crescimento não foi significativo para esta espécie. No experimento desenvolvido por Stefanini et al. (2002) observou-se que a adição de ácido giberélico promoveu aumento no número de ramos, altura e expansão de toda a plântula de erva-cidreira. 4) Conclusão 1. Após 10 dias de observação percebeu-se que os embriões inoculados nos meios de cultura Y3 e MS, com adição de hormônio, apresentaram 80% das folhas abertas, enquanto a emissão de raízes correspondeu a 82 e 55%, respectivamente. 2. As plântulas mostram tendência a maior crescimento da parte aérea em meio de cultura Y3. A presença de hormônio não foi significativa para este caráter analisado. 27

12 3. Com relação ao comprimento das raízes não foi detectado maior ou menor eficiência entre os meios de cultura MS e Y3, embora no meio Y3 o crescimento tenha sido mais uniforme. 4. Houve homogeneidade entre os tratamentos Y3 com hormônio e MS sem giberelina, tanto nas partes aéreas quanto nas raízes. 5) Agradecimentos A Capes pela concessão da bolsa de pesquisa. 6) Bibliografia Adaime, R. R. Estrutura, produção e transporte em um manguezal. Academia de Ciências do Estado de São Paulo, Simpósio sobre Ecossistemas da Costa Sul e Sudeste Brasileira, São Paulo, 1(54):80-99, Adema - Administração Estadual de Meio Ambiente. Levantamento da flora e caracterização dos bosques de mangue do Estado de Sergipe. Relatório Técnico, Aracaju. 154p., 1984 Assis, T. F. de; Teixeira, S. L. Enraizamento de plantas lenhosas. IN: Torres, A. C.; Caldas, L. S; Buso, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Embrapa-SPI, Brasília, 1: , Caldas, L. S. ; Haridasan, P ; Ferreira, M. E. Meios nutritivos. IN: Torres, A.C.; Caldas, L.S., eds. (Org.). Técnicas e Aplicações da Cultura de Tecidos de Plantas. Brasília: EMBRAPA/ABCTP, p , Eeuwens, C.J..Effects of organic nutrients and hormones on growth and development of tissue explants from coconut (Cocos nucifera L.) and date 28

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