ABX Pentra. HbA1c WB. Reagente para a determinação quantitativa in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). A11A01702
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1 (Sangue total) Ref.: A11A01702 Volume R1: Volume R2: Volume R3: 1 x 110 ml Volume R4: 2 x 21 ml Volume R5: 1 x 25 ml ABX Pentra Sangue total Reagente para a determinação quantitativa in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). 2009/10/06 A93A01022M PT A11A01702 Form-0846 Rev. 3 Interesse clínico (1-7) O valor HbA1c é obtido pela fixação não-enzimática do fragmento N- terminal da cadeia β da hemoglobina A0. Os níveis de HbA1c, que são proporcionais aos níveis de glicose no sangue, reflectem a concentração diária média de glicose durante os dois meses que antecedem a amostra de sangue. Estudos recentes mostram que a medição regular de HbA1c pode levar a alterações no tratamento da diabetes e ao aumento do controlo metabólico, indicado por uma redução nos valores de HbA1c. O presente método de diagnóstico in-vitro é, assim, utilizado para a determinação quantitativa da hemoglobina A1c (HbA1c), um marcador de diabetes, no sangue humano. As medições obtidas com este procedimento podem ser utilizadas para o controlo da diabetes a longo prazo. Método HbA1c é expresso como uma percentagem do conteúdo total de hemoglobina. De forma a que se determine as concentrações de THb por espectrofotometria, as diferentes formas de hemoglobina têm de ser convertidas em uma única forma, com um espectro de absorvância uniforme. Os valores de HbA1c e hemoglobina total (THb) em μmol, obtidos com o teste, são utilizados para calcular a relação HbA1c/THb e não deverão ser utilizados individualmente para efeitos de diagnóstico. Princípio (8): As concentrações de hemoglobina total e o HbA1c são medidos, e a relação é expressa como uma percentagem de HbA1c. De modo a determinar o HbA1c como uma percentagem, são utilizados cinco reagentes: Antibody Reagent (R1) diluído com Diluent I (R5), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4). A amostra de sangue total é misturada com o Hemolysis Reagent (R3) pelo analisador: Os glóbulos vermelhos são lisados e a cadeia da hemoglobina é hidrolisada, pela acção de uma protease presente no reagente. O Total Hemoglobin Reagent (R4) é utilizado para deteminar a hemoglobina total. O método baseia-se na conversão de todas as formas de hemoglobina em hematina alcalina, numa solução alcalina de detergente não iónico, consoante a descrição no procedimento original, de Wolf et al. A reacção é activada pela adição de uma amostra de sangue previamente processada com Total Hemoglobin Reagent (R4), resultando na coloração verde da solução. 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml HORIBA ABX SAS BP Montpellier- cedex 4 - France A conversão dos diferentes tipos de hemoglobina em hematina alcalina com um espectro de absorvância definido permite calcular a concentração total de hemoglobina. A hemoglobina é medida através do método do ponto final, a 550 nm. Os níveis de hemoglobina são directamente proporcionais ao aumento no OD observado. O teste de inibição da aglutinação de partículas de latex é utilizado para medir o HbA1c específico. Uma aglutinina (polímero sintético contendo várias cópias da porção imunorreactiva de HbA1c) causa a aglutinação das partículas de latex cobertas com anticorpos monoclonais de ratinhos, específicos para HbA1c. Na ausência de HbA1c na amostra, a aglutinina no Agglutinator Reagent (R2) e as micropartículas cobertas com aglutinado do Antibody Reagent (R1). A aglutinação leva ao aumento na absorvância da suspensão. A presença de HbA1c na amostra reduz a taxa de aglutinação, uma vez que o HbA1c entra em competição com o Agglutinator Reagent (R2) nos pontos de docking dos anticorpos das micropartículas. Quanto maior a quantidade de HbA1c na amostra, menor a taxa de aglutinação. A reacção é medida pela absorvância a 550 nm, e a taxa de aglutinação é utilizada para calcular a concentração a partir de uma curva de calibração. A percentagem de HbA1c é, então, calculada, utilizando-se os valores de HbA1c e hemoglobina total, em µmol.
2 Reagentes O ABX Pentra é um kit de vários reagentes. Conteúdo do kit: Reagente 1: Antibody Reagent Reagente 2: Agglutinator Reagent Reagente 3: Hemolysis Reagent Reagente 4: Total Hemoglobin Reagent Reagente 5: Diluent I Antibody Reagent (R1) contém: partículas acopladas com anticorpos HbA1c (ratinho); albumina de soro bovino; solução tampão; surfactantes; conservantes. Agglutinator Reagent (R2) contém: hapteno de ligação covalente de polímeros; albumina de soro bovino; solução tampão; conservante; surfactantes. Hemolysis Reagent (R3) contém: pepsina de suíno; solução tampão; conservante. Este reagente também é vendido em separado, sob a referência A11A Total Hemoglobin Reagent (R4) contém: hidróxido de sódio; surfactante. Diluent I (R5) Contém: Conservante; NaCl. O ABX Pentra deve ser utilizado de acordo com esta nota de reagente. O fabricante não se responsabiliza pelo seu desempenho caso seja utilizado de outro modo. Preparação a 1. Misture 1 volume de Antibody Reagent (R1) com 1 volume de Diluent I (R5) num frasco MBU de 100 ml, Ref. A11A Misture cuidadosamente o Agglutinator Reagent (R2) virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente. 3. Misture cuidadosamente o Hemolysis Reagent (R3) virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente. 4. Misture cuidadosamente o Total Hemoglobin Reagent (R4) virando-o ao contrário, e entorne-o num frasco de reagente. 5. Antes de os utilizar, aguarde até que os reagentes se estabilizem no compartimento de refrigeração do ABX Pentra 400 durante uma hora. Veja o diagrama que se segue (os sectores A, B e C são tomados como exemplo): Hemolysis Reagent Reagente Total Hemoglobin Reagent Reagente 4 1 x 110 ml 2 x 21 ml 1 x 25 ml Agglutinator Reagent Reagente 2 Antibody Reagent Reagente 1 (diluído) Utilize apenas a quantidade necessária, e depois de os utilizar, coloque imediatamente os reagentes num ambiente frio, num frasco fechado. As amostras de sangue total, o calibrador e o controlo não necessitam de qualquer processamento prévio. A utilização de uma pipeta de deslocamento positivo é recomendada, para a recolha do sangue total. Nota: É possível testar simultaneamente até 4 amostras. Se for necessário testar mais do que 4 amostras, espere até que o instrumento mude para o estado A analisar, antes de colocar as próximas amostras, após a homogenização. Os ensaios têm de ser solicitados apenas utilizando a relação. Nunca solicite os ensaios HbA1c e THb em separado. A fórmula da relação tem de ser criada a partir da relação do NGSP (ver o Manual do Utilizador do ABX Pentra 400). Calibrador Para calibrar, utilize: O ABX Pentra Cal, Ref. A11A01703 (não incluído) 1 x 8 ml + 5 x 2 ml A hemoglobina total é calibrada com o ABX Pentra Cal (CAL 1), utilizando um valor alvo de hemoglobina total. Os calibradores e reagentes não dependem do lote, e são submetidos a um controlo de qualidade interno na HORIBA Medical. A calibração do método HbA1c é levada a cabo utilizando o ABX Pentra Cal, que contém seis níveis de calibrador de HbA1c. Esses procedimentos de calibração são compatíveis com o certificado NGSP/DCCT. Posição dos calibradores na prateleira de amostras correspondente: 1. CAL 1 (200 µl) para THb 2. CAL 1 (200 µl) para HbA1c 3. CAL 2 (150 µl) 4. CAL 3 (150 µl) 5. CAL 4 (150 µl) 6. CAL 5 (150 µl) 7. CAL 6 (150 µl) Nota: o CAL 1 na posição 1 é tomado como exemplo, e também também pode ser colocado na posição 8, 9 ou 10. a.modificação do índice L para M: modificação da preparação.
3 Controlo Para controlo de qualidade interno, utilize: O ABX Pentra HbA1C WB Control, Ref. A11A01704 (não incluído) Controlo normal: 2 x 0.25 ml (liofilizado) Controlo patológico: 2 x 0.25 ml (liofilizado) Cada controlo deve ser analisado diariamente e/ou após cada calibração. A frequência dos controlos e os intervalos de confiança devem estar de acordo com as normas laboratoriais e com as directivas específicas de cada país. Os resultados devem ficar dentro do intervalo dos limites de confiança definidos. Cada laboratório deve estabelecer o procedimento a seguir se os resultados excederem esses limites de confiança. Materiais necessários mas não fornecidos Analisador automático de química clínica: ABX Pentra 400 Calibrador: ABX Pentra Cal, Ref. A11A01703 Controlo: ABX Pentra Control, Ref. A11A01704 ABX Pentra Hemolysis Reagent, Ref. A11A01730 Frasco MBU de 100 ml, Ref. A11A01759 Equipamento standard de laboratório Amostra a (9) Sangue total em EDTA. Estabilidade(10): 3 dias a C 8 dias a 2-8 C 60 dias a -20 C As amostras congeladas devem ser descongeladas à temperatura ambiente e, de seguida, devem ser cuidadosamente misturadas, antes de serem utilizadas. Misture cuidadosamente as amostras de sangue, imediatamente antes de proceder ao teste, de forma a poder garantir a precisão dos resultados de THb. Intervalo de referência (4,11,13,14,15,16) Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios intervalos de referência. Os valores aqui fornecidos são utilizados apenas como linhas de orientação. Cada laboratório deverá certificar-se de que os seus valores standard são compatíveis com os valores de referência do NGSP. Esta técnica obteve o certificado NGSP, com 4 a 6 % de HbA1c como valor standard em não diabéticos, com o objectivo terapêutico de obter valores < 7 %, consoante recomendação da ADA (American Diabetes Association). Todos os resultados deverão ser interpretados à luz das análises clínicas gerais dos pacientes. Limites do método (11): A maioria dos pacientes possui níveis de hemoglobina entre 4.4 mmol/l e 14.4 mmol/l. No entanto, as publicações especializadas demonstram que os níveis de hemoglobina dos pacientes com anemia grave podem ser inferiores a 4.4 mmol/l, e que os níveis de hemoglobina dos pacientes com policitemia podem exceder 14.4 mmol/l. Quando forem conhecidos pacientes que tenham estes sintomas, estes deverão ser testados utilizando-se outro método, se os seus valores de hemoglobina estiverem fora do intervalo de medição. Qualquer condição que afecte o ciclo de vida dos glóbulos vermelhos (tal como uma anemia hemolítica ou outras doenças hemolíticas, gravidez ou uma perda de sangue significativa...) causa uma redução na exposição dessas células à glicose e, consequentemente, uma redução nos níveis de hemoglobina glicada (GHb). Os resultados de Ghb % não são fiáveis nos pacientes que sofrem de perda de sangue crónica e, consequentemente, ciclos de vida variáveis dos eritrócitos. As amostras contendo hemoglobina C e S podem causar um aumento do valor esperado de HbA1c. Para além disso, as amostras contendo altos níveis de hemoglobina F (> 15 %) poderão gerar resultados de HbA1c menores do que os esperados. Não existe interferência com a hemoglobina carbamilada e acetilada. Este teste não é fiável para o diagnóstico de diabetes mellitus (14,16). Este teste não é útil para avaliar o controlo diário de glicose, e não deverá ser utilizado para subsituir os testes diários caseiros de glicose sanguínea(14). Armazenamento e Estabilidade Proteger contra temperaturas extremamente quentes ou frias e manter ao abrigo da luz. Período de validade dos reagentes (selados e depois de abertos): Os reagentes permanecem estáveis até à data de validade indicada no rótulo, se forem armazenados entre 2 e 8 C nas embalagens originais e forem protegidos contra contaminação. Estabilidade da solução de latex reconstituída: consulte o parágrafo "Desempenho do ABX Pentra 400". Procedimento do ensaio Encontram-se disponíveis, a pedido, instruções de teste para outros sistemas automáticos diferentes do ABX Pentra 400. Gestão de resíduos É favor consultar os requisitos da legislação local. a. Modificação do índice L para M: alteração da estabilidade da amostra.
4 Precauções gerais 1. Este reagente destina-se apenas a diagnóstico in-vitro profissional. 2. Antibody Reagent (R1) : Na preparação deste produto foram utilizados componentes derivados humanos. Cada unidade de dador foi testada individualmente por métodos aprovados pela FDA, tendo sido considerada negativa para o antigénio de superfície da sepatite B (HBsAg), para os anticorpos do vírus da imnunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) e para o vírus da hepatite C (HCV). Cuidado. No entanto, uma vez que nenhum método de análise pode excluir completamente o risco potencial de infecção, o material deve ser tratado com o mesmo cuidado que uma amostra de paciente: como sendo potencialmente infeccioso, devendo ser manuseado com a devida precaução. Em caso de exposição, siga as directrizes das autoridades de saúde competentes. Irritante. S24: Evitar o contacto com a pele. S37: Usar luvas adequadas. R43: O contacto com a pele poderá causar sensibilidade. 3. Agglutinator Reagent (R2): Irritante. S24: Evitar o contacto com a pele. S37: Usar luvas adequadas. R43: O contacto com a pele poderá causar sensibilidade. 4. Antibody Reagent (R1), Agglutinator Reagent (R2), Hemolysis Reagent (R3) e Total Hemoglobin Reagent (R4): Evitar o contacto com os olhos, pele e vestuário. Lavar as mãos cuidadosamente com água, depois de manusear o produto. Não ingerir. 5. Diluent I (R5): Irritante. R36/38: Irritante para os olhos e pele. R43: O contacto com a pele poderá causar sensibilidade. 6. Os frascos de reagente devem ser eliminados após a utilização. 7. Consulte a MSDS (folha de dados de segurança do material) relacionada com o reagente. Desempenho do ABX Pentra 400 a O dados de desempenho enumerados em seguida foram determinados no analisador ABX Pentra 400. Número de testes: 381 testes Período de validade da solução de latex reconstituída: O período de validade da solução de latex reconstituída é de 60 dias, se for armazenada a 2-8 C depois da reconstituição. Utilize apenas a quantidade necessária, e depois de os utilizar, coloque imediatamente os reagentes num ambiente frio. Volume da amostra (após o processamento): Hb: 25 µl/teste HbA1c: 3 µl/teste Limite de detecção: O limite de detecção da hemoglobina total é determinado de acordo com o protocolo CLSI (NCCLS), EP17-A (17) e é igual a 1.60 µmol/l (0.42 g/dl). Limite mínimo de interpretação: O limite mínimo de interpretação (MIL) do HbA1c é avaliado através de várias determinações de amostras de baixa concentração, e equivale a 0.17 µmol/l (0.05 g/dl). Exactidão e Precisão: Repetibilidade (precisão no mesmo ciclo) 3 amostras de concentrações baixa, média e alta e 2 controlos são testados 20 vezes de acordo com as recomendações especificadas no protocolo Valtec (18). Valor médio %HbA1c CV % Amostra de controlo Amostra de controlo Amostra Amostra Amostra Reprodutibilidade (precisão ciclo a ciclo) 3 amostras de nível baixo, médio e elevado e 2 controlos foram testados em duplicado durante 20 dias (2 séries por dia) de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP5-A2 (19). Valor médio %HbA1c CV % Amostra de controlo Amostra de controlo Amostra Amostra Amostra Linearidade e Gama de Medição: A linearidade do reagente é determinada de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP6-A (20). Linearidade baixa: Linearidade elevada: para Hemoglobina total: para HbA1c: para Hemoglobina total: para HbA1c: 1.60 µmol/l (0.42 g/dl)) 0.17 µmol/l (0.05 g/dl)) µmol/l (22.41 g/dl)) 10.8 µmol/l (2.85 g/dl)) O intervalo do método de hemoglobina total no qual o valor %HbA1c é considerado preciso, encontra-se entre 17.5 e 85.0 µmol/l (4.61 e g/dl). O ensaio confirmou uma gama de medição de 4.46 a para % HbA1c. a.modificação do índice L para M: alteração dos dados de desempenho.
5 As amostras não devem ser diluídas, caso a concentração de HbA1c seja superior ao ponto mais elevado de calibração de µmol/l (2.85 g/dl). No caso em que a concentração em HbA1c é superior ao ponto mais elevado de calibração, as amostras não devem ser diluídas. No entanto, é possível calcular o menor valor de %HbA1c da amostra com a concentração em THb, fornecendo o resultado como: Superior a...xxx. Exemplo: se a concentração de THb for 44.0 µmol/l (11.6 g/dl), o menor valor de %HbA1c para o método será: - em µmol/l: (10.80)/44.00 x 100 = %HbA1c (aplicar a estes resultados o factor de correcção NGSP = 15.9 %). O resultado de %HbA1c para esta amostra é: Superior a 15.9 %. - em g/dl (2.85)/11.6 x 100 = 24.6 %HbA1c (aplicar a estes resultados o factor de correcção NGSP = 15.9 %). O resultado de %HbA1c para esta amostra é: Superior a 15.9 %. Correlação: 118 amostras de sangue total dos pacientes foram correlacionadas com um reagente já comercializado tomado como referência de acordo com as recomendações incluídas no protocolo CLSI (NCCLS), EP9-A (21). Valores no intervalo de 4.53 a % de HbA1c. A equação da linha alométrica obtida por meio do procedimento de regressão Passing-Bablock (22) é: Y = 1.03 X (%HbA1c) com um coeficiente de correlação r 2 = Interferências: Triglicéridos: Bilirrubina total: Bilirrubina directa: Ácido ascórbico: Hemoglobina lábil: Outros limites são fornecidos por Young através de uma lista de medicamentos e variáveis pré-analíticas conhecidas que afectam esta metodologia (23, 24). Estabilidade de calibração: O reagente é calibrado no Dia 0. A estabilidade de calibração é verificada testando 2 amostras de controlo. A estabilidade da calibração é de 30 dias. até 7 mmol/l (612.5 mg/dl), (como o Intralipid, representativo da lipémia). até 561 µmol/l (32.8 mg/dl). até 587 µmol/l (34.3 mg/dl). até 3.40 mmol/l (59.8 mg/dl). Não se observa interferência com a hemoglobina lábil. Nota: Recomenda-se uma recalibração quando os lotes de reagente mudam, quando a suspensão de latex é alterada e quando os resultados do controlo de qualidade ficam fora do intervalo estabelecido. Relação do NGSP a : Y = (581400*(HbA1c/Hb) )/10000 Versão da aplicação para o ensaio de HbA1c (A1c-WB) b : 6.xx Versão da aplicação para o ensaio de hemoglobina total (THb-WB) c : 7.xx Aviso É da responsabilidade do utilizador verificar se este documento se aplica ao reagente utilizado. Bibliografia 1. Mayer TK and Freedman ZR: Protein glycosylation in diabetes mellitus: A review of laboratory measurements and of their clinical utility. Clin. Chim. Acta 127; (1983). 2. Baynes JW.Bunn HF, Goldstein DE, et al: National Diabetes Group; Report of the expert committee on glucosylated hemoglobin. Diabetes Care 7; (1984). 3. Koenig RJ, Peterson CM, Kilo C. et al: Hemoglobin A1c as an indicator of the degree of glucose intolerance in diabetes. Diabetes 25; (1976). 4. Nathan DM, Singer DE, Hurxthal K, and Goodson JD: The clinical information value of the glycosylated hemoglobin assay. NE J. Med. 310; (1984). 5. McCarren M: DCCT; and it works: Intensive therapy reduces the risk of diabetic eye, kidney, and nerve disease. Diabetes forecast (September 1993). 6. Larsen ML, Horder M, and Mogensen EF: Effect of long-term monitoring of glycosylated hemoglobin levels in insulindependent diabetes mellitus. NE. J. Med. 323; (1990). 7. Nathan DM: Hemoglobin A 1c. Infatuation or the real thing? NE. J. Med. 323; (1990). 8. Wolf HU, Lang W, and Zander R; Alkaline haematin D-575, a new tool for the determination of haemoglobin as an alternative to the cyanhaemoglobin method. Clin. Chim. Acta. 136; (1984). 9. Guder W.G., Zawta B., The Quality of Diagnostics Samples. Samples: From the Patient to the Laboratory. 1 st ed. Guder W.G., Narayanan S., Zawta B., (WHILEY-VCH, Darmstadt, Germany), (2001), HORIBA Medical Internal studies. 11. Knowles BJ, Haigh WB, and Michaud GC: A monoclonal antibodybased immunoassay for hemoglobin A 1c. Diabetes 35; Supplement: 94A (1986). 12. Sacks D.B., Carbohydrates, Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4 th Ed., Burtis C.A., Ashwood E.R., Bruns D.E., (Elsevier Saunders eds., St Louis, USA), (2006), Goldstein DE, Little RR, Wiedmayer HM, et al: Glycated hemoglobin: Methodologies and clinical applications Clin. Chem. 32; (1986). 14. Burtis CA and Ashwood ER, eds: Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2 nd edition, WB Saunders Company, Philadelphia, PA. p.2021 (1994). a.modificação do índice L para M: nova relação do NGSP. b.modificação do índice L para M: nova versão da aplicação. c.modificação do índice L para M: nova versão da aplicação.
6 15. Diabetes Care 2002; 25 (suppl. 1); Ellis G. Diamandis EP, Giesbrecht EE, et al. An automated «high pressure» liquid chromatographic assay for hemoglobin A 1c. Clin. Chem. 30: (1984). 17. Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation, Approved Guideline, CLSI (NCCLS) document EP17-A, Vol. 24, No. 34, Vassault A., Grafmeyer D. Naudin C. et al., Protocole de validation de techniques (document B), Ann. Biol. Clin., 1986, 44, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices, Approved Guideline, CLSI (NCCLS) document EP5-A2, Vol. 24, No. 25, august Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods, Approved Guideline, CLSI (NCCLS) document EP6-A, Vol. 23, No. 16, april Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples, Approved Guideline, 2 nd ed., CLSI (NCCLS) document EP9-A2, Vol. 22, No. 19, Passing H, Bablock W. A new biometrical procedure for testing the equality of measurements from two different analytical methods. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1983) 21: Young DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. 4th Edition, Washington, DC, AACC Press (1997) 3: Young DS. Effects of Preanalytical Variables on Clinical Laboratory Tests. 2nd Edition, Washington, DC, AACC Press (1997) 3:
ABX Pentra. HbA1c WB. Reagente para a dosagem in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). A11A01702
(Sangue total) Ref. : A11A01702 Volume R1 : Volume R2 : Volume R3 : 1 x 110 ml Volume R4 : 2 x 21 ml Volume R5 : 1 x 25 ml Reagente para a dosagem in-vitro da Hemoglobina A1c (HbA1c). ABX Pentra 2007/09/24
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