PROTOCOLOS DE OBTENÇÃO E EXPANSÃO IN VITRO DAS CÉLULAS PROGENITORAS MESENQUIMAIS DA GELEIA DE WHARTON DE EQUINOS (eq- CPMW)

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ UFPI PRÓ-REITORIA DE PESQUISA Coordenadoria de Pesquisa CPES Campus Universitário Ministro Petrônio Portela, Bloco 06 Bairro Ininga Cep: Teresina-PI Brasil Fone (86) PROTOCOLOS DE OBTENÇÃO E EXPANSÃO IN VITRO DAS CÉLULAS PROGENITORAS MESENQUIMAIS DA GELEIA DE WHARTON DE EQUINOS (eq- CPMW) Camila Arrivabene Neves (bolsista do PIBIC/CNPq), Maria Acelina Martins de Carvalho (Orientadora, Depto de Morfofisiologia Veterinária UFPI) INTRODUÇÃO O uso das células-tronco é um campo terapêutico que vem crescendo ao longo dos anos, devido seu alto potencial de regeneração de tecidos e órgãos lesados (VIOLINI et al., 2009). As células tronco mesenquimais equinas podem ser obtidas a partir da medula óssea (FORTIER et al, 1998), tecido adiposo (VIDAL et al, 2007), sangue do cordão umbilical e sangue periférico. A medula óssea é a mais antiga e conhecida fonte de células-tronco, porém as células provenientes deste sítio anatômico possuem capacidade de diferenciação indiretamente proporcional à idade do animal doador, por esse motivo, o potencial terapêutico dessas células declina com o tempo (NARDI, 2007). Dessa forma, cientistas têm buscado fontes alternativas de células-tronco, e a geleia de Wharton, uma matriz gelatinosa e elástica de mucopolissacarídeos que recobre o cordão umbilical, tem sido descrita como uma fonte vantajosa perante as demais. As células-tronco mesenquimais (CTMs) dessa estrutura podem ser caracterizadas pela alta taxa de proliferação sem demonstrações de imunogenicidade e tumorgenicidade, além de cumprir todos os outros requisitos para classificação como tronco-mesenquimais. Outro ponto positivo dessa alternativa é uma coleta não invasiva, e com materiais que normalmente seriam descartados (HOYNOWSKI et al, 2007; CREMONESI et al, 2011) Tendo isso em vista, o objetivo desse trabalho foi elaborar protocolos para o isolamento e expansão de células-tronco mesenquimais provenientes da Geleia de Wharton do cordão umbilical de equinos. METODOLOGIA Foi utilizado o cordão umbilical de um potro, produto de abortamento espontâneo, coletado no momento exato do aborto. Cerca de 20cm do cordão foi encaminhado para o laboratório de células tronco do Núcleo Integrado de Morfologia e Pesquisa com Células-Tronco (NUPCelt). O material foi

2 dissecado, dissociado, e plaqueado para isolamento e obtenção das células-tronco mesenquimais (Figura 1). Figura 1 - Dissecação e Dissociação mecânica da geleia de Wharton do Cordão umbilical de equino. As células foram expandidas em meio DMEM High Glucose (SIGMA). Sendo submetidas a processo de repique até atingirem quantidade suficiente para seus respectivos processos. Para ensaio da cinética, foram locadas em placas de cultura de seis poços. Foi feita contagem durante seis dias para confecção da curva de crescimento. Outra parte das células cultivadas foi congelada em solução criopreservativa, constituída de 50% de DMEM F12 (SIGMA), 40% de SFB, 9% de DMSO E 1% de antibiótico durante 24 horas a -80ºC, sendo posteriormente armazenadas em nitrogênio líquido. Após cinco meses, uma fração dessas células foi descongelada para realização da curva pós-congelamento. RESULTADOS E DISCUSSÃO O cordão umbilical coletado a partir de um abortamento espontâneo não interferiu nos resultados. Contudo, é válido ressaltar que a equipe estava de prontidão no momento exato do ocorrido, possibilitando que a coleta fosse imediata, antecedendo morte celular e liberação de toxinas. O material foi coletado da maneira mais estéril possível, o que possibilitou o desenvolvimento celular in vitro sem que houvesse contaminações, essa foi, portanto, uma etapa bem-sucedida desse trabalho. Através dos protocolos utilizados para isolamento e expansão, foi possível o cultivo in vitro das células progenitoras da geleia de Wharton de equino. As células isoladas apresentaram após 48h de plaqueamento aderência ao plástico, morfologia fibroblastóide, e tendência à formação de colônias, características fundamentais para serem classificadas como células-tronco mesenquimais (Figura 2). Os protocolos utilizados nessas etapas estão de acordo com os protocolos utilizados por DE VITA (2011), CORRADETTI et al (2011), e BARBERINI (2013).

3 A B Figura 2 - Células-tronco mesenquimais da Geleia de Wharton de equino. A Colônia de Células-tronco mesenquimais com morfologia fibroblastóide, plástico aderentes, aumento de 4x. B Garrafa com Unidades Formadoras de Colônias (Seta preta aponta para uma das colônias). No estudo cinético realizado com as células de cultivo observou-se o padrão de crescimento das células (Gráfico 1). Número de células x Curva de Crescimento Pré-Congelamento das CTGWEq (Pré-Congelamento) 24h 48h 72h 96h 120h 144h Curva A Tempo de Cultivo (Horas) Gráfico 1 - Curva de crescimento pré-congelamento das células tronco mesenquimais da geleia de Wharton de equino, na quarta passagem. Foram plaqueadas 1 x 10 4 células em cada poço da placa, tendo isso em vista nota-se no gráfico acima um crescimento significante logo no primeiro dia de contagem, em que foram contabilizadas 2 x 10 4 células, o dobro do que foi plaqueado, indicando um crescimento celular bastante satisfatório. No decorrer das horas, ainda que em menor quantidade, há proliferação das células até o quinto dia, momento em que ocorre o pico de crescimento celular e, em seguida, a partir do sexto dia inicia-se um declínio. Comparando a curva encontrada nesse estudo com curvas de crescimento de células mesenquimais da medula óssea de humanos, ambas possuem crescimento semelhantes, com progressão até as 120 primeiras horas, um pico de crescimento nesse momento, e um declínio em seguida (DISSANAYAKA et al., 2011), também possui progresso semelhante a curva descrita por

4 Baghaban Eslaminejad (2009) de células mesenquimais provenientes da medula óssea de equinos. Ainda, corrobora com as curvas de crescimento de células provenientes tanto do saco vitelínico, como da membrana amniótica de equinos, com crescimento progressivo não linear, e com uma grande quantidade de células proliferadas, o que é comum quando se trata de células-tronco provenientes de anexos fetais (FRANCIOLLI, 2012; INT ANKER et al., 2004). CONCLUSÃO A Geleia de Wharton de equino pode ser caracterizada como uma fonte viável de célulastronco mesenquimais, tendo em vista o sucesso na obtenção de células com aderência ao plástico, morfologia fibroblastóide, e tendência à formação de colônias. Ainda que sejam necessários novos estudos para aprimoramento na caracterização das células, a Geleia de Wharton se revela, como uma fonte alternativa vantajosa. Esse estudo se apresenta como o primeiro passo ao longo de um caminho promissor no que diz respeito à formação de um banco de células-tronco, à terapia celular e à medicina equina regenerativa. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARBERINI, D. Caracterização imunofenotípica e potencial de diferenciação de células-tronco mesenquimais provenientes de medula óssea, tecido adiposo e cordão umbilical de equinos f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Disponível em: < BAGHABAN ESLAMINEJAD, M. R.; TAGHIYAR, L.; DEHGHAN, M. M.; FALAHI, F. AND KAZEMI MEHRJERDI, H. Equine marrow-derived mesenchymal stem cells: isolation, differentiation and culture optimization. Iranian Journal of Veterinary Research, Shiraz University, Vol. 10, No. 1, Ser. No. 26, 2009 CORRADETTI B, LANGE-CONSIGLIO A, BARUCCA M, CREMONESI F, BIZZARO D: Size-sieved subpopulations of mesenchymal stem cells from intervascular and perivascular equine umbilical cord matrix. Cell Prolif 2011, 44: CREMONESI, F.; CORRADETTI, B.; LANGE, C. A. Fetal adnexa derived stem cells from domestic animals: progress and perspectives. Theriogenology. 2011;75: DE VITA, B. Isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais derivadas de anexos fetais equinos f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Disponível em: < DISSANAYAKA, W. L.; ZHU, X.; ZHANG, C.; JIN, L. Characterization of Dental Pulp Stem Cells Isolated from Canine Premolars. JOE Volume 37, Number 8, August 2011 FORTIER, A.L.; NIXON, A.J.; WILLIAMS, J.; CABLE, C.S. Isolation and chondrocytic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells. AVRJ. v. 59, n. 9, p , FRANCIOLLI, A. L. R. Medicina veterinária regenerativa: multipotencialidade das células da membrana amniótica e do saco vitelino no modela equino (Equus caballus, Linnaeus 1758). Tese (Doutorado em Ciências), Faculdade de medicina veterinária e zootecnia, Universidade de São Paulo, 2012.

5 HOYNOWSKI SM, FRY MM, GARDNER BM, LEMING MT, TUCKER JR, BLACK L, SAND T, MITCHELL KE. Characterization and differentiation of equine umbilical cord-derived matrix cells. Biochem Biophys Res Commun 2007, 362: IN T ANKER, P.S.; SCHERJON, S.A.; KEUR, C.K.; GROOT-SWINGS, G.M.J.S.; CLAAS, F.H.J.; FIBBE, W.E.; KANHAI, H.H.H. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. V. 22, p , NARDI, N. B. Células-tronco: fatos, ficção e futuro. Genet Esc. 2007;2:25-9. VIDAL MA, KILROY GE, LOPEZ MJ, et al Characterization of equine adipose tissue-derived stromal cells: Adipogenic and osteogenic capacity and comparison with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Vet Surg, 36: VIOLINI, S.; RAMELLI, P.; PISANI, L. F.; GORNI, C.; MARIANI, P. Horse bone marrow mesenchymal stem cells embryo stem cell markers and show the ability for fenogenic differentiation by in vitro exposure to BMP-12. BMC Cell Biol. 2009:10: Palavras-Chave: Célula-tronco Mesenquimal. Geleia de Wharton. Equinos.