Fatores preditivos para leishmaniose visceral canina em quatro municípios endêmicos do Brasil. por. Francisco Edilson Ferreira de Lima Júnior

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1 Fatores preditivos para leishmaniose visceral canina em quatro municípios endêmicos do Brasil por Francisco Edilson Ferreira de Lima Júnior Dissertação apresentada com vistas à obtenção do título de Mestre Modalidade Profissional em Epidemiologia em Saúde Pública. Orientador principal: Prof. Dr. Guilherme Loureiro Werneck Segundo orientador: Prof. Dr. Fabiano Borges Figueiredo Rio de Janeiro, julho de 2012.

2 Esta dissertação, intitulada Fatores preditivos para leishmaniose visceral canina em quatro municípios endêmicos do Brasil apresentada por Francisco Edilson Ferreira de Lima Júnior foi avaliada pela Banca Examinadora composta pelos seguintes membros: Prof. Dr. José Ueleres Braga Prof. Dr. Valmir Laurentino Silva Prof. Dr. Guilherme Loureiro Werneck Orientador principal Dissertação defendida e aprovada em 25 de julho de 2012.

3 Catalogação na fonte Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica Biblioteca de Saúde Pública L732 Lima Júnior, Francisco Edilson Ferreira de Fatores preditivos para leishmaniose visceral canina em quatro municípios endêmicos do Brasil. / Francisco Edilson Ferreira de Lima Júnior f. : tab. Orientador: Werneck, Guilherme Loureiro Figueiredo, Fabiano Borges Dissertação (Mestrado) Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, Rio de Janeiro, Leishmaniose Visceral-epidemiologia. 2. Leishmaniose Visceral-prevenção & controle. 3. Leishmaniose Visceraldiagnóstico. 4. Doenças do Cão-epidemiologia. 5. Doenças do Cão-prevenção & controle. 6. Controle de Vetores. 7. Incidência. 8. Brasil. I. Título. CDD - 22.ed

4 AGRADECIMENTOS À minha esposa Kellen Christine por todo apoio e compreensão durante toda jornada do curso. Ao Prof. Dr. Guilherme Werneck pela sua estimada orientação e dedicação na elaboração da dissertação. Ao Prof. Dr. Fabiano Figueiredo pelas suas valiosas colaborações e auxílios na elaboração da dissertação. Ao Corpo Técnico de professores do Mestrado Profissional Em Epidemiologia Aplicada Aos Serviços de Saúde pelos inestimáveis ensinamentos durante o curso. Aos colegas de curso pelo companheirismo e compartilhamento das angústias e vitórias. Aos amigos Evaldo Tacho e Darlane Tacho pelas suas colaborações prestadas quanto ao uso do software SPSS. À Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde pela oportunidade dada e liberação das atividades profissionais durante o curso. Aos demais que não foram aqui destacados, mas que contribuíram de forma importante para o alcance deste objetivo.

5 Sumário 1. INTRODUÇÃO Leishmaniose Visceral Humana Leishmaniose Visceral Canina Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina JUSTIFICATIVA OBJETIVO GERAL Objetivos Específicos MATERIAIS E MÉTODOS Contexto do estudo... 9 Área do estudo... 9 Cálculo e seleção da amostra Coleta de dados Desenho do estudo População do estudo Variáveis do estudo Variável desfecho Variáveis preditoras: Análises estatísticas Considerações Éticas ARTIGO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 48

6 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Leishmaniose Visceral Humana A leishmaniose visceral (LV) humana é uma zoonose de evolução crônica, sistêmica, caracterizada por febre de longa duração, esplenomegalia, hepatomegalia, perda de peso, astenia, adinamia e anemia, dentre outros sinais e sintomas 1-3. Quando não tratada pode evoluir para óbito em até 100% dos casos 4. Tem ampla distribuição, ocorrendo na Ásia, na Europa, no Oriente Médio, na África e nas Américas. Estima-se a ocorrência de aproximadamente 500 mil casos novos anualmente no mundo, estando estes casos concentrados principalmente na África, Américas e regiões do Sudeste Asiático, sendo que 90% deles ocorrem em Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão. Dentre os 6 países citados, o Brasil é o único que apresenta uma transmissão antropozoonótica, onde o cão é o principal reservatório do parasito Leishmania (Leishmania) chagasi (L. chagasi), enquanto nos demais, o homem assume o papel principal como reservatório do parasito Leishmania donovani 5, 6. Na América Latina a doença já foi descrita em pelo menos 12 países, com maior ocorrência no Paraguai, Argentina e Brasil, sendo que nestes estão concentrados cerca de 90% dos casos da região 7. No Brasil, a doença está distribuída nas cinco regiões do país, em 21 Unidades Federadas, com média anual ( ) de casos humanos, e no de 2010, letalidade de 6,2% e incidência aproximada de 1,8 casos por hab. no ano de Desde a década de 1980 observa-se uma mudança no perfil epidemiológico da LV, com um intenso processo de expansão territorial e urbanização da doença no Brasil, sobretudo nas periferias e nas chamadas zonas de transição das cidades de médio e grande porte, passando a atingir e provocar epidemias em municípios das regiões Norte, Sudeste e Centro-Oeste 9.

7 2 Na década de 1990, aproximadamente noventa por cento (90%) dos casos notificados de LV ocorreram na Região Nordeste 9, no entanto esta situação vem se modificando, de forma que em 2009 quarenta e oito por cento (48%) dos casos notificados ocorreram nesta Região 8. Este processo está principalmente relacionado à complexidade do ciclo de transmissão da LV e às influências de diversos fatores ambientais, socioeconômicos, demográficos, genéticos e climáticos 10, 11. No Brasil, o ciclo de transmissão da LV é estabelecido pela presença do agente etiológico (L. chagasi), do vetor (Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi), do hospedeiro humano susceptível, dos reservatórios silvestres (raposas e marsupiais) e do cão (Canis familiaris), principal reservatório do parasito em áreas urbanas A forma de transmissão da LV para o homem se dá através da picada de fêmeas de Lutzomyia longipalpis infectadas pelo protozoário L. chagasi Leishmaniose Visceral Canina A leishmaniose visceral canina (LVC) ocorre na Europa, Ásia, África e Américas 6. No Brasil, além das 21 Unidades com ocorrência de casos humanos, há também registro de casos de LVC autóctones em Santa Catarina, estado onde ainda não foram registrados casos humanos autóctones da doença 17. Em muitas áreas tropicais e neotropicais do mundo, o cão tem sido incriminado como o principal responsável pela manutenção da transmissão da LV 18. No Brasil, em regra, epidemias de LV em humanos tem sido precedida pela enzootia canina 19, 20. Estudos demonstram que a presença de cães no domicílio é um fator de risco individual para ocorrência da LV em humanos e que este risco é maior quanto maior o número de cães na residência 21, 22. Os cães infectados por L. chagasi podem permanecer sem sinais clínicos por um longo período de tempo 23, por outro lado, cerca de 50% dos cães infectados pela L. chagasi são

8 3 sintomáticos 24. Estudos demonstram que existe uma relação positiva entre a presença de sinais clínicos da doença em cães e a carga parasitária 25 e a capacidade de infectar flebotomíneos 26, 27. A doença se manifesta clinicamente de forma bastante variável e caracteriza-se por ser oportunista e de evolução lenta. Os sinais clínicos habituais são: perda de peso, hiporexia, astenia, apatia, febre, mucosas hipocoradas, linfadenopatia regional ou generalizada, onicogrifose, alterações oftálmicas, hepatoesplenomegalia e alterações cutâneas; tais como: lesões, alopecia localizada ou generalizada, descamação furfurácea, eczema, úlceras rasas e hiperqueratose Outros sinais menos frequentes também observados são: descarga nasal, diarreia, vômitos, desidratação e atrofia muscular 28, 30, 31. Em seu estágio avançado ocorrem epistaxe, hemorragia intestinal, edema, paresia dos membros posteriores, inanição e morte, geralmente devido à insuficiência renal ou hepática 28, 30, Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral O Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVC-LV) do Brasil preconiza que as ações de vigilância e controle sejam realizadas de forma integrada e focalizadas nas áreas de maior risco. Para tanto, os municípios devem ser estratificados a partir da média anual de casos humanos dos últimos três anos em: municípios sem transmissão ou silenciosos (média de casos = 0), com transmissão esporádica (média de casos 0,1 e < 2,4), com transmissão moderada (média de casos 2,4 e < 4,4) e com transmissão intensa (média de casos 4,4). As ações de vigilância e controle são distintas para cada situação epidemiológica e adequadas de acordo com o município a ser trabalhado 34. Na estratificação do ano de 2011, considerando a média anual de casos humanos de 2008 a 2010, dos municípios brasileiros, 4312 (77,5%) eram considerados sem transmissão ou silenciosos, (18,3%) com transmissão esporádica, 98 (1,7%) com transmissão moderada e 138 (2,5%) com transmissão intensa 35.

9 4 As ações de vigilância e controle da LV normatizadas no Brasil estão centradas no diagnóstico precoce e tratamento adequado dos casos humanos, vigilância e monitoramento canino com eutanásia de cães com diagnóstico sorológico ou parasitológico positivos, vigilância entomológica, saneamento ambiental, controle químico com inseticida de efeito residual e medidas preventivas direcionadas ao homem, ao vetor e ao cão 9. Dentre as ações de controle da LV, as relacionadas ao cão são consideradas as mais polêmicas devido à indicação da eutanásia de cães infectados. A identificação dos animais positivos é feita através de inquéritos sorológicos censitários e amostrais ou na rotina de atendimento de médicos veterinários da rede pública ou privada. Os inquéritos sorológicos censitários estão indicados especialmente para os municípios com transmissão intensa e moderada de LV 9. Segundo alguns autores, a ação de controle por meio da eutanásia de cães infectados tem tido baixo impacto na redução de casos humanos da doença no Brasil. Dentre as possíveis causas relacionadas estão: a longa demora entre o diagnóstico e a eutanásia dos cães infectados e a baixa sensibilidade dos testes diagnósticos utilizados A baixa sensibilidade estaria relacionada à utilização no PVC-LV de kits diagnósticos compostos por antígeno bruto de cepa heteróloga de Leishmania (Leishmania major - Like). Enquanto a demora entre o diagnóstico e a retirada dos cães infectados seria explicada pelo desequilíbrio entre a alta demanda de amostras biológicas encaminhadas para diagnóstico e a baixa capacidade operacional dos laboratórios de saúde pública, seja por deficiência de estrutura física ou de recursos humanos, bem como devido às interrupções constantes no fornecimento de kits diagnósticos 41, 42. Outro ponto crítico é a baixa especificidade dos testes diagnósticos da LVC, levando um número considerável de animais falsos positivos a serem submetidos à eutanásia 43. Neste contexto, o diagnóstico laboratorial da LVC pode ser considerado um fator crucial no PVC-LV do Brasil.

10 5 1.4 Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina As técnicas laboratoriais usualmente utilizadas para o diagnóstico da LVC no mundo são as parasitológicas e sorológicas, sendo estas últimas mais indicadas para inquéritos epidemiológicos 6. Até o final do ano de 2011, os métodos diagnósticos sorológicos da LVC utilizados pelos órgãos de Saúde Pública no Brasil eram o Ensaio Imunoenzimático (cepa Leishmania major - Like (EIE major - Like)) como método de triagem e a Reação de Imunofluorescência Indireta (cepa Leishmania major - Like (IFI major - Like)) como confirmatório (titulação > 1:40), ambos produzidos pelo laboratório Bio-manguinhos/Fiocruz e utilizados na rotina e nos inquéritos caninos em municípios onde já houve registro da doença 44. Este protocolo utilizando o EIE major - Like e a IFI major - Like associados possui altos valores de sensibilidade e especificidade 45. Estudo recente demonstrou valores de sensibilidade de 91% (IC95% 83,6-95,8) para o EIE major - Like, 90% (IC95% 82,38-95,10) para IFI major - Like (1:40) e de 86% (IC95% 77,63-92,13) para associação sequencial entre EIE - major - Like e IFI major - Like (1:40). Os valores da especificidade foram: 83,07% (IC95% 80,90-85,09) para o EIE - major - Like, 52,27% (IC95% 49,51-55,02) para IFI major - Like (1:40) e de 85,71% (IC95% 83,67-87,59) para associação sequencial entre EIE - major - Like e IFI major - Like (1:40) (Ministério da Saúde: dados não publicados). O uso de outras técnicas tais como histopatologia, imuno-histoquímica e moleculares não são factíveis atualmente para o diagnóstico da LVC na rotina em função do alto custo, da necessidade de equipamentos de alta complexidade, e, para este último, da inexistência de protocolos padronizados.

11 6 É consenso entre pesquisadores e profissionais envolvidos no controle da LV que ainda se faz necessário uma melhoria substancial na acurácia e oportunidade do diagnóstico da LVC em áreas endêmicas do Brasil. Por esse motivo, o desenvolvimento de testes de diagnóstico rápidos, dotados de níveis elevados de sensibilidade e especificidade e de fácil execução, que possam ser usados para avaliar grandes populações de animais, é essencial para a identificação acurada dos animais infectados, especialmente em áreas remotas, contribuindo para o sucesso dos programas de vigilância da LV 37, 46. Testes rápidos imunocromatográficos podem ser úteis em inquéritos epidemiológicos da LVC, principalmente como técnica de triagem diagnóstica. As principais vantagens e facilidades desses testes são: - O baixo custo; - A rapidez, simplicidade e praticidade; - Poder ser realizado a partir de uma pequena amostra de sangue total; - Ser dotado de elevada sensibilidade; - Não exigir equipamentos laboratoriais específicos, a eletricidade, ou de frio e especialização tecnológica; - Permitir que a execução seja feita na frente do proprietário do animal Em estudo encomendado pelo MS o teste rápido imunocromatográfico de plataforma de duplo percurso (DPP LVC) produzido pelo laboratório Bio-manguinhos/Fiocruz em uma população cuja a prevalência de infecção era de 7,0%, apresentou uma sensibilidade de 91% (IC95% 83,60-95,80), especificidade de 70,21% (IC95% 67,68-72,65), Valor Preditivo Positivo (VPP) de 18,61% (IC95% 15,26-22,35), Valor Preditivo Negativo (VPN) de 99,05% (IC95% 98,20-99,56) e um índice Kappa de 0,78 (IC95% 0,74-0,81) entre laboratórios (Ministério da Saúde: dados não publicados).

12 7 Neste mesmo estudo observou-se como o melhor cenário, tanto do ponto de vista do poder discriminatório quanto de praticidade diagnóstica, o protocolo utilizando o teste rápido DPP-LVC como triagem e o EIE - major - Like como teste confirmatório, apresentando sensibilidade de 87,88 (IC95% 79,78-93,58), especificidade de 88,53% (IC95% 86,68-90,21), VPP de 36,71% (IC95% 30,56-43,19) e VPN de 98,97% (IC95% 98,22-99,47) (Ministério da Saúde: dados não publicados). Estes resultados levaram ao MS substituir a partir do ano de 2012 o protocolo diagnóstico anteriormente utilizado no PVC-LV por este novo cenário utilizando o DPP-LVC como triagem e o EIE - major - Like como teste confirmatório 44. Apesar de suas vantagens, este novo protocolo diagnóstico ainda não solucionará definitivamente o problema enfrentado com a demora na retirada dos animais infectados, principalmente em áreas remotas, onde há a necessidade de se enviar as amostras para a realização do exame confirmatório em laboratórios de referência, localizados em outros municípios. Estudo recente demonstrou que o teste rápido DPP-LVC pode ser útil para confirmação de casos caninos com suspeita clínica da doença, por possuir altas sensibilidade e especificidade neste grupo de animais JUSTIFICATIVA Os modelos de predição são de relevante utilidade na área da saúde, especialmente os modelos clínicos. Uma das suas utilidades é trazer informações aos pacientes e seus médicos da probabilidade de um diagnóstico, de modo que se permita decidir sobre a necessidade de adoção de testes ou condutas clínicas adicionais. 55 Para construção de modelos clínicos preditivos em que considerem os resultados de diagnóstico (presença ou ausência de infecção ou doença) como a variável desfecho, o modelo de regressão logística é a técnica mais utilizada, principalmente a multivariada, pois permite estimar a probabilidade associada a determinado desfecho em face de um conjunto de variáveis

13 8 explanatórias 55, 56. Uma das alternativas para expressão dos resultados obtidos na regressão logística é o sistema de escores 55. Estudos que busquem combinar resultados de um teste diagnóstico simples e rápido, como o DPP-LVC, com informações de sinais clínicos associados ao parasitismo de cães pela L. chagasi com o intuito de gerar um modelo de predição com base em um sistema de escore com aplicabilidade na prática veterinária privada e pública são inexistentes. Apenas um estudo avaliou essa possibilidade, no entanto utilizando a IFI - major - Like como teste diagnóstico laboratorial em uma amostra de cães de base hospitalar e de um único município 57. O desenvolvimento de um sistema de predição para LVC, combinando informações clínicas com os resultados do DPP-LVC poderia contribuir para a melhoria do diagnóstico da LVC em áreas endêmicas, aumentando a acurácia e a agilidade diagnóstica em campo. Considerando que cerca de 50% dos cães infectados pela L. chagasi são sintomáticos 24 e que existe uma relação positiva entre a presença de sinais clínicos da doença em cães e a carga parasitária e a capacidade de infectar flebotomíneos 25-27, a utilização de aspectos clínicos dos cães como fatores de predição da infecção em municípios endêmicos poderia, ainda, contribuir para a identificação de uma parcela importante de cães com maior potencial de infectividade, promovendo um impacto significativo na redução da transmissão. 3. OBJETIVO GERAL Desenvolver e validar um modelo de predição para o parasitismo por L. chagasi em cães de municípios endêmicos do país, combinando resultados do teste rápido DPP-LVC e sinais clínicos da doença Objetivos Específicos Estimar a associação de diferentes sinais clínicos com o parasitismo por L. chagasi em cães.

14 9 Desenvolver um modelo clínico-laboratorial de predição para o parasitismo por L. chagasi em cães. Desenvolver um sistema de escores para o modelo clínico-laboratorial de predição para o parasitismo canino por L. chagasi. Validar o modelo clínico-laboratorial preditivo desenvolvido. Estimar e comparar a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo do modelo clínico-laboratorial e do teste rápido DPP-LVC. 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Contexto do estudo Para realização do presente estudo foi utilizado um banco de dados secundário gerado por um estudo transversal, multicêntrico de base populacional, denominado Construção de um painel de soros caninos para o Ministério da Saúde utilizar na validação de kits de diagnósticos para leishmaniose visceral canina realizado no período de outubro de 2008 a abril de 2009 em quatro municípios endêmicos para LV de quatro macrorregiões do país (Ministério da Saúde: dados não publicados). O objetivo deste estudo foi construir um painel multicêntrico de soros caninos com diagnóstico negativo e positivo confirmado por meio de exames parasitológicos diretos e indiretos para leishmaniose visceral canina em uma população canina não supervisionada. Área do estudo Para construção do painel foram selecionadas áreas de municípios de transmissão moderada ou intensa (média anual de casos humanos dos últimos três anos > 2,4) com prevalência estimada de LVC igual ou superior a 10%, localizados em quatro diferentes regiões no território brasileiro. Assim, foram selecionados os municípios de Brasília/DF (média de casos humanos = 3,7), Palmas/TO (média de casos humanos = 30),

15 10 Bauru/SP (média de casos humanos = 46,7) e Fortaleza/CE (média de casos humanos = 141,3) 58. Cálculo e seleção da amostra Baseado em um intervalo com 95% de confiança, uma sensibilidade e especificidade esperadas de 90% e de 80%, respectivamente, calculou-se o tamanho amostral de 140 animais infectados e de 243 animais não infectados. Considerando que a prevalência de infecção estimada nas áreas era de 10% seria necessário um mínimo de animais de idade adulta (> 8 meses), com raça variada, residentes em áreas urbanas. Dentre as áreas do município com prevalência superior a 10%, foram selecionadas por conveniência aquelas com maior tempo sem a realização de inquérito canino censitário. Os animais foram selecionados por amostragem sistemática com o intervalo de seleção de uma residência, até que se encontrasse um cão cujo proprietário concordasse em participar do estudo. Todos os cães da residência selecionada eram incluídos, independente do número de animais. Foram coletadas amostras de sangue e pele íntegra de um total de 1600 cães. Coleta de dados Os dados referentes às variáveis clínicas foram coletados por meio de um formulário padronizado (anexo I) que era preenchido por um agente de endemias previamente treinado da Secretaria Municipal de Saúde de cada município com as informações passadas pelos veterinários que estavam realizando a anamnese e exame clínico do animal. Os veterinários que realizaram os exames clínicos foram os mesmos para todos os animais do estudo. O teste rápido DPP-LVC foi realizado a partir de amostras de soros congelados dos animais. Estas amostras foram encaminhadas numeradas sequencialmente sem a identificação dos resultados dos exames parasitológicos, ao Laboratório de Referência Nacional (LRN) da Fundação Ezequiel Dias - MG (Funed-MG) para o processamento, sendo armazenadas em freezer a -80ºC.

16 11 As amostras de soro foram retiradas da geladeira e mantidas à temperatura ambiente por meia hora antes da execução dos testes utilizando o DPP-LVC, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante (Bio-Manguinhos/Fiocruz). Os resultados foram armazenados em planilhas Excel. Os testes parasitológicos foram realizados a partir de biópsias de pele íntegra da região escapular. As amostras foram encaminhadas à temperatura de 4 a 8º C em caixas térmicas contendo gelo reciclável ao Laboratório de Leishmanioses da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz-RJ). As técnicas parasitológicas utilizadas foram imuno-histoquímica, histopatologia e cultura com identificação da espécie de Leishmania por isoenzimas, conforme metodologias descritas nos estudos publicados por Madeira e cols. (2009) 59 e Madeira e cols. (2006) Desenho do estudo Estudo transversal para construção de um modelo clínico preditivo População do estudo Todos os 1600 animais selecionados para o estudo Construção de um painel de soros caninos para o Ministério da Saúde utilizar na validação de kits de diagnósticos para leishmaniose visceral canina foram inclusos no presente estudo Variáveis do estudo Variável desfecho A variável utilizada como desfecho foi o resultado dos testes parasitológicos para L. chagasi (negativo/positivo). Considerou-se como positivo o animal que apresentou pelo menos um dos testes parasitológicos positivos, e negativo aquele com resultado negativo em todos os três testes Variáveis preditoras:

17 12 As variáveis clínicas selecionadas para serem testadas no modelo foram: idade (>8 meses e < 12 meses/ >1 e < 7 anos/ >7 anos), mucosas (normocoradas/hipocoradas/hiperêmicas /ictéricas), desidratação (ausente/presente), lesões cutâneas (não/sim), perda de apetite (não/sim), emagrecimento/caquexia (não/sim), apatia (não/sim), alopecia (ausente/ localizada/generalizada), descamação cutânea furfurácea (não/sim), pelo opaco (não/sim), úlceras crostosas (não/sim), onicogrifose (não/sim), alterações oftálmicas (não/sim), linfadenopatia (ausente/regional/generalizada) e esplenomegalia (não/sim). A variável preditora não clínica também utilizada no modelo foi o resultado do teste rápido DPP-LVC (negativo/positivo) Análises estatísticas Inicialmente realizou-se uma análise descritiva das variáveis de interesse, por meio da estimação da prevalência de infecção por L. chagasi em cães segundo diferentes características clínicas. Algumas características foram comparadas entre a população do estudo e as perdas, por meio do teste qui-quadrado de Pearson e o teste exato de Fischer, adotando-se p-valor < 0,05 para julgar diferenças estatisticamente significantes. Para o desenvolvimento e validação do modelo de predição, a amostra dos animais foi dividida aleatoriamente em dois grupos de tamanhos iguais, sendo um utilizado para criação do modelo preditivo (Amostra 1) e outro para validação deste modelo (Amostra 2) (split-sample validation) 55. A amostra 1 foi analisada por meio de regressão logística univariada com cada variável preditora e a variável desfecho. Em seguida uma análise de regressão logística multivariada pelo método Stepwise backward foi realizada com as variáveis que apresentaram associação com o desfecho com um nível de significância menor que 20% na regressão logística univariada.

18 13 Na regressão multivariada foram estimadas as razões de chance ajustadas, os respectivos intervalos de 95% de confiança. As variáveis que tiveram associação ao desfecho considerando um nível de significância de 5% compuseram o modelo preditivo final. A calibração do modelo clínico-laboratorial foi avaliada pela estatística de Hosmer- Lemeshow, que consiste em dividir o número de observações em dez classes e, em seguida, comparar as frequências preditas com as observadas, considerando um nível de significância de 5% 61. Um sistema de escores foi desenvolvido atribuindo uma pontuação para cada variável a partir da razão entre o coeficiente de regressão associado a cada variável e o menor coeficiente de regressão dentre estas, arredondando o valor para o número inteiro mais próximo 62. O escore clínico-laboratorial foi comparado ao resultado parasitológico e foram estimados a área sob a curva ROC (auroc) e a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN para os diferentes pontos de cortes. A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN também foram estimados para o teste rápido DPP-LVC. A partir de um escore clínico-laboratorial que variou entre 0 e 10, adotaram-se três pontos de corte para considerar um cão como positivo ou negativo: escore 5 (animais com escore > 5 são considerados positivos), escore 6 (animais com escore > 6 são considerados positivos) e escore 7 (animais com escore > 7 são considerados positivos). Os modelos contendo apenas o teste rápido DPP-LVC e o modelo clínico-laboratorial foram validados na amostra n 2, quando também foram comparadas as medidas de interesse e a auroc. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio dos softwares estatísticos SPSS versão 16.0 e Stata (Stata Corp., College Station, TX) Considerações Éticas

19 14 O protocolo do estudo mãe foi licenciado pela Comissão de Ética no uso de Animais da Fiocruz (licença n L-038/08). Para a realização do estudo não houve a utilização de informações de seres humanos, nem a manipulação de animais, dispensando a submissão aos Comitês de Éticas, conforme declaração do Comitê de ética de Uso de Animais da Fiocruz (Anexo II). 5. ARTIGO Fatores preditivos para a leishmaniose visceral canina em quatro municípios endêmicos do Brasil Predictive factors for canine visceral leishmaniasis in four endemic municipalities in Brazil RESUMO O diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral canina pode ser considerado um fator crucial no Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral no Brasil, fazendo-se necessário uma melhoria substancial em sua acurácia e oportunidade. O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um modelo clínico-laboratorial de predição para o parasitismo por Leishmania chagasi em cães de municípios endêmicos do Brasil. O presente estudo utilizou um banco de dados secundário com informações clínicas e laboratorias de 1600 cães de idade adulta (> 8 meses) de ambos os sexos e raças variadas gerado por um estudo transversal, multicêntrico e de base populacional realizado no período de outubro de 2008 a abril de 2009 em quatro municípios endêmicos para leishmaniose visceral no Brasil. Utilizouse como variáveis preditoras os sinais clínicos e o resultado do teste rápido

20 15 imunocromatográfico de plataforma de duplo percurso (DPP-LVC) produzido pelo laboratório Bio-manguinhos/Fiocruz, enquanto a variável desfecho foi o resultado do exame parasitológico. O modelo clínico-laboratorial apresentou um bom poder discriminatório e demonstrou uma calibração satisfatória. No entanto, quando comparado ao desempenho do modelo contendo apenas o teste rápido DPP-LVC, não se observaram ganhos importantes no poder de predição para o parasitismo por L. chagasi. Conclui-se que adicionar variáveis clínicas no modelo com o teste rápido DPP-LVC não contribuiu de forma importante no poder de predição deste teste. No entanto, a adoção do modelo clínico-laboratorial poderá ter utilidade com o objetivo de identificar animais com maior probabilidade de infecção de forma rápida e simples. ABSTRACT The laboratory diagnosis of canine visceral leishmaniasis can be considered a crucial factor in the Program for Surveillance and Control of Leishmaniasis in Brazil, making it necessary a substantial improvement in their accuracy and timeliness. The objective of this study was to develop and validate a clinical and laboratory prediction model for parasitism by Leishmania chagasi in dogs from endemic municipalities of Brazil. The present study used a secondary database with clinical and laboratorial 1600 adult dogs (> 8 months) of both sexes and various breeds generated by a cross-sectional, multicenter, population based study conducted from October 2008 to April 2009 in four counties endemic for visceral leishmaniasis in Brazil. Was used as predictor variables the clinical signs and the result of rapid immunochromatographic test platform dual path (DPP-LVC) produced by the laboratory Bio-Manguinhos/Fiocruz as the outcome variable was the result of parasitological diagnosis. The laboratory-clinical model showed good discriminatory power and has demonstrated a satisfactory calibration. However, when compared to the performance of the model containing only the rapid test DPP-LVC, there were no gains in predictive power to parasitism by L. chagasi. It is concluded that adding clinical variables in the model with the DPP-LVC quick test did not contribute significantly to

21 16 predictive power of this test. However, the adoption of clinical and laboratory model may be useful in order to identify animals with greater likelihood of infection quickly and easily. INTRODUÇÃO O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório da leishmaniose visceral (LV) em áreas urbanas do Brasil 1-5. Os cães infectados por Leishmania chagasi (L. chagasi) podem permanecer sem sinais clínicos por um longo período de tempo 6. Aproximadamente 50% dos cães infectados por L. chagasi são sintomáticos 7 e a presença de sinais clínicos está associada positivamente à carga parasitária 8 9, 10. e à capacidade de infectar os vetores da doença A doença nos cães se manifesta clinicamente de forma bastante variável e caracteriza-se por ser oportunista e de evolução lenta. Os sinais clínicos habituais são: perda de peso, hiporexia, astenia, apatia, febre, mucosas hipocoradas, linfadenopatia regional ou generalizada, onicogrifose, alterações oftálmicas, hepatoesplenomegalia e alterações cutâneas, tais como: lesões, alopecia localizada ou generalizada, descamação furfurácea, eczema, úlceras rasas e hiperqueratose Dentre as ações de controle da LV recomendadas no Brasil, as relacionadas ao cão são consideradas as mais polêmicas devido à indicação da eutanásia dos animais infectados. Alguns autores referem que essa ação de controle tem tido baixo impacto na redução de casos humanos da doença no Brasil. Dentre as possíveis causas relacionadas estão: a longa demora entre o diagnóstico e a eutanásia dos cães infectados e a baixa sensibilidade dos testes diagnósticos utilizados Outro ponto crítico é a baixa especificidade dos testes diagnósticos da leishmaniose visceral canina (LVC), levando a um número considerável de animais falsos positivos a serem submetidos à eutanásia 21. Neste contexto, o diagnóstico laboratorial da LVC pode ser considerado um fator crucial no Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVC-LV) no Brasil, fazendo-se necessário uma melhoria substancial em sua acurácia e oportunidade.

22 17 Desta forma, a utilização de um diagnóstico rápido, dotado de níveis elevados de sensibilidade e especificidade e de fácil execução, que possa ser usado para avaliar grandes populações de animais, é essencial para a identificação dos animais infectados, especialmente em áreas remotas 17, 22. Em estudo encomendado pelo MS o teste rápido imunocromatográfico de plataforma de duplo percurso (DPP LVC) produzido pelo laboratório Bio-manguinhos/Fiocruz em uma população cuja a prevalência de infecção era de 7,0%, apresentou uma sensibilidade de 91% (IC95% 83,60-95,80), especificidade de 70,21% (IC95% 67,68-72,65), Valor Preditivo Positivo (VPP) de 18,61% (IC95% 15,26-22,35), Valor Preditivo Negativo (VPN) de 99,05% (IC95% 98,20-99,56) e um índice Kappa de 0,78 (IC95% 0,74-0,81) entre laboratórios (Ministério da Saúde: dados não publicados). Neste mesmo estudo observou-se como o melhor cenário diagnóstico, tanto do ponto de vista de qualidade quanto de praticidade, o protocolo utilizando o teste rápido DPP-LVC para triagem e o Elisa (cepa Leishmania major - Like) do laboratório Bio-Manguinhos/Fiocruz como teste confirmatório, o que levou ao MS substituir a partir do ano de 2012 o protocolo diagnóstico anteriormente utilizado no PVC-LV por este novo cenário 23. Apesar de suas vantagens, este novo protocolo diagnóstico ainda não solucionará o problema enfrentado com a demora na retirada dos animais infectados, principalmente em áreas remotas, onde há a necessidade de se enviar as amostras para a realização do exame confirmatório em laboratórios de referência, localizados em outros municípios. Neste contexto, o desenvolvimento de um sistema de predição para LVC, combinando informações clínicas com os resultados do teste rápido DPP-LVC poderia contribuir para a melhoria do diagnóstico da LVC em áreas endêmicas, aumentando a acurácia e a agilidade diagnóstica em campo. Adicionalmente, permitiria identificar uma parcela importante de cães com maior potencial de infectividade, promovendo um impacto significativo na redução da transmissão.

23 18 O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar um modelo clínico-laboratorial de predição para o parasitismo por L. chagasi em cães de municípios endêmicos do país, associando resultados do teste rápido DPP-LVC e sinais clínicos da doença. MÉTODOS Para realização do presente estudo foi utilizado um banco de dados secundário gerado por um estudo transversal, multicêntrico de base populacional ( estudo de fundo ), denominado Construção de um painel de soros caninos para o Ministério da Saúde utilizar na validação de kits de diagnósticos para leishmaniose visceral canina realizado no período de outubro de 2008 a abril de 2009 em quatro municípios endêmicos para LV de quatro macrorregiões do país (Ministério da Saúde: dados não publicados). Área e população do estudo Para construção do painel foram selecionados, por amostra de conveniência, quatro municípios endêmicos para LV humana com prevalência esperada de LVC maior ou igual a 10%. Os municípios selecionados foram: Brasília/DF, Palmas/TO, Bauru/SP e Fortaleza/CE. Os animais foram selecionados por amostragem sistemática com o intervalo de seleção de uma residência, incluindo todos os cães da residência selecionada. Um total de 1600 cães de idade adulta (> 8 meses), de ambos os sexos e raças variadas compôs a amostra final. Todos os cães do painel foram inclusos no presente estudo. Coleta de dados Os dados referentes às variáveis clínicas foram obtidos por veterinários mediante exame clínico do animal e registrados em um formulário padronizado por um agente de endemias previamente treinado da Secretaria Municipal de Saúde de cada município. Os veterinários que realizaram os exames clínicos dos animais foram os mesmos para todos os animais do estudo.

24 19 As 1600 a amostras de soro foram armazenadas em freezer a -80 C e mantidas à temperatura ambiente por meia hora antes da execução do teste rápido DPP-LVC. O teste rápido DPP-LVC foi realizado pelo Laboratório da Fundação Ezequiel Dias de Minas Gerais, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante (Bio-Manguinhos/Fiocruz). Os testes parasitológicos foram realizados a partir de biópsias de pele íntegra da região escapular. As amostras foram armazenadas à temperatura de 4 a 8º C e processadas pelo Laboratório de Leishmanioses da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz-RJ). As técnicas parasitológicas utilizadas foram imuno-histoquímica, histopatologia e cultura com identificação da espécie de Leishmania por isoenzimas, conforme metodologias descritas no estudo publicado por Madeira e cols. (2009) 24 e Madeira e cols. (2006) 25. Variável desfecho A variável utilizada como desfecho foi o resultado dos testes parasitológicos para L. chagasi (positivo/negativo). Considerou-se como positivo o animal que apresentou pelo menos um dos testes parasitológicos positivos, e negativo aquele com resultado negativo em todos os três testes. Variáveis preditoras As variáveis clínicas selecionadas para serem testadas no modelo foram: idade (>8 meses e < 12 meses/ >1 e < 7 anos/ >7 anos), mucosas (normocoradas/hipocoradas/hiperêmicas /ictéricas), desidratação (ausente/presente), lesões cutâneas (não/sim), perda de apetite (não/sim), emagrecimento/caquexia (não/sim), apatia (não/sim), alopecia (ausente/localizada/generalizada), descamação cutânea furfurácea (não/sim), pelo opaco (não/sim), úlceras crostosas (não/sim), onicogrifose (não/sim), alterações oftálmicas (não/sim), linfadenopatia (ausente/regional/generalizada) e esplenomegalia (não/sim). A variável preditora não clínica também utilizada no modelo foi o resultado do teste rápido DPP-LVC (positivo/negativo).

25 20 Análises Estatísticas Inicialmente realizou-se uma análise descritiva das variáveis de interesse, por meio da estimação da prevalência de infecção por L. chagasi em cães segundo diferentes características clínicas. Algumas características foram comparadas entre a população do estudo e as perdas, por meio do teste qui-quadrado de Pearson e o teste exato de Fischer, adotando-se p-valor < 0,05 para julgamento das diferenças estatisticamente significantes. Para o desenvolvimento e validação do modelo de predição, a amostra dos animais foi dividida aleatoriamente em dois grupos de tamanhos iguais, sendo um utilizado para derivação do modelo preditivo (Amostra 1) e outro para validação deste modelo (Amostra 2) (splitsample validation) 26. A amostra 1 foi analisada por meio de regressão logística univariada com cada variável preditora e a variável desfecho. Em seguida uma análise de regressão logística multivariada pelo método Stepwise backward foi realizada com as variáveis que apresentaram associação com o desfecho com um nível de significância menor ou igual a 20% na regressão logística univariada. Na regressão multivariada foram estimadas as razões de chance ajustadas e respectivos intervalos de 95% de confiança. As variáveis que tiverem associação ao desfecho considerando um nível de significância de 5% compuseram o modelo preditivo final. A calibração do modelo clínico-laboratorial foi avaliada pela estatística de Hosmer- Lemeshow, que consiste em dividir o número de observações em dez classes e, em seguida, comparar as frequências preditas com as observadas, considerando um nível de significância de 5% 27.

26 21 Um sistema de escore foi desenvolvido atribuindo uma pontuação para cada variável a partir da razão entre o coeficiente de regressão associado a cada variável e o menor coeficiente de regressão dentre estas, arredondando o valor para o número inteiro mais próximo 28. O escore clínico-laboratorial foi comparado ao resultado parasitológico e foram estimados a área sob a curva ROC (auroc), a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN para diferentes pontos de cortes. A sensibilidade, a especificidade, o VPP e o VPN também foram estimados para o teste rápido DPP-LVC. Os modelos contendo apenas o teste rápido DPP-LVC e o modelo clínico-laboratorial foram validados na amostra n 2, quando também foram comparadas o desempenho preditivo destes utilizando-se medidas de sensibilidade, especificidade, VPP e VPN e auroc. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio dos softwares estatísticos SPSS versão 16.0 e Stata (Stata Corp., College Station, TX). Aspectos éticos O protocolo do estudo de fundo foi licenciado pela Comissão de Ética no uso de Animais da Fiocruz (licença n L-038/08). Para a realização deste estudo não houve a utilização de informações de seres humanos, nem a manipulação de animais, dispensando a submissão aos Comitês de Éticas. RESULTADOS Dentre os 1600 cães recrutados, houve uma perda de 150 animais (9,37%) para os quais não se puderam obter resultados de testes parasitológicos para caracterização do desfecho, resultando em uma população final de estudo de 1450 animais. A distribuição da população final de estudo e das perdas segundo faixa etária, sexo, estado geral e resultado do teste rápido DPP-LVC foi semelhante (tabela 1). Houve, entretanto, diferença estatisticamente significativa na distribuição dos animais estudados e as perdas em

27 22 relação ao município de residência, sendo estas mais frequentes na população oriunda de Fortaleza/CE (tabela 1). Os 1450 animais estudados foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 725 animais (Amostra 1 e Amostra 2). A prevalência de infecção por L. chagasi na população total de cães foi de 7,0% (6,9% na Amostra 1 e 7,0% na Amostra 2), sendo maior no município de Bauru/SP (11,3%), seguido pelos municípios de Fortaleza/CE (7,5%), Brasília/DF (6,4%) e Palmas/TO (2,6%). Apesar de descritos na literatura como aspectos clínicos comuns em animais com LVC, na análise exploratória dos dados da Amostra 1 observou-se que sinais como epistaxe, distúrbio urinário, edema de membros e paresia de membros posteriores foram raramente registrados ou mesmo ausentes entre os animais parasitologicamente positivos, não sendo incluídos nas análises uni e multivariadas. Dentre as 15 variáveis incluídas na análise univariada, apenas esplenomegalia não esteve associada com parasitismo com um nível de significância <20% (tabela 1). Assim, todas as demais 14 avaliadas foram selecionadas para a análise multivariada (tabela 2). O modelo final obtido mediante regressão logística multivariada na amostra de derivação (Amostra 1) foi composto por três variáveis clínicas (emagrecimento/caquexia, descamação furfurácea e onicogrifose) e a variável laboratorial (teste rápido DPP-LVC), todas associadas significativamente (p-valor < 0,05) com o parasitismo por L. chagasi (tabela 3). A equação do modelo desenvolvido pode ser exposta da seguinte forma: Z = -6, ,904*descamação + 2,032*onicogrifose + 2,571*emagrecimento/caquexia + 4,000*DPP, onde Z corresponde ao logaritmo da chance ( log odds ) do cão ser positivo em pelo menos um dos testes parasitológicos realizados. A variável do modelo final com maior peso no cálculo do escore clínico-laboratorial foi o teste rápido DPP-LVC (peso 4), seguido por emagrecimento/caquexia (peso 3), onicogrifose (peso 2) e descamação furfurácea (peso 1) (tabela 3). Com base nesses pesos a pontuação do

28 23 escore clínico-laboratorial pode variar entre 0 a 10. A auroc do modelo clínico-laboratorial gerado a partir da Amostra 1 foi de 0,919. Adotou-se três pontos de cortes para o escore clínico-laboratorial para considerar um cão como positivo ou negativo: escore 5 (animais com escore > 5 são considerados positivos), escore 6 (animais com escore > 6 são considerados positivos) e escore 7 (animais com escore > 7 são considerados positivos). Os valores de sensibilidade e especificidade obtidos para todos os pontos de corte do modelo clínico-laboratorial e para o teste rápido DPP-LVC na Amostra 2 foram inferiores àqueles estimados na Amostra 1 (tabela 4). A auroc na amostra de validação (Amostra 2) foi de 0,850, um pouco menor que a auroc gerada do modelo desenvolvido na Amostra 1. Na amostra de validação (Amostra 2), os valores de especificidade e VPP nos três pontos de cortes do modelo clínico-laboratorial foram superiores aos encontrados para o teste rápido DPP-LVC, no entanto, houve uma perda importante nos valores de sensibilidade quanto maior o ponto de corte adotado (tabela 4). O teste de Hosmer e Lemeshow do modelo clínico-laboratorial apresentou uma estatística de qui-quadrado não significativa ( 2 = 0,815; p-valor = 0,846) na Amostra 1, ou seja, os valores preditos não foram significativamente diferentes dos observados. Isto ocorreu também para a amostra de validação (Amostra 2; 2 = 0,452; p-valor = 0,929). DISCUSSÃO As 14 variáveis clínicas que apresentaram associação univariada com o parasitismo por L. chagasi são descritas na literatura como frequentes em cães com LV 11-15, 29, 30. Por outro lado, a raridade ou ausência de sinais clínicos característicos da fase final de evolução da LVC nos animais com LVC do presente estudo, tais como epistaxe, distúrbio urinário, edema e paresia dos membros posteriores pode decorrer de um viés de sobrevivência seletiva 11-13, 29. Neste caso, o viés teria duas origens: (1) animais infectados normalmente são detectados e

29 24 submetidos à eutanásia ou mesmo evoluem ao óbito nas fases menos avançadas da doença, quando esses sinais ainda não estão presentes e (2) animais que apresentam estes sinais evoluem rapidamente para óbito, seja em decorrência da doença ou porque o proprietário encaminha o animal para a eutanásia. Estudos observaram uma prevalência entre 24% e 53% de esplenomegalia dentre os animais infectados por L. chagasi 12, 13, 29. No presente estudo a esplenomegalia não esteve associada ao parasitismo por L. chagasi. Uma hipótese que poderia explicar este achado seria a ocorrência de outras enfermidades nas localidades estudadas, como as infecções por Babesia canis e Ehrlichia canis, em que a esplenomegalia é um sinal clínico comum 31, 32, levando à subestimação da associação deste sinal com a LVC. O modelo clínico-laboratorial apresentou um bom poder discriminatório e demonstrou uma calibração satisfatória em ambas as amostras. No entanto, quando comparado ao desempenho do modelo contendo apenas o teste rápido DPP-LVC, não se observaram ganhos importantes no poder de predição para o parasitismo por L. chagasi. Gouvêa (2011) 33 encontrou um modelo clínico que inclui as seguintes características: idade do animal, lesões de pele, linfadenopatia, alopecia periocular e emagrecimento/caquexia. Apesar de todas essas variáveis estarem associadas com a infecção por L. chagasi nas análises univariadas do presente estudo, apenas emagrecimento/caquexia permaneceu no modelo final. A diferença entre os resultados encontradas nos dois estudos pode estar relacionada às características das populações avaliadas, tendo em vista que o estudo realizado por Gouvêa (2011) 33 utilizou dados de uma população canina de base hospitalar, o que leva a uma prevalência de características clínicas e do desfecho superiores à do presente estudo. Outro possível fator que pode explicar essas diferenças é a inclusão, no presente estudo, do teste rápido DPP-LVC desde o início da modelagem, o que pode interferir diretamente na composição no modelo final, já que as associações das características clínicas e LVC aqui apresentadas são condicionais ao resultado do DPP-LVC. Adicionalmente, a variável idade do

30 25 animal no estudo de Gouvêa (2011) 33 era do tipo numérica, enquanto neste estudo a variável foi analisada em categorias. Uma limitação adicional do presente estudo está relacionada ao teste diagnóstico utilizado como padrão-ouro, em especial à sua sensibilidade, o que poderia resultar em um viés de classificação. Apesar do diagnóstico parasitológico realizado a partir de amostras de pele ser considerado como de boa acurácia 24, a utilização de apenas amostras de pele para a realização dos exames parasitológicos pode permitir que animais infectados não sejam detectados 34, 35, o que levaria a uma subestimação da prevalência real de infecção da população canina, considerando que a especificidade seria próxima de 100%. O uso de um padrão de referência incapaz de detectar todos os animais infectados pode resultar em uma subestimação da especificidade dos modelos testados, pois amostras com resultados falsos negativos no padrão de referência utilizado poderiam ser detectados como positivos pelos modelos preditivos. Por outro lado, Almeida e cols. (2011) 34 demonstrou que a cultura de amostras de pele íntegra apresentou melhor desempenho para o isolamento de L. chagasi em cães sintomáticos do que assintomáticos, o que poderia implicar em uma superestimação da associação dos sinais clínicos com a infecção por L. chagasi no presente estudo. Com o intuito de aumentar a sensibilidade do padrão de referência utilizado neste estudo adotaram-se três técnicas parasitológicas. A utilização adicional de amostras biológicas de medula óssea 34, 36, baço 36, 37, fígado e linfonodos 36 seriam boas opções para melhorar o desempenho dos testes parasitológicos, porém seriam pouco viáveis de serem realizadas em campo. Supõe-se que a perda de cerca de 9% de cães em decorrência de amostras impróprias para realização de testes parasitológicos não deva ter promovido distorções nos resultados do estudo. Ainda que mais concentradas em um dos municípios avaliados, estas perdas decorreram fundamentalmente de dificuldades operacionais no transporte adequado das amostras podendo, assim, serem caracterizadas como perdas aleatórias ou não seletivas.

31 26 As perdas referentes às recusas do estudo de fundo não foram mensuradas e caracterizadas, tendo sempre sido substituídas por outros animais de forma a garantir a cobertura de 1600 cães. Assim, um possível viés de seleção não pode ser descartado. O fato de agentes de endemias estarem envolvidos no processo de coleta das amostras biológicas poderia levar os proprietários de cães aparentemente doentes, ou seja, com a presença de sinais clínicos da doença, a se negarem a participar do estudo por temerem que estes estivessem infectados, e, portanto, tivessem que ser entregues aos orgãos de saúde pública locais para eutanásia. A perda seletiva de animais sintomáticos infectados por L. chagasi poderia resultar em uma subestimação das medidas de associação, influenciando na composição do modelo final. Há relato na literatura de que cães portadores de algumas doenças caninas endêmicas em diversas regiões do país como a infecção por Babesia canis e Ehrlichia canis podem reagir sorologicamente de forma cruzada com a infecção por L. chagasi 38. Os animais do presente estudo não foram testados para estas duas enfermidades, no entanto, em estudo realizado com testes diagnósticos compostos por proteínas recombinantes, como é o caso do teste rápido DPP- LVC, a reação cruzada entre essas enfermidades e a LVC não foi observada 39. Reações cruzadas em testes sorológicos também são relatadas entre o parasitismo por L. chagasi e outras tripanossomíases como a infecção por Leshmania braziliensis e Trypanosoma cruzi Dentre os 1600 animais da população total deste estudo, apenas um animal foi identificado com a infecção por Leishmania braziliensis e nove por Trypanosoma canis. Desses animais, apenas um infectado por Trypanosoma canis foi positivo no teste rápido DPP-LVC (resultados não mostrados). Esses resultados indicam que a reação cruzada entre a infecção por L. chagasi e outras tripanossomíases não devem ter influenciado na estimação das medidas de acurácia do teste rápido DPP-LVC e do modelo clínico-laboratorial na população do estudo. Tanto na Amostra 1 quanto na Amostra 2, os valores de sensibilidade nos três pontos de cortes adotados no modelo clínico-laboratorial do nosso estudo foram inferiores aos encontrados para o modelo clínico-laboratorial gerado no estudo de Gouvêa (2011) 33 que

32 27 associou o teste IFI - major - Like aos sinais clínicos da doença, no entanto, as especificidades foram superiores. Por outro lado, a sensibilidade e a especificidade no modelo contendo apenas o teste rápido DPP-LVC no presente estudo foram, respectivamente, superior e inferior ao modelo encontrado por Gouvêa (2011) 33. A comparação dos valores preditivos encontrados nos dois estudos é desaconselhada nesta situação, tendo em vista as diferenças importantes na prevalência de infecção nas duas populações e que influenciam diretamente nesses valores. Os valores de especificidade e VPP encontrados nos três pontos de cortes do modelo clínico-laboratorial foram semelhantes ou superiores aos encontrados para o novo protocolo diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde (triagem com o DPP-LVC e confirmatório com EIE - major - Like) nessa mesma população de estudo, no entanto a sensibilidade e o VPN foram inferiores (Ministério da Saúde: dados não publicados). Desta forma, a utilização, por exemplo, do escore 5 como ponto de corte, ou seja, teste rápido DPP-LVC positivo mais a presença de um dos três sinais clínicos (emagrecimento/caquexia ou onicogrifose ou descamação furfurácea) poder ser um alternativa interessante para diagnosticar animais de forma rápida e simples em inquéritos censitários em municípios endêmicos. Este ponto de corte permitiria identificar de forma ágil mais da metade dos animais infectados (sensibilidade = 54,35%) e potencialmente mais infectantes ao vetor, com um valor preditivo positivo semelhante ao protocolo diagnóstico adotado pelo MS. O valor da sensibilidade do modelo clínico-laboratorial no presente estudo foi inferior ao encontrado para o teste rápido DPP-LV por Grimaldi e cols. (2012) 42 em cães sintomáticos, considerando uma escala semiquantitativa baseada na presença e gravidade de cinco sinais clínicos típicos da LVC (alopecia, dermatite, úlceras, linfadenopatia e onicogrifose). Estas diferenças podem ser explicadas pelas formas distintas como foram analisadas as variáveis clínicas nos dois estudos. Outro ponto que pode ajudar a explicar os diferentes desempenhos do teste rápido DPP-LVC entre os estudos é a forma de seleção dos animais para realização do diagnóstico padrão de referência. Enquanto nosso estudo realizou o diagnóstico padrão de

33 28 referência de todos os animais sem triagem sorológica, o estudo de Grimaldi e cols. (2012) 42 submeteu ao diagnóstico padrão de referência apenas os cães previamente triados com a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), selecionando desta forma, animais com maior intensidade de resposta imunológica. Este critério superestima os valores da sensibilidade dos testes sorológicos posteriormente testados, que utilizam o mesmo mecanismo da RIFI, a detecção de anticorpos específicos contra Leishmania sp.. A especificidade em animais com sinais clínicos compatíveis com LVC não foi mensurada nos animais sintomáticos no estudo de Grimaldi e cols. (2012) 42, tendo em vista que um dos critérios de exclusão de seus controles negativos era a presença de sinais clínicos compatíveis com a doença. A gravidade dos sinais clínicos da LVC é um fator que pode influenciar no poder de predição dos testes diagnósticos 43. Esta abordagem não foi considerada no presente estudo, no entanto, seria interessante que modelos considerando este aspecto fossem testados. É possível que o desempenho do modelo clínico-laboratorial desenvolvido neste estudo seja diferente em outras localidades, influenciado pela prevalência e o processo de endemicidade da LVC, portanto é importante que este seja validado em outras populações. A inoportunidade na retirada dos animais infectados é apontada como umas das limitações que comprometem a efetividade das ações de controle da LV no Brasil Moreira e cols. (2004) 20 refere que para alcançar uma maior efetividade nas ações de controle de reservatório da LV é importante a capacidade de identificar, dentre os animais infectados, os mais infectantes ao vetor, enquanto outros autores demonstram a maior infectividade a flebotomíneos de cães sintomáticos em relação aos assintomáticos Portanto, conclui-se que adicionar variáveis clínicas no modelo com o teste rápido DPP- LVC não contribuiu de forma importante no poder de predição deste teste. No entanto, considerando que os animais falso-negativos no modelo clínico-laboratorial que forem positivos no teste rápido DPP-LVC poderão seguir o fluxo estabelecido pelo PVC-LV, ou seja, serem submetidos ao diagnóstico laboratorial por meio do EIE - major - Like, a adoção do

34 29 modelo clínico-laboratorial poderá ter utilidade com o objetivo de identificar animais com maior probabilidade de infecção de forma rápida e simples. Esta abordagem diagnóstica contribuiria para a oportunidade da ação de controle em uma parcela importante dos cães infectados e potencialmente mais infectantes ao vetor. Adicionalmente, esta alternativa reduziria o número de amostras encaminhadas para um exame confirmatório em nível laboratorial, minimizando a sobrecarga dos laboratórios de saúde pública e o consumo de kits diagnósticos de EIE - major - Like. Propõe-se que estudos de validação deste modelo tendo como variável desfecho a infectividade a flebotomíneos sejam realizados com vistas a elucidar as hipóteses levantadas neste estudo. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Dantas-Torres F. The role of dogs as reservoirs of Leishmania parasites, with emphasis on Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viannia) braziliensis. Veterinary parasitology. 2007;149(3-4): Epub 2007/08/ Deane LM. LV no Brasil. Estudos sobre reservatórios e transmissores realizados no Estado do Ceará [Tese]: Serviço Nacional de Educação Sanitária, Rio de Janeiro, Brasil; Deane LM, Deane MP. [Dogs naturally infected by Leishmania donovani in Ceara]. Hospital (Rio J). 1954;45(6): Epub 1954/06/01. Encontro de caes naturalmente infetados por Leishmania donovani, no Ceara. 4. Sherlock IA. Ecological interactions of visceral leishmaniasis in the state of Bahia, Brazil. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1996;91(6): Epub 1996/11/ Sherlock IA, Miranda JC, Sadigursky M, Grimaldi Junior G. Natural infection of the opossum Didelphis albiventris (Marsupialia, Didelphidae) with Leishmania donovani, in Brazil. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 1984;79(4):511. Epub 1984/10/01.

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41 36 Tabela 2 Associação univariada de características clínicas com o parasitismo de cães para L. chagasi, Brasil, 2008/2009. Total (n= 725*) % Parasitológico positivo RC** (IC***) p-valor Idade >8meses <1ano 111 2,7 1,00 Referência >1ano<8anos 508 7,7 2,99(0, ) 0,072 >8anos 52 11,5 4,70(1,13-19,60) 0,034 Mucosas Normocoradas 616 5,7 1,00 Referência Hipocoradas 69 17,4 3,49(1,72-7,11) 0,001 Hiperêmicas/Ictéricas 25 4,0% 0,69(0,91-5,26) 0,722 Desidratação Ausente 694 5,8 1,00 Referência Presente 11 54,5 19,62(5,74-67,06) <0,001 Lesões cutâneas Ausente 615 5,7% 1,00 Referência Presente 46 30,4% 7,25(3,55-14,82) <0,001 Perda de apetite Ausente 683 5,6 1,00 Referência Presente 36 33,3 8,49(3, ) <0,001 Emagrecimento/caquexia Ausente 644 4,2 1,00 Referência Presente 55 40,0 15,23(7,85-29,56) <0,001 Apatia Ausente 695 6,2 1,00 Referência Presente 12 58,3 21,23(6, ) <0,001 Alopecia Ausente 615 5,5 1,00 Referência Localizada 41 9,8 1,85(0,62-5,48) 0,269 Generalizada 33 27,3 6,41(2,76-14,85) <0,001 Descamação furfurácea Ausente 551 4,0 1,00 Referência Presente ,9 4,89(2,67-8,95) <0,001 Pelo opaco Ausente 546 4,2 1,00 Referência Presente ,1 4,38(2,42-7,92) <0,001 Úlceras crostosas Ausente 691 6,2 1,00 Referência Presente 14 50,0 15,07(5, ) <0,001

42 37 Onicogrifose Ausente 669 5,2 1,00 Referência Presente 27 51,9 19,51(8,52-44,65) <0,001 Alterações Oftálmicas Ausente 644 5,6 1,00 Referência Presente 55 25,5 5,77(2,88-11,54) <0,001 Linfadenopatia Ausente 509 4,3 1,00 Referência Regional ,1 2,77(1,37-5,58) 0,004 Generalizada 61 21,3 5,99(2,84-12,65) <0,001 Esplenomegalia Ausente 572 7, Referência Presente 140 6,4 0,76(0,42-1,88) 0,759 * As diferenças nos totais representam os valores missing. **Razão de Chance ajustada. ***Intervalo de 95% de Confiança. Tabela 3 Variáveis do modelo preditivo final com os respectivos coeficientes de regressão, razões de chances ajustadas e pesos do escore para o parasitismo de cães por L. chagasi, Brasil, 2008/2009. Coeficiente de Regressão RC* p-valor Peso (escore) Emagrecimento 2,571 < 0,001 3 Ausente 1.00 Referência Presente 13,08 Descamação furfurácea 0,904 0,049 1 Ausente 1.00 Referência Presente 2,47 Onicogrifose 2,032 0,010 2 Ausente 1.00 Referência Presente 7,63 DPP-LVC 4,000 < 0,001 4 Negativo 1.00 Referência Positivo 54,58 *Razão de Chance ajustada Tabela 4 - Valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) e seus respectivos IC (95%) nas amostras de derivação (Amostras 1) e de validação (Amostra 2), no modelo composto pelo teste rápido DPP-LVC e em três pontos de cortes do modelo clínico-laboratorial final. Modelos Sensibilidade Especificidade VPP (IC*)% VPN (IC*)%

43 38 (IC*)% (IC*)% DPP-LVC - Amostra 1 94,59 (82,30-98,50) 73,43 (69,30-77,19) 21,59 (18,84-24,65) 99,43 (98,12-99,83) DPP-LVC - Amostra 2 90,00 (78,64-95,65) 68,75 (65,15-72,14) 17,88 (15,82-20,17) 98,91 (97,61-99,51) Escore 5 - Amostra 1 70,27 (54,22-82,51) 93,10 (90,46-95,04) 44,06 (34,79-53,78) 97,59 (96,12-98,51) Escore 5 - Amostra 2 54,35 (40,18-67,85) 92,05 (89,67-93,92) 34,08 (26,23-42,94) 96,39 (95,11-97,34) Escore 6 - Amostra 1 51,35 (35,89-66,55) 98,33 (96,73-99,15) 70,40 (53,19-83,23) 96,31 (94,94-97,32) Escore 6 - Amostra 2 21,74 (12,26-35,57) 96,50 (94,76-97,68) 31,96 (19,32-48,01) 94,22 (93,31-95,01) Escore 7 - Amostra 1 48,65 (33,45-64,11) 98,74 (97,29-99,42) 74,92 (56,60-87,34) 96,13 (94,78-97,14) Escore 7 - Amostra 2 21,74 (12,26-35,57) 97,29 (95,71-98,31) 37,76 (22,94-55,19) 94,27 (93,39-95,07) 6. CONCLUSÕES As variáveis clínicas que apresentaram associação univariada com o parasitismo por L. chagasi, bem como aquelas que compuseram o modelo final são características frequentes da LVC relatadas em outros estudos, sugerindo a aplicabilidade na prática veterinária pública ou privada do modelo proposto em áreas endêmicas da doença. O acréscimo de variáveis clínicas ao teste rápido DPP-LVC não contribuiu de forma importante no poder de predição deste teste, no entanto, a adoção do modelo clínicolaboratorial poderá ter utilidade com o objetivo de identificar animais com maior probabilidade de infecção de forma rápida e simples. A aplicação do modelo clínico-laboratorial em municípios endêmicos contribuiria para a oportunidade da ação de controle em uma parcela importante dos cães infectados e potencialmente mais infectantes ao vetor. Adicionalmente, esta alternativa reduziria o número de amostras encaminhadas para um exame confirmatório a nível laboratorial, minimizando a sobrecarga dos laboratórios de saúde pública e o consumo de kits diagnósticos de EIE - major - Like. É relevante que estudos de validação deste modelo tendo como variável desfecho a

44 39 infectividade a flebotomíneos sejam realizados com vistas a elucidar as hipóteses levantadas neste estudo. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Chagas E, Cunha AM, Ferreira LC, Deane L, Deane G, Guimarães FN, et al. LV americana. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz Rio de Janeiro jun;33(1): Rigo RS, Rigo L, Hone MR. Aspectos Clínicos e Laboratoriais na LV Americana. J Bras Nefrol 2009;31(1): Xavier-Gomes LM, Costa WB, Prado PF, Oliveira-Campos M, Leite MTS. Características clínicas e epidemiológicas da LV em crianças internadas em um hospital universitário de referência no norte de Minas Gerais, Brasil. Rev Bras Epidemiol. 2009;12(4): Basset D, Faraut F, Marty P, Dereure J, Rosenthal E, Mary C, et al. Visceral leishmaniasis in organ transplant recipients: 11 new cases and a review of the literature. Microbes and infection / Institut Pasteur. 2005;7(13): Epub 2005/07/ World Health Organization (WHO). The global burden of disease: 2004 update. Geneva: World Health Organization; World Health Organization (WHO). Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Geneva: World Health Organization; Acha PN, Szyfres B. Zoonosis y Enfermedades Transmissibles Comunes al Hombre y a los Animales. Organización Panamericana de la Salud Washington. 2003;3(3).

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53 48 8. ANEXOS Anexo I: Formulário Padronizado (frente)

54 Anexo I: Formulário Padronizado (verso) 49

55 Anexo II: Declaração do Comitê de Ética de Uso de Animais - Fiocruz 50