FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação de Clínica e Reprodução Animal VANESSA VISCARDI

Transcrição

1 FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA Programa de Pós-Graduação de Clínica e Reprodução Animal VANESSA VISCARDI DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA (EC ) NO LAVADO TRAQUEAL DE EQUINOS DA POLÍCIA MILITAR DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO NITERÓI 2012

2 1 VANESSA VISCARDI DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA (EC ) NO LAVADO TRAQUEAL DE EQUINOS DA POLÍCIA MILITAR DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Veterinária Orientador: Prof. Dr. DANIEL AUGUSTO BARROSO LESSA Orientador: Profa. Dra. NADIA REGINA PEREIRA ALMOSNY Coorientador: Prof. Dr. NAYRO XAVIER ALENCAR Niterói 2012

3 2 V822 Viscardi, Vanessa Determinação da atividade da fosfatase alcalina (EC ) no lavado traqueal de equinos da Polícia Militar do estado do Rio de Janeiro/ Vanessa Viscardi; orientador Daniel Augusto Barroso Lessa f. Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, Orientador: Daniel Augusto Barroso Lessa 1. Doença respiratória. 2. Doenças do cavalo. 3. Fosfatase alcalina. 4. Traqueia. 5. Citologia. I. Título. CDD

4 3 DEDICATÓRIA À minha família, pela torcida, pela compreensão e pelo incentivo sempre presentes. Em especial aos meus pais, Monica e Tadeu, por todo apoio, amor e dedicação que me ofereceram desde o meu primeiro dia de vida até hoje; ao meu querido irmão Filipe, que embora pequeno, já é um grande companheiro, inclusive de cavalgadas; à minha avó Lygia, que onde estiver, tenho certeza que está acompanhando mais esta vitória. Aos meus queridos amigos de infância, adolescência, de faculdade, de residência, da vida, pelos anos de amizade, por compreenderem as minhas ausências, pelos momentos compartilhados, por permanecerem por perto e acreditarem em mim. À minha égua Ventania, por me mostrar que o meu caminho era o da veterinária, pelo exemplo de força e de luta. Aos rottweilers Juma e Bructus, pelo amor incondicional, pela fidelidade e pelo companheirismo que nunca serão esquecidos. Ao meu querido Mangalarga Paulista, Querubim, que desde 1997 me traz alegrias. Aos animais, por sua sinceridade e pureza, por compreenderem muitas ações que sequer o ser humano compreende e, principalmente, por tudo que são capazes de nos ensinar.

5 4 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Daniel Lessa, meu orientador, por acreditar em mim, por me orientar e, junto com o prof. Nayro Xavier, meu coorientador, por todas as dicas e pela infraestrutura viabilizada que otimizaram meu experimento. Muito obrigada pela paciência, incentivo e ensinamentos, desde a época da graduação. A mestre e, agora, colega de trabalho, Maria Luisa, pela presença e ajuda constantes em todas as fases do meu mestrado, inclusive na dissertação. Você é um exemplo de pessoa e profissional a ser seguido! Às mestres Juliana e Kátia, pela ajuda indispensável com as coletas, dosagens e dissertação. Meninas, muito obrigada por tudo, principalmente por serem meu cérebro nos meus instantes de débito ou crédito e por tornarem divertidos até os momentos mais estressantes. Ao nosso grupo de pesquisa Hipiatras, que vem crescendo e se fortalecendo a cada ano. Às mestrandas Gabi e Paula, pela ajuda com o certificado do comitê de ética e abstract, e Julia Timponi pela ajuda nas coletas. Aos graduandos Carlos, Marina, Nathália, Gisela e Thomaz pela presença nos longos dias de coletas na PMERJ. A mestre e amiga Eliene Pina, pela ajuda na dissertação. Ao Rodolpho Oliva, pela presença indispensável com o design. À Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro, em especial à equipe da subseção de veterinária, minha nova família! Aos PM Aux. Enf. André, Cardoso, (Carlos) Azevedo, Duque, Edimilson, Fernando, Kassia, Jonas, Márcia Amorim, Matias, Mello e Trindade; aos Ten PM Rego e Schrapett e aos civis Juninho e Maurício por toda ajuda na seleção e manejo dos animais. Ao CB PM Hector pelo auxílio com a nova ortografia. Ao Maj PM Vet Alexandre e ao grande amigo e Ten PM Vet (Roberto) Gonçalves, por permitirem trocar os plantões necessários para concluir meu experimento. Ao Cmt do RPMont/CECS, Cel Samaha, e ao chefe da Subseção de Veterinária, Ten Cel Luciano, pela autorização para a execução deste trabalho. A Coopers Brasil LTDA, pela doação do Coopazine, sedativo necessário para contenção química de alguns cavalos, garantindo a segurança dos animais e dos profissionais. Aos amigos: os doutorandos Ananda e Pedro, a mestranda Renata Guedes e os Ten Vet Lee e Cássia pela presença indispensável nas hemogasometrias. À profa. Nadia Almosny, sem a qual eu não teria material para fazer os exames de hemogasometria, além da ajuda essencial na interpretação dos resultados obtidos.

6 5 Aos professores da UFF Ana Beatriz Monteiro, pela estatística e Luciano, pela ajuda com os exames parasitológicos. À técnica do laboratório de patologia clínica da UFF Camila, pela ajuda com as bioquímicas e com as minhas amostras congeladas. À veterinária do JCB Rosalie Kowal, por permitir que o uso do microscópio para realizar as leituras de algumas lâminas. Aos meus colegas de trabalho do SIT pelos diversos plantões trocados, especialmente às amigas Julia e Angelina, sem as quais eu não conseguiria ter conciliado trabalho e mestrado. Aos queridos amigos Bruno, doutorando na UFF, pelo apoio e ajuda nesses dois anos e João Paulo, doutorando na Universidade de Michigan, pelos diversos artigos adquiridos; Carol Costa e Rodrigo Almeida, pela presença na hora do meu desespero estatístico. Aos colegas de turma de mestrado, em especial Gabriel Bobany, Isabela, Livia, Luis e Renata Guedes pela amizade, pelas risadas compartilhadas e por tornarem esta etapa de nossas vidas mais alegre e divertida. Espero não perdermos o contato. À minha mãe, por aturar meus momentos de mau humor, cansaço e ansiedade, pela motivação sempre presente e por todo o tempo dispensado comigo e minha dissertação. Ao meu pai, pelos conselhos, apoio e torcida; por realizar um dos meus maiores sonhos e mantê-lo até hoje: o Querubim! À minha roomie Fernanda, pelo lar compartilhado, por ser a irmã que nunca tive, pela paciência com a minha pessoa, pelas diversas soluções básicas para problemas que eu considerava complexos. Vou sentir saudades!!! A todos os animais que cruzaram o meu caminho, seja em aula, seja na rua, seja no trabalho ou nas férias... Em especial aos cavalos da PMERJ! Desculpem-me por qualquer coisa, e muito obrigada pela existência de vocês! A Deus e ao meu Anjo da Guarda, por cuidarem tão bem de mim. A todos aqueles que de alguma maneira estiveram presentes na minha vida nesses últimos dois anos e que, direta ou indiretamente, me ajudaram a completar mais esta jornada, o meu MUITO OBRIGADA!

7 6 Quanto mais as pessoas acreditam em uma coisa, quanto mais se dedicam a ela, mais podem influenciar no seu acontecimento. Dov Éden

8 7 RESUMO Doenças respiratórias são a segunda principal causa de interrupção do treino de cavalos atletas, sendo responsáveis por perdas econômicas consideráveis no setor equestre mundial. A importância clínica das determinações das atividades enzimáticas como ferramenta diagnóstica das enfermidades do trato respiratório posterior já foi demonstrada em várias espécies, mas esses estudos ainda são escassos na espécie equina. Por isso, o objetivo deste trabalho foi determinar a atividade da Fosfatase Alcalina (FAL) no lavado traqueal (LT) de equinos considerados sadios e equinos portadores de inflamação do trato respiratório posterior, de acordo com o escore endoscópico e perfil citológico da traqueia. Para tal, foram avaliados 36 cavalos machos, adultos, pertencentes à Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro. Todos os animais apresentaram resultados do exame físico, hemogasometria, hematócrito, leucograma, proteína total e fibrinogênio plasmáticos dentro dos parâmetros fisiológicos. Os equinos selecionados foram submetidos ao exame endoscópico para quantificação do muco traqueal e coleta do lavado. O LT foi utilizado para citologia traqueal e dosagem da atividade da FAL, realizada por espectrofotometria a partir de alíquotas do sobrenadante preservadas em nitrogênio líquido. Esses 36 equinos foram classificados em três categorias divididos em sadios e/ou com inflamação: categoria 1 - endoscopia (GE1 e GE2), categoria 2 citologia (GC1 e GC2) e categoria 3 endoscopia + citologia (G1, G2, G3 e G4). A atividade da FAL no LT dos cavalos com achados compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior (GE2, GC2, G4) foi maior que nos cavalos considerados sadios (GE1, GC1 e G1, respectivamente), sendo esta diferença estatisticamente significativa (P=0,021) entre os GC1 (10282,85 ± 5856,97) e GC2 (18865,05 ± 11233,40). A determinação da FAL no LT pode ser usada como complementação do diagnóstico de enfermidades respiratórias, estando esta elevada em equinos adultos, sem queixas clínicas, com perfil citológico traqueal compatível com inflamação do trato respiratório posterior. Palavras-chaves: equino, lavado traqueal, fosfatase alcalina, citologia traqueal, escore endoscópico.

9 8 ABSTRACT Respiratory diseases are the second main cause of lost training days and premature retirement in performance horses and are responsible for considerable economic losses in the equine industries worldwide. The clinical importance of enzymatic activity determination as a diagnostic tool in lower respiratory tract (LRT) disorders has been shown in many species, but there are still few studies in the equine species. Therefore, the purpose of this study was to determine alkaline phosphatase (AP) activity in tracheal wash (TW) of horses considered healthy and those with LRT inflammation according to tracheal endoscopic score and cytological profile. Thirty six male adult horses belonging to the Military Police of Rio de Janeiro State were evaluated. All animals were normal at the physical exam and blood gas analysis; and packed cell volume, white cell count, total protein and fibrinogen were within normal limits. Endoscopic examination was done to quantify mucus accumulation and to perform TW. TW cytology was evaluated and the AP activity of TW supernatant aliquots preserved in liquid nitrogen was determined by spectrophotometry. The 36 horses were classified in three categories and divided into healthy and/or with inflammation: category 1 endoscopy (GE1, GE2), category 2 cytology (GC1, GC2) and category 3 endoscopy + cytology (G1, G2, G3, G4). The AP activity of TW in horses with LRT inflammation (GE2, GC2, G4) was higher than in healthy horses (GE1, GC1 and G1, respectively). However, this difference was considered statistically significant (P=0,021) only between GC1 (10282,85 ± 5856,97) and GC2 (18865,05 ± 11233,40). With the results of this study, it is possible to conclude that determining AP activity in equine TW can be used as a complementary diagnosis of respiratory diseases, since it is higher in adult horses with cytological profile of LRT inflammation without clinical signs. Key words: horses, tracheal wash, alkaline phosphatase, tracheal cytology, endoscopic score.

10 9 SUMÁRIO LISTA DE APÊNDICES 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS INTRODUÇÃO FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA MATERIAL E MÉTODO Animais Exames realizados Exame Endoscópico Exames Laboratoriais Critérios para a formação dos grupos Categoria 1 - Endoscopia Categoria 2 - Citologia Categoria 3 Endoscopia + Citologia Análise estatística RESULTADOS Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 1 (GE1 e GE2) Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 2 (GC1 e GC2) Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 3 (G1,G2,G3,G4) DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA 37 APÊNDICES 43

11 10 LISTA DE APÊNDICES APÊNDICE A Dados de identificação dos 36 equinos pertencentes a PMERJ utilizados neste estudo. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f. 43. APÊNDICE B Dados das funções vitais dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.44. APÊNDICE C Resultados dos Hematócritos, Proteínas Plasmáticas Totais e Fibrinogênios Plasmáticos dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.45. APÊNDICE D Resultados dos Leucogramas dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.46. APÊNDICE E Resultados do ph, da PaO 2 e da PaCO 2 do sangue arterial dos 36 equinos. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.47. APÊNDICE F Resultados dos exames endoscópicos dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.48. APÊNDICE G Resultados em percentuais da contagem celular diferencial das amostras de LT coradas pelo Giemsa dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.49. APÊNDICE H Valores da atividade da FAL no FET dos 36 equinos deste experimento. Rio de Janeiro, setembro-dezembro de 2010/2011, f.50.

12 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS DIVA E FAL FAN FD FET Fig. GC GE LBA LT PMERJ RPMont/CECS Doença Inflamatória das Vias Aéreas Escore endoscópico Fosfatase Alcalina Fosfatase Alcalina dos Neutrófilos Fator para correção da diluição Fluido epitelial traqueal Figura Grupo citologia Grupo endoscopia Lavado broncoalveolar Lavado traqueal Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro Regimento de Polícia Montada Coronel Enyr Cony dos Santos

13 12 1. INTRODUÇÃO A história do homem e do cavalo é o relato de uma longa e bem sucedida parceria, baseada em mútua confiança e em grande dose de compreensão. Desde sua domesticação, há mais de dois mil anos, até o presente, o cavalo tem sido tanto companheiro como servo fiel do homem. Poucos animais possuem um registro tão antigo e completo, e o estudo de sua história é fascinante. Através dele, toma-se conhecimento dos efeitos causados pela crescente mudança do meio ambiente na batalha do animal pela sobrevivência e das adaptações que foram sendo necessárias durante o processo de sua evolução (SAYER, 1977). O Brasil possui a quarta maior tropa de equinos do mundo, com 5,8 milhões de cabeças, sendo a maior concentração na região sudeste, com mais de cavalos (IBGE, 2007). A importância social e econômica da equideocultura nacional é traduzida por uma movimentação econômica da ordem de R$ 7,3 bilhões por ano e a ocupação direta de mais de 640 mil pessoas, cifra que poderia atingir a casa de 3,2 milhões se fossem incluídos os empregos considerados indiretos. Considerando apenas o segmento representado pelas federações hípicas, este mercado movimenta R$ anuais, empregando pessoas. As escolas de equitação movimentam R$ , gerando empregos diretos, enquanto que o segmento militar movimenta R$ e gera empregos diretos (BARROS, 2006). Se primeiramente o cavalo foi fonte de alimentação para o homem, logo passou a ser meio de transporte urbano e rural, correio, máquina agrícola e até força motriz, sendo um símbolo de poder em várias épocas históricas. Atualmente este nobre animal ainda é usado como carro de carga e de passeio, além de ser um elemento fundamental de desporto, lazer e para o policiamento montado.

14 13 Policiamento montado é a forma de policiamento que utiliza como meio de locomoção o cavalo. Dentre as suas vantagens podemos citar: efeito psicológico da presença do animal; atuação em terrenos inacessíveis a outras tropas; flexibilidade e grande mobilidade (OLIVEIRA e ALVES, 2009). O bom funcionamento do aparelho respiratório é fundamental para a saúde e desempenho atlético. As enfermidades respiratórias acometem equinos de qualquer idade e são a segunda principal causa de interrupção no treino de cavalos atletas (RUSH e MAIR, 2004), sendo responsáveis por perdas econômicas consideráveis na indústria equestre mundial (HODGSON e HODGSON, 2002). A permanência dos equinos em grandes centros urbanos é um importante fator de risco no desenvolvimento dessas enfermidades. Dentre elas, as não infecciosas do trato respiratório posterior são particularmente importantes, sobretudo na cidade do Rio de Janeiro, devido à sua prevalência (AMARAL et al., 1999; LESSA et al., 2005; SAD, 2007; LESSA et al., 2008; JORGE, 2011; PEREIRA, 2011), e porque muitas vezes manifestam-se de forma discreta ou assintomática (LESSA et al., 2008; LESSA et al., 2011), dificultando o diagnóstico e o tratamento preciso. Exame físico completo, histórico detalhado e técnicas diagnósticas adicionais são importantes, especialmente para o diagnóstico das doenças respiratórias que progridem de forma assintomática (VAN ERCK, 2009). O estudo das secreções obtidas do trato respiratório já vem sendo realizado no Brasil (MICHELOTTO JR, 1993; SANCHES, 1998; FERNANDES, 2001; LESSA, 2003; BIAVA, 2007; SAD, 2007; SANTOS et al., 2007; VIANA, 2008; SILVA, 2010; VISCARDI et al., 2010; MICHELOTTO JR, 2010; JORGE, 2011) e tem sido considerado de grande valia, já que representa um meio semiológico importante, ajudando no diagnóstico (SANCHES, 1998; LESSA et al., 2011). A citologia do lavado traqueal (LT) é considerada mais específica do que somente o exame endoscópico. Apesar do lavado broncoalveolar (LBA) ser um método bastante recomendado e utilizado para coleta de material para a avaliação citológica do trato respiratório posterior (SCHUMACHER e MOLL, 2011), Hoffman (2008) afirma que a realização deste procedimento, além de necessitar de sedação, exige que o animal permaneça em repouso nas 24 a 48 horas posteriores. No caso de animais atletas em atividade constante, esse repouso torna-se difícil de ser

15 14 executado. Nessas situações, o LT é apropriado, uma vez que não há necessidade de repouso após a realização do procedimento, não interferindo no treinamento. As técnicas diagnósticas rotineiramente utilizadas podem apresentar resultados falso-negativos, o que aumenta a necessidade de incorporação de novos métodos que levem à melhoria da eficácia no diagnóstico e, por conseguinte, na terapêutica. Portanto, é necessário estabelecer e implementar como rotina na clínica médica de equinos a utilização de outros marcadores de processos inflamatórios pulmonares como, por exemplo, a atividade das enzimas e, dentre elas, a fosfatase alcalina (FAL). Tais marcadores podem, de forma segura, complementar as informações obtidas pelas técnicas diagnósticas já consagradas. O fluido epitelial contém elementos celulares e moleculares como, por exemplo, enzimas e imunoglobulinas, que podem ser utilizados para a avaliação da integridade do trato (SILVA et al., 2010). Pesquisadores já demonstraram a importância clínica da utilização da determinação da atividade da FAL no trato respiratório posterior como ferramenta diagnóstica em várias espécies (HENDERSON et al., 1995; CAPELLI et al., 1997; COBBEN et al., 1999a; COBBEN et al., 1999b; MADEN et al., 2001). Na espécie equina, Jorge (2011) constatou diminuição da atividade da FAL no LBA de equinos com citologia compatível com Doença Inflamatória das Vias Aéreas (DIVA), não havendo informação sobre este assunto, até o momento, para LT. Em face do que foi previamente exposto, a determinação da atividade da FAL no fluido epitelial traqueal (FET) de equinos é importante para o estabelecimento de valores que futuramente possam ser utilizados na complementação do diagnóstico de enfermidades pulmonares. Neste contexto, este estudo teve por objetivo determinar a atividade da enzima FAL no FET de equinos adultos clinicamente sadios, utilizados em policiamento montado no Estado do Rio de Janeiro, alocados em três categorias de acordo com os escores endoscópicos e perfil citológico traqueais.

16 15 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Enfermidades não infecciosas do trato respiratório posterior são comuns e geralmente limitam o desempenho atlético do cavalo (RUSH e MAIR, 2004). As doenças inflamatórias pulmonares possuem alta prevalência em equinos e podem estar associadas tanto ao manejo ambiental quanto às condições de trabalho (VAN ERCK, 2009). As síndromes inflamatórias que afetam o trato respiratório posterior têm recebido diversas nomenclaturas nos últimos anos, o que indica uma falta de compreensão da fisiopatologia dessas síndromes e suas inter-relações. Nos consensos internacionais de e de foram definidos três fenótipos distintos para estas doenças das vias aéreas: Obstrução Recorrente das Vias Aéreas (ORVA), DIVA de cavalos de corrida e DIVA de cavalos de lazer. Estas definições mais precisas do fenótipo têm ajudado a esclarecer a patogênese das doenças das vias aéreas (ROBINSON, 2008). Lessa et al. (2008) caracterizaram clinicamente a DIVA nos cavalos da Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro (PMERJ) como assintomática e justificaram o fato devido ao trabalho de menor intensidade aeróbica realizado no policiamento montado ou instruções de montaria. O histórico detalhado do animal associado a um minucioso exame físico é essencial para um diagnóstico preciso, mas algumas doenças respiratórias progridem de forma assintomática e requerem técnicas adicionais de investigação (VAN ERCK, 2009). O exame endoscópico permite a visualização direta do trato respiratório anterior, traqueia e entrada dos brônquios principais (RUSH e MAIR, 2004). Além de 1 International Workshop on Equine Chronic Airway Disease, Michigan StateUniversity, 16-18Jun Inflammatory airway disease: defining the syndrome, Havemeyer Foundation, 30sep-3oct 2002.

17 16 possibilitar a avaliação da superfície da mucosa respiratória e da secreção traqueal, a endoscopia também viabiliza a coleta guiada de secreções da traqueia e brônquios para posterior avaliação citológica e bacteriológica (HODGSON e HODGSON, 2002). Gerber et al. (2004a) demonstraram que a estratificação do acúmulo de muco na traqueia baseada em uma avaliação endoscópica semiquantitativa (escore) apresentou correlação significativa com o percentual de neutrófilos verificado à citologia broncoalveolar, sendo considerada uma ferramenta clínica e de pesquisa confiável para o diagnóstico de afecções inflamatórias do trato respiratório posterior dos equinos. Porém, é subjetiva e sujeita a variações de resultados que dependem do momento do exame (antes ou após exercício) e da interpretação de quem realiza o exame, e por isso deve ser avaliado com cuidado. A avaliação das secreções do trato respiratório posterior tem um papel vital tanto para o manejo dos animais clinicamente doentes quanto para o progresso na compreensão da fisiopatologia respiratória, especialmente com o desenvolvimento de novas ferramentas de pesquisa (HEWSON e VIEL, 2002). As duas técnicas mais importantes para avaliação das secreções do trato respiratório posterior são o LT e o LBA (RUSH e MAIR, 2004). Greet (1982) descreveu o método de coleta do LT em equinos via endoscópio. Segundo Hodgson e Hodgson (2003) este método tem se tornado popular, sendo considerado uma boa alternativa para coleta de material da traqueia. Além de ser uma técnica não invasiva, ainda permite que o cateter seja guiado e proporciona a inspeção do trato respiratório na hora da coleta de material, possibilitando a avaliação da traqueia (grau de hiperemia) e conteúdo luminal (quantidade e qualidade de secreção traqueal), dados que podem auxiliar na interpretação dos resultados citológicos. Apesar de o LT ser uma técnica simples, de baixo custo e segura para coleta de componentes celulares e moleculares dos pulmões, a quantidade de fluido que retorna é variável (PORTO et al., 2010). A instilação de solução isotônica para a realização do LT resulta numa diluição significativa do FET (SILVA et al., 2010). Por isso, para determinar a atividade enzimática no LT é preciso corrigir a diluição causada pelo mesmo. A ureia é comumente utilizada como marcador endógeno de diluição devido ao seu livre trânsito pelas membranas biológicas, estando em equilíbrio no plasma e no FET (McGORUM et al., 1993).

18 17 Estudos avaliando enzimas celulares como marcadoras de afecções pulmonares já foram realizados em ratos (HENDERSON et al., 1995), camundongos (BEHNIA et al., 1996), caninos (MADEN et al., 2001), equinos (ART et al., 2006; JORGE, 2011) e em seres humanos (COBBEN et al., 1999a; COBBEN et al., 1999b; KUBOTA e HARUTA, 2006). As fosfatases (EC ) têm função hidrolítica, responsável pela remoção do grupamento fosfato de vários tipos de moléculas (KANEKO, 1989). Elas são classificadas em dois grupos: FAL e fosfatase ácida, de acordo com seu ph ótimo em regiões com ph alcalino ou ácido, respectivamente. Nos mamíferos a FAL é encontrada no fígado, intestino, placenta, rins (SEKIGUCHI et al., 2011) e ossos (KANEKO, 1989). Sua atividade sérica vem sendo utilizada como indicador de lesão hepática desde a década de 20 (KALINA et al., 1990). A localização da enzima dentro da célula interfere na sua liberação para o sangue. Enzimas de membrana como a FAL não são solúveis, estão firmemente ligadas à membrana celular, e podem ser liberadas após um dano severo. Entretanto, elas são detectadas no sangue usualmente após uma estimulação para o aumento na produção (MEYER et al., 1995). Segundo Jain (1993), a FAL pode ser encontrada em abundância nos neutrófilos maduros. Em seres humanos adultos saudáveis, a maior parte da atividade da FAL sanguínea é proveniente da FAL hepática e óssea e em diversos pacientes os neutrófilos foram relacionados como fonte de aumento da atividade da FAL no soro sanguíneo. A fosfatase alcalina dos neutrófilos (FAN) é detectada em neutrófilos e monócitos diferenciados, e sua atividade in vitro aumenta com a exposição dos neutrófilos ao fator estimulante de colônia de granulócitos (IZUMI et al., 2005). Segundo Bednarska et al. (2006), a FAN localiza-se em vesículas secretoras e vai para a membrana celular após a estimulação da célula. Apesar do papel biológico da FAN permanecer incerto, ela é usada como marcador para maturação granulocítica, e vem sendo útil no diagnóstico de algumas doenças hematológicas. Acredita-se, ainda, que nas doenças bacterianas ocorra aumento da atividade da FAN, enquanto que nas virais esta atividade diminua. Entretanto, Kubota e Haruta (2006) observaram variação na atividade desta enzima em diferentes tipos de infecções respiratórias virais em humanos, sendo inclusive, elevada nos casos de adenovírus e do vírus sincicial.

19 18 Estudos indicam alta atividade da FAL nos pneumócitos do tipo II de seções de tecido pulmonar, bem como em cultivos deste tipo celular. Esta atividade parece estar relacionada com a síntese de compostos fosfolipídicos e proteicos da substância surfactante pulmonar (KALINA et al., 1990). As alterações encontradas na atividade da FAL no LBA durante a resposta inflamatória pulmonar são difíceis de serem interpretadas devido às incertezas sobre a sua origem e os mecanismos que envolvem sua liberação no fluido epitelial pulmonar. Existem pelo menos três principais fontes potenciais de FAL no fluido epitelial pulmonar: secreções das células tipo II, transudato das proteínas sanguíneas e neutrófilos, sendo as duas últimas especialmente importantes no pulmão inflamado, devido ao aumento da permeabilidade da barreira capilar alveolar e influxo de neutrófilos (HENDERSON et al., 1995). Sanchez et al. (2000) encontraram, ao realizar eletroforese das isoenzimas da FAL sérica de pacientes com pneumopatias, uma banda isoenzimática única, correspondente à mesma fração molecular no fluido do LBA. Capelli et al. (1997) realizaram um estudo em 140 pacientes humanos para avaliar a atividade da FAL no LBA como marcador de fibrose em enfermidades pulmonares intersticiais crônicas e concluíram que o aumento da relação FAL:albumina no LBA pode refletir a progressão de fibrose nesses pacientes. Cobben et al. (1999a) constataram aumento das atividades da FAL e da lactato desidrogenase no LBA de seres humanos com pneumonia ou fibrose pulmonar que tinham predominância de polimorfonucleares no LBA. Esses autores observaram que a atividade das enzimas obtidas por meio desse procedimento pode ser útil como indicador de morte e lesão celular, sendo a atividade da FAL associada à lesão ou ao estímulo de células do tipo II. Eles concluíram que não houve relação entre a atividade da FAL e as células presentes no lavado, sugerindo que esta enzima origina-se de células que não estão presentes no LBA. Em outro estudo com pacientes humanos com doenças pulmonares com e sem sinais de infecção pulmonar, Cobben et al. (1999b) perceberam que, apesar de haver um aumento da atividade da FAL em todos os pacientes, não houve diferença estatística entre os grupos, ao contrário da atividade da lactato desidrogenase, que foi significativamente mais elevada no grupo de pacientes com infecção. O aumento significativo da atividade da FAL no LBA de ratos com inflamação pulmonar induzida por instilação intra-traqueal de endotoxinas parece estar

20 19 associado a uma lesão aguda e ao aumento da secreção de surfactante em resposta à inativação do surfactante alveolar pela transudação de proteína sérica no tecido pulmonar lesado. Esta informação, associada aos resultados de outros estudos da FAL na região alveolar, indica que a maior fonte de aumento da atividade da FAL no LBA está nos pneumócitos tipo II (HENDERSON et al., 1995). Maden et al. (2001) observaram aumento significativo das atividades de lactato desidrogenase e FAL no LBA de cães com broncopneumonia, mostrando a relevância da atividade destas enzimas no LBA como indicadora de inflamação e/ou lesão pulmonar. Estes autores observaram ainda aumento não significativo da atividade destas enzimas no grupo de cães com traqueobronquite, e sugeriram que o exame do LBA é útil no diagnóstico de enfermidades pulmonares. Em um estudo com equinos da PMERJ, Jorge (2011) detectou redução da atividade da FAL no fluido epitelial pulmonar dos animais do grupo com DIVA em relação ao grupo sadio. A autora concluiu que a determinação da atividade desta enzima no LBA pode ser usada como complementação no diagnóstico da DIVA em equinos adultos, sem queixa clínica, com o mesmo perfil de trabalho e citologia broncoalveolar compatível com essa enfermidade, sobretudo nos casos com escore endoscópico de secreção traqueal intermediário (grau 2 e grau 3).

21 20 3. MATERIAL E MÉTODO Este trabalho foi realizado de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal. Obteve a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA/UFF), sob nº 00124/11 e autorização da Diretoria Geral de Saúde da Polícia Militar do Estado do Rio de Janeiro (DGS PMERJ), bem como do Comando do Regimento de Polícia Montada Coronel Enyr Cony dos Santos (RPMont/CECS) Animais Foram utilizados 36 equinos adultos, do sexo masculino, sem raça definida, com idade entre cinco e 14 anos, pesando em média 468 Kg. Esses animais (apêndice A), pertencentes à PMERJ, eram usados em policiamento montado e instrução de montaria. Foram mantidos semiestabulados diariamente em baias de 6m 2, sem cama, das cinco às 15 horas (figura 1), e o restante do período soltos em piquetes (figura 2), com água ad libitum. Eram alimentados com seis kg/animal de ração comercial 12% de proteína bruta e 12 kg/animal de Capim-Angola (Brachiaria mutica) cortado. Todos os cavalos foram submetidos ao calendário profilático da Corporação: vermifugação trimestral; vacinação semestral contra influenza, rinopneumonite, encefalomielite equina leste e oeste, e anual contra tétano e raiva; e controle de anemia infecciosa equina segundo as normas vigentes do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Nos dois meses anteriores à realização do experimento os animais não estiveram sob nenhum tipo de tratamento, nem foram relatados sinais de doenças respiratórias.

22 21 Fig. 1 - Equinos da PMERJ alojados em baias durante o dia. RPMont/CECS, Fig.2 - Equinos da PMERJ soltos em piquete. Esquadrão Escola de Cavalaria, Para a seleção dos cavalos foram realizados exames físicos (apêndice B), com especial ênfase no exame do aparelho respiratório, sendo os achados para percussão e auscultação pulmonares considerados normais baseando-se em McGorum et al. (2002). Não foram observadas alterações no exame clínico sugestivas de doença respiratória ou infecciosa e nem foram relatadas queixas de queda de performance em nenhum dos animais selecionados, No momento do experimento, todos os equinos estavam com valores de hematócrito, proteína plasmática total, fibrinogênio plasmático (apêndice C) e leucograma (apêndice D) dentro da normalidade segundo Jain (1993). Para avaliação funcional pulmonar foram mensuradas as pressões parciais de oxigênio (PaO 2 ) e gás carbônico (PaCO 2 ) (apêndice E), cujos valores podem ser observados no apêndice E, sendo considerados como valores de referência de Van Erck et al. (2005) e Doherty e Valverde (2006), respectivamente. Os equinos foram então submetidos ao exame endoscópico do trato respiratório para a quantificação da secreção traqueal e coleta do LT para realização da citologia e dosagem da FAL. Com base nos resultados dos exames endoscópicos e citológicos foram criadas três categorias: endoscopia, citologia e endoscopia + citologia (vide seção 3.3.).

23 22 Baseando-se em Lessa et al. (2008) e Robinson (2008), os animais com perfil compatível com inflamação aqui estudados poderiam se enquadrar na categoria de DIVA de cavalos de lazer. Entretanto, como pelo escore endoscópico e pela contagem diferencial da citologia traqueal não é possível diferenciar as síndromes inflamatórias pulmonares, atribuiu-se o termo inflamação do trato respiratório posterior, ao invés de DIVA Exames realizados Exame Endoscópico A avaliação endoscópica foi realizada sem exercício prévio dos animais, utilizando-se fibroscópio de 13,3mm de diâmetro externo, 3,2mm de canal de trabalho e 168cm de comprimento (colonofibroscópio Olympus modelo CF-10L, Olympus Optical do Brasil, Ltda). O trato respiratório foi avaliado desde os meatos nasais até a traqueia, sendo esta considerada normal quando estava com a mucosa brilhante, íntegra e de coloração pálida e carina com aspecto afiado. Foi adotado o escore endoscópico descrito por Gerber et al. (2004a) para a quantificação de secreção observada na traqueia, conforme abaixo relacionado, assim como foi assinalada a presença de qualquer sinal flogístico. Escore 0 (E0) Nenhuma secreção aparente; Escore 1 (E1) Pequenos e poucos pontos de secreção; Escore 2 (E2) Um número maior ou pontos maiores de secreção, podendo vir a formar confluência; Escore 3 (E3) Presença de confluência de secreção na face ventral do lúmen traqueal, podendo haver poças de secreção ao redor; Escore 4 (E4) Presença profusa de secreção traqueal ocupando 25% de toda sua extensão e circunferência, e Escore 5 (E5) - Presença profusa de secreção traqueal ocupando mais que 25% de toda sua extensão.

24 Exames Laboratoriais a) Amostras sanguíneas: as amostras de sangue venoso foram coletadas por venopunção da jugular, utilizando-se tubos a vácuo (Vacutainer ) e agulhas hipodérmicas 0,80x25mm (21G). As amostras de sangue arterial foram obtidas por punção da artéria facial transversa (figura 3) com agulha hipodérmica 0,55x20mm (24G) segundo a técnica descrita por Taylor (1981). Fig. 3 Coleta de sangue da artéria facial transversa de um dos equinos do experimento para realização da hemogasometria. Esquadrão Escola de Cavalaria Subseção de Veterinária, Hematócrito, leucograma, dosagem de proteína e fibrinogênio plasmático: sangue coletado em tubos a vácuo com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 10% na proporção de 0,1mL para cada 5mL de sangue. Estes exames foram executados conforme as metodologias descritas por Jain (1993). Ureia sérica: sangue coletado em tubos a vácuo sem anticoagulante no momento da realização do LT e mantidos à temperatura ambiente até coagular. Em seguida, os tubos foram centrifugados para separação do soro sanguíneo, que foi estocado em micro tubos entre -14º e -18ºC. A concentração da ureia foi determinada por meio de espectrofotometria (Analisador bioquímico semiautomático Bioplus 2000 ), utilizando-se kits Ureia UV (Analisa ). Pressão parcial de Oxigênio (PaO 2 ) e de Gás Carbônico (PaCO 2 ): as amostras de sangue arterial foram coletadas em seringas plásticas estéreis de 3mL (BD Plastipak ), sem anticoagulante e processadas imediatamente em analisador contínuo portátil i-stat (Roche ) com a utilização do cartucho i-stat EG7+ (figura 4).

25 24 A B Fig. 4 Realização do exame de hemogasometria. Preenchimento do cartucho EG7+ com o sangue arterial coletado de um dos equinos do experimento (A). Resultado de um dos exames processados no analisador contínuo portátil i-stat (Roche ) (B). Esquadrão Escola de Cavalaria Subseção de Veterinária, b) Lavado Traqueal (LT): os animais foram colocados em brete e contidos com cachimbo e, quando necessário, sedados com cloridrato de Xilazina a 2% (Coopazine ), na dosagem de 0,5-1,1mg/Kg, via endovenosa. O endoscópio, com um cateter de polietileno no seu canal de trabalho, foi introduzido pelo meato nasal ventral da narina em direção à traqueia (figura 5A). O cateter foi posicionado na porção distal da traqueia, anterior à carina, de acordo com técnica utilizada por Whitwell e Greet (1984). Foram instilados 20mL de solução salina estéril (figura 5B) com uso de seringas plásticas estéreis de 20mL (Injex ) e realizada imediata aspiração (figura 5C). As amostras foram consideradas adequadas quando se observou presença de turvação, de partículas suspensas e/ou de filamentos de muco (figura 5D). O lavado obtido permaneceu refrigerado (4-8º C) em tubos cônicos de 50mL (figura 5E) até o momento do processamento, que não ultrapassou quatro horas pós coleta.

26 25 A B C Fig. 5 Realização de exame endoscópico e coleta do LT: endoscópio, com um cateter de polietileno no seu canal de trabalho, introduzido pelo meato nasal ventral da narina em direção à traqueia (A). Instilação de solução salina estéril com uso de seringa plástica (B) e imediata aspiração (C) e armazenamento em tubos cônicos de 50mL (D). Amostras consideradas adequadas: presença de turvação, de partículas suspensas e/ou muco (E). Esquadrão Escola de Cavalaria Subseção de Veterinária, D E Citologia do LT: alíquotas de 200µL da suspensão celular do LT foram submetidas à citocentrifugação a 110g por cinco minutos (centrífuga Serocito modelo 2400 FANEM ), de acordo com Hoffman (2008). As lâminas confeccionadas foram fixadas com metanol e coradas com o corante Giemsa. A leitura foi realizada em microscópio óptico com objetiva de imersão de 100X, sendo analisados os tipos celulares com a contagem de 300 células nucleadas (figuras 6).

27 26 L m M m M N L CE CE GC A Fig. 6 - Fotomicrografia digitalizada de citologia do LT de um equino sadio (A) e de um equino com perfil citológico compatível com inflamação do trato respiratório posterior (B). Presença de neutrófilos (N), células epiteliais (CE), célula epitelial caliciforme (GC), linfócitos (L), macrófagos (M) e muco (m). Coloração de Giemsa. Microscopia ótica, aumento de 400x (A)/1000x (B). Laboratório de Patologia Clínica/UFF, B Atividade da FAL e concentração da ureia: foram realizadas em alíquotas do sobrenadante do LT, centrifugadas a 800g por cinco minutos (centrífuga FANEM modelo 206R). Em seguida, as amostras foram acondicionadas em criotubos e preservadas no nitrogênio líquido (-196 C) para posterior determinação da atividade da FAL (JORGE, 2011). Para a dosagem da concentração de ureia no LT, as amostras foram estocadas em micro tubos entre -14 e -18 C. Todas as amostras foram analisadas dentro do período de dois meses por espectrofotometria (analisador bioquímico semiautomático Bioplus 2000 ), utilizando-se kits Fosfatase Alcalina (Analisa ) e Ureia UV (Analisa ), respectivamente. As determinações da concentração da ureia no soro sanguíneo e no sobrenadante do LT foram necessárias para corrigir a diluição causada pelo LT e estimar a atividade da FAL no FET. Para calcular a atividade da FAL no FET foi utilizada a seguinte fórmula (PORTO et al., 2010): FAL no FET = FAL dosada no LT x Fator para correção da diluição (FD), onde: FD = Ureia no soro sanguíneo Ureia no sobrenadante do LT

28 Critérios para a formação dos grupos Os 36 equinos selecionados foram organizados em três categorias (figura 7) e divididos em sadios e/ou com inflamação (tabela 1) de acordo com os resultados da endoscopia (categoria 1), da citologia traqueal (categoria 2) e da combinação dos resultados destes dois exames (categoria 3) conforme explicitado a seguir. Fig. 7 Esquema explicativo com a formação e divisão das três categorias nas quais foram organizados e classificados os 36 equinos estudados neste experimento. Rio de Janeiro, 2012.

29 Tabela 1 Relação dos 36 equinos estudados com seus respectivos resultados de escore endoscópico de muco traqueal e citologia do LT e sua classificação em cada categoria. Rio de Janeiro/RJ, setembro-dezembro 2010/2011. Escore Citologia Animal Endoscópico Traqueal Categoria 1 Categoria 2 Categoria 3 01 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 02 Normal Normal GE1 GC1 G1 03 Normal Normal GE1 GC1 G1 04 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 05 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 06 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 07 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 08 Normal Normal GE1 GC1 G1 09 Normal Normal GE1 GC1 G1 10 Normal Normal GE1 GC1 G1 11 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 12 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 13 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 14 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 15 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 16 Normal Normal GE1 GC1 G1 17 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 18 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 19 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 20 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 21 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 22 Normal Normal GE1 GC1 G1 23 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 24 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 25 Normal Normal GE1 GC1 G1 26 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 27 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 28 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 29 Normal Inflamado GE1 GC2 G2 30 Normal Normal GE1 GC1 G1 31 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 32 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 33 Inflamado Normal GE2 GC1 G3 34 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 35 Inflamado Inflamado GE2 GC2 G4 36 Normal Normal GE1 GC1 G Categoria 1 - Endoscopia A avaliação semi-quantitativa do muco traqueal (escore) durante o exame endoscópico variou de E0 a E3 nos 36 animais estudados (apêndice F). Baseandose na gradação estabelecida por Gerber et al. (2004a), nesta categoria foram criados dois grupos:

30 29 a) Grupo endoscopia 1 (GE1) - cavalos considerados sadios (E0 ou E1): dezenove (52,78%) dos 36 animais estudados tinham E0 ou E1 de secreção traqueal b) Grupo endoscopia 2 (GE2) - cavalos com escore compatível com inflamação do trato respiratório posterior (E 2): dos 36 animais estudados, 17 (47,22%) tinham E2 ou E3 de secreção traqueal Categoria 2 - Citologia Nesta categoria, os 36 animais estudados foram divididos de acordo com os resultados da citologia traqueal (apêndice G), segundo o consenso de Havemeyer, ratificado por Robinson (2003): a) Grupo citologia 1 (GC1) - cavalos considerados sadios (eosinófilos < 1% e neutrófilos < 20%): dezoito (50%) dos 36 animais estudados apresentaram perfil citológico dentro dos valores de normalidade. b) Grupo citologia 2 (GC2) - cavalos com perfil citológico compatível com inflamação do trato respiratório posterior (eosinófilos 1% e/ou neutrófilos 20%): dos 36 animais estudados, 18 (50%) tinham infiltrado eosinofílico e/ou neutrofílico Categoria 3 Endoscopia + citologia Nesta categoria foram combinados os resultados de escore endoscópico (E) e perfil citológico traqueal de cada animal (tabela 1), e os 36 equinos foram divididos em quatro grupos: a) Grupo 1 (G1) - equinos com escore endoscópico e perfil citológico normais: dez equinos (27,78%) foram considerados sadios tanto pelo exame endoscópico (E<2) quanto pelo citológico (eosinófilo<1% e neutrófilo <20%). b) Grupo 2 (G2) - equinos com escore endoscópico normal e perfil citológico compatível com inflamação do trato respiratório posterior: nove equinos (25%) com E<2 de secreção traqueal estavam com infiltrado eosinofílico e/ou neutrofílico na citologia traqueal.

31 30 c) Grupo 3 (G3) - equinos com escore endoscópico compatível com inflamação do trato respiratório posterior e perfil citológico normal: oito equinos (22,22%) com E 2 de secreção traqueal foram considerados citologicamente sadios (eosinófilo<1% e neutrófilo <20%). d) Grupo 4 (G4) - equinos com escore endoscópico e perfil citológico compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior: nove equinos (25%) tinham perfil compatível com inflamação do trato respiratório posterior tanto no exame endoscópico (E 2) quanto no citológico (eosinófilo 1% e/ou neutrófilo 20%) Análise Estatística A análise estatística da atividade da FAL no LT foi realizada com o auxílio do programa computacional SPSS versão 13, aplicando-se os testes não paramétricos de Mann-Whitney para comparar os grupos da categoria 1 (GE1 e GE2) e da categoria 2 (GC1 e GC2) independentemente e de Kruskal-Wallis para comparar os quatro grupos (G1, G2, G3 e G4) da categoria 3, sendo considerado o nível de significância de 5% para ambos os testes. Para comparar os grupos G1, G2, G3 e G4 dois a dois foi utilizado o teste de Mann-Whitney, com o nível de significância de 1,25%.

32 31 4. RESULTADOS Os valores da atividade da FAL no LT dos 36 equinos estudados podem ser observados no apêndice H. Observou-se aumento na atividade da FAL no LT dos cavalos com achados compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior (GE2, GC2, G4) em relação aos cavalos considerados sadios (GE1, GC1 e G1, respectivamente), sendo esta diferença estatisticamente significativa (P=0,021) entre os grupos de animais com perfil citológico compatível com inflamação (GC2) e grupo citologicamente sadio (GC1) Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 1 (GE1 e GE2) Ao comparar os valores da atividade da FAL entre os grupos da categoria 1 (tabela 2), foi observado um aumento desta atividade no grupo com escore endoscópico compatível com inflamação do trato respiratório posterior (GE2) em relação ao grupo com escore endoscópico normal (GE1), entretanto com os dados obtidos não foi possível afirmar que exista uma diferença estatística (P=0,051). Tabela 2 - Atividade da FAL em U/L no LT dos equinos na categoria 1 (GE1 e GE2), descrita em média e desvio padrão. Rio de Janeiro/RJ, set-dez 2010/2011. GE1 (n= 19) GE2 (n = 17) Média 12511, ,11 + Desvio Padrão 9958, ,18 + Existe uma tendência a apresentar diferença estatisticamente significativa (P=0,051).

33 Atividade da FAL no LT dos animais na categoria 2 (GC1 e GC2) Dentro da categoria 2 (tabela 3), houve diferença estatística (P= 0,021) entre os grupos com perfil citológico normal (GC1) e com perfil citológico compatível com inflamação do trato respiratório posterior (GC2), sendo observado aumento da atividade da FAL no GC2. Tabela 3 - Atividade da FAL em U/L no LT dos equinos na categoria 2 (GC1 e GC2), descrita em média e desvio padrão, Rio de Janeiro/RJ, set-dez 2010/2011. GC1 (n= 18) GC2 (n = 18) Média 10282,85* 18865,05* Desvio Padrão 5856, ,40 * Existe diferença estatisticamente significativa (P<0,05) Atividade da FAL dos animais na categoria 3 (G1, G2, G3 e G4) Foi observada diferença significativa (P=0,034) na atividade da FAL (tabela 4) entre os quatro grupos. Ao comparar os grupos dois a dois não é possível afirmar que exista diferença estatística entre eles, embora haja uma tendência (P=0,022) ao comparar a atividade desta enzima entre os G1 e G4. Tabela 4 - Atividade da FAL em U/L no LT dos equinos na categoria 3 (G1, G2, G3 e G4), descrita em média e desvio padrão, Rio de Janeiro/RJ, setembrodezembro 2010/2011. G1 (n= 10) G2 (n = 9) G3 (n= 8) G4 (n = 9) Média ,38 + * 17007, , ,03 + * Desvio Padrão 5922, , , ,87 + Existe diferença significativa entre os quatro grupos (P<0,05) pelo teste de Kruskal-Wallis. * Existe uma tendência a apresentar diferença estatisticamente significativa (P=0,022) entre G1 e G4 pelo teste de Mann-Whitney, considerando P=0,0125 para comparar os grupos dois a dois.

34 33 5. DISCUSSÃO Assim como observado por Capelli et al. (1997), Cobben et al. (1999a), Cobben et al. (1999b) e Maden et al. (2001) em estudos com LBA, neste experimento também foi observado aumento da atividade da FAL nos animais com achados compatíveis com inflamação do trato respiratório posterior, embora a dosagem tenha sido feita no LT. O aumento da atividade da FAL no GE2 quando comparada ao GE1 não teve diferença significativa. Mazan (2010) afirma que apesar da visualização endoscópica de muco traqueal ser o método mais conveniente e rápido para estudos a campo, este método é muito inespecífico sobre a natureza e a origem da inflamação. Além disso, Gerber et al. (2004b) consideram quantidades intermediárias de muco (E2 e E3) achados inespecíficos, pois foram observadas tanto em animais sadios quanto nos doentes. Ratificando estas informações, salienta-se que todos os animais aqui utilizados foram considerados sadios ao exame físico, e não foram encontrados escores endoscópicos superiores ao E3. É possível afirmar que há uma tendência à diferença estatística (P=0,051), logo o aumento da atividade da FAL no GE2 é uma informação relevante, pois relaciona a FAL elevada à inflamação do trato respiratório posterior. Neste estudo foi escolhido utilizar como critério realizar o exame endoscópico sem exercitar os animais previamente. Como o exercício aumenta a quantidade de neutrófilos e de muco na traqueia (HODGSON, 2006; MALIKIDES et al., 2007), talvez se estes animais tivessem sido exercitados anteriormente ao exame, a gradação do escore endoscópico não seria a mesma e, consequentemente, o resultado da atividade da FAL pudesse ter diferença significativa. Segundo Michelotto Jr (2008), as amostras de LT devem ser coletadas entre 30 e 60 minutos após exercício para que tenham maior valor diagnóstico.