INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia. Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a Síndrome de Lynch

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1 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia Tatiane de Pinho Pastor Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a Síndrome de Lynch Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira Rio de Janeiro Setembro 2014

2 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia Tatiane de Pinho Pastor Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a Síndrome de Lynch Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Oncologia do Instituto Nacional de Câncer José de Alencar Gomes da Silva como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Oncologia Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira Rio de Janeiro Setembro 2014 ii

3 P293v Pastor, Tatiane de Pinho. Variantes de seqüência no gene MSH2 em pacientes selecionados para a Síndrome de Lynch. / Tatiane de Pinho Pastor. Rio de Janeiro, xviii, 94 f.: il. color. Dissertação (Mestrado em Oncologia) - Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, Orientador: Miguel Ângelo Martins Moreira. 1. Neoplasias Colorretais Hereditárias sem Polipose. 2. Gene MSH2. 3. Síndrome de Lynch. I. Moreira, Miguel Ângelo Martins. II. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. III. Título. CDD iii

4 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Pós-Graduação em Oncologia Tatiane de Pinho Pastor Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a Síndrome de Lynch Orientador: Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira Aprovada em: EXAMINADORES: Dr. Marcelo Alex de Carvalho Presidente Drª. Tatiana de Almeida Simão Drª. Cláudia Vitória de Moura Gallo Drª. Cynthia Chester Cardoso Suplente I Dr. Fernando Regla Vargas Suplente II Rio de Janeiro Setembro 2014 iv

5 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a Síndrome de Lynch RESUMO Dissertação de Mestrado Tatiane de Pinho Pastor A Síndrome de Lynch (SL) ou Câncer Colorretal Hereditário Não-Poliposo (HNPCC) é uma doença autossômica dominante associada a mutações na linhagem germinativa nos genes do Sistema Mismatch Repair (MMR) de reparo do DNA e é responsável por aproximadamente 5% de todos os casos de câncer colorretal (CCR). A maioria das mutações ocorre nos genes MSH2 (50%) e MLH1 (40%), e gera uma proteína truncada e não funcional. Mais de 513 alterações diferentes nos genes de reparo foram relatadas, sendo que 10% das encontradas no gene MSH2 envolvem a substituição de um aminoácido. O sistema de reparo MMR corrige erros de pareamento base\base, além de inserções e deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo de replicação, além de estar envolvido nos processos de recombinação, na geração da diversidade imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA. A inativação mutacional dos genes MMR leva a um reparo insuficiente do DNA e ao desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos níveis MSI. Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade precoce, além de possuírem um risco aumentado de desenvolver tumores extracolônicos. O principal objetivo desse estudo foi identificar variantes de sequência no gene MSH2 em pacientes selecionados para Síndrome de Lynch de acordo com os critérios de Amsterdam ou Bethesda modificados, avaliando a sensibilidade e especificidade dos mesmos para a presença de mutação. E para isso, foram selecionados candidatos provenientes de quatro centros clínicos e desses pacientes foram obtidos o sangue periférico para isolamento do DNA genômico. Os éxons do gene MSH2 foram amplificados e sequenciados através dos sequenciamentos automático de Sanger e sequenciamento de nova geração (NGS), além do sequenciamento da região promotora, para a identificação de mutações na linhagem germinativa. A partir da análise de variações de ponto no gene MSH2, identificamos um total de 6 variantes patogênicas ou potencialmente patogênicas (c. 388_389delCA; c.1046c>g; c.1738_1741delgaaa; c.2021g>a; c.2078g>a; c.2152c>t, sendo essa última em quatro pacientes), representando 46.1% das variantes identificadas neste estudo em 9 pacientes, sendo que 6 preenchiam os critérios de Amsterdam e 3 preenchiam os critérios de Bethesda, mostrando que os critérios de diagnóstico clínico são mais sensíveis e específicos para identificar a presença mutações patogênicas no gene MSH2. Além disso, identificamos também 3 variantes novas, sendo que duas delas (c.1738_1741delgaaa; c.2078g>a) foram classificadas como sendo patogênicas e uma não pode ser classificada (c.-185 C>A). Obtivemos uma frequência total de variantes missense de 55.5%, seguido de 22.2% de mutações frameshift, 11.1% de mutações nonsense e 11.1% de alterações sinônimas, além de alterações na região promotora e de íntron, mostrando que o espectro de variantes do gene MSH2 é bastante heterogêneo, englobando diferentes tipos de alterações. v

6 Ministério da Saúde Instituto Nacional de Câncer Coordenação de Pós-graduação INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER Variantes de Sequência no gene MSH2 em Pacientes Selecionados para a Síndrome de Lynch ABSTRACT Dissertação de Mestrado Tatiane de Pinho Pastor Lynch syndrome (SL) or Colorectal Cancer Hereditary nonpolyposis (HNPCC) is an autosomal dominant disease associated with germline mutations in the MMR genes of the DNA repair system and it is responsible for approximately 5% of all cases of colorectal cancer (CCR). Most of the mutations occur in the MSH2 (50%) and MLH1 genes (40%), and generates a truncated, nonfunctional protein. More than 513 different changes in repair genes have been reported, and 10% of those mutations can be found in the MSH2 gene causing substitution of one amino acid. The repair system MMR corrects mismatched nucleotides, insertions and deletions that occur during DNA synthesis, improving the fidelity of replication mechanism and it is also involved in the process of recombination in the generation of immune diversity and specific cellular response to DNA damage. Mutational inactivation of MMR genes leads to insufficient DNA repair and the development of tumors characterized by high levels of MSI. SL patients often develop colorectal cancer at an early age, and they also have an increased risk of developing extra colonic tumors. The main objective of this study was to identify sequence variants in the MSH2 gene in selected patients for Lynch syndrome according to the criteria of Amsterdam or modified Bethesda, assessing the sensitivity and specificity for the presence of the mutation. And for that, candidates from four clinical centers were selected, and genomic DNA were obtained from peripheral blood. The MSH2 exons and promoter region were amplified by PCR and sequenced by automatic DNA Sangersequencing and by Next Generation Sequencing. From the analysis of variations in the extent of MSH2 gene, we identified a total of 6 variants pathogenic or potentially pathogenic (c. 388_389delCA; c.1046c> G; c.1738_1741delgaaa; c.2021g> A, c.2078g> A; c.2152c> T, the latter being in four patients), representing 46.1% of the variants identified in this study in 9 patients, 6 fulfilled the Amsterdam criteria and three met the criteria of Bethesda, showing that the criteria for clinical diagnosis are more sensitive and specific for the presence of pathogenic mutations in the MSH2 gene. In addition, we identified three new variants, two of which (c.1738_1741delgaaa; c.2078g> A) were classified as pathogenic and one could not be classified (C-185 C> A). In the present study, we obtained an overall frequency of 55.5% missense variants, followed by 22.2% frameshift mutations, 11.1% nonsense mutations of and 11.1% of silent changes, and alterations in the promoter region and intron, showing that the spectrum of variants of the MSH2 gene is very heterogeneous, encompassing different types of changes. vi

7 Este trabalho foi realizado na Divisão de Genética da Coordenação de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer José de Alencar Gomes da Silva, sob Orientação do Dr. Miguel Ângelo, e contou com apoio Financeiro da FAPERJ, CNPq e INCT-Câncer. vii

8 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer a todas as pessoas que de alguma forma foram importantes para o desenvolvimento deste trabalho. Ao meu orientador Dr. Miguel Ângelo Martins Moreira pelos ensinamentos e direcionamentos que conduzem a minha formação profissional e que acrescentaram muito no desenvolvimento deste projeto. A toda minha família, em especial meus pais, minhas irmãs e meus sobrinhos, pelo estímulo constante nessa jornada, sempre me incentivando a continuar os meus estudos. Agradeço também por toda a orientação que me deram durante a vida, e por me ajudarem a enfrentar os obstáculos e transformações que a vida impõe. Ao Thiago, por sempre estar ao meu lado nos momentos alegres e por me incentivar nos momentos difíceis. A todos os centros participantes deste projeto, em especial a Dra. Patrícia Prolla, por estar sempre disposta a ajudar e a colaborar com qualquer coisa. Gostaria de agradecer aos companheiros do laboratório, pela grande ajuda no dia-a-dia e, principalmente, pelos nossos momentos de descontração. Um agradecimento especial à Shay, Ayslan, Carol, Karla e Albert por todo auxílio durante os experimentos. As minhas amigas da faculdade, Kélvia e Bia, um muitíssimo obrigada. Mesmo nos encontrando tão pouco, saibam que sempre serão minhas amigas e que podem contar comigo quando quiser! Aos pacientes participantes, sem os quais este trabalho não teria sido realizado, e aos seus familiares, por entenderem a importância das investigações genéticas. Por fim, um agradecimento às instituições de fomento: CNPq, FAPERJ e INCT-Cancer. viii

9 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A ADP Adenina Difosfato de Adenosina AP-1 Proteína Ativadora 1 ATP APC APAF ATR BRAF BER C Trifosfato de Adenosina Gene da Polipose Adenomatosa Familiar Polipose Adenomatosa Familiar Atenuada Gene da Ataxia Telangiectasia V-Raf Murine Sarcoma Viral Oncogene Homolog B Reparo por excisão de bases Citosina º C Grau Celsius CIN CIMP CpG CCR dntp DAB dssnp EDTA EPCAM Instabilidade Cromossômica Fenótipo metilador de ilhas CpG Regiões do DNA onde os nucleotídeos citosina e guanina ocorrem um ao lado do outro Câncer Colorretal Desoxirribonucleotídeo Fosfatado Diaminobenzidina Banco de dados de polimorfismos de nucleotídeos únicos Ácido Triacético Diamino Etileno Epithelial Cell Adhesion Molecule EXO1 Gene da exonuclease 1 F FAP FCCTX G HCPA HNPCC HR H3BO3 IHQ INCA Forward ou senso Polipose Adenomatosa Familiar Câncer colorretal familial tipo X Guanina Hospital das Clínicas de Porto Alegre Câncer Colorretal Hereditário Não Poliposo Reparo por recombinação homóloga Ácido bórico Imunohistoquímica Instituto Nacional de Câncer ix

10 InSiGHT IDLs JPS K-ras LBP-1 MLH MSH MMR International Society for Gastrointestinal Hereditary Tumors Loops de inserção/deleção Síndrome da Polipose Juvenil Familiar Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog Proteína líder tipo B1 Homólogo de MutL Homólogo de MutS Reparo de Erros de Pareamento MLH1 Human MutL Homolog 1 MSH2 Human MutS Homolog 2 MSH3 Human MutS Homolog 3 MSH6 Human MutS Homolog 6 MSI MSI-H MSI-L MSS MAPK MYH MgCl2 NaOH NGS NER NHEJ NF-1 Instabilidade de microssatélites Instabilidade de microssatélites de alto grau Instabilidade de microssatélites de baixo grau Ausência de instabilidade de microssatélitess Proteínas quinases ativadas por mitógenos MutY human homologue (E.coli) Cloreto de Magnésio Hidróxido de sódio Sequenciamento de nova geração Reparo por excisão de nucleotídeos Reparo por recombinação não-homóloga Fator de transcrição, também conhecido como proteína de ligação ao elemento TGGCA NF-E4 Nuclear Factor Erythroid 4 pb Pares de Base PMS2 Postmeiotic Segregation Increased 2 PMS1 Postmeiotic Segregation increased 1 PJS PI3K PCNA P Síndrome de Peutz-Jeghers Fosfatidilinositol-3-Cinase Antígeno nuclear de células em proliferação Braço curto de um cromossomo x

11 q Braço longo de um cromossomo R reverse ou anti-senso RER Fenótipo de erro de replicação RFC Human replication factor C SL Síndrome de Lynch STK11 Serine/threonine kinase 11 SP-1 Stimulating Protein 1 SUS Sistema Único de Saúde T Timina TP53 Proteína tumoral 53 TGF-β Transforming growth factor beta UV Variante não classificada UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul Uvr DNA Helicase II Wnt Wingless-type xi

12 LISTA DE FIGURAS 1.1. A evolução do câncer Estimativa de incidência do câncer Colorretal para o ano de Modelo Adenoma Carcinoma Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI Diagnósticos diferenciais para o CCR Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR Espectro mutacional dos genes MMR Diferentes funções das proteínas de reparo MMR MMR em eucariotos Localização do gene MSH2 no cromossomo Modelo estrutural do heterodímero MutSα Região promotora do gene MSH Fragmento de 571 pb amplificado Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 1 A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.23 C>T Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.573c>t Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 3. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.388_389del CA Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1046 C>G Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no éxon 6. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.965 G>A Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2021 G>A Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2152 C>T xii

13 4.8. Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 13. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.2078 G>A Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR do éxon 11. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.1738_1741del GAAA Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração c.-118 T>C em heterozigose. C) Sequência com a alteração c.-118 T>C em homozigose Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR da região promotora de MSH2. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Alteração c.-185 C>A em heterozigose Eletroferogramas gerados pelo sequenciamento do produto da PCR no íntron 1. A) Sequência selvagem do gene MSH2. B) Sequência com a alteração a alteração c C>G em heterozigose. C) Sequência com a alteração c C>G em homozigose xiii

14 LISTA DE QUADROS I.I. Critérios de Amsterdam I...10 I.II. Critérios de Amsterdam II...11 I.III. Critérios de Bethesda modificados LISTA DE TABELAS Tabela 3.1. Tabela 3.2. Tabela 3.3. Reagentes utilizados na reação de PCR e concentração utilizada para cada reação Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos éxons 1 a 16 do gene MSH Oligonucleotídeos utilizados para amplificar a região promotora do gene MSH Tabela 3.4. Tabela 4.1. Oligonucleotídeos e condições de ciclagem utilizados no sequenciamento de nova geração para amplificar o éxon 5 do gene MSH2, para o paciente Variantes de sequência identificadas nos 53 pacientes selecionados para Síndrome de Lynch Tabela 4.2. Classificação da patogenicidade da variante T8M por análises in sílico Tabela 4.3. Classificação da patogenicidade da variante P349R por análises in sílico Tabela 4.4. Classificação da patogenicidade da variante G322D por análises in sílico Tabela 4.5. Classificação da patogenicidade da variante G674D por análises in sílico Tabela 4.6. Classificação da patogenicidade da variante C693Y por análises in sílico Tabela 4.7. Classificação da variante c.-118 T>C Tabela 4.8. Classificação da variante c211+9 C>G Tabela 4.9. Média de cobertura base-base dos 16 amplicons para os pacientes 3 e GGC xiv

15 Tabela Tabela Tabela 5.1. Tabela 5.2. Resumo das alterações encontradas no Paciente 3 através do Sequenciamento de nova geração Resumo das alterações encontradas no Paciente GGC 1108 através do Sequenciamento de nova geração Resumo das variantes identificadas pelo sequenciamento de Sanger e de nova geração no gene MSH2 e suas classificações de acordo com o grupo InSiGHT e programas in sílico Características clínicas e epidemiológicas dos pacientes com alteração na região codificante do gene MSH xv

16 SUMÁRIO INTRODUÇÃO Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento Carcinogênese Colorretal Padrões de CCR Síndrome de Lynch Características clínicas Critérios de diagnóstico Testes genéticos de rastreamento Bases genéticas de SL Vias de reparo de DNA Sistema MMR MSH Estudos brasileiros sobre a SL OBJETIVOS Geral Específicos METODOLOGIA Pacientes Testes de rastreamento Teste de Instabilidade de microssatélites (MSI) Teste de Imunohistoquímica (IHQ) Extração de DNA a partir de sangue periférico Estimativas da concentração e da integridade do DNA Amplificação do gene MSH Regiões codificantes do gene MSH xvi

17 3.5.2 Região promotora do gene MSH Avaliação da qualidade dos fragmentos amplificados e do rendimento da reação Purificação dos produtos da PCR Sequenciamento Automático de Sanger Ferramentas eletrônicas Análise das variantes missense Análise da região promotora Sequenciamento de Nova Geração por síntese Preparação das bibliotecas Geração dos clusters Sequenciamento por síntese Análise dos dados RESULTADOS Caracterização dos pacientes incluídos Variantes identificadas através do Sequenciamento Automático de Sanger Variantes identificadas nas regiões codificantes do gene MSH Características das variantes encontradas nas regiões codificantes Variantes identificadas na região promotora do gene MSH Características das variantes encontradas na região promotora Variante identificada no íntron 1 do gene MSH Resultados do Sequenciamento de Nova Geração Média das coberturas dos amplicons Variantes identificadas através do Sequenciamento de Nova Geração xvii

18 DISCUSSÃO Variantes de sequência patogênicas ou possivelmente patogênicas Variantes de sequência não patogênicas Variantes de sequência não patogênicas ou benignas CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo Anexo xviii

19 INTRODUÇÃO: 1.1 Câncer Colorretal: Incidência e Desenvolvimento O câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de doenças que têm como característica comum o crescimento desordenado de células anormais com potencial invasivo e metastático. Sua origem se dá por condições multifatoriais, envolvendo fatores ambientais e hereditários, que podem agir em conjunto ou em sequência para promover o desenvolvimento e/ou a progressão tumoral (INCA, 2014). O câncer é resultado de um processo de múltiplas etapas, nas quais ocorrem alterações genéticas e epigenéticas que levam ao surgimento de um clone de células com vantagens proliferativas sobre as demais (HANAHAN; WEINBERG, 2000). Trata-se de uma doença complexa e heterogênea tanto em nível celular quanto em molecular, como resultado de profundas alterações metabólicas em programas genéticos que controlam a proliferação, apoptose, diferenciação, interação célula-célula e interação célula-matriz extracelular. As células tumorais podem apresentar múltiplas alterações genéticas, tais como deleções, inserções e translocações (SALK; FOX; LOEB, 2010), perda de heterozigosidade e instabilidade de microssatélites (FEARON, 2011). Estas alterações permitem que células normais escapem da sua regulação e passem a obter um fenótipo maligno, através da ativação de oncogenes e da inativação de genes supressores de tumor e genes de reparo do DNA (LIU; BODMER, 2005). Diversas mudanças fisiológicas podem ocorrer no processo de tumorigênese, tais como: (i) autossuficiência em sinais de crescimento, levando a uma proliferação descontrolada; (ii) evasão da morte celular programada; (iii) capacidade replicativa ilimitada, uma vez que as células cancerosas possuem a enzima telomerase ativa, o que evita o encurtamento dos telômeros; (iv) indução da angiogênese, promovendo a vascularização tumoral; e (v) capacidade de invasão e metástase, possibilitando a formação de tumores secundários (Fig.,1.1). (HANAHAN; WEINBERG, 2011). 1

20 DANOS NO DNA CAPACIDADE REPLICATIVA ILIMITADA EVASÃO DA APOPTOSE AUTOSSUFICIÊNCIA EM SINAIS DE CRESCIMENTO ANGIOGÊNESE INVASÃO MASSA TUMORAL METÁSTASE Figura 1.1. A evolução do câncer. Os danos no DNA que não foram reparados desencadeiam diversas modificações que levam à formação de tumores e metástase. Adaptado de SALK et al., O câncer representa uma das principais causas de morte no mundo e constitui, assim, um sério problema de saúde pública para países desenvolvidos e também para os em desenvolvimento. Em 2030, estima-se que ocorrerão 21,4 milhões de casos novos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do crescimento e do envelhecimento da população (INCA, 2014). O câncer colorretal (CCR), segundo o Instituto Nacional de Câncer (INCA), é o terceiro tipo de câncer mais comum no mundo em homens e o segundo mais comum nas mulheres. Mais da metade dos casos são provenientes de regiões mais desenvolvidas, porém mais recentemente, a incidência de CCR tem aumentado em áreas antes consideradas de baixo risco e acredita-se que isso se deva ao envelhecimento da população, à adoção de estilos de vida mais sedentários e ao consumo de dietas pouco saudáveis (FRANCO; FRANCO, 2005). Essa neoplasia é considerada de bom prognóstico se a doença for diagnosticada em estágios iniciais e apresenta uma sobrevida de aproximadamente 55%. No Brasil, o CCR está entre as seis neoplasias malignas mais comuns sendo o terceiro em mortalidade no sexo masculino e o segundo no sexo feminino (desconsiderando os tumores de pele não-melanoma). Estimam-se, para 2014, casos novos de câncer de cólon e reto em homens e em mulheres (INCA, 2014) (Fig., 1.2). 2

21 Figura 1.2. Estimativa de incidência do câncer colorretal para o ano de2014 (Fonte: Instituto Nacional de Câncer, 2014). Entre os fatores de risco conhecidos para esta neoplasia estão a dieta (rica em gordura e com baixa ingestão de frutas, vegetais e cereais), o estilo de vida, a predisposição genética para doenças inflamatórias intestinais, a história familiar e a idade, visto que tanto a incidência quanto a mortalidade aumentam de maneira proporcional à idade (VAN DEN BRANDT; GOLDBOHM, 2006; GIL; CASALI, 2011). E os fatores protetores mais importantes são a atividade física (SAMAD et al., 2005) e o consumo de alimentos que contêm fibra, tais como: frutas, hortaliças (legumes e verduras) e cereais integrais (INCA, 2014). 1.2 Carcinogênese Colorretal A carcinogênese colorretal é a melhor compreendida dentre as neoplasias humanas e se caracteriza pelo acúmulo de mutações e alterações epigenéticas em diversos genes associados ao câncer: supressores de tumor, oncogenes e genes de reparo de erros de pareamento do DNA (mismatch repair MMR), resultando em expansão clonal e acarretando a formação de lesões neoplásicas benignas ou malignas (FUJIWARA et al., 1998). Além destas mutações, acreditase que um fenótipo geneticamente instável seja necessário para o desenvolvimento do tumor (MARKOWITZ, 1999). O desenvolvimento de tumores colorretais se dá de forma progressiva e envolve diferentes alterações que levam a uma transformação do epitélio colônico normal em adenomatoso intermediário e posteriormente em adenocarcinoma (modelo adenoma carcinoma proposto por Fearon e Vogelstein) (GRADY; PRITCHARD, 2013) (Fig., 1.3). 3

22 VIA CIN/MSS APC K-RAS/ BRAF TP53 PERDA DE 18q EPITÉLIO NORMAL EPITÉLIO DISPLÁSICO ADENOMA PEQUENO ADENOMA GRANDE CÂNCER CÂNCER METASTÁTICO VIA MSI INATIVAÇÃO DOS GENES MMR VIA CIMP Figura 1.3. Modelo Adenoma Carcinoma. A carcinogênese colorretal está associada a três diferentes vias de instabilidade. A via de instabilidade cromossômica (CIN) é caracterizada pela aquisição de mutações no gene supressor tumoral APC, levando à sua downregulação, frequentes mutações de ativação do oncogene K-RAS nos estágios iniciais da progressão tumoral, perda de heterozigosidade no cromossomo 18q nos estágios mais avançados e mutação no gene supressor de tumor TP53. Em contraste, tumores esporádicos com instasbilidade de microssatélites (MSI) frequentemente adquirem mutações no oncogene BRAF, associadas com a metilação do promotor do gene de reparo MLH1 e tumores associados com a Síndrome de Lynch, a MSI se dá por mutações em um dos genes do sistema de reparo MMR. A via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) está associada com a hipermetilação de promotores gênicos onde se encontram a maioria das ilhas CpG. Adaptado de GRADY; PRITCHARD, Três vias de instabilidade genômica e epigenética têm sido associadas com a carcinogênese colorretal: a via da instabilidade cromossômica (CIN), da instabilidade de microssatélites (MSI) e a via do fenótipo metilador das ilhas CpG (CIMP) (GRADY; PRITCHARD, 2013). O fenótipo CIN é a forma mais comum de instabilidade genética, sendo associada a mais de 85% dos casos de câncer colorretal (GRADY; CARETHERS, 2008; IMAI; YAMAMOTO, 2008). É caracterizada pela presença de alterações cromossômicas numéricas, múltiplas alterações estruturais e o acúmulo de mutações somáticas em oncogenes como K-ras e genes supressores de tumor como APC e TP53 (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Estudos mostram que instabilidade cromossômica promove a progressão tumoral através do aumento da diversidade clonal (GRADY, 2004) e é um marcador de pior prognóstico em CCR (POPAT et al., 2005; WALTHER et al., 2008). 4

23 A MSI ocorre em aproximadamente 15% dos casos de câncer colorretal e tumores com essa instabilidade apresentam um cariótipo normal e um melhor prognóstico quando comparados com tumores apresentando fenótipo CIN (POPAT et al., 2005; WALTHER et al., 2008). Esse fenótipo está associado com pequenas inserções e deleções em sequências repetitivas do genoma, conhecidas como microssatélites (IMAI; YAMAMOTO, 2008). Os mecanismos relacionados ao desenvolvimento deste fenótipo envolvem a inativação de genes da família MMR tanto por metilação do DNA como por mutações somáticas (GRADY, 2004) (Fig., 1.4). Indivíduos com câncer colorretal hereditário não-poliposo (HNPCC), também conhecido como Síndrome de Lynch (SL), desenvolvem câncer colorretal MSI+ devido a mutações na linhagem germinativa em um dos genes do sistema MMR. Em contraste, nos tumores colorretais esporádicos a MSI se dá pelo silenciamento do gene MLH1- um dos genes do sistema MMR - através da metilação do promotor (KANE et al., 1997). SÍNDROME DE LYNCH CRC ESPORÁDICO (CIMP POSITIVO) IINATIVAÇÃO DOS GENES MMR MUTAÇÕES GERMITATIVAS E EPIMUTAÇÕES NOS GENES MMR HIPERMETILAÇÃO DO GENE MLH1 DO GENE SEGUNDO HIT (MUTAÇÃO, DELEÇÃO E METILAÇÃO) MSI MUTAÇÃO NO GENE K-ras MUTAÇÃO NO GENE β- CATENINA MUTAÇÕES FRAMESHIFT EM GENES COM REPETIÇÕES MICROSSATÉLITES METILAÇÃO NO DNA OUTRAS MUTAÇÕES MUTAÇÃO NO GENE BRAF CÂNCER COLORRETAL Figura 1.4. Vias moleculares para o desenvolvimento de CCR com MSI. Adaptado de BOLAND; GOEL,

24 Alguns estudos mostram que estas duas vias (CIN e MSI) não são mutualmente exclusivas, pois existem casos de CCR apresentando os dois fenótipos (CIN+/MSI+) (JONES et al., 2005). A instabilidade epigenética em CCR ocorre com a hipermetilação de promotores gênicos, onde se encontram a maioria das ilhas CpG e a hipometilação global do genoma. Aproximadamente 20% dos casos de CCR apresentam uma alta proporção de CpG com padrão de metilação aberrante. Os mecanismos associados a CIMP ainda não são bem compreendidos, mas alguns estudos sugerem uma associação entre a ativação do oncogene BRAF e a patogênese de CCR CIMP+ (WEISENBERGER et al., 2006; BARAULT et al., 2008). Além das vias de instabilidade, o acúmulo de mutações em genes específicos e a consequente desregulação de vias de sinalização que controlam o desenvolvimento e a progressão tumoral, também são fundamentais para o entendimento da patogênese do câncer colorretal. As principais vias de sinalização associadas com o CCR são: a via Wnt/β-catenina, a via do TGF- β, a via MAPK e a via PI3K (SIENA et al., 2009; WALTHER et al., 2009). 1.3 Padrões de CCR O CCR é uma doença que atinge indiscriminadamente homens e mulheres e geralmente, apresenta três padrões distintos: esporádico, hereditário e familial (Fig., 1.5). A forma esporádica da doença, sem nenhuma predisposição hereditária ou familial, representa cerca de 80% dos casos de CCR (DANTAS et al., 2009), e é comum em pessoas com mais de 60 anos de idade. Nesses casos, os danos ao DNA são causados pela interação com fatores ambientais (exposição a substâncias carcinogênicas e radiações) ou pelos efeitos da idade, resultando numa instabilidade genômica através do acúmulo de múltiplas mutações somáticas em uma célula. O CCR hereditário decorre principalmente da existência de uma mutação na linhagem germinativa em um gene de predisposição ao câncer. Os portadores herdam de um dos pais uma mutação deletéria, geralmente em um gene supressor de tumor. As síndromes hereditárias representam cerca de 10% de todos os casos de CCR, e nesse grupo, a síndrome mais comum é a SL, sendo responsável por aproximadamente 5% de todos os diagnósticos de CCR (LYNCH et al., 2005). 6

25 Outras síndromes hereditárias possuem um risco aumentado de desenvolver CCR, tais como a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e suas variantes (a FAP atenuada, a síndrome de Gardner e síndrome de Turcot), a síndrome de Peutz-Jeghers, a polipose associada ao gene MYH, o CCR tipo X, entre outras. A Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) é uma síndrome com herança autossômica dominante causada por mutações no gene supressor tumoral APC (Adenomatous Polyposis Coli) em linhagens germinativas, tendo como principal característica clínica o surgimento de múltiplos pólipos adenomatosos no cólon e/ou reto ainda na adolescência (LINDOR; GREENE,1998) além de uma variedade de lesões extracolônicas. A FAP é uma síndrome rara, sendo responsável por menos de 1% de todos os casos de CCR. Há ainda variantes da FAP, tais como a síndrome de Gardner, que inclui a polipose colônica e duodeno-gástrica, além do desenvolvimento de tumores desmóides e osteomas; a síndrome de Turcot, caracterizada pelo desenvolvimento de tumores no SNC além do fenótipo típico da FAP e a FAP atenuada (APAF), causada por mutações no gene APC em linhagens germinativas, sendo caracterizada pela presença de menos de 100 pólipos adenomatosos com surgimento numa idade mais tardia, aproximadamente 40 anos (SWATI; DENNIS, 2012). A síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) é causada por mutações no gene STK11 em linhagens germinativas, que apresenta múltiplas funções incluindo a regulação do ciclo celular, apoptose e polaridade celular. É caracterizada por lesões hipercrômicas palmares, plantares e de mucosas que coexistem com os pólipos intestinais do tipo hamartoma, além de uma alta taxa de tumores extracolônicos, incluindo tumores gástricos, de mama, pulmão, entre outros (BEGGS et al., 2010). Há também a polipose associada ao gene MYH (também chamado de MutYH), que está envolvido no reparo de danos oxidativos no DNA. É uma síndrome autossômica recessiva, caracterizada por múltiplos pólipos adenomatosos que são os precursores mais comuns do CCR e também por pólipos serrilhados (SWATI; DENNIS, 2012). A síndrome da Polipose Juvenil Familiar (JPS) que é uma doença rara, caracterizada pela presença de múltiplos pólipos hamartomatosos juvenis localizados no cólon e reto, manifestando-se na infância (WANDERLEY et al., 2009). O termo CCR Familial tipo X (FCCTX) foi proposto por Lindor et al em 2005 para descrever famílias que preenchiam o critério de Amsterdam I, mas apresentavam CCR com estabilidade de microssatélites (MSS). Os membros da família que preenchiam os critérios 7

26 FCCTX apresentavam um risco aumentado de desenvolver CCR, porém o risco se tornava menor quando comparados com famílias com CCR apresentando um fenótipo de alta instabilidade de microssatélites (MSI-H). Famílias FCCTX apresentam um padrão de transmissão autossômico dominante mas as bases genéticas dessa síndrome ainda não foram estabelecidas (SWATI; DENNIS, 2012). A terceira forma de CCR é o familial, que representa cerca de 10 a 20% de todos os casos de câncer colorretal (VETTORE; CABALLERO, 2004). Nas famílias afetadas, observam-se agregados de câncer que impedem a classificação desses casos como esporádicos, mas a distribuição e características desses tumores não seguem o padrão observado nas síndromes hereditárias. Nesse subgrupo de famílias, é encontrada uma associação entre fatores ambientais e genéticos ainda pouco conhecidos, incluindo polimorfismos específicos e mutações em genes de risco (ROCHA, 2005). Figura 1.5. Diagnósticos diferenciais para o CCR. Adaptado de World Gastroenterology Organisation (WGO), Síndrome de Lynch A Síndrome de Lynch é uma doença genética autossômica dominante com penetrância de 80% causada por uma deficiência do sistema de reparo de malpareamento do DNA (Sistema MMR). Nessa síndrome, os indivíduos afetados herdam uma mutação em um dos alelos destes genes (mutação na linhagem germinativa), e uma mutação somática leva a inativação do outro 8

27 alelo (SANTOS et al., 2012), com consequente acúmulo de erros na replicação do DNA, aumento da taxa de mutações e aceleração do processo carcinogênico. Os primeiros relatos sobre a SL ocorreram em 1913, quando Warthin reportou pela primeira vez o caso de uma família com predisposição para desenvolver câncer gastrointestinal e ginecológico, sendo chamada de Família G e o seu pedigree foi usado como modelo para identificar outras famílias com fenótipo similar. Em 1966, Henry Lynch descreveu duas famílias (Família N e Família M) que apresentavam agregados tumorais similares, e atribuiu essa característica a uma síndrome de câncer familial de origem autossômica dominante. O termo Síndrome de Lynch foi criado em 1984 e foi subdividido em SL I e II para distinguir famílias com predisposição somente ao CCR daquelas com predisposição a tumores adicionais, respectivamente. (BOLAND; TRONCALE, 1984). Os primeiros dados moleculares da síndrome começaram a surgir em 1993, onde foram identificados dois loci de suscetibilidade ao câncer no cromossomo 2p, (PELTOMÄKI et al., 1993) e 3p (LINDBLOM et al., 1993). Inicialmente a alteração molecular observada nos pacientes com a Síndrome de Lynch foi chamada de fenótipo de erro de replicação (RER) e atualmente essa característica é chamada de instabilidade de microssatélites (MSI) (THIBODEAU; BREN; SCHAID, 1993; DE LA CHAPELLE et al.,2003). A associação entre a instabilidade de microssatélites em tumores colorretais e defeitos no sistema MMR foi feita através de estudos genéticos feitos em bactérias e leveduras (BOLAND, 2005) Características clínicas Os pacientes com SL frequentemente desenvolvem câncer colorretal em uma idade precoce (aproximadamente 45 anos), com predominância no cólon direito (proximal) (WEI et al., 2011), além de possuírem um risco aumentado de desenvolver múltiplos tumores sincrônicos (18% dos casos) ou metacrônicos (50% dos casos) e tumores extracolônicos, como, por exemplo, tumores de endométrio e, com menores ricos, carcinoma de intestino delgado, tumores no trato biliar, tumores urinários, câncer de ovário, tumores gástricos, câncer de estômago, tumores cerebrais e tumores de glândulas sebáceas (LYNCH; DE LA CHAPELLE, 2003). Os tumores na SL têm como características histopatológicas o excesso de muco (carcinomas mucinosos), são pouco diferenciados, com células em anel de sinete e diploides. Apresentam um comportamento menos agressivo, com menor potencial metastático e melhor resposta à quimioterapia tendo assim melhor prognóstico do que os CCRs esporádicos e, 9

28 possivelmente, isso se deve ao excesso de infiltrado linfocitário envolvendo a lesão (ALEXANDER et al., 2001; SMYRK et al., 2001). Os indivíduos afetados não apresentam os múltiplos pólipos adenomatosos vistos na FAP, o que dificulta a identificação clínica dos portadores da doença (ROSSI, 2009) Critérios de diagnóstico A história familiar foi um dos primeiros métodos para identificar pacientes em risco (KASTRINOS; STOFFEL, 2014), já que estudos epidemiológicos mostraram que indivíduos com familiares de primeiro grau com CCR têm um risco maior em desenvolver a doença (COURA; ASHTON-PROLLA; PROLLA, 2005). Em 1990, o International Collaborative Group on HNPCC (atualmente denominado Intenational Society of Gastrointestinal Hereditary Tumors InSiGHT) propôs a criação de critérios para o diagnóstico clínico da síndrome (Critérios de Amsterdã I) (VASEN et al., 1991). Os critérios de Amsterdã I (Quadro I.I) levam em consideração a história familiar do paciente e a idade no diagnóstico, porém não incluem tumores extracolônicos, tornando-os extremamente restritivos. Por esses motivos, os critérios de Amsterdã I foram reformulados em 1999 para a inclusão de outros tumores (Critérios de Amsterdã II) (Quadro I.II). Como nem todos os pacientes com mutações em linhagens germinativas nos genes MMR preenchem os critérios de Amsterdã, foram também estabelecidos critérios de suspeição para a síndrome (Critérios de Bethesda I e II), que são muito mais sensíveis e servem para identificar indivíduos candidatos a testes de rastreamento (SANTOS et al., 2012) (Quadro I.III). Quadro I.I. Critérios de Amsterdam I. I. Famílias com 3 casos de CCR em que 2 dos indivíduos afetados são parentes de 1º grau do terceiro; II. III. IV. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações; Famílias com 1 caso de CCR <50 anos de idade; Exclusão do diagnóstico de FAP. 10

29 Quadro I.II. Critérios de Amsterdam II I. Três ou mais familiares com neoplasia associada à SL (CCR ou câncer de endométrio, intestino delgado, estômago, hepatobiliar, de pelve renal e ureter), sendo um parente de 1º grau dos outros dois; II. Famílias com casos de CCR em no mínimo 2 gerações; III. Famílias com 1 ou mais casos de CCR diagnosticados antes dos 50 anos de idade. Quadro I.III. Critérios de Bethesda Modificados Pelo menos um dos seguintes critérios: I. CCR diagnosticado antes dos 50 anos de idade; II. Presença de CCR sincrônico ou metacrônico, ou outro tumor do espectro Lynch independentemente da idade; III. CCR com histologia sugestiva de alta instabilidade de microssatélites antes dos 60 anos de idade; IV. Probando com CCR e um ou mais familiares de 1º grau com tumor do espectro Lynch sendo um dos tumores diagnosticado antes dos 50 anos; V. Probando com CCR e dois ou mais familiares de 1º ou 2º grau com tumores do espectro Lynch diagnosticados em qualquer idade. 11

30 1.4.3 Testes genéticos de rastreamento Quando uma família preenche os critérios de Bethesda, existe indicação para realização de testes genéticos do tecido tumoral, como a análise de instabilidade de microssatélites (MSI) e o teste de imunohistoquímica (IHQ) (BURT et al., 2007). Se um ou ambos os testes derem positivo é necessária a realização de análise de mutação genética nos genes MMR. O teste de MSI apresenta uma sensibilidade de quase 100% e é positivo mesmo nos casos em que a mutação nos genes MMR não é conhecida. No entanto, sua especificidade é baixa, já que a MSI não é exclusiva da SL (LIVING, 2008). O procedimento padrão para análise e identificação da instabilidade de microssatélites proposto pelo InSiGHT, é o uso de cinco marcadores de microssatélites comparativamente entre o tecido normal e tumoral. Dois destes são repetições mononucleotídicas (BAT25 e BAT26) e os demais são repetições dinucleotídicas (D2S123, D5S346 e D17S250) (BOLAND et al., 1998). Baseado no número de marcadores apresentando instabilidade, os tumores são classificados em três grupos: alta instabilidade (MSI-H) para os que apresentam dois ou mais marcadores instáveis ( 30-40%); baixa instabilidade (MSI-L), para os com apenas um marcador instável (<30%); e estável (MSS) quando não apresenta nenhum marcador instável (KASTRINOS; STOFFEL, 2014). De forma a aumentar a sensibilidade e especificidade do teste, foram incluídos outros marcadores mononucleotídicos para detecção de MSI-H, como NR-21, NR-24, e MONO-27 (BACHER et al., 2004). O teste de IHC usa anticorpos monoclonais produzidos contra as proteínas codificadas pelos vários genes do sistema MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). A ausência de uma destas proteínas no tecido tumoral pode ser indicadora de uma mutação na linhagem germinativa. Porém, este teste pode gerar falsos positivo nos casos em que se têm proteínas truncadas e inativas, sendo reconhecidas de forma errônea pelos anticorpos (COURA; ASHTON- PROLLA; PROLLA, 2005). A complementação da análise de genes MMR por sequenciamento completo das regiões codificantes para identificação de mutações pontuais é atualmente a abordagem mais completa para identificação de mutações e diagnóstico da SL (WAGNER et al., 2003; van der KLIFT et al., 2005). Até recentemente, o sequenciamento de Sanger, ou de terminação de cadeia, foi o método dominante e padrão ouro para o sequenciamento de DNA. Porém, o sequenciamento de nova geração (Next Generation Sequencing - NGS) tem ganhado espaço, pois além 12

31 sequenciar milhões de fragmentos de DNA ao mesmo tempo, apresenta uma redução impressionante no custo por megabase. Portanto, as tecnologias de sequenciamento de nova geração, incluindo o sequenciamento total do genoma e o sequenciamento das regiões exônicas, têm permitido a introdução de novas abordagens para facilitar a identificação de novos genes responsáveis pela predisposição de doenças humanas, incluindo o câncer (JURADO et al., 2014). Uma combinação de abordagens de rastreamento para identificação do defeito MMR e diagnóstico de mutações em linhagens germinativas tem sido utilizada por muitos investigadores por ser considerada a abordagem mais custo-efetiva (PROLLA, 2010) (Fig., 1.6). AVALIAÇÃO DO HEREDOGRAMA: SÍNDROME DE LYNCH CRITÉRIOS DE AMSTERDAM CRITÉRIOS DE BETHESDA DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE HNPCC IHQ QUAL GENE MMR MUTADO? PRESENÇA AUSÊNCIA MSI IHQ SEQUENCIAMENTO GENE (S) MMR SELECIONADO (S) QUAL GENE MMR ALTERADO? POSITIVO NEGATIVO NÃO METILADO METILAÇÃO METILADO ENCERRAR INVESTIGAÇÃO Figura 1.6. Abordagens de diagnóstico laboratorial da SL em pacientes com CCR. Adaptado de PROLLA,

32 1.4.5 Bases genéticas da SL Apesar de sete genes terem sido associados com a SL (MSH2, MLH1, MSH6, PMS1, PMS2, MLH3 e EXO1), a grande maioria dos pacientes com o fenótipo clínico apresenta mutações em apenas quatro deles: MLH1 (mutl homolog 1) (40%), MSH2 (muts homolog 2) (50%), MSH6 (muts homolog 6) (7%) e PMS2 (postmeiotic increased 2) (3-5%) (GROVER et al., 2009). A inativação mutacional dos genes MMR leva a um reparo insuficiente do DNA e ao desenvolvimento de tumores caracterizados pelos altos níveis MSI, e esta é uma característica encontrada em mais de 95% dos CCRs associados à SL (NAGASAKA et al., 2010). Mais de 513 alterações diferentes em genes MMR já foram descritas, entretanto, muitas vezes essas alterações são consideradas como variantes não classificadas (UV), pois suas consequências funcionais e clínicas são desconhecidas, não podendo ser facilmente classificadas como patogênicas ou neutras (BRYONY et al., 2012; STEINKE et al., 2013). (Fig., 1.7). Segundo Santos e colaboradores (2012), a maioria das mutações nos genes de reparo em pacientes com SL, gera uma proteína truncada e não funcional. MSH2 PATOGÊNICA Figura 1.7. Espectro mutacional dos genes MMR. Adaptado de STEINKE et al.,

33 1.5 Vias de reparo de DNA A manutenção da integridade genômica e a adaptação a estresses genotóxicos são elementos fundamentais para garantir a sobrevivência de um organismo. O DNA pode sofrer alterações por diferentes agentes, tanto endógenos, causados por alterações espontâneas decorrentes da instabilidade das ligações químicas da molécula ou por alterações causadas por produtos do metabolismo celular, quanto exógenos, associados a fatores ambientais. Frente a estas lesões, uma complexa resposta celular é ativada com a finalidade de se preservar a estabilidade genômica. A resposta ao dano no DNA envolve a detecção do sítio lesionado, a amplificação do sinal através de uma cascata de proteína cinases e a ativação de uma série de efetores que promovem uma resposta celular específica (apoptose, parada do ciclo celular, senescência) (MÉNDEZ-ACUÑA et al., 2010) As vias de reparo do DNA são responsáveis pelo processamento de diferentes tipos de dano e são essenciais para evitar o acúmulo de mutações e garantir a transmissão acurada da informação genética. Dependendo do tipo de lesão no DNA, diferentes proteínas são recrutadas para reconhecer e processar o dano. Existem cinco vias principais de reparo do DNA: (i) reparo por excisão de bases (ou BER, do inglês Base-Excision Repair) (ROBERTSON et al., 2009); (ii) reparo por excisão de nucleotídeos (ou NER, do inglês Nucleotide-Excision Repair) (NOUSPIKEL, 2009); (iii) reparo de erros de pareamento (ou MMR, do inglês Mismatch Repair) (HSIEH; YAMANE, 2008); (iv) reparo por recombinação homóloga (ou HR, do inglês Homologous Recombination) (NOWOSIELSKA, 2007) e (v) reparo por recombinação nãohomóloga (ou NHEJ, do inglês Non-Homologous End Joining) (MAHANEY; MEEK; LEES- MILLER, 2009) Sistema MMR O sistema de reparo MMR é altamente conservado ao longo da evolução e é essencial para a estabilização do genoma tanto em procariotos quanto em eucariotos (SUNG-HOON; KIM; BAN, 2006). Este sistema corrige erros de pareamento base\base, além de inserções e deleções que ocorrem durante a síntese do DNA, melhorando a fidelidade do mecanismo de replicação (OLLILA et al., 2008), além de estar envolvido nos processos de recombinação, na geração da diversidade imune e na resposta celular a danos específicos ao DNA, como, por exemplo, danos causados por agentes alquilantes. (WARREN et al., 2007) (Fig., 1.8). 15

34 DIVERSIFICAÇÃO DE ANTICORPOS REGULAÇÃO DA RECOMBINAÇÃO PROMOÇÃO DO CROSSING OVER MEIÓTICO PROTEÍNAS MMR REPARO DE ERROS NA REPLICAÇÃO RESPOSTA A DANOS NO DNA Figura 1.8. Diferentes funções das proteínas de reparo MMR. Adaptado de SUNG-HOON et al., O reparo de erros de pareamento consiste no reconhecimento da base mal pareada, causando distorção na dupla fita de DNA, excisão do segmento de DNA que contém o erro através da ação de exonucleases específicas e a síntese da região removida utilizando a fita parental como molde, através da ação das enzimas DNA polimerase e ligase (IYER et al., 2006). O sistema MMR reconhece com eficiência a maioria dos erros, retirando-os do genoma recém-replicado. É necessário que haja uma coordenação entre o MMR e a replicação do DNA, para que seja feito o direcionamento do reparo à fita recém sintetizada (BOWERS et al., 2001). Os primeiros estudos com os genes mismatch foram desenvolvidos na bactéria Escherichia coli (E. coli), onde os componentes essenciais do sistema MMR MutS, MutL, MutH e Uvr foram identificados pela primeira vez através de estudos genéticos de mutantes (COX; DEGNEN; SCHEPPE, 1972; WAGNER; MESELSON, 1976). O homodímero MutS liga-se de forma inespecífica à molécula de DNA em busca do mismatch. Quando o erro é reconhecido, a proteína perde afinidade pela molécula de ADP, sofre uma mudança conformacional que permite sua ligação ao homodímero MutL formando um complexo ternário dependente de ATP. A formação deste complexo estimula a atividade endonuclease do homodímero MutH, que se liga ao sítio GATC hemi-metilado na fita recém sintetizada e quebra a molécula de DNA tanto na posição 5 quanto na 3 do malpareamento. Além disso, há o 16

35 recrutamento de helicases UvrD que se ligam na fita contendo a quebra e impedem que o DNA duplex se enrole, enquanto o reparo não é feito. Isso permite a ação de diferentes exonucleases, que digerem o DNA nas direções 5-3 e 3-5. A ação exonucleolítica acaba no momento em que o erro é removido. O reparo é corrigido pela DNA polimerase III e o processo é finalizado pela DNA ligase (JIRICNY, 2006). A complexidade da via MMR nos organismos eucarióticos é maior que a encontrada em procariotos, de modo que há ainda muitas dúvidas quanto aos detalhes do processo de reparo. As poucas informações que se têm a respeito dos mecanismos MMR em eucariotos são derivadas, principalmente, de estudos feitos com DNA circular heteroduplex de extratos de células de mamíferos. Estes estudos indicam que a sequência de eventos que ocorrem durante o processo de reparo é ditada por interações entre diferentes proteínas e o DNA heteroduplex (MODRICH, 2006). Todos os organismos eucarióticos, apresentam componentes homólogos dos complexos MutS (MSHs) e MutL (MLHs), porém, em contraste com os encontrados nas bactérias, os componentes eucarióticos funcionam como heterodímeros. Estudos feitos em levedura não encontraram similares aos complexos MutH e Uvr, indicando que provavelmente não existem homólogos para estas duas proteínas no genoma de eucariotos (HAFE; ROBERTSON, 2000). Em eucariotos, os componentes do sistema MMR formam três subunidades proteicas principais: MutSα (MSH2 + MSH6), que reconhece os erros base/base e pequenos loops de inserção/deleção (IDLs) envolvendo um ou dois nucleotídeos, MutSβ (MSH2 + MSH3), que reconhece grandes IDLs e MutLα (MLH1 + PMS2), que age como um mediador entre o complexo MutS e as outras proteínas que participam do processo de reparo (PELTOMÄKI, 2003; EDELBROCK; KALIYAPERUMAL; WILLIAMS, 2012;) (Fig., 1.9). As interações protéicas já documentadas nesse sistema incluem os seguintes pares de moléculas: MutSα MutLα, MutSα PCNA, MutSβ PCNA, MutLα PCNA, MutSα ExoI, MutLα ExoI, ExoI PCNA e PCNA polimerase δ. Com exceção das interações MutSα - ExoI e entre PCNA polimerase δ, o significado destas outras interações no reparo de erros de pareamento ainda não foi estabelecido (MODRICH, 2006). Em contraste com a E. coli, onde o reparo é direcionado pela ausência transitória de metilação na adenina presente no sítio GATC da fita recém-sintetizada (hemi-metilação), os 17