JULIANA VIANNA PEREIRA. Arctium lappa

Transcrição

1 JULIANA VIANNA PEREIRA Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de constituintes e de medicação intracanal à base de Arctium lappa Orientadora: Profª. Drª. Yara T C Silva Sousa RIBEIRÃO PRETO 2004

2 JULIANA VIANNA PEREIRA Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de constituintes e de medicação intracanal à base de Arctium lappa Dissertação apresentada ao curso de Odontologia da Univeridade de Ribeirão Preto, para obtenção do Título de Mestre em Odontologia sub-área de Endodontia. Orientadora: Profª. Drª. Yara T C Silva Sousa RIBEIRÃO PRETO 2004

3 Ficha catalográfica preparada pelo Centro de Processamento Técnico da Biblioteca Central da UNAERP - Universidade de Ribeirão Preto - P436a Pereira, Juliana Vianna, Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana de constituintes e de medicação intracanal à base de Arctium lappa / Juliana Vianna Pereira. - - Ribeirão Preto, f. : il. Orientador(a): Profa. Dra. Yara T. C. Silva Sousa. Dissertação (mestrado) - Universidade de Ribeirão Preto, UNAERP, Odontologia, área de concentração: Endodontia, Odontologia. 2. Endodontia. 3. Canal radicular - Tratamento. 4. Odontologia - Medicação intracanal. 5. Fitoterapia. I. Título CDD:

4 Laboratório de Biotecnologia Universidade de Ribeirão Preto Laboratório de Pesquisas em Odontologia Universidade Federal do Amazonas Este trabalho foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Odontologia - UNAERP, Laboratórios da Biotecnologia da UNAERP e no Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas UFAM.

5 Resumo

6 O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro a atividade antimicrobiana de fases purificadas e subfrações da fase hexânica de Arctium lappa contra microrganismos comuns em infecções endodônticas e avaliar a ação antimicrobiana de medicação intracanal à base de fase hexânica de Arctium lappa em dentes humanos infectados por vinte e oito dias. A atividade antimicrobiana foi investigada pelo teste de difusão em Agar, que permitiu a detecção da fase hexânica como inibidora do crescimento da maioria dos microrganismos estudados, sendo esta, portanto, submetida a um fracionamento. A fase hexânica e suas subfrações foram então avaliadas pelo ensaio da bioautografia, que permitiu a detecção de substâncias antimicrobianas, presentes na fase hexânica com R f em três zonas distintas, sugerindo a presença de ativos de diferentes polaridades, sendo esta selecionada para ser avaliada como medicação intracanal. Foram utilizados 72 caninos superiores humanos, dos quais 54 foram contaminados com uma suspensão mista composta por Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Candida albicans, a cada 72 horas, com culturas de 24 horas durante 28 dias. Os dentes foram divididos em quatro grupos segundo a medicação utilizada: Grupo I os dentes foram contaminados, mas não receberam medicação, Grupo II medicação à base de Arctium lappa; Grupo III medicação à base de hidróxido de cálcio, Grupo IV controle,

7 sem contaminação e sem tratamento. Decorridos os períodos de 7, 14 e 28 dias, 6 dentes de cada grupo foram avaliados quanto ao crescimento microbiano após tratamento. Os resultados evidenciaram que a medicação preparada com A. lappa foi efetiva na inibição do crescimento dos microrganismos após 7, 14 e 28 dias de tratamento, sendo diferente estatisticamente do hidróxido de cálcio no período de 14 dias. Podemos concluir que a medicação à base de A. lappa apresentou efetividade antimicrobiana contra microrganismos persistente em infecções de longa duração.

8 Summary

9 The objective of the present study was to evaluate the in vitro antimicrobial activity of hexane fraction and compounds isolated from hidro-alcoholic leaf extracts of Arctium lappa against microorganisms common in endodontic infections and to evaluate the antimicrobial activity of intracanal medication containing hexane fraction of A. lappa in infected human teeth treated during 28 days. The antimicrobial activity was investigated using the Agar Diffusion Test, which showed that the hexane fraction could inhibit the growth of the majority of target microorganisms investigated. Subsequently, the hexane fraction was partitioned and its sub-fractions were submitted to the Bioautography Assay. Antimicrobial substances, displaying distinct R f values, in three different zones, were detected, indicating the presence of bioactive compounds of distinct polarities, which may play a synergistic role in the exhibited antimicrobial activity, although specific compounds only affected some microorganisms. Consequently the hexane fraction was selected for the evaluation as intracanal medication. Human superior canine teeth (72) were collected and 54 of them were infected every 72 hours, during 28 days, with a suspension containing a mixture of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis and Candida albicans microorganisms, cultured for 24 hours. The contaminated teeth were gather in four groups and treated as follow: Group I - contaminated teeth which received no medication; Group II medication

10 containing A. lappa; Group III - medication containing calcium hydroxide; Group IV control with neither contamination nor medication treatment. After 7, 14 and 28 days of treatment, 6 teeth of each group were evaluated for the level of microbial growth after treatment. Obtained results demonstrated that the medication containing A. lappa hexane extract was effective against the tested microorganisms after 7, 14 and 28 days of treatment, being statistically different from calcium hydroxide at 14 days of treatment. Therefore, we can conclude that medication containing A. lappa presents anti-microbial efficiency against persistent microorganisms in long term infections.

11 Sumário

12 RESUMO SUMMARY

13 1- Introdução

14 A desinfecção do canal radicular tem sido uma busca constante dos pesquisadores que procuram eliminar não apenas os microrganismos presentes no lúmem do canal, mas também aqueles localizados em todo o sistema de canais radiculares. O processo de desinfecção do sistema de canais radiculares inicia-se com o preparo biomecânico através da ação mecânica dos instrumentos e químicas das substâncias irrigantes. No entanto, esta etapa não elimina por completo os microrganismos presentes em processos infecciosos de longa duração que, do lúmem, se disseminam para os túbulos dentinários, canais acessórios, ramificações lateral e colateral e delta apical (LEONARDO et al.,1994). Um agravante deste é observado em canais achatados que dificultam o acesso dos instrumentos e soluções irrigantes (BARBIZAM et al., 2002; MARCHESAN et al., 2003). Dessa forma, um efetivo controle microbiano requer o uso de medicação intracanal (BYSTROM; SUNDQUIVIST, 1991; LEONARDO et al., 1994; ESTRELA et al., 2003) com a finalidade de eliminar os microrganismos não atingidos pelo preparo biomecânico, uma vez que os mesmos poderão voltar a se reproduzir e ser detectados novamente na luz do canal radicular após 72 e 96h (LEONARDO et al., 1993). Diversas substâncias têm sido propostas como medicação intracanal. Dentre elas, o hidróxido de cálcio tem apresentado papel de destaque devido às

15 suas propriedades: antimicrobiana (MARTINS et al., 1979; ESTRELA et al., 1995a; LYNNE et al., 2003), solvente de matéria orgânica (GORDON et al., 1985) e indutora de tecido mineralizado (CVEK et al., 1976; HOLLAND; SOUZA, 1985). Por outro lado, a busca de medicamentos a partir de plantas medicinais tem mobilizado a sociedade científica na área da saúde. Seguindo esta tendência, os pesquisadores da Endodontia têm-se mostrado estimulados a buscar novas perspectivas para a terapêutica nas plantas que apresentam potencial antimicrobiano. A planta de nome científico Arctium lappa é originária do Japão e vem sendo amplamente utilizada na medicina popular em todo mundo devido às suas reconhecidas aplicações terapêuticas. Possui atividade antibacteriana e antifúngica (TESKE; TRENTINI, 1991; SILVA, 2001; HOLETZ et al., 2002), ação diurética (KAN, 1981; TESKE; TRENTINI, 1991), ação antioxidante (MARUTA et al., 1995), ação ansiolítica (SBOLLI et al., 1996), efeito antiagregante plaquetário (IWAKAMI et al.,1992) e a ação inibitória em relação ao HIV (ITO et al., 1987). No que diz respeito à Endodontia, a Arctium lappa possui potencial antimicrobiano frente a microrganismos encontrados no interior do canal radicular. PERIN et al. (2001) avaliaram in vitro o potencial bactericida do extrato bruto da A. lappa frente aos microrganismos, Enterococcus faecalis,

16 Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, freqüentes no interior dos canais radiculares por meio do teste de difusão em Agar. Os resultados evidenciaram que a formulação fitoterápica liofilizada apresentou maior efetividade, com halos de inibição maiores que a solução de Milton sobre a C. albicans e B. subtilis, não sendo efetiva apenas contra o E. faecalis. Ainda em 2001, PERIN avaliou a efetividade de três diferentes métodos de desinfecção dos canais radiculares frente aos mesmos microrganismos. Os canais radiculares foram tratados com solução de hipoclorito de sódio a 1%, solução fitoterápica liofilizada obtida a partir do extrato bruto de A. lappa e laser Er:YAG. Foi observado que a solução fitoterápica apresentou atividade antimicrobiana contra a C. albicans. Com o objetivo de avaliar a capacidade antimicrobiana da A. lappa como medicação intracanal, GENTIL (2003) infectou canais radiculares, in vitro, com C. albicans, Escherichia coli, Lactobacillus acidophylus, Pseudomonas aeruginosa e Streptococcus mutans, por um período de cinco dias. Após quatorze dias de exposição ao extrato da planta, o crescimento microbiano no interior dos canais radiculares foi totalmente inibido. Os resultados obtidos até o momento reforçam o potencial uso de ativos da A. lappa como medicação intracanal, sendo necessário, no entanto, determinar a fase que apresenta maior atividade contra os microrganismos freqüentes no

17 canal radicular, bem como o seu comportamento em infecções de longa duração.

18 2- Revisão da Literatura

19 Os estudos com o uso do hidróxido de cálcio como medicação intracanal têm sido relatados dede Já com relação a Arctium lappa são mais recentes. Como forma de ordenamento, a revisão sobre esses produtos é apresentada separadamente Hidróxido de Cálcio O hidróxido de cálcio é uma base forte obtida a partir da calcinação (aquecimento) do carbonato de cálcio, até sua transformação em óxido de cálcio (cal viva). Com a hidratação do óxido de cálcio chega-se ao hidróxido de cálcio Herman, em 1920, introduziu a aplicação do hidróxido de cálcio na Odontologia, relatando sua ação biológica (ESTRELA et al., 1999). Desde então, tem sido alvo de inúmeras pesquisas. CVEK et al. (1976) avaliaram clínica, radiológica e microbiologicamente o efeito do hidróxido de cálcio como obturador temporário em incisivos permanentes não vitais, com raiz matura e imatura, canais infectados e não infectados e com e sem demonstração radiográfica de lesão periapical. Utilizaram 141 dentes que foram irrigados com solução salina ou hipoclorito de sódio a 5%. Amostras microbiológicas foram colhidas após a remoção do tecido necrótico, após completa limpeza do canal radicular e decorridos três e seis meses. Os resultados foram avaliados radiograficamente antes do tratamento e

20 após trinta e seis meses. Os pesquisadores evidenciaram que não houve correlação estatística das amostras tiradas aos três e seis meses quando comparadas com o controle. O mesmo ocorreu com a análise bacteriológica antes do preenchimento com hidróxido de cálcio, o desenvolvimento radicular e cura periapical aos três e seis meses do tratamento. Os autores concluíram que o tratamento local pode ser feito rotineiramente, independente do estado inicial. MARTINS et al. (1979) avaliaram a redução microbiana proporcionada pela instrumentação e irrigação com solução salina fisiológica e o efeito antisséptico da pasta aquosa de hidróxido de cálcio, solução aquosa a 1% de paramonoclorofenol e a mistura. Utilizaram sessenta dentes unirradiculares necrosados, cujas coletas microbiológicas com cones de papel foram realizadas antes do tratamento, após a biomecânica e após o curativo de demora por quarenta e oito ou setenta e duas horas. Os dentes foram divididos em três grupos para receber uma das medicações. O efeito da instrumentação e irrigação com solução salina fisiológica, assim como o efeito antisséptico dos medicamentos, mostrou ser estatisticamente significante na redução da flora microbiana. Embora sem significância estatística, a mistura de hidróxido de cálcio e paramonoclorofenol a 1% apresentou melhor resultado, seguida da pasta aquosa de hidróxido de cálcio e, finalmente, pelo paramonoclorofenol a 1%.

21 TROSTAD et al. (1981) avaliaram o ph do tecido dental após o uso do hidróxido de cálcio no canal radicular. Foram utilizados macacos com formação incompleta de incisivos e caninos em estágio de esfoliação ou incisivos e caninos permanentes em estágio de erupção. Quinze incisivos foram extraídos e reimplantados após uma hora. O tratamento endodôntico foi realizado após quatro semanas, quando a necrose pulpar estava instalada. Os dentes foram irrigados com hipoclorito de sódio a 1% e, posteriormente, receberam medicação de pasta de hidróxido e cálcio e solução de Ringer. Oito incisivos não receberam tratamento e cinco dentes com polpa viva foram utilizados como controle. Quatro semanas após o tratamento endodôntico os macacos foram sacrificados e vinte e sete dentes seccionados no sentido transversal e cinco dentes no sentido longitudinal, para análise em microscópio de transmissão. O ph foi mensurado a partir da periferia até o canal radicular. Nos dentes que apresentavam formação completa, o ph variou de 8,0 a 11,1 na dentina circunpulpar e de 7,4 a 9,6 na dentina periférica. Os dentes com formação incompleta apresentaram variação de ph entre 8,0 e 10,0. Já os dentes que não receberam tratamento e que apresentavam necrose pulpar, o ph variou de 6,0 a 7,4. GORDON et al. (1985) analisaram o efeito do hidróxido de cálcio quanto às variações de ph e concentração de cálcio em tecido pulpar bovino. Os autores concluíram que os efeitos do hidróxido de cálcio dependem

22 fundamentalmente do seu ph. Sua eficiência pode ser o resultado de sua baixa solubilidade e, portanto, toxicidade, quando se comparam com soluções alcalinas de cátion bivalente como o hidróxido de bário. Salientaram ainda, que o mesmo apresenta ação bactericida não específica no interior do canal, e que seu efeito depende exclusivamente de seu ph, e como agente antibacteriano, atua sem o suporte dos mecanismos teciduais de defesa. HOLLAND; SOUZA, (1985) avaliaram a habilidade do cimento obturador à base de hidróxido de cálcio para induzir a reparação tecidual. Utilizaram canais achatados de cães e macacos, obturados com Sealapex, Kerr e hidróxido de cálcio. Como controle, alguns canais foram deixados vazios. Após seis meses, os animais foram sacrificados, os dentes foram removidos e preparados para análise histológica. O Sealapex e o hidróxido de cálcio induziram o fechamento apical pela deposição de cemento. O fechamento foi mais freqüentemente observado nos casos com pulpectomia parcial do que nos casos com pulpectomia total. PASHLEY et al. (1986) avaliaram o efeito do hidróxido de cálcio na permeabilidade dentinária. Foram preparados discos de dentina de terceiros molares não erupicionados e colocados em uma câmara fendida utilizada para quantificar a permeabilidade dentinária através da condução hidráulica da dentina. Os discos tinham espessura de 0,5-0,9mm e uma superfície de 0,317cm 2. Todos os discos foram tratados dos dois lados com ácido cítrico a 6%

23 por vinte e cinco minutos para determinar a permeabilidade máxima. O fluido utilizado foi solução salina tamponada de fosfato (PBS) com pressão entre 0,069 e 0,241 MPa. Em seguida, os discos receberam aplicação de uma pasta de hidróxido de cálcio durante dois minutos, tendo como veículo a água destilada, seguido por irrigação com água destilada por vinte segundos, sendo a permeabilidade dentinária mensurada novamente. Posteriormente, os dentes receberam aplicação de ácido cítrico a 6% por dois minutos para verificar quanto o hidróxido de cálcio influenciou na permeabilidade dentinária. Em seguida, em um dos lados do disco foi induzido a formação de smear layer criada pela ação da broca 69L em alta rotação e a permeabilidade mensurada novamente. Os dentes receberam nova aplicação de pasta de hidróxido de cálcio por dois minutos e uma nova mensuração da permeabilidade foi realizada. Finalmente, os dentes receberam ácido cítrico a 6%. Um dente de cada grupo foi analisado em MEV. Os autores observaram que o tratamento com hidróxido de cálcio reduziu em 75% a permeabilidade dentinária. Microscopicamente, observou-se uma redução na dimensão dos túbulos dentinários. HAAPASALO; ØRSTAVIK (1987) desenvolveram in vitro um modelo para infecções dos túbulos dentinários para testar a eficácia de medicações intracanal. Os autores prepararam cilindros de dentina bovina com 4 mm de altura, 6 mm de diâmetro externo e 2,3 mm de diâmetro interno. O cemento foi removido e os túbulos tratados com EDTA a 17% e hipoclorito a 5,25%,

24 seguidos por esterilização, infecção com Enterococcus faecalis e incubação a 37ºC por vinte e oito dias. Posteriormente, alguns dentes foram avaliados histologicamente pela técnica de Brown-Brenn. Para o teste contra os medicamentos, as superfícies externas dos dentes foram impermeabilizadas com esmalte de unha e montados em cera utilidade. Em seguida, foram aplicados os medicamentos Calasept (hidróxido de cálcio) e paramonoclorofenol canforado (PMCC). Os dentes foram incubados por um período de cinco minutos a dez dias. Após esse período as amostras foram colhidas em tubos de BHI através do desgaste do lúmen do canal com as brocas 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 40, 42, 45 e 50. Os tubos foram incubados a 37ºC e analisados diariamente por sete dias. As bactérias penetraram μm após vinte e quatro horas e atingiram até 1000μm após vinte e oito dias. O PMCC causou rápida redução de bactérias, eliminando-as após uma hora, sendo os canais desinfetados após sete dias. O hidróxido de cálcio não foi eficaz na eliminação do Enterococcus faecalis. Os pesquisadores concluíram que o modelo proposto é sensível e pode ser utilizado para avaliação de medicações intracanal in vitro. FOREMAN; BARNES (1990) realizaram uma revisão sobre o hidróxido de cálcio, evidenciando suas principais ações quando utilizado como medicação intracanal. Os autores afirmaram que o hidróxido de cálcio é o material de eleição no controle de infecções, atuando em regiões não atingidas pelas soluções irrigantes, reduzindo a infiltração de fluidos periapicais para dentro do

25 canal, devido à formação de uma barreira fibrosa formada pelo contato direto com os tecidos, provocando contração dos capilares sanguíneos ou simplesmente através de bloqueio mecânico. Proporciona o fechamento apical de dentes não vitais, pelo desenvolvimento continuado da raiz, ou pela formação de uma barreira calcificada de mineralização do tecido através do forame apical. Além disso, promove o tratamento de reabsorções inflamatórias interna e externa, com finalidade de parar o processo e estimular a reparação e para o reparo de perfuração radicular. STUART et al. (1991) compararam o efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio, PMCC e do formocresol contra os microrganismos Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus e Bacteroides gingivalis ou Bacteroides fragilis. Para realização da análise utilizaram dentes unirradiculares que foram preparados até a lima 50K, esterilizados e inoculados com a mistura das bactérias. Em seguida, os canais radiculares receberam as medicações, foram selados e incubados por uma hora. O conteúdo do canal foi analisado pelo número de bactérias testes viáveis. Os resultados evidenciaram que todos os produtos testados mostraram atividade antimicrobiana contra todos os microrganismos, com redução de 64,3 a 100% de bactérias viáveis. Os dentes tratados com o hidróxido de cálcio mostraram resultados estatisticamente superiores quando comparados ao PMCC e ao formocresol para o Streptococcus

26 mutans e Bacteroides gingivalis ou Bacteroides fragilis, mas não mostrou diferença para o Actinomyces viscosus. HOLLAND et al. (1992) avaliaram o processo de cura em dentes de cães com lesões periapicais com e sem o uso de soluções irrigantes e medicação intracanal antibacteriana. Utilizaram como irrigante, a solução de Dakin e como medicação intracanal, o PMCC. No grupo controle, foi utilizada solução salina fisiológica e algodão na câmara pulpar. Os dentes foram obturados em uma segunda sessão. Após seis meses da obturação, os animais foram sacrificados e os exames histológicos mostraram que os melhores resultados foram obtidos no grupo irrigado com Dakin e que utilizou como curativo o PMCC. Os dentes desse grupo apresentaram sinais característicos de formação de cemento e tecido ósseo, bem como uma marcante redução do tamanho da lesão periapical. LEONARDO et al. (1993) avaliaram o PMCC, hidróxido de cálcio e a combinação de ambos, quanto a difusão dos mesmos nos canalículos dentinários e ramificações laterais do sistema de canais radiculares. Foram seccionados 50 incisivos centrais superiores medindo 23 mm, instrumentados até a lima Hedstroen #60. A solução irrigante utilizada foi o hipoclorito de sódio a 1%, e a irrigação final realizada com EDTA durante três a quatro minutos sob agitação, seguida por água destilada. Os curativos analisados receberam um corante cor violeta [Zn(Ne)2] antes da introdução no canal radicular. Após a introdução do curativo, os dentes foram colocados em gazes úmidas em estufa

27 a 37ºC por sete dias. Posteriormente, os dentes foram cortados longitudinalmente com discos diamantados e a penetrabilidade do curativo foi avaliada em um aparelho Profile Projector com aumento de 20X. A ordenação crescente de infiltração foi PMCC (0,148mm), Calen (0,447mm), Calen com PMCC (0,711mm), Calen com PMC (0,797mm) e pasta aquosa de hidróxido de cálcio (1,038mm). LEONARDO et al. (1994) avaliaram radiograficamente o reparo apical e periapical em dentes de cães com lesões crônicas, experimentalmente induzidas após dois tipos de tratamentos clínicos e compararam a presença de microrganismos em cortes seriados, coloridos pelo método de Brown-Brenn da região apical e periapical. No grupo 1 utilizaram como irrigação o hipoclorito de sódio 4-6% e, como medicação intracanal, o hidróxido de cálcio. O grupo 2 teve como solução irrigante a solução de Dakin e não recebeu medicação intracanal. Os resultados evidenciaram que houve uma considerável redução ou mesmo desaparecimento da área radiolúcida com maior sucesso para o grupo 1. A extensão da invasão bacteriana nos túbulos dentinários foi maior e mais intensa no grupo 2. A quantidade de microrganismos detectados nas ramificações e no lúmen do canal foi intensa no grupo 2 e mediana ou ausente no grupo 1. Os autores afirmaram que a medicação penetra em áreas não alcançadas por instrumentos e soluções irrigantes e também age como uma barreira física que

28 previne a reinfecção, ou mesmo reduz o risco de proliferação de bactérias residuais. ESTRELA et al. (1995a) analisaram o efeito antimicrobiano de pastas de hidróxido de cálcio, associadas ao soro fisiológico e ao PMCC, sobre culturas puras das bactérias aeróbias facultativas Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Streptococcus faecalis. Utilizaram sessenta cilindros confeccionados a partir de sonda gástrica, com quatro milímetros de diâmetro por seis milímetros de comprimento, que foram divididas em três grupos, de acordo com o microrganismo, e armazenados em placas de Petri contendo meio de cultura apropriado. Dez cilindros de cada grupo foram preenchidos com pasta de hidróxido de cálcio, preparadas com soro fisiológico e os outros dez cilindros com pasta de hidróxido de cálcio, preparadas com PMCC. Após o preenchimento dos cilindros, 0,1mL da suspensão bacteriana diluída foi transportado para o meio de cultura. A leitura dos halos de inibição foi realizada após vinte e quatro e quarenta e oito horas. Os autores observaram que a pasta de hidróxido de cálcio associada ao PMCC mostrou um maior halo de inibição do crescimento bacteriano, estatisticamente significante, quando comparada com a pasta que continha o soro fisiológico como veículo. ESTRELA et al. (1995b) analisaram in vitro a difusão dos íons hidroxila, na dentina radicular, de pastas de hidróxido de cálcio preparadas com diferentes veículos. Foram preparados sessenta incisivos centrais superiores que

29 receberam medicações de hidróxido de cálcio com os veículos: solução salina, anestésico, e polietilenoglicol 400. As raízes foram seccionadas dois milímetros aquém do ápice radicular e os dentes montados no centro de uma plataforma redonda, preenchidos com solução salina até dois milímetros da extremidade radicular. As plataformas permaneceram em uma atmosfera de nitrogênio, completamente seladas, com ausência de luz e temperatura constante de 36,5ºC. A difusão dos íons hidroxila foi analisada pelo método do colorímetro em 7, 15, 30, 45 e 60 dias. As pastas preparadas com solução salina e anestésica apresentaram mudança de ph de 6-7 para 7-8 após trinta dias, permanecendo por sessenta dias. O grupo que teve o polietilenoglicol 400 como veículo, a mesma alteração ocorreu em quarenta e cinco dias e continuou por sessenta dias. SIMON et al. (1995) determinaram, quantitativamente, a difusão de íons OH - e Ca +2 no cemento e dentina radicular, em pastas de hidróxido de cálcio preparadas com solução salina, água destilada, propilenoglicol e PMCC. Utilizaram quarenta pré-molares inferiores, que tiveram o batente apical confeccionado com instrumento número setenta, sendo irrigados com 1mL de solução salina entre cada troca de instrumentos. Inicialmente, foi determinado como controle, o ph e a concentração de íons cálcio, os quais foram comparados posteriormente com os dados obtidos após a colocação das pastas de hidróxido de cálcio dentro dos canais. Previamente à introdução das pastas,

30 os dentes foram irrigados com 5 ml de EDTA a 17%, seguido por hipoclorito de sódio a 5,25%. Para a confecção das pastas, foram misturadas 150g de pó de hidróxido de cálcio com 0,15mL de veículo. O ph foi mensurado após 1, 3, 5, 7, 14, 21 e 30 dias. Após 30 dias, todos os quatro grupos mostraram um aumento gradual e significante de ph, quando comparado com o controle. As pastas preparadas com água destilada e PMCC mostraram valores maiores de aumento de ph comparadas com aquelas preparadas com solução salina e propilenoglicol em todos os períodos de tempo. Não houve diferença estatística significante entre a água destilada e o PMCC. Os valores de ph medidos com um e trinta dias foram maiores para o PMCC, seguido por água destilada e em ordem decrescente para a solução salina e propilenoglicol. A concentração de Ca +2 aumentou significantemente após a introdução de hidróxido de cálcio nos quatro grupos experimentais. Os maiores valores de Ca +2 foram observados com água destilada em qualquer intervalo de tempo. Os grupos com água destilada e propilenoglicol mostraram resultados superiores após vinte e um dias. A pasta com solução salina obteve menor valor após sete dias. Aos trinta dias, a concentração de Ca +2 foi muito superior com água destilada, seguida em ordem decrescente pela solução salina, propilenoglicol e PMCC. Os resultados evidenciam que o veículo influencia na liberação de Ca +2. O propilenoglicol permite a liberação controlada de OH - e Ca +2, além de evitar o aumento do ph para cima do nível crítico ótimo, necessário para reparação e regeneração do

31 tecido. Com base nos resultados, não há justificativa para usar o PMCC como veículo. O propilenoglicol possui qualidades desejáveis para ser utilizado rotineiramente em preferência a qualquer outro veículo. ALAÇAM et al. (1998) estudaram as mudanças de ph na dentina após o uso de preparações de hidróxido de cálcio com água destilada e glicerina, através da mensuração do ph do ambiente externo das superfícies radiculares. Utilizaram cento e quarenta incisivos centrais superiores e caninos humanos, que foram divididos em dois grupos de cinquenta dentes e quatro controles de 10 dentes cada um. O batente apical foi confeccionado com instrumento número cinquenta, um milímetro aquém do ápice, sendo irrigados com hipoclorito de sódio a 5,25%. Os canais foram preenchidos com EDTA a 17% por quatro minutos, para remover a smear layer. Foram preparadas fenestrações de 5mm 2 para remover cemento e dentina das porções mesial e distal do terço cervical, sendo preenchidos com EDTA para remover a smear layer. As cavidades e o canal radicular receberam uma irrigação final abundante com água destilada para remover o EDTA. Todos os dentes foram armazenados em água destilada. O ph da água de armazenamento foi mensurado para se ter certeza de que o EDTA foi totalmente removido. Os canais foram, então, secos com cones de papel absorvente. As pastas foram preparados usando 0,0536g de hidróxido de cálcio e 0,0744mL de água destilada ou 0,0445mL de glicerina (ph 7,52). O ph foi medido aos 1, 4, 7 e 12 dias. As pastas foram colocadas

32 com lentullo e todas as superfícies, com exceção das fenestrações, foram impermeabilizadas com esmalte. Cada raiz foi colocada em um tubo com 5mL de água destilada a 37ºC. Os resultados evidenciaram que independente do tempo de incubação, a mistura de hidróxido de cálcio com glicerina apresentou valores de ph significativamente superiores quando comparada com a mistura com água destilada. Os autores propõem o uso de hidróxido de cálcio com glicerina devido à elevação do ph. ESTRELA et al. (1998) determinaram, in vitro, o tempo necessário para a ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio, quando em contato direto com microrganismos. Utilizaram os microrganismos Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Streptococcus sp. As cepas foram cultivadas em 5mL de BHI, com exceção do Fusobacterium nucleatum, que foi cultivado em BHI-PRAS, e incubados a 37ºC por quarenta e oito horas. Suspensões puras e mistas foram preparadas para contaminar cones de papel absorvente por três minutos. As misturas foram: I (Micrococcus luteus, Streptococcus sp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa); II (os cocos Micrococcus luteus, Streptococcus sp, Staphylococcus aureus); III (os bastonetes Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa); IV (cocos e bastonetes Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa). Após a contaminação, os cones foram colados em placas de Petri e cobertos com pasta de hidróxido de cálcio preparada com

33 solução salina em intervalos de 0, 1, 2, 6, 12, 24, 48, 72 horas e 7, dias quando foram transferidos para meios de cultura. O crescimento de colônias foi observado por um estereomicroscópio. O efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio ocorreu após doze horas para o Micrococcus luteus e Fusobacterium nucleatum, vinte e quatro horas para Streptococcus sp, quarenta e oito horas para Escherichia coli e em setenta e duas horas para Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. A mistura II foi sensível à medicação após quarenta e oito horas, enquanto que as misturas I, III e IV foram inativadas após setenta e duas horas de exposição. Os autores afirmaram que a complexa anatomia dos canais radiculares oferece oportunidade e um bom meio ambiente para o crescimento, multiplicação e interação dos microrganismos em infecções pulpares, além disso, a dificuldade de controle microbiano requer o uso de medicação intracanal para complementar o preparo biomecânico. SIQUEIRA-JÚNIOR et al. (1998) avaliaram o tempo necessário para bactérias da saliva humana penetrarem e recontaminarem completamente a porção coronária de canais radiculares medicados com PMCC, hidróxido de cálcio e a combinação. Foram utilizados 50 incisivos superiores humanos, instrumentados até a lima 25K e irrigados com hipoclorito de sódio a 1%. Os dentes foram divididos recebendo no grupo 1: PMCC; grupo 2: hidróxido de cálcio com solução salina e grupo 3: hidróxido de cálcio, PMCC e glicerina. Os dentes foram, então, selados com algodão. Para avaliar a infiltração de saliva,

34 foi utilizado um método descrito por Torabinejad et al. (1991) modificado. Frascos de vidro com tampas de borracha perfuradas ao centro receberam cada dente sob pressão até a junção cemento-esmalte (JCE), de forma que a raiz permanecesse dentro do aparato. Cilindros preparados com seringas plásticas de 10mL foram adaptadas à superfície externa dos tampões de borracha para criar um reservatório ao redor da coroa dos dentes. Os frascos de vidro foram preenchidos com BHI até que dois milímetros do ápice fossem imersos no caldo. O aparato foi, então, esterilizado. Aplicou-se o cianoacrilato entre o dente e o tampão de borracha. O reservatório plástico foi preenchido com 5mL de saliva humana e BHI (3:1) a cada três dias. O aparato foi incubado a 37ºC e observado diariamente para avaliação da turbidez no BHI, representando o tempo necessário para recontaminar o canal radicular completamente. Os canais medicados com PMCC foram totalmente recontaminados em 6,9 dias, em média. Os preenchidos com hidróxido de cálcio e a mistura mostraram total recontaminação em 14,7 e 16,5 dias respectivamente. Os autores concluíram que as pastas contendo hidróxido de cálcio foram significantemente mais efetivas do que a de PMCC (p<0,05). ESTRELA et al. (1999) avaliaram a atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio em túbulos dentinários após infecção microbiana de 28 dias. Utilizaram Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa e uma mistura de todas as bactérias. Os microrganismos foram

35 inoculados em BHI e incubados a 37ºC por 24 horas. As suspensões bacterianas foram ajustadas à escala 2 de MacFarland. Um mililitro de cada suspensão de microrganismos foi removido e uma mistura foi preparada. Sessenta e três incisivos centrais superiores tiveram os forames apicais selados com resina composta para evitar contaminação externa. O batente apical foi confeccionado com instrumento número 60, um milímetro aquém do forame apical pela técnica Step-back, sendo os terços médio e cervical preparados com Gates-Glidden números três e quatro. Para irrigação, utilizaram 3mL de hipoclorito de sódio a 1% entre cada troca de instrumentos. Os canais foram secos e preenchidos com EDTA a 17% por 3 minutos. Em seguida, os dentes foram esterilizados em autoclave a 120ºC por 30 minutos e divididos em cinco grupos, de acordo com o microrganismo mais a mistura e inoculados com seringas Luer com volume suficiente para preencher os canais radiculares, sendo mantidos em ambiente úmido a 37ºC. Esse procedimento foi repetido a cada setenta e duas horas por vinte e oito dias, sempre utilizando culturas de vinte e quatro horas e ajustadas à escala 2 de MacFarland. Decorrido o período de vinte e oito dias, os canais foram irrigados com 5mL de solução salina, secos com papel absorvente esterilizados e completamente preenchidos com pasta de hidróxido de cálcio. A pasta foi preparada usando hidróxido de cálcio pró-análise e solução salina, correspondendo à consistência de creme dental com ph 12,6. Em intervalos de 0, 48, 72h e 7 dias, a pasta foi removida de 3 dentes de cada grupo, por meio

36 de solução salina e lima. Os canais foram secos, os dentes imersos em 5mL de BHI e incubados por quarenta e oito horas. O crescimento bacteriano foi observado pela turbidez do meio de cultura. Os tubos de BHI positivos foram selecionados e o inóculo espalhado em BHI sólido, seguido de incubação. Posteriormente, realizaram a coloração de Gram das colônias desenvolvidas em meio sólido. Os resultados evidenciaram que não houve atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio nos períodos estudados. Os autores concluíram que, apesar de estudos mostrarem atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio em curativos de curtos períodos, um tempo maior é necessário para destruir os microrganismos nos túbulos dentinários, devido à profundidade de penetração desses microrganismos de acordo com a espécie e o tempo de incubação. WALTIMO et al. (1999) determinaram a suscetibilidade da Candida ssp, comum na cavidade bucal, em solução aquosa de hidróxido de cálcio. Testaram dezesseis linhagens de C. albicans, três linhagens de C. glabrata, três linhagens de C. guilliermondii, duas linhagens de C. krusei e duas linhagens de C. tropicalis. Utilizaram uma linhagem de referência para cada espécie, as outras foram isolados clínicos de periodontite apical resistente ou de periodontite marginal. Para fins comparativos, estudaram também a suscetibilidade do Enterococcus faecalis. Inóculos padronizados das linhagens foram incubados em solução aquosa de hidróxido de cálcio, ph 12,4, por períodos de tempo variando

37 de cinco minutos a seis horas. Foram cultivados 0,1mL das suspensões teste diretamente em meio Brucella Blood agar e incubadas em ambiente aeróbico a 37ºC. As colônias foram contadas após vinte e quatro e quarenta e oito horas de crescimento. A sensibilidade das linhagens de C. albicans foi baixa, necessitando de dezesseis horas de incubação para matar 99,9% das unidades formadoras de colônia (UFC). Não houve diferença nas linhagens isoladas das infecções do canal radicular e periodontite marginal. As linhagens de C. tropicalis foram eliminadas entre três e seis horas de incubação, enquanto que a C. guilliermondii foram eliminadas após dezessete horas. Todas as linhagens de C. glabrata sobreviveram por vinte minutos, mas não por uma hora de incubação, enquanto que a C. krusei levou dezesseis horas para serem mortas. Comparadas com o E. faecalis, todas as espécies de Candida mostraram, igualmente, altíssima resistência à solução aquosa de hidróxido de cálcio. Os autores afirmaram que este estudo indica que as espécies de Candida foram resistentes ao hidróxido de cálcio in vitro, o que pode explicar o isolamento constante de leveduras em periodontite apical. LEONARDO et al. (2000) avaliaram a atividade antimicrobiana de quatro cimentos endodônticos (AH Plus, Sealaex, Ketac-Endo e Fill Canal), duas pastas de hidróxido de cálcio (Calen e Calasept) e pasta de oxido de zinco e eugenol. Utilizaram seis linhagens de bactérias: Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli

38 e Enterococcus faecalis e uma linhagem isolada da saliva de um adulto. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método da difusão em Agar com os meios de cultura BHI e Müler-Hinton. As pastas e cimentos a base de hidróxido de cálcio foram colocados em poços de 4 x 4mm ou em cones de papel absorvente. Foram mantidas à temperatura ambiente por duas horas para difusão. Em seguida, as placas foram incubadas a 37ºC por duas horas. O meio de cultura foi otimizado com 5mL de gel de TCC (1% de Agar e 0,05% de cloreto de trifeniltetrazolium) e, posteriormente, o halo de inibição foi medido. Todas as linhagens foram inibidas por todos os materiais testados, utilizando o método do poço. Entretanto, quando o material foi aplicado em cones de papel absorvente, o Enterococcus faecalis não foi inibido pelo óxido de zinco e eugenol; a Pseudomonas aeruginosa não foi inibida pelo AH Plus, Fill canal e pelo óxido de zinco e eugenol. Concluíram que as pastas e cimentos utilizados apresentaram atividade antimicrobiana in vitro e a otimização do meio de cultura com gel de TCC facilitou a observação dos halos de inibição. SAFAVI; NAKAYAMA (2000) avaliaram a extensão da dissociação do hidróxido de cálcio na mistura de dois veículos não aquosos usados na Endodontia. Para realização do experimento, misturaram 25mL de glicerina ou propilenoglicol em água ultra-pura por diluição em série (0-100%). O hidróxido de cálcio foi adicionado (0,3g) e as soluções saturadas foram preparadas por agitação dos tubos. O hidróxido de cálcio não dissolvido foi, então, separado por

39 centrifugação. A condutividade dos líquidos foi medida a 23, 30 e 37ºC. A condutividade do grupo controle foi medida nas soluções sem hidróxido de cálcio. Os valores de condutividade a 37ºC da mistura glicerina-água foram estreitos (0-10%), superior a temperatura de 23ºC. Entretanto, todos os perfis de condutividade foram semelhantes às diferentes temperaturas. A condutividade aumentou estreitamente na proporção que a concentração de glicerina aumentou de 0 a 20%, e diminuiu drasticamente quando a concentração de glicerina aumentou de 20 a 100%. Os valores de condutividade das soluções controle foram próximos a zero. O perfil de condutividade na mistura propilenoglicol-água foi estritamente diferente daqueles da mistura glicerina-água. A condutividade aumentou levemente quando a concentração do propilenoglicol aumentou de 0 a 20%, assemelhando-se à mistura glicerinaágua. No entanto, o pico para o propilenoglicol ficou entre 20 e 40%, decrescendo drasticamente com aumento da concentração entre 40 e 100%. Os valores de condutividade foram semelhantes em ambas as misturas (glicerina e propilenoglicol) e essencialmente zero com 100% de glicerina e 100% de propilenoglicol. Os pesquisadores afirmaram que a capacidade de uma solução em conduzir uma corrente elétrica é diretamente proporcional à concentração de substâncias ionizadas na solução. Os autores concluíram que o uso de altas concentrações de glicerina e propilenoglicol em veículos mistos podem diminuir a eficiência do hidróxido de cálcio como medicação intracanal.

40 BARBIZAM et al. (2002) avaliaram a limpeza no terço apical de canais achatados com instrumentação rotatória de Ni-Ti. Concluíram que, tanto a instrumentação rotatória como a manual, não limpam completamente os canais radiculares. Complementaram afirmando que canais radiculares estreitos, curvos e achatados não são de fácil acesso, o que indica que as variações anatômicas são também fatores importantes que devem ser considerados. KIM; KIM (2002) determinaram a influência do hidróxido de cálcio como medicação intracanal e várias técnicas para sua remoção, no selamento apical do cimento de óxido de zinco e eugenol. Os autores utilizaram oitenta molares inferiores, divididos em três grupos. Prepararam pastas de hidróxido de cálcio com água destilada na proporção 1:1,25. Após o preparo dos canais radiculares até a lima 30, utilizando o sistema Profile.06, as pastas foram colocadas nos canais em dois grupos, deixando o grupo controle sem medicação. Após uma semana, as pastas do grupo 1 foram removidas com lima 35K, solução de hipoclorito de sódio a 2,5% e EDTA a 15%. No grupo 2, as pastas foram removidas do mesmo modo, no entanto, não foi utilizada a solução de EDTA. Os canais foram obturados com guta-percha e cimento Tubli-seal, por meio da técnica de condensação lateral. O selamento apical foi avaliado pela penetração de corante e mensurado em um estereomicroscópio. Os grupos que receberam medicação de hidróxido de cálcio apresentaram significantemente mais infiltração do que o grupo controle (P<0,05). No entanto, não houve diferença

41 significativa entre os dois grupos medicados com hidróxido de cálcio (P>0,05). Os autores concluíram que as medicações com o hidróxido de cálcio aumentam a infiltração apical de cimento de óxido de zinco e eugenol. SUNDE et al. (2002) analisaram a microbiota de trinta e seis dentes com lesão periapical refratária, resistentes à terapia endodôntica e medicação com hidróxido de cálcio por seis meses. Após serem cultivados, foram identificadas cento e quarenta e oito cepas de sessenta e sete espécies de microrganismos. Aproximadamente 51% das bactérias encontradas eram anaeróbias. As espécies Gram positivas constituíram 79,5% da flora. Os microrganismos facultativos eram compostos de espécies de Staphylococcus, Enterococcus, Enterobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Sphingomonas; Bacillus e Candida constituíram 75% das lesões. Grânulos sulfúricos foram encontrados em 25 % dos casos, apresentando Actinomyces israelli, A. viscosus, A. naeslundii e A. meyeri. Este estudo demonstrou a variedade de microrganismos existentes em periodontite apical refratária, após tratamento com hidróxido de cálcio. ESTRELA et al. (2003) avaliaram o tempo necessário para o hidróxido de cálcio eliminar microrganismos em canais infectados. Foram preparados cento e sessenta e oito dentes humanos anteriores que tiveram seus ápices selados com resina composta e foram irrigados com hipoclorito de sódio a 1% e, posteriormente, com CDTA. Após o preparo, os dentes foram esterilizados e inoculados com suspensões de Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis,

42 Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis e Candida albicans a cada setenta e duas horas, durante vinte e oito dias, sempre com culturas de vinte e quatro horas, de acordo com o tubo 1 da escala de MacFarland. Após esse período, os dentes foram irrigados com solução fisiológica e preenchidos com pastas de hidróxido de cálcio preparadas com solução salina. Coletaram amostras após 1 minuto, 7, 15, 21, 27, 30, 45, 60 e 90 dias, sendo a pasta removida e as amostras imersas em Lethen Broth. O crescimento microbiano foi analisado pela turvação do meio de cultura e subcultura em BHI. Os autores observaram e concluíram que o efeito antimicrobiano ocorreu após sessenta dias para os microrganismos utilizados e para a mistura. EVANS et al. (2003) avaliaram uma pasta de hidróxido de cálcio misturada com clorexidina a 2%, verificando sua ação antimicrobiana contra o Enterococcus faecalis, em túbulos dentinários de incisivos bovinos. Foram utilizados vinte e quatro incisivos bovinos que tiveram suas coroas removidas e foram preparados em forma de cilindro, com o diâmetro interno equivalente a broca esférica número 10. Em seguida, foram mantidos em banho ultrassônico com EDTA a 17% seguido de hipoclorito de sódio a 5,25% por cinco minutos. Após o preparo, os dentes foram autoclavados e, posteriormente, imersos em tryptic soy broth contendo cultura de E. faecalis, incubados por cinco dias a 35ºC, para infecção dos túbulos dentinários. Decorrido esse tempo, os dentes foram removidos do meio, lavados com 2mL de água estéril, secos e divididos

43 em dois grupos. No primeiro grupo, os dentes foram preenchidos com pasta de hidróxido de cálcio preparada com água estéril e no segundo grupo com pasta de hidróxido de cálcio e clorexidina a 2%. Os espécimes foram incubados a 35ºC por sete dias. Após uma semana, as pastas foram removidas com 2mL de água esterilizada. Amostras de dentina foram coletadas em BHI da porção interna do canal radicular utilizando brocas números 29, 31, 33 e 35 e brocas 37, 40, 42 e 45 para recolher amostras da dentina da porção externa do canal radicular. Após incubação por vinte e quatro horas, foram contadas as CFU/mg. O grupo que recebeu somente hidróxido de cálcio apresentou 1040 ± 3134 CFU/mg, sendo significantemente diferente (p<0,001) do grupo que recebeu a mistura (23 ± 41 CFU/mg). A diferença do número de CFU entre a porção interna e externa da dentina não foi significante. Os pesquisadores concluíram que a pasta de hidróxido de cálcio preparada com clorexidina a 2% foi mais efetiva para eliminar o E. faecalis dos túbulos dentinários do que a pasta preparada com água. LIN et al. (2003) compararam o efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio, clorexidina e sua combinação contra o E. faecalis. O teste de difusão em Agar foi realizado em placas contendo Mueller-Hinton. As placas receberam por meio de swabs, o E. faecalis ajustado de acordo com a escala 0,5 de MacFarland, sendo, posteriormente, incubadas por setenta e duas horas. Após esse período, discos de papel foram impregnados com: grupo 1: pasta de

44 hidróxido de cálcio preparada com água estéril; grupo 2: pasta de hidróxido de cálcio (Pulpdent ) com água estéril; grupo 3: Peridex 0,12%; grupo 4: pó de hidróxido de cálcio com Peridex 0,121% e grupo 5: Pulpdent com Peridex 0,12%. Ampicilina foi utilizada como controle. As placas foram incubadas a 37ºC por vinte e quatro e setenta e duas horas. Não houve diferença no tamanho dos halos de inibição após vinte e quatro horas. O Peridex mostrou zonas de inibição significantemente maiores quando comparado com o hidróxido de cálcio. Não houve diferença estatística significante entre Peridex e a combinação hidróxido de cálcio e Peridex. Os autores constataram que a clorexidina sozinha e em combinação mostrou efeito antibacteriano significantemente melhor que o hidróxido de cálcio sozinho e que não houve diferença entre a clorexidina combinada com o hidróxido de cálcio ou sozinha. LYNNE et al. (2003) avaliaram e compararam o efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio e do gluconato de clorexidina a 0,12%, sozinhos e em combinação, a várias profundidades nos túbulos dentinários bovinos infectados com Enterococcus faecalis, após vinte e quatro horas. Utilizaram incisivos centrais e laterais bovinos que tiveram as coroas e os sete milímetros apicais removidos com broca diamantada. As raízes foram preparadas em forma de cilindro de cinco milímetros de altura e cinco a seis milímetros de diâmetro. Em seguida, as amostras receberam EDTA a 17% por quatro minutos em banho ultrassônico, seguido por hipoclorito de sódio a 5,25% pelo mesmo período.

45 Posteriormente, os dentes foram esterilizados em autoclave a 121ºC por 15 minutos. Todos os tubos, com exceção de seis, foram encubados em BHI contendo 7x10 4 UFC de E. faecalis a 37ºC por vinte e quatro horas e 5% de CO 2. Os seis cilindros reservados foram colocados em BHI estéril e incubados sob as mesmas condições, servindo como controle. As amostras foram lavadas em tampão fosfato e mantidas em culturas individuais. Os medicamentos foram aplicados de forma a preencher o lúmen do canal. Os três grupos experimentais mostraram atividade antimicrobiana significantemente maior quando comparados ao grupo que recebeu água destilada (p<0,001). O grupo tratado com o hidróxido de cálcio mostrou atividade antimicrobiana significativamente maior que os demais, em qualquer profundidade de dentina (p<0,05). Os autores afirmaram que os dados sugerem que o hidróxido de cálcio a 10% é mais eficiente que o Peridex ou a mistura de Peridex com o hidróxido de cálcio para a eliminação do E. faecalis. MARCHESAN et al. (2003) afirmaram que variações na anatomia interna podem influir na terapia dos canais radiculares, uma vez que os canais não são cilíndricos, mas sim, achatados. Por isso, podem permanecer tecidos remanescentes nos istmos, reentrâncias e ramificações, tornando a instrumentação mais difícil. PACIOS et al. (2003) avaliaram o nível de ph e estimaram, quantitativamente, a liberação de proteínas, hidroxiprolina e fósforo de pedaços