PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ESPÉCIES ORNAMENTAIS

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1 PROPAGAÇÃO IN VITRO DE ESPÉCIES ORNAMENTAIS 1 INTRODUÇÃO 1 Eng ª. Agro ª., Mestranda Fitotecnia - UFLA 2 Estudante Agronomia 9º período- UFLA 3 Biólogo DAG - UFLA 4 Eng ª. Agro ª., Doutoranda Fitotecnia -UFLA 5 Eng o. Agro o., Dr., Prof. Dep. de Agricultura - UFLA. Chrystiane Borges Fráguas 1 Alba Regina Pereira 2 Vantuil Antônio Rodrigues 3 Ester Alice Ferreira 4 Moacir Pasqual 5 A floricultura brasileira representa um setor altamente competitivo e exigente na utilização de tecnologias avançadas, principalmente quando se trata de exportação. Abrange desde o cultivo de plantas ornamentais, flores de corte, plantas envasadas, floríferas ou não, até a produção de sementes, bulbos e mudas de várias espécies, inclusive arbóreas. O Estado de São Paulo responde por 70% da produção nacional, destacando-se Holambra e Atibaia com o maior número de produtores. Minas Gerais é outro grande Estado produtor, prevalecendo a floricultura de corte. A maior produção concentra-se em Belo Horizonte, Juiz de fora, São João Del Rei, Barbacena e Diamantina. A necessidade de obtenção de plantas matrizes sadias torna a cultura de tecidos um método de propagação importante, além de possibilitar a obtenção de grande número de plantas em curto espaço de tempo, com alta qualidade genética, propagação de clones em qualquer época do ano e de espécies que dificilmente seriam propagadas por métodos convencionais, suprindo, assim, a necessidade dos produtores de flores ou plantas ornamentais na aquisição de mudas com qualidade comprovada.

2 6 A micropropagação de plantas ornamentais e sua utilização em âmbito comercial já são realidade em diversos países do mundo, destacando-se Holanda, França, Espanha, Japão e, mais recentemente, o Brasil. O processo de cultura de tecidos vegetais compreende um conjunto de técnicas nas quais um explante (célula, tecido ou um órgão) é isolado sob condições assépticas, em meio nutritivo artificial. Esse processo baseia-se na totipotencialidade das células, ou seja, qualquer célula do organismo vegetal apresenta todas as informações genéticas necessárias à regeneração de uma planta completa. 2 ORQUÍDEAS O cultivo comercial de orquídeas vem apresentando significativo aumento nos últimos anos. Alguns gêneros com elevado valor econômico, como Cattleya e Laelia, são apreciados nos mercados brasileiro e internacional, evidenciando a potencialidade do País no cultivo de orquídeas. As orquídeas são plantas herbáceas perenes, bastante diversificadas quanto ao tamanho, forma e cor das flores, sendo comercialmente cultivadas tanto para produção de plantas de corte como de vaso. A propagação de orquídeas pode ser tanto vegetativa quanto por meio de sementes. Essas, embora produzidas em grande quantidade, apenas germinam na natureza se houver associação simbiótica com fungos micorrízicos, pois não possuem endosperma funcional. A cultura de tecidos proporciona taxa de germinação de aproximadamente 100% das sementes, ao passo que a cultura de meristemas

3 7 é utilizada para propagar plantas idênticas à planta-mãe e isentas de viroses, especialmente plantas de alto valor econômico. 2.1 Metodologia 1: Material Vegetal: Sementes de cápsulas maduras e fechadas. Esterilização: Mergulhar a cápsula fechada por 1 minuto em álcool 70% e, em seguida, por 20 minutos em hipoclorito de sódio (água sanitária a 2-2,5%). Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada. Inoculação: Utilizar a câmara de fluxo laminar para abrir as cápsulas. Semeadura: inocular as sementes em meio de cultura Knudson + 50 ml/l de água de coco verde + 40 g de polpa de banana Nanica + 2 g/l de carvão ativado. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar ph para 5,8. Após 3 meses (pode variar de acordo com a espécie), repicar para meio de desenvolvimento da parte aérea e do sistema radicular: Knudson + 50 ml/l de água de coco verde + 40 g de polpa de banana Nanica + 2 g/l de carvão ativado + 1,0 mg/l de tiamina + 0,25 mg/l de ácido nicotínico + 0,25 mg/l de piridoxina mg/l de mio-inositol + 2 mg/l de glicina. Após 2 ou 3 meses, repica-se novamente para o mesmo meio até a planta atingir 3 a 4 cm, quando serão aclimatizadas. Tempo de maturação das cápsulas: Cattleya leopoldi = 5 a 6 meses Cattleya loddigesii = 8 a 9 meses Cattleya warneri = 5 a 6 meses

4 8 Cattleya walkeriana = 8 a 9 meses Cattleya nobilior = 8 a 9 meses Laelia purpurata = 6 a 7 meses Laelia harpophylla = 5 meses Laelia crispa = 8 a 9 meses Laelia flava = 8 a 9 meses 2.2 Metodologia 2: Material vegetal: Meristema Esterilização: Retirar da planta adulta o broto com aproximadamente 2 cm de comprimento e deixar por 1 minuto em álcool 70% e, posteriormente, por 20 minutos em hipoclorito de sódio. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada. Com auxílio de lupa, pinça e bisturi, retirar todas as folhas até atingir o meristema (0,1 0,2 mm), que será inoculado em meio Knudson + 2 mg/l de GA 3 + 0,5 mg/l de BAP + 0,01 mg/l de ANA + 100ml de água de coco verde + 2 g/l de carvão ativado, deixando no escuro por uma semana. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar ph para 5,8. Após, aproximadamente, 30 dias, transferir para meio Knudson + 0,5 mg/l de BAP + 2 g/l de carvão ativado + 1,0 mg/l de tiamina + 0,25 mg/l de ácido nicotínico + 0,25 mg/l de piridoxina mg/l de mio-inositol + 2 mg/l de glicina. A cada 30 dias, repicar para esse meio novamente, até obter o número de plântulas desejado.

5 9 Individualizar as plântulas e transferi-las para meio Knudson sem reguladores de crescimento + 2 g/l de carvão ativado + 1,0 mg/l de tiamina + 0,25 mg/l de ácido nicotínico + 0,25 mg/l de piridoxina mg/l de mio-inositol + 2 mg/l de glicina. As plântulas permanecerão nesse meio até enraizarem e atingirem 3 a 4 cm, quando serão aclimatizadas. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar como recipientes bandejas ou copos plásticos e como substrato pó de xaxim ou esfagno. Adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante. A casa-devegetação deve estar coberta com sombrite 70% durante os primeiros 6 meses e, após esse período, passar para sombrite 50%. 3 BROMÉLIAS As bromélias têm recebido atenção de um número cada vez maior de pesquisadores e colecionadores. A importância econômica das bromélias está na sua crescente utilização em projetos paisagísticos, por causa da beleza de suas flores, resistência e praticidade no manuseio, além de formar um micro habitat para diversos grupos de organismos. Durante o ciclo vital, de acordo com a espécie e/ou condições ambientais, a planta floresce e frutifica somente uma vez. Porém, uma vez coletadas as sementes, consegue-se em curto espaço de tempo, com a

6 10 germinação in vitro, grande quantidade de mudas, sendo a taxa de multiplicação muito superior à obtida in vivo. 3.1 Metodologia 1: Material Vegetal: Sementes maduras Esterilização: Embrulhar as sementes em um pedaço de tecido fino e deixar por um minuto em álcool 70% e, em seguida, por 20 minutos em hipoclorito de sódio (1,0 a 1,25%). Após esse procedimento, dentro da câmara de fluxo laminar, realizar a tríplice lavagem em água destilada e esterilizada e, em seguida, inocular no meio de cultura. Semeadura: inocular as sementes em meio de cultura MS, acrescido de 2g/L de carvão ativado. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar ph para 5,8. O tempo gasto para a germinação pode variar de 1 semana a 1 mês, dependendo da espécie, como por exemplo: Aechmea bromelifolia 7 dias Aechmea fasciata 7 a 10 dias Alcantarea imperialis 7 a 10 dias Neoregelia carolinae 7 a 10 dias Nidularium fulgens 7 a 10 dias Após 1 mês, transferir as plântulas para meio de multiplicação. Dependendo da espécie, o meio de cultura pode variar. Existem três meios alternativos que podem ser utilizados: (1) MS + 2 mg/l de AIA + 2 mg/l de cinetina + 40 mg/l de adenina, (2) MS + 0,5 mg/l

7 11 de ANA + 1 mg/l de BAP + 40 mg/l de adenina e (3) MS + 1 mg/l de ANA + 1 mg/l de BAP + 40 mg/l de adenina. Após 1 mês, repicar os brotos para meio de cultura de enraizamento: MS + 0,1 mg/l de ANA, onde permanecem por 30 dias e, posteriormente, as plântulas serão aclimatizadas. 3.2 Metodologia 2: Material Vegetal: Plantas (caule) após a frutificação. Esterilização: Lavar a planta em água corrente para a retirada do solo. Retirar as folhas de forma que reste somente o caule. Deixar o caule mergulhado em solução de álcool 70% por 1 minuto, transferindo-o para solução de hipoclorito de sódio 1,5% por 20 minutos, sob agitação. Realizar a tríplice lavagem na câmara de fluxo laminar em água destilada e esterilizada. Utilizando uma lupa, retirar o meristema e inocular em meio de cultura MS. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar o ph para 5,8. Após 40 a 60 dias, transferir o explante para meio de cultura MS acrescido de 2,0 mg/l de ANA e 2,0 mg/l de BAP. Após o desenvolvimento das plântulas, transferi-las para meio de enraizamento: MS + 0,1 mg/l de ANA, onde permanecerão por 30 dias, sendo, posteriormente, aclimatizadas.

8 12 Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar bandejas de isopor ou plásticas com o substrato comercial Plantmax e adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante. 4 VIOLETA AFRICANA A violeta-africana (Saintpaulia ionantha H. Wendl.) é uma espécie originária das montanhas de Usambra, no leste da África. É uma espécie florífera perene e é uma das mais populares plantas de interior. É uma planta herbácea, com folhas ovais, de textura aveludada e cor verde-escura, com flores simples ou dobradas de variadas cores. A violeta é propagada comercialmente por meio de estacas de folhas com ou sem pecíolo, ou também por divisão de touceiras. Para a propagação in vitro, diversas estruturas da planta podem ser utilizadas como explante, como limbo foliar, pecíolo, pétalas e anteras. 4.1 Metodologia: Material Vegetal: Folhas Esterilização: Retirar as folhas sadias da planta e lavar com detergente em água corrente. Deixar em álcool 70% por 1 minuto, transferindo-as para hipoclorito de sódio (1 a 1,25%) por 20 minutos. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada, em câmara de fluxo laminar.

9 13 Cortar as bordas das folhas queimadas pela esterilização e as regiões necrosadas. Cortar as folhas em pedaços de 1 x 1cm e inocular em meio de cultura MS acrescido de 10 mg/l de GA 3, 1,0 mg/l de BAP e 0,1 mg/l de ANA. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar o ph para 5,8. Ocorrerá regeneração direta após 1 mês de cultivo. Quando os brotos atingirem 1 a 1,5 cm de comprimento, deve-se individualizá-los e transferi-los para meio MS acrescido de 0,5 mg/l de BAP. Repicar para esse meio até obter o número de plântulas desejado. Após 1 mês, transferi-los para meio de cultura MS 50% sem reguladores de crescimento, para que ocorra o enraizamento. Após 30 dias, as plântulas podem ser aclimatizadas. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar bandejas de isopor ou plásticas com o substrato comercial Plantmax e adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante. 5 GLOXÍNIA A gloxínia (Sinningia speciosa) é uma planta ornamental, de vaso, cultivada pela beleza e exoticidade de suas flores. A maioria das espécies é de origem brasileira, desenvolvendo-se naturalmente nos picos rochosos da serra do Mar, nos Estados do Paraná, São Paulo e Rio de Janeiro. É uma

10 14 planta herbácea, tuberosa, perene, acaule, de folhas carnosas e aveludadas, flores eretas, simples ou dobradas, em diversas cores ou pontilhadas. A propagação comercial é feita pelas sementes e, por esse método, as plantas produzem flores após 6 a 7 meses. Além dessa forma de propagação, o cultivo in vitro de segmentos nodais é utilizado quando se quer clonar uma planta-matriz ou quando surge um mutante de valor comercial. 5.1 Metodologia 1: Material Vegetal: Sementes Esterilização: Coletar as sementes já maduras da planta e embrulhá-las em um pedaço de tecido fino e deixar por um minuto em álcool 70% e, em seguida, por 20 minutos em hipoclorito de sódio (1,0 a 1,25%). Prosseguindo, dentro da câmara de fluxo laminar, realizar a tríplice lavagem em água destilada e esterilizada e, em seguida, inocular no meio de cultura. Inocular as sementes em meio de cultura MS, utilizar 6 g/l de ágar e ajustar ph para 5,8. Após atingir 1 a 1,5 cm de comprimento, repicar para meio MS contendo 1,0 mg/l de BAP + 2,0 mg/l de GA 3, permanecendo nesse meio por 60 dias. Transferir as plântulas para meio MS 50% sem reguladores de crescimento, para que ocorra o enraizamento. Após 30 dias, segue-se a etapa de aclimatização.

11 Metodologia 2: Material Vegetal: Folhas Esterilização: Retirar as folhas sadias da planta e lavar com detergente em água corrente. Deixar em álcool 70% por 1 minuto e transferir para hipoclorito de sódio (1 a 1,25%) por 20 minutos. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada, em câmara de fluxo laminar. Cortar as bordas das folhas queimadas pela esterilização e as regiões necrosadas. Cortar as folhas em pedaços de 1 x 1 cm e inocular em meio de cultura MS acrescido de 0,5 mg/l de BAP + 2,0 mg/l de GA 3, permanecendo nesse meio por 60 dias. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar ph para 5,8. Quando os brotos atingirem aproximadamente 1,5 cm de comprimento, individualizá-los e colocá-los novamente no meio de multiplicação utilizado anteriormente. Os brotos permanecerão nesse meio por 60 dias. Repicar para esse meio até obter o número de plântulas desejado. Transferir as plântulas para meio MS 50% sem reguladores de crescimento para que ocorra o enraizamento. Após 30 dias, segue-se a etapa de aclimatização. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura.

12 16 Utilizar bandejas de isopor ou plásticas com o substrato comercial Plantmax e adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante. 6 CRISÂNTEMO O crisântemo (Dendranthema grandiflorum) é uma das principais flores no mercado em virtude de suas belas inflorescências, com infinidade de formas e cores, o que faz com que seja uma das mais comercializadas. Caracteriza-se como planta herbácea ereta. A produção de mudas é uma etapa muito importante no cultivo do crisântemo. Essa atividade representa um dos fatores básicos para o sucesso de uma cultura, uma vez que a formação inicial da planta influencia toda a sua vida produtiva. A propagação in vitro comercial do crisântemo é realizada pelo cultivo de meristemas, gemas ou segmentos nodais. 6.1 Metodologia 1: Material Vegetal: Meristema ou gema Esterilização: Retirar da planta os brotos apicais ou os segmentos nodais que possuem as gemas e deixar por 1 minuto em álcool 70%, transferindoos para hipoclorito de sódio 1 a 1,25% por 20 minutos. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada, em câmara de fluxo laminar.

13 17 Utilizando uma lupa, retirar o meristema ou gema e inocular em meio de cultura MS + 2 mg/l de GA 3 + 0,5 mg/l de BAP + 5 mg/l de tiamina + 0,5 mg/l de piridoxina + 0,5 mg/l de ácido nicotínico. Utilizar 6 g/l de ágar e ajustar ph para 5,8. Permanecer no escuro por 3 dias. Após 30 dias, transferir para meio WPM 150% + 4 mg/l de BAP. Quando os brotos atingirem 1 cm de comprimento, transferi-los para meio de cultura sem reguladores de crescimento, para desenvolvimento e enraizamento das plântulas. Após essa etapa, as planta serão aclimatizadas. 6.2 Metodologia 2: Material Vegetal: segmentos nodais Esterilização: Retirar da planta segmentos nodais que possuem as gemas e deixar por 1 minuto em álcool 70% e, em seguida, transferir para hipoclorito de sódio 1 a 1,25% por 20 minutos. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada, em câmara de fluxo laminar. Inocular em meio de cultura MS 50% acrescido de 1,0 mg/l de BAP. Após 30 dias, repicar as brotações para meio de cultura WPM 150% e 4 mg/l de BAP. Quando os brotos atingirem 1cm de comprimento transferí-los para meio de cultura sem reguladores de crescimento para o

14 18 desenvolvimento e enraizamento das plântulas. Após essa etapa, as plantas serão aclimatizadas. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar bandejas de isopor ou plásticas com o substrato comercial Plantmax e adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante. 7 ESTRELÍCIA/AVE-DO-PARAÍSO A estrelícia ( Strelitzia reginae Ait.) ou ave-do-paraíso é uma planta ornamental de expressivo valor comercial e sua produção desperta especial interesse no mercado externo. Essa planta, no entanto, é de lento desenvolvimento, demandando de 5 a 7 anos para iniciar a produção de flores. É uma planta herbácea rizomatosa, ereta, entouceirada, acaule, da África do Sul, com folhas firmes e coreáceas. A propagação é feita pela divisão de touceiras, resultando em pequeno número de mudas, ou por sementes, as quais apresentam dormência. Por meio da cultura de tecidos, consegue-se germinar os embriões retirados das sementes maduras em reduzido tempo; porém, para a multiplicação in vitro, ainda não houve sucesso.

15 Metodologia: Material Vegetal: Embriões de sementes maduras Esterilização: Após 6 a 7 meses da fecundação, as sementes já estão maduras e o embrião pronto para germinar. Retirar as sementes e deixar por 1 minuto em álcool 70% e, posteriormente, em hipoclorito de sódio (2 a 2,5%) por 20 minutos. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada, em câmara de fluxo laminar. Retirar os embriões com auxílio de lupa e bisturi e inoculá-los em meio de cultura MS acrescido de 100 ml de água de coco verde por litro de solução. A germinação ocorre de 15 a 30 dias após a inoculação. Após 60 dias, aclimatizar as plântulas. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar bandejas de isopor ou plásticas com o substrato comercial Plantmax e adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante. 8 JATROFA A jatrofa (Jatropha podagrica) ou batata-do-inferno é uma planta rústica, resistente a solos áridos; porém, não é resistente a baixas temperaturas, sendo originária da América Central e Antilhas.

16 20 É um arbusto suculento, leitoso, de tronco dilatado na base, de folhas recortadas, espessas, coreáceas, de cor verde-escura em cima e prateada em baixo. As flores são pequenas e numerosas, dispostas em inflorescências com haste longa e suculenta, de coloração vermelha. A propagação é realizada facilmente pelo processo de semeadura, com sementes produzidas a partir de frutos suculentos. O cultivo in vitro proporciona rápida germinação dos embriões, possibilitando a organização de lotes pela seleção de plantas de mesmo tamanho. 8.1 Metodologia: Material Vegetal: Embriões de sementes maduras Esterilização: Retirar as sementes e deixar por 1 minuto em álcool 70% e, posteriormente, em hipoclorito de sódio (2 a 2,5%) por 20 minutos. Lavar 3 vezes em água destilada e esterilizada, em câmara de fluxo laminar. Retirar os embriões com auxílio de lupa e bisturi e inoculá-los em meio de cultura MS. A germinação ocorre 5 dias após inoculação. Após atingirem 3 cm de comprimento, aclimatizar as plântulas. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar bandejas de isopor ou plásticas com o substrato comercial Plantmax e adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante.

17 21 9 CACTOS A família Cactaceae apresenta-se de forma diversa e contém muitas espécies ornamentais. Os cactos são nativos do norte e sul da América, do Canadá ao Chile, e o México têm a mais rica diversidade entre as regiões áridas desses continentes. É propagado por sementes ou por individualização das brotações laterais. Porém, os métodos convencionais de propagação são, geralmente, inadequados, a fim de atingir a demanda comercial, uma vez que alguns cactos exibem baixa taxa de germinação e de crescimento ou baixa taxa de desenvolvimento de brotações laterais. A cultura de tecidos proporciona, em curto espaço de tempo, grande número de novas plantas sadias e, além disso, é uma forma de propagar as espécies que estão em extinção e já atingem 25% de todos os cactos existentes. 9.1 Metodologia: Material Vegetal: Sementes maduras Esterilização: Embrulhar as sementes em um pedaço de tecido fino e deixar por um minuto em álcool 70% e, posteriormente, por 20 minutos em hipoclorito de sódio (1,0 a 1,25%). Prosseguindo, dentro da câmara de fluxo laminar, realizar a tríplice lavagem em água destilada e esterilizada e, em seguida, inocular no meio de cultura. Semeadura: inocular as sementes em meio de cultura MS.

18 22 Após germinadas, transferir para meio de multiplicação, que varia conforme a espécie. Epithelantha micromeris var. bokei: MS + 5mg/L de 2iP Escobaria minima: MS + 1mg/L de BAP + 0,05mg/L de ANA Mammillaria pectinifera: MS + 5mg/L de 2iP Pediocactus paradinei: MS + 10mg/l de 2iP + 1mg/L de AIB Opuntia arenaria Engelm.: MS + 4mg/L de cinetina + 2mg/L de AIA Após a multiplicação, transferir para meio de cultura sem reguladores de crescimento, para que ocorra o enraizamento. Aclimatização: Lavar as plântulas em água corrente para retirar o excesso de meio de cultura. Utilizar bandejas de isopor ou plásticas contendo areia + solo + Plantmax na proporção 2:1:1. Adubar com a formulação NPK , de acordo com recomendação do fabricante.

19 23 Tabela 1: Composição básica dos meios de cultura MS, WPM e Knudson. Componentes MS (mg/l) WPM (mg/l) KNUDSON* (mg/l) Macronutrientes: CaCl 2. 2H 2 O Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O KH 2 PO KNO K 2 SO MgSO 4. 7H 2 O NH 4 NO (NH 4 ) 2 SO Micronutrientes: CoCl 2. 6H 2 O 0, CuSO 4. 5H 2 O 0,025 0,25 0,040 H 3 BO 3 6,2 6,2 0,056 KI 0, MnSO 4. 4H 2 O 22,3 22,3 7,5 Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0,25 0,25 0,016 ZnSO 4. 7H 2 O 8,6 8,6 0,331 FeEDTA: FeSO 4. 7H 2 O 27,8 27,8 25 Na 2 EDTA. 2H 2 O 37,2 37,2 - Orgânicos: Ácido nicotínico 0,5 0,5 - Glicina 2,0 - - Mio-inositol Piridoxina - HCl 0,5 0,5 - Tiamina - HCl 0,5 1,0 - Sacarose (g/l) Fonte: Murashige e Skoog (1962), Lloyd e McCown (1980), Arditti e Ernst (1993). * Modificado por Arditti e Ernst, 1993.

20 24 10 BIBLIOGRAFIA CONSULTADA ARDITTI, J.; ERNST, R. Micropropagation of orchids. New York: John Wiley, Cap. 3, p GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Ed.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília-DF: EMBRAPA, v. 1, p HUBSTENBERGER, J. F.; CLAYTON, P. W.; PHILLIPS, G. C. Micropropagation of cacti (Cactaceae). In: BAJAJ, Y. P. S. (Ed.). Hightech and micropropagation IV. Berlin: Spring Verlag, p (Biotechnology in agriculture and forestry, 20) LLOYD, G.; McCOWN, B. Use of microculture for production and improvement of Rhododendron spp. HortScience, Alexandria, v. 15, p. 416, (Abst., 321). MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossays with tabacco tissue culture. Physiologia plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p , TOMBOLATO, A. F. C.; COSTA, A. M. M. Micropropagação de plantas ornamentais. Campinas: IAC, p. (IAC. Boletim Técnico, 174).